专利名称：培养哺乳动物味细胞的方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物味细胞的分离和长期细胞培养的方法。哺乳动物味细胞包括应答味觉刺激物或呈味物质(tastant)的哺乳动物味觉感受器表达细胞。本发明的方法使得对味觉感受器细胞的研究持续延长的一段时间，例如长达三个月或更长时间。此外，本发明的方法与已知方法相比较降低了需要从其分离味细胞的动物数量。由于本发明的方法允许味细胞在体外增殖和分化，使得包括增殖和分化的味细胞过程的体外研究，例如这些过程所需要的营养因子的测定成为可能。将味细胞培养一段延长的时间的能力使得能够进行需要较长时间范围的实验。
背景味蕾由大约50-100个味细胞组成，味细胞包括呈现神经元和表皮特性的三种形态类型。基于免疫细胞化学特征，可以将这些味细胞分类为I型(暗)、II型(亮)和III型(居中)(Yee等，J Comp Neurol.2001年11月5日；440(1)97-108；Takeda等，J Comp Neurol.2004年11月1日；479(1)94-102)。
研究表明这些味细胞中的大约10％呈现出对神经细胞粘附分子(NCAM)的免疫反应性。虽然NCAM-免疫反应性细胞是III型细胞，但不是所有的III型味细胞对NCAM是免疫反应性的(Nelson和Finger1993，J Comp Neurol 336(4)507-16)，且味细胞中的NCAM表达依赖于IX神经的神经支配(Smith等，1994，J Comp Neurol 347(2)187-96)。这些和其他数据表明了NCAM表达味细胞与神经相联系。
相反，对味觉刺激物的功能性应答所需要的关键分子不在NCAM免疫反应性细胞中表达。例如，味转导素，是一种参与味觉传导的关键性G-蛋白并且只存在于II型细胞中。然而，没有在NCAM表达细胞中检测到味转导素(Takeda等，1992，J.Electron Microsc.41(5)375-80；Yang等，2000，J.Comp Neurol 425(1)139-51)。
认为味细胞源自上皮细胞谱系，具有10天的有限平均寿命，其中垂死细胞由基细胞群替代。报道了大部分的味细胞的原代细胞培养物最多持续数天，例如，最多3至5天(比较，例如，对于小鼠味细胞，改良自哺乳动物中枢神经元分离的方法，Spielman等，1989，BrainResearch 503326-29；而对于大鼠味细胞，Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25，和Stone等，2002，Chem.Senses27779-87)。
为了能够检测给定的呈味物质，味细胞通常需要呈味物质(例如，苦味、甜味、鲜味(umami))的相关味觉感受器和味觉传导所必需的分子二者。味觉感受器可以包括一种或多种T2R和/或一种或多种T1R。信号传导分子可以包括味转导素和磷脂酶C。在此将表达至少一种味觉感受器并能够应答至少一种味觉刺激物/呈味物质的细胞称为“味觉感受器细胞”。因此，味细胞在其他细胞类型中包括味觉感受器细胞。
迄今为止，不存在味觉感受器细胞的细胞培养物模型，且任何体外研究都必须依赖于维持有限时间的味细胞的原代细胞培养物。
Ookura等(2002，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal 38365-72)描述了从小鼠味觉上皮分离的特定类型的细胞，这些细胞已经基于它们的整联蛋白β1标记得到了分选并表达NCAM标记。因此，这种整联蛋白阳性连续小鼠细胞培养没有产生与那些负责味觉刺激物初级检测的细胞相似的细胞。
Ruiz等(2001，Chem.Senses 26(7)861-73)报道了源自味蕾的原代细胞培养物维持了长达14天，条件是将细胞保持于室温，认为这减缓了各种细胞过程。值得注意的是，保持于37℃的细胞只能维持几天，和之前所报道的相同。报道了保持于室温的细胞在第10天左右开始死亡，这与预期的味细胞的平均寿命相符。Ruiz等1995年公开的实验方案(“Tissue Culture of Rat Taste Buds”(大鼠味蕾的组织培养)，编辑Spielman AI，Brand JG Experimental Cell Biologyof Taste and Olfaction(味觉和嗅觉的实验细胞生物学)，CRC出版社，1995)公开了相似的室温下方法，该方法提及了长达18天的培养持续时间。
概述本发明总地涉及分离、培养和/或测定哺乳动物味细胞的方法，味细胞包括味觉感受器细胞，以及涉及培养的哺乳动物味细胞。
本发明内包括培养哺乳动物味细胞的方法，该方法步骤为在合适的细胞培养基中和有涂层的细胞培养容器上(其中在培养容器情况下的术语“上”包括其中)培养味细胞，并从第一次更换培养基开始，以至少约5天的间隔更换培养基。一些实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞。一些实施方案中，味细胞只包括味觉感受器细胞。优选的实施方案中，细胞培养基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。培养容器的涂盖物优选包括胶原。
本发明还包括通过分离舌上皮来分离和培养哺乳动物味细胞的方法，其中将舌上皮中的味细胞暴露于存在或不存在蛋白水解酶的分离溶液的时间长度最小化，在合适的细胞培养基中和在有涂层的细胞培养容器上孵育分离的味细胞上皮碎片，并且，从第一次更换培养基开始，以至少5天的间隔更换培养基。味细胞暴露于含有或不含蛋白水解酶的分离溶液的时间长度为约30分钟或更短时间。在一些实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞，一些实施方案中，味细胞只包括味觉感受器细胞。优选的实施方案中，细胞培养基包括含有MCDB 153、FBS、胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。更优选的实施方案中，细胞培养基包括含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。培养容器的涂盖物优选包括胶原。
本发明进一步包括根据本发明的方法培养或分离并培养的味细胞。优选的实施方案中，味细胞是味觉感受器细胞。味觉感受器细胞优选应答至少一种味觉刺激物。可以将本发明的培养的味细胞在约37℃培养至少约10天，在约18-37℃培养至少约20天。本发明还包括味细胞的培养物。一些优选的实施方案中，本发明提供在细胞培养物中分裂超过48小时，优选超过约5天，更优选超过约2周的哺乳动物味觉感受器细胞。
本发明还提供了具有约300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和约7.0至约7.3的pH的味细胞测定缓冲液，以及将味细胞维持于这样的缓冲液中的方法。
进一步关注转染的培养的哺乳动物味细胞。本发明的转染细胞可以用载体DNA，如质粒或病毒载体DNA转染。还提供了转染培养的味细胞的方法，该方法通过使培养的哺乳动物味细胞接触核酸，诸如但不限于，载体DNA，例如，病毒载体DNA或质粒载体DNA来进行。
本发明还包括使用培养的哺乳动物味细胞的测定方法。一些优选的实施方案中，测定方法中所用的味细胞测定缓冲液具有300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和7.0至7.3的pH。
提供了测定对候选味觉刺激物的味觉应答的方法，该方法包括将培养的味细胞暴露于候选味觉刺激物，并将该味细胞对候选味觉刺激物的一种或多种细胞应答与培养的味细胞对标准味觉刺激物的应答相比较，其中培养的味细胞对候选味觉刺激物和对标准味觉刺激物相同的细胞应答表明候选味觉刺激物在味细胞中引起和标准味觉刺激物相同的味觉应答。还提供了测定候选味细胞的味觉应答的方法，包括将候选的培养的味细胞暴露于已知的味觉刺激物，并将候选的培养的味细胞对已知味觉刺激物的细胞应答与标准味细胞对已知味觉刺激物的细胞应答相比较，其中候选味细胞和标准味细胞对已知味觉刺激物相同的细胞应答表明候选味细胞和标准味细胞都具有对味觉刺激物的应答。
在此进一步提供了鉴定味觉调节剂的方法，该方法包括在已知味觉刺激物的存在下，将培养的味细胞暴露于候选味觉调节剂，并将该味细胞对候选味觉调节剂的一种或多种细胞应答与候选调节剂不存在下的细胞应答相比较，其中在候选味觉调节剂存在下对刺激物的细胞应答的改变表示是味觉调节剂。
从以下的详细描述和实施例将清楚本发明的其他特征和优点。
详述在此提供了供给长达1、2或3个月或更长时间的味细胞培养物的分离和培养方法，所述味细胞包括味觉感受器细胞。本发明的方法可保持高百分比的存活细胞，甚至在37℃的温度下，且结果没有减缓所有的细胞过程。
本发明的味细胞分离和/或培养方法优选包括以下步骤中的至少一个-在分离过程中，将味细胞暴露于含有和不含酶的分离溶液的时间最小化。例如，优选味细胞暴露于分离溶液的时间不超过约30分钟，优选不超过约20分钟，且最优选不超过约15分钟。例如，优选将味细胞暴露于如下所述使用的含有链霉蛋白酶E和弹性蛋白酶的分离溶液不超过约30分钟，优选不超过约20分钟，且最优选不超过约15分钟。
-用合适的涂盖物涂盖细胞培养容器。对本发明来说合适的涂盖物是引起细胞粘附和增殖的涂盖物。涂盖物优选包括胶原。涂盖物优选不包括聚-D-赖氨酸、CELL-TAKTM或MATRIGELTM。
-使用合适的培养基。对本发明来说合适的培养基是维持细胞存活、增殖和分化的培养基。用于本发明方法的优选培养基包括Iscove氏培养基、MCDB 153、FBS、胰岛素和抗生素。合适培养基的实例是含有15-20％ MCDB 153、10％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。培养基优选不选自DMEM、F12或MCDB 153，单独或含有胎牛血清(FBS)和抗生素补充物。
-在第一次更换培养基之后(例如，在24至48小时第一次更换培养基之后)，应当以不少于约5天，优选不少于约7天，且最优选不少于约8天的间隔更换培养基。
本发明的方法优选包括这些步骤中的两个或两个以上，更优选这些步骤中的三个或三个以上，且最优选包括全部四个步骤。
包括这些步骤中一个或一个以上的味细胞培养方法将在约37℃至少约10天或在约18℃至约37℃至少约20天的培养持续时间后提供至少约40％，优选至少约60％，最优选至少约75％的味细胞存活力。味细胞培养方法优选在高达约37℃的温度约1至2个月或更长时间的培养持续时间后提供至少约40％的存活力，优选至少约60％，且最优选至少约75％存活力。通过以下所述的锥虫蓝测试来测试细胞存活力。
包括全部四个步骤的分离和培养方法在约37℃至少约10天或在约18℃至37℃至少约20天的培养持续时间后达到至少约80％至约90％或更高的味细胞存活力。包括全部四个步骤的培养方法在高达37℃的温度至少约一个月的培养持续时间后优选达到至少约80％，优选约90％，更优选约95％，和更优选约98％或更高的存活力。
本发明的方法包括分离和培养哺乳动物味细胞的方法，包括i)分离舌上皮，其中将细胞暴露于含有或不含酶的分离溶液的时间最小化，ii)在用合适涂盖物有涂层的细胞培养容器中的合适细胞培养基中孵育分离的舌上皮，和iii)在第一次更换培养基之后，例如在约24-48小时，以至少约5天的间隔更换培养基。
一些优选的实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞。优选的实施方案中，味细胞只包括味觉感受器细胞。一些实施方案中，味细胞暴露于含有或不含酶的分离溶液的时间为约30分钟或更短，更优选约20分钟或更短，且最优选约15分钟或更短。一些优选的实施方案中，涂盖物是胶原。一些实施方案中，培养基更换的时间间隔是至少约7天，且优选至少约8天。
根据本发明的方法，可以将具有至少约40％存活力的细胞在高达约37℃的温度维持至少约10天，或在约18℃至约37℃至少约20天。一些实施方案中，根据本发明的方法在高达37℃的温度至少约10天或在约18至约37℃至少约20天达到至少约80％，更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％的存活力。
已经发现味细胞特别充分地粘附于有涂层的表面上。因此，本发明还提供了培养哺乳动物味细胞的方法，包括i)在有涂层的细胞培养容器中的合适细胞培养基中培养味细胞，和ii)在第一次更换培养基之后，例如在约24-48小时，以至少约5天的间隔更换培养基。
可以根据本领域已知的方法来分离根据本发明的方法培养的细胞。优选，根据在此提供的方法来分离味细胞。一些优选的实施方案中，味细胞包括味觉感受器细胞。一些优选的实施方案中，涂盖物是胶原。一些实施方案中，培养基更换的时间间隔是至少约7天，优选是至少约8天。
本发明还提供了将味细胞维持于改良的测定缓冲液中至少约6小时，优选至少约12小时，更优选至少约24小时的方法。改良的测定缓冲液具有确定的约300-320毫渗摩，优选300-310毫渗摩的摩尔渗透压浓度。可以调节测定缓冲液的摩尔渗透压浓度，例如，用5M NaCl调节。应当避免太高的摩尔渗透压，例如，高于约320毫渗摩，因为细胞开始死亡且在测定细胞对味觉刺激物的应答时对于钙成像测定不再接受测定试剂如fura-2AM(参见，例如，实施例9)。测定缓冲液具有约7.0-7.3的pH。对于改良的测定缓冲液而言优选的pH是约7.15至约7.25。作为基础缓冲液，可以使用任何合适的缓冲液。如果需要，可以调节基础缓冲液的摩尔渗透压浓度和/或pH。例如，合适的基础缓冲液是改良的MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸钠、20mM Hepes-Na，pH7.2)。当欲维持细胞用于测定目的时，维持方法是有用的。现有技术方法中没有一个能够将包括味觉感受器细胞的味细胞在缓冲液中维持相当的持续时间同时保持对味觉刺激物的反应性。
对根据本发明培养的味细胞的分析显示了它们在整个培养持续过程中保持几种功能和分子特性，培养持续时间例如为长达约一个月、两个月或三个月，或更长时间。特别地，细胞持续分裂(如通过BrdU标记所示的)并持续分化成表达味觉感受器细胞特异性标记的细胞，这些标记包括味转导素、磷脂酶C-β-2(PLC-β2)、TRPM5、T1R3和T2R5。此外，根据本发明的方法培养的味细胞保持被味觉刺激物激活的能力。例如，如通过钙成像所示的，通过一种或多种味觉刺激物激活根据本发明的方法培养的味细胞，所述味觉刺激物包括苦精(苯酸苄铵酰胺)、丁磺氨钾(6-甲基-1，2，3-噻嗪-4(3H)-酮2，2-二氧化物钾盐)、MSG(谷氨酸一钾)、放线菌酮(3-[2-(3，5-二甲基-2-氧环己基)-2-羟乙基]戊二酰亚胺)、甘氨酸和高钾缓冲液(高钾缓冲液富含钾并含有改良的改良MHNK林格溶液，该溶液含有5mM NaCl、80mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸钠和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl将其摩尔渗透压浓度调节至300-310；所有其他刺激物均从Sigma，Saint Louis，MO，USA购得)。钙成像可检测应答味觉刺激物激活的胞内钙的升高，这是几个对味觉刺激物的反应机理之一(钙从外部的进入或从内部钙储备中释放)。
本发明还提供了在细胞培养物中持续分裂超过约48小时的味细胞，包括味觉感受器细胞。根据培养的持续时间，味细胞可持续分裂超过约5天，优选超过约2周，且更优选超过约4周或更长时间。值得注意的是，现有技术方法提供了味细胞培养物，其中细胞分裂在分离后不久只持续一段短的时间或减慢得非常快以致于细胞只能存活几天。Ruiz等，2001，上文，报道了将BrdU加入到已经培养48小时的细胞中导致基本上没有被BrdU标记。按照本领域公知的，使用BrdU标记可以容易地测试细胞是否在培养物中持续分裂，例如在至少2天的培养后。根据本发明的味细胞显示出高百分比的被BrdU标记的细胞，例如，至少约30％的细胞。优选，至少约40％的细胞，更优选至少约50％的细胞，甚至更优选约60％的细胞，且最优选至少约70％的细胞是被BrdU标记的。通常，至少约60-70％的细胞是被标记的。
哺乳动物味细胞实施例中所述的分离的味蕾源自大鼠的舌头，但是根据本发明的方法也可以使用来自其他哺乳动物的材料。所有哺乳动物在味蕾中的味细胞的组构及其细胞和分子组构中都有高度的相似性。因此，也可以分离和/或长期培养其他哺乳动物的味细胞，而具有相似的存活力。例如，可以使用的常见研究动物是啮齿动物，包括，例如，大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠。可以使用的其他哺乳动物包括，例如牛科动物、猪、狗、猫和灵长类(例如，猿、猴子、人)。
味细胞分离的方法倘若使用酶和分离溶液的孵育时间较短的话，可以按照本领域公知的进行用于分离舌上皮组织和味蕾的分离方法。最初的方法由Spielman等描述，1989，Brain Research 503326-29。对这种方法的各种改进是已知的，例如Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25，Stone等，2002，Chem.Senses 27779-87，和Ruiz等，2001，Chem.Senses 26(7)861-73所述的。
根据本发明的分离过程涉及足够短的在分离溶液中孵育和用蛋白水解酶孵育的孵育期，以便达到所需的培养和细胞存活力的持续时间，这可以如在此所述的容易地测试。优选，使用分离溶液和蛋白水解酶的孵育持续时间是约30分钟或更短，优选约20分钟或更短，且更优选约15分钟或更短。本发明使用没有酶的单纯分离溶液孵育约2至约15分钟，优选在冰上，向其中加入一种或多种蛋白水解酶并孵育约10至约15分钟。
根据本发明的分离方法中所用的优选酶是水解蛋白质的蛋白酶，足以在不超过约30分钟的短时间段内分离味细胞，使得可以分离细胞而不损害它们的粘附、生长和分化的能力。合适的水解酶是，例如，链霉蛋白酶E和/或弹性蛋白酶。优选，使用多于一种的酶。例如，链霉蛋白酶E和弹性蛋白酶的组合可以用于本发明的分离方法中。链霉蛋白酶E是来自灰色链霉菌(Streptomcyes griseus)的非特异性蛋白酶混合物且是可购得的，例如，可得自Sigma，Saint Louis，MO，USA。弹性蛋白酶，例如I型猪胰腺弹性蛋白酶(同义词胰腺肽酶E，猪胰腺弹性蛋白酶、CAS编号39445-21-1；酶委员会(EC)编号3.4.21.36)，水解蛋白质包括具有优先切割位点Ala-Xaa的弹性蛋白，且从Sigma，Saint Louis，MO，USA可购得(例如水性悬浮液中的1mg/ml弹性蛋白酶，4单位/mg蛋白，产品编号为E1250)。
另外，可以按照本领域公知的和例如Baumstark等(Baumstark等，1963，Biochim.Biophys.Acta 676；和Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”(分子克隆，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory)所述的克隆并表达所述的酶。
优选在分离后将舌上皮切碎。优选，在将从味蕾区(轮廓状、叶状和菌状乳头中的一种或多种)分离的上皮转移至含有培养基的培养容器中后，使用合适的工具例如外科手术刀片将分离的上皮切碎，来提供包含完整味蕾以及部分切开的味蕾的混合物。源自这样的混合物的原代细胞培养物易于及时提供可以保持较长时间段的细胞培养物，这可能是由于更好的粘附和/或更长时间段的存活和/或生长所致。
味细胞的培养方法本发明方法中使用的合适培养基将维持味细胞的存活力、增殖和分化。用于本发明方法的培养基优选包括Iscove氏培养基，优选补充了MCDB 153培养基、FBS、胰岛素和抗生素中的一种或多种。例如，用于细胞培养的优选培养基是Iscove氏培养基，优选补充了15-20％MCDB 153培养基、5-20％ FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素中的一种或多种。合适的FBS浓度是10％。合适的抗生素组合是，例如，青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B。合适的浓度是100U/ml/100μg/ml青霉素/链霉素，2.5μg/ml庆大霉素和0.5μg/ml两性霉素B。
Iscove氏培养基是改良自Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)的高富集合成培养基，并含有亚硒酸钠、附加的氨基酸和维生素、丙酮酸钠、HEPES缓冲液和替代硝酸铁的硝酸钾。Iscove氏培养基例如以“Iscove氏Modification of DMEM”从Cellgro，Mediatech Inc，Herndon，VA，USA可购得(产品编号为10-016)。
MCDB 153培养基，例如含有L-谷氨酰胺和28mM HEPES，不含有碳酸氢钠，是对Ham氏营养混合物F-12的改良，并且是为无血清生长设计的高富集培养基并使用激素、生长因子、微量元素或低水平的渗析的胎牛血清蛋白。MCDB 153从Sigma，Saint Louis，MO，USA可购得(产品编号为M7403)。
用于细胞培养的合适温度是允许细胞生长和所需速率的细胞过程的任何温度，例如，约18℃至约37℃，包括室温(18-22℃)和约37℃，例如35至39℃。优选的温度是37℃，这是生理温度并提供通常速率的细胞过程。例如在约37℃培养细胞时，温度将随着时间略有改变，在约37℃的平均值上下，例如±0.5或1℃波动，这将取决于细胞培养系统，这是本领域技术人员清楚的。
在含有合适CO2浓度和合适湿度的合适环境中进行细胞培养，这是本领域技术人员清楚的。例如，根据选定培养基的缓冲系统，约5％的CO2浓度是合适的。通常在高湿度，例如约95％的条件下培养细胞。细胞培养容器，例如培养皿或盖玻片，根据本发明，优选使用胶原，更优选I型胶原，且最优选鼠尾1型胶原涂盖。
在例如接种后约24-48小时可以进行第一次培养基更换，此后，以不短于至少约5天，优选至少约7天，最优选至少约8天的间隔来进行随后的培养基更换。根据培养条件、选定的培养基、抗生素的浓度和生长速率，通常应当在大约10天后更换培养基。
本领域中已知的任何方法都可以用于测定细胞存活力。例如，可以使用锥虫蓝染色(Sigma，Saint Louis，MO，USA)。可以如下测试存活力将锥虫蓝(Sigma，Saint Louis，MO，USA)直接加入到培养容器的细胞培养基中来获得0.2％(w/v)锥虫蓝的浓度。锥虫蓝将死细胞的细胞核染成蓝色。5至10分钟后，在相差显微镜下以10x放大倍数使用目镜网格来计数100个细胞。以百分比来确定存活力(计数的活细胞除以计数的总细胞，乘以100)。用2-3个盖玻片重复该程序并确定平均值。不同盖玻片之间的差异通常很低。细胞培养物至少约80％是活的，更优选至少约80％是活的，更优选至少约90％是活的，更优选至少约95％，甚至更优选至少约98％，且甚至更优选至少约99％是活的。
味细胞测定根据本发明的方法和味细胞可以用于本领域已知的测定方法中来鉴定引发味细胞中应答的候选刺激物或化合物，包括呈味物质、味觉调节剂(包括提高、遏抑、刺激或抑制味觉的刺激物，或影响特定味质的刺激物)，和引发味细胞中特定应答或效应的其他候选刺激物或化合物。例如，这些测定可以用于鉴定和评价候选物的味觉、味质、味觉调节、生长促进、抑制或毒性作用。此外，它们可以用于鉴定治疗味觉丧失的候选物、用于药物研发的靶和维持健康味细胞所需要的营养因子。通常，这样的测定包括将目标候选物或候选物混合物的至少一种类型的细胞应答(例如，与钙浓度相关的荧光信号)与标准相比较。
候选刺激物或化合物可以是，例如，候选呈味物质或呈味物质存在下的候选味觉调节剂。标准的刺激物或化合物可以是已知的味觉刺激物或已知味质的呈味物质，或能够引发对味细胞的特定作用的刺激物/化合物。这样的作用可以是生长促进、抑制或毒性作用，或丧失对味觉刺激物的应答，维持细胞生长或味细胞的健康。如果要比较不同味细胞，例如，不同来源(物种、个体、年龄等)的味细胞的应答差异，候选物和标准可以是相同的(例如，已知的呈味物质)。
将根据本发明的包括味觉感受器细胞的味细胞暴露于候选物和标准，并比较产生可测量信号的细胞应答。可以按照本领域公知的连续地或平行地进行暴露。可以一起测试几种刺激物或化合物。
不同的细胞应答是本领域公知的并包括钙浓度、pH和电压的改变。应答的改变可以包括大小、反应时间(定义为介于刺激物暴露与应答之间的时间)或持续时间的改变。通过本领域公知的检测方法来检测这些改变，包括对钙或pH敏感的荧光化合物，电压敏感染料(例如，Hayashi等，1996，Biophys J.，71(2)1057-70所述的)和电生理学记录(例如，如Ogura等，J Neurosci.1997年5月15日；17(10)3580-7，和Zviman MM等，J Membr Biol.1996年1月；149(2)81-8所述的)。
存在多种特定的测定类型，并且本领域技术人员清楚怎样详细地建立它们。例如，可以按照Frank ME所述的，“Taste nerve recordingin rodents”(啮齿动物中的味觉神经记录)来进行测定，在“Experimental cell biology of taste and olfaction”(味觉和嗅觉的实验细胞生物学)，A.Spielman和J.Brand编辑，CRC出版社，1995；Bryant，BP.“Trigeminal nerve recording in rodents”(啮齿动物中的三叉神经记录)，A.Spielman和J.Brand编辑，CRC出版社，1995；Gilbertson TA，“Patch-clamping of taste cellsin hamster and rat”(仓鼠和大鼠中味细胞的膜片钳术”)，A.Spielman和J.Brand编辑，CRC出版社，1995。
在此提供了一些功能测定的概述。
呈味物质鉴定/表征测定将味细胞对未知味质的候选物的应答与对已知呈味物质的应答相比较来鉴定细胞应答的差异或相似。通过它们对已知呈味物质的应答来鉴定味细胞，例如，如实施例8中所述的或使用本领域技术人员已知的可比较的细胞应答测定。监控对候选物的细胞应答并与相同细胞对呈味物质的细胞应答相比较。
调节剂(味觉调节剂)测定比较在候选调节剂(例如，味觉调节剂)存在或不存在下对已知刺激物(例如，已知呈味物质)的味细胞应答。检测并比较细胞应答。比较可以显示出应答得到了提高、降低、延迟、延长或未受到影响。引起对刺激物的细胞应答大小的增大或对刺激物的细胞应答频率的增加的候选调节剂表明该候选调节剂可用于增强刺激物(例如，呈味物质)的强度，和可以用于加入到某些产品如食品中，来增强给定的刺激物(例如，味觉刺激物/食用香料)。引起较短反应时间或较长应答持续时间应答的刺激物或化合物表明提高的强度或改变的品质。
提高的味觉强度或较快或更长时间的味知觉的发现将刺激物或化合物鉴定为味觉增强剂，可以将其加入到食品中来增强食品的口味。将导致对靶刺激物减小的应答大小、较慢的反应时间或较短的应答持续时间的候选调节剂鉴定为用作靶刺激物的遮掩、封闭或抑制剂。如果结果显示在候选调节剂存在与不存在下对靶刺激物的应答没有差异，该化合物就不是靶刺激物的调节剂。
不同测试对象中味细胞应答差异的测定比较源自不同来源的味细胞对给定刺激物(例如，已知呈味物质，已知呈味物质和味觉调节剂)的应答。通过使用这些测定，可以确定根据不同培养物、个体、物种或与年龄、遗传组成、代谢或营养状况、疾病状态、药物使用和治疗性处理的不同联系起来选择的不同来源的味细胞之间对刺激物或呈味物质的细胞应答是否不同。
鉴定的差异使得可以开发改良的以食用香料和食用香味为目标的味觉系统，例如，用于食品，使所述系统适应特定物种、群体或个体的需要。例如，在源自老年相对年轻受试者的细胞中对特定刺激物降低的反应性可鉴定出必要的刺激物浓度的提高/降低来改善消费者的食欲品质，这将取决于打算供其食用该产品的消费者群的年龄。可以在不同物种中鉴定在一个物种中已知其活性的味觉调节剂的功效来鉴定在目标物种中有效的味觉刺激物。
涉及不同细胞参数的基于味细胞的细胞应答的测定测量的参数包括如上详述的应答差异、对味觉刺激物的应答频率或如实施例中所述的特定的细胞参数，包括细胞的增殖速率、与味觉或味细胞再生(增殖、分化、存活)相关的蛋白标记的表达等等。
可以通过比较在候选化合物存在和不存在下的味细胞应答来鉴定影响味细胞再生、修复、增殖、分化、存活和置换的可以用作治疗药物的候选化合物。可以在体内或体外使细胞暴露于候选化合物。
可以通过以下本领域公知的一种或多种方法来进一步证实通过上述测定鉴定的候选刺激物或化合物。这些方法包括对测试对象的行为测试、感官测试、信号转导测试、生理学方法(例如，神经记录)，如例如Spielman A.I.，和Brand，J.G.(编辑)，“Experimental cellBiology of Taste and Olfaction”(味觉和嗅觉的实验细胞生物学)，CRC出版社，Boca Raton，FL，pp.437，1995和Doty，R.L.(编辑)Handbook of Olfaction and Gustation(嗅觉和味觉手册)，第2版，N.Y.Marcel Dekker，2003，1150pp所述。
通过使用根据本发明的味细胞的测定法鉴定的刺激物或化合物可以加入到食品中。“食品”意思是包括置于口腔中的所有产品，包括药物、漱口水和其他口腔健康和卫生产品。它进一步包括宠物食品。
转染方法本发明第一次提供了转染的培养的味细胞。在另一方面中，本发明因此涉及例如通过质粒载体转染的培养的味细胞，优选根据本发明培养的味细胞，和涉及产生这样的细胞的方法，例如通过转染，例如，通过使用质粒载体。
可以使用用于转染真核细胞的标准方法来转染根据本发明的方法培养的味细胞，包括味细胞和味觉感受器细胞，例如以下所述的方法，Murray，EJ，编辑(1990)，Gene Transfer and Expression ProtocolsMethods in Moplecular Biology(基因转移和表达方案分子生物学方法)，Vol.7，Humana Press，Clifton，New Jersey；Perkus ME等，(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1572)；Felgner，J.等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1563)。或者，可以使用FuGene 6转染试剂(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)来转染所述细胞，如实施例10中对于含有报道基因的表达载体所示的。还可以按照本领域公知的使用已知的病毒转染方法来通过病毒转染根据本发明的味细胞。使用病毒将遗传物质引入味细胞的方法是已知的(Kishi等，2001，Neuroscience 106(1)217-25；Stone等，2002，Chem.Senses27779-87)。
质粒载体转染方案具有避免复杂的病毒处理的优点。使用质粒载体可以成功地转染根据本发明的味细胞，而具有良好的转染效率，从转染的蛋白质(如绿色荧光蛋白)产生容易目视的荧光信号。使用根据本发明的培养的细胞，良好的转染效率可以是至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约50％。优选，使用培养了至少约5天或更长时间(例如，至少约7天，至少约2周，至少约3周，至少约4周，和至少约2个月)的细胞。
以下实施例更详细地描述了本发明实施方案的几个方面。提供这些实施例来进一步说明，而不是限制在此所述的本发明的各方面。
实施例实施例1从大鼠味蕾(轮廓状、叶状)分离包括味觉感受器细胞的味细胞和细胞培养所用的大鼠是1-2个月大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。通过CO2吸入接着颈部脱位来处死大鼠。解剖接近于轮廓乳头的舌头并立即放入冰上的冷分离溶液(26mM NaHCO3、2.5mM NaH2PO4、20mM葡萄糖、65mM NaCl、20mM KCl和1mM EDTA)中，持续5至10分钟。
从冰中取出标本并将约1ml的分离溶液与1.5mg/ml链霉蛋白酶E(来自灰色链霉菌的蛋白酶，从Sigma，St.Louis，MO，USA可购得，产品编号为P6911，具有5.5单位/mg固体的活性。单位定义1单位在pH7.5，37℃下每分钟水解酪蛋白产生相当于1.0微摩尔(181微克)酪氨酸的颜色)和1mg/ml弹性蛋白酶(也称为I型猪胰腺弹性蛋白酶，CAS编号39445-21-1，从Sigma，St.Louis，MO，USA可购得，产品编号为E1250，含有4单位/mg蛋白的水性悬浮液)混合。
用25号的NORM-JECT注射器将所得的含有酶的溶液均匀地注射至解剖的舌头的轮廓状和叶状乳头的舌上皮下面或周围，使其增大到正常大小的约两倍。将含有酶溶液的解剖的舌头放入冷的分离溶液中并在室温孵育15分钟。
在酶孵育后，在解剖显微镜(Stereomaster，Fischer Scientific，Pittsburgh，PA)下将上皮轻轻地从下面的肌肉层上剥离并浸泡在分离溶液中。从轮廓状和叶状乳头区分离上皮并将其转移至培养基中。
使用以下的培养基-Iscove氏培养基(来自Mediatech Inc，Herndon，VA，USA的CELLGRO“Iscove氏Modification of DMEM”，产品编号为10-016)，含有10％胎牛血清(BTI，MA，USA)、15-20％ MCDB 153培养基(Sigma，St.Louis，MO，USA)、10ng/ml胰岛素和抗生素(100U/ml/100μg/ml青霉素/链霉素，2.5μg/ml庆大霉素和0.5μg/ml两性霉素B)。
-含或不含10％FBS的Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)(Gibco BRL，NY，USA；Cellgro，USA)-MCDB153(Sigma，St.Louis，MO，USA)在培养基中，用外科手术剪刀将从轮廓状和叶状乳头区分离的上皮剪成小片，使得存在完整的味蕾和部分切开的味蕾。将上皮的碎片接种于选定的培养皿或盖玻片上。所用的不同培养皿或盖玻片是-鼠尾1型胶原涂盖的(1∶4稀释于水中的3.96mg/ml，BDSciences，San Diego，CA)18mm圆形玻璃盖玻片(Fisher，USA)；-没有涂层的聚苯乙烯培养皿；
-没有涂层的玻璃盖玻片；-涂盖了基质凝胶(2ml/l，ATCC，USA)的玻璃盖玻片。从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(ATCC，USA，产品编号为CRL-2108)制得基质溶液。如下以三种变化形式来使用基质凝胶在接种之前将细胞包埋于基质凝胶内并轻轻地施加于盖玻片上；用基质凝胶涂盖盖玻片并将细胞接种于聚合的基质凝胶上；将细胞接种于基质凝胶上，同时凝胶聚合；-涂盖了聚-D-赖氨酸(Sigma，St.Louis，MO，USA，产品编号为P-6407，最终工作浓度为0.1mg/ml)的玻璃盖玻片。
在涂盖或使用之前，如下处理盖玻片在2M NaOH中孵育1小时并在70％硝酸(HNO3)中孵育过夜，接着在HCl酸洗液中孵育1小时。然后将盖玻片在水中高压灭菌，用70％乙醇和100％乙醇冲洗，并进行空气干燥。
将培养皿或盖玻片在37℃在含有5％CO2的湿润环境(95％湿度)中孵育。在24-48小时后更换培养基，此后每5-10天更换一次。
在过夜培养后使用显微镜(10x)监控细胞的粘着。
通过用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，MO，USA)染色来测定细胞的存活力。以0.2％(w/v)的浓度将锥虫蓝加入到培养皿中。5至10分钟后，在相差显微镜下以10x放大倍数使用目镜网格来计数100个细胞。通过在相差显微镜下观察染上蓝色的核来识别死细胞。拍照细胞培养皿或盖玻片的某一个区域并通过计数每2-3个盖玻片的100个细胞来确定细胞的存活力(用计数的存活细胞除以计数的总细胞，乘以100)。
结果在整个培养过程中监控细胞并在使用根据本发明的分离方法、胶原涂盖的培养表面和Iscove氏培养基保持时显示出以下的特征单个细胞和味蕾类型的细胞在平板培养后24-48小时是活的。细胞以贴壁细胞和细胞簇的形式生长达长7-8天。第5-7天后，产生子细胞的细胞簇开始分离。细胞维持它们的原始形状长达15-20天。第15-20天后，部分细胞群开始改变形态，不过细胞仍保持它们的紧密的外观，保持圆形细胞体，具有或不具有一个或多个过程。20天后，大部分长期培养的细胞获得较扁平的外观。细胞维持高存活力长达3周，具有至少95％存活力，在大部分培养皿中，为至少98％至99％存活力。
当使用另一种分离方案或没有胶原的不同细胞培养表面时，细胞没有附着，或如果培养它们，则最迟在2周时死细胞的数量快速增加。
在过夜培养后测定细胞附着的百分比。当如上所述分离细胞，将其接种于胶原涂盖的盖玻片上，并在Iscove氏培养基+20％ MCDB153+10％FBS+10ng/ml胰岛素+抗生素(青霉素/链霉素+庆大霉素+两性霉素B)中培养时，细胞显示出过夜孵育(12-16小时)后15-20％的细胞附着率。7天后，发现至少90％细胞是活的。2个月后，细胞仍然是至少90％活的。
表1培养皿/盖玻片表面(用根据本发明的改良方案分离并在Iscove氏培养基中培养的细胞)
表2组织培养基(用根据本发明的改良方案分离并接种于胶原涂盖的盖玻片上的细胞)
使用所示的酶，在最佳化的表面上分离并且使用最佳化的培养基，将味细胞维持至少长达2个月，长达3个月，且可能更长时间。头3至4周，味细胞维持接近约98至99％的存活力，如如上所述使用锥虫蓝所测试的。在2个月后和3个月时，味细胞仍然维持约95％的存活力和部分细胞增殖。
实施例2通过BrdU标记所示的包括味觉感受器细胞的味细胞的增殖为了确定原代细胞培养物是否含有增殖性细胞，如下所述对长达11天的培养物进行5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺入。
发现用BrdU标记了60-70％的味细胞，这显示出通过实施例1的方案分离并按照以下详述的培养时，味细胞在至少长达11天的培养持续时间后持续增殖。
按照实施例1中所述的从大鼠分离味细胞并接种于胶原涂盖的盖玻片中。将细胞培养5-6天，然后用50μM溶解于10mM DMSO中的BrdU(Sigma，Saint Louis，MO，USA)处理24-48小时，此后用Iscove氏培养基+20％ MCDB 153+10％FBS+10ng/ml胰岛素+抗生素(青霉素/链霉素+庆大霉素+两性霉素B)替换培养基来除去BrdU。将细胞在盖玻片上的培养物中再维持3天，然后用0.1M PB(pH7.2)中的4％低聚甲醛在室温固定10分钟。固定后，通过免疫组织化学分析细胞中的BrdU掺入。固定后，将盖玻片在0.1M PBS(pH7.2)中洗涤三次(每次5分钟)，并用H2O2溶液(4mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.5mL 100％甲醇+0.5mL 30％ H2O2)在室温处理20分钟来封闭内源性过氧化物酶。然后，用PBS漂洗盖玻片，然后用2N HCl在37℃变性30分钟。变性后，用PBS洗涤盖玻片，并用PBS中的封闭缓冲液(SuperBlock，Pierce Chemical Company，Rockford，IL)在室温孵育1小时来降低非特异性结合。然后在4℃将盖玻片与稀释于含有0.05％吐温20的10％ SuperBlock中的小鼠抗-BrdU(1∶100稀释的，Sigma，Saint Louis，MO，USA B-2531)一起孵育过夜。在PBS中洗涤三次后，在室温将盖玻片与稀释于含有0.05％吐温20的10％ SuperBlock中的FITC缀合的抗小鼠IgG(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)一起孵育1小时。然后，将盖玻片在PBS中洗涤三次，每次5分钟，并在水中洗涤三次，每次10分钟。最后，用封固剂(Vectashield，或含有DAPI的Vectashield，Vector Labs，USA)封固盖玻片。
作为阴性对照，使用小鼠IgG对照血清代替初次抗体来排除抗-BrdU抗体的BrdU非特异性染色。作为进一步的证实，用抗-BrdU抗体将未标记的细胞染色。这些对照中没有一个显示出任何与BrdU相关的特异性染色，且发现味细胞的BrdU染色是特异性的。
实施例3通过RT-PCR分析味细胞特异性标记的表达对如实施例1中所述的分离并培养的味细胞进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析，如实施例1中所述的根据快速分离方法分离并在胶原涂盖的培养皿上和在改良的Iscove氏培养基中培养所述味细胞。
通过RT-PCR分析以下的味细胞特异性标记味转导素、PLC-β-2(PLC-β2)、TRPM5、T1R3和T2R5。将β-肌动蛋白(管家基因)用作阳性对照。
从培养7-10天的味细胞、培养2个月的味细胞和作为阳性对照从大鼠舌上皮分离总RNA。如下所述将RNA分离、逆转录并通过PCR扩增。在所有样品(培养7-10天、2个月的味细胞和大鼠舌上皮)中，检测预期大小的扩增产物。这显示出即使在培养2个月后，培养的味细胞仍持续表达味细胞特异性标记的mRNA。
用于RNA-分离、逆转录和PCR扩增的方案按照本领域公知的，例如根据制造商的说明，用TRIZOL试剂(Invitrogen Corp，USA)提取每种样品。或者，可以按照Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”(分子克隆，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory所述的分离、逆转录和扩增RNA。
在42℃使用用于RT-PCR的SUPERSCRIPT第一链合成系统(Invitrogen Corp.，USA)将总共20μl体积的4μg RNA逆转录90分钟。作为检查基因组DNA污染的阴性对照，在逆转录酶存在和不存在下平行处理RNA样品并用于PCR。之后通过PCR扩增对基因组DNA污染的测试显示出不存在基因组DNA污染。以下列出了用来显示味转导素、PLC-β2、β-肌动蛋白、T2R3、T1R5和TRPM5表达的已知特定引物。
选择跨越一个或多个内含子的引物以排除与来自基因组DNA的扩增片段的混淆并确保靶特异性产物的产生。之前公开了味转导素、PLC-β2和β-肌动蛋白的引物，例如在Rossler等，2000，ChemicalSenses 25413-421。之前Heiner等，2003，Biochem.J.3711045-1053公开了TRPM5。所示的第一个引物是正向引物，第二个是反向引物。
味转导素5’-gat gct agc caa tcc gag aag tag aga gg-3’(SEQ ID NO1)5’-cgg aga tct gct gtt gaa gag gtg aag ac-3’(SEQID NO2)PLC-β25’-ctg gag gct gaa gta aag gag-3’(SEQ ID NO3)5’-gcc cct gca tgt atg tta gg-3’(SEQ ID NO4)β-肌动蛋白5’-tca tgt ttg aga cct tca a-3’(SEQ ID NO5)5’-gtc tt gcg gat gtc cac g-3’(SEQ ID NO；6)T2R55’-tgg caa atc cac atg aag aa-3’(SEQ ID NO7)5’-gca ggg ata gag gaa tgc aa-3’(SEQ ID NO8)T1R35’-gat cag tgg tcc cca gaa aa-3’(SEQ ID NO9)5’-taa gct agc atg gcg aag gt-3’(SEQ ID NO10)TRPM55’-caa gat cat cgt ggt aga gc-3’(SEQ ID NO11)5’-tcc aga aca tgt ctg cgt tg-3’(SEQ ID NO12)在含有2μl RT反应物、1×Ampli Taq Gold PCR缓冲液、2.5mM MgCl2、1mM脱氧核苷三磷酸、0.4μM每种引物和0.25U/μl Ampli TagGold聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)的50μl终体积中进行每个RT反应的cDNA的PCR扩增。PCR扩增包括最初95℃5分钟的变性，接着是94℃变性30秒、55℃退火45秒和72℃延伸30秒的循环。40个扩增循环后，在72℃最后延伸10分钟。将PCR产物在1.4％琼脂糖凝胶上分离并用0.2μg/ml溴化乙锭染色来证实它们预期的大小。
实施例4味觉感受器细胞特异性生物标记味转导素、PLC-β2和BrdU的免疫组织化学定位α-味转导素和PLC-β2是分化的应答味觉刺激物的味觉感受器细胞的已知生物标记。BrdU是细胞增殖的一般标记。对如实施例1中所述的分离并培养的味细胞进行免疫细胞化学，按照实施例1中所述的根据快速分离方法分离并在胶原涂盖的培养皿上和在改良的Iscove氏培养基中培养所述味细胞。将分析的味细胞培养7-10天，或2个月，并按照以下方案中所述的测试它们对α-味转导素、PLC-β2和BrdU的免疫反应性。通过使用检测非特异性结合的抗体特异性免疫球蛋白来证实抗体特异性。用抗体特异性免疫球蛋白的免疫染色证明了不存在非特异性免疫染色。
在7-10天和2个月的培养物中都观察到了α-味转导素和PLC-β2的免疫反应性，具有相似的表达模式，即，它们在相似形态的细胞中表达。
免疫反应性的方案使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2，PB)中的4％低聚甲醛在室温固定接种于胶原涂盖的盖玻片上的细胞10分钟。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中三次洗涤步骤(每次持续10分钟)后，用0.1M PBS中的0.3％曲通X-100、2％正常山羊血清和1％牛血清白蛋白封闭盖玻片1小时，接着在PBS中再洗三次。将稀释于封闭溶液中的初次抗体添加至盖玻片上并在+4℃孵育过夜。所用的初次抗体是多克隆兔子抗-味转导素(稀释度1∶500-1∶1000)和多克隆兔子抗-PLC-β2(稀释度1∶1000，Santa Cruz Biotechnology)。然后将盖玻片在PBS中洗涤并在黑暗中与稀释于封闭缓冲液中的ALEXA FLUOR 488抗小鼠(1∶500，Molecular Probes Inc.)或ALEXA FLUOR 633抗兔子(1∶500，Molecular Probes Inc.)在室温反应1小时。最终PBS和水洗涤后，用VECTORSHIELD封固盖玻片。
以相似的方式进行全部双免疫标记研究，所不同的是在完成第一个初次抗体抗-BrdU的检测后引入第二个初次抗体、抗-味转导素或抗-PLC-β2。免疫荧光显微镜的对照包括省略初次抗血清，且在这些条件下没有看到免疫反应性。
实施例5味转导素、PLC-β2和BrdU平行的免疫组织化学定位通过用味转导素、PLC-β2和BrdU的双标记来平行分析已经在体外增殖的细胞和味细胞特异性生物标记表达之间的相关性。按照实施例4中所述的进行实验，每个实验平行使用三个生物标记中的两个。
培养7-10天和2个月的味细胞呈现出分化的味细胞(味转导素、PLC-β2)以及增殖(后者通过BrdU染色来显示)特异性标记的表达。通过使用味转导素或PLC-β2，各自结合BrdU的双标记来进行实验。尽管一些细胞显示出只有一种标记(BrdU、味转导素或PLC-β2)的信号，但是大部分细胞平行显示出两种标记(味转导素和BrdU，PLC-β2和BrdU)的信号。这显示出细胞已经在体外增殖并分化成味细胞。
实施例6共焦成像用Leica TCS SP2光谱共焦显微镜(LEICA Microsystems Inc.，Mannheim，Germany)，使用UV、铔和氦氖(HeNe)激光器捕获荧光图像。在HC PL APO CS 20.0x(0.070NA)物镜下观察盖玻片。所用的激发波长对DAPI为405nm，而对ALEXA FLUOR 488为488nm，对ALEXA FLUOR 633为633nm，在合适的波长下检测发射。对于所用的物镜，将针孔直径设定在爱里斑(Airy disc)的第一个最小直径处，获得对于荧光焦平面可接受的z-轴分辨率。调节激光束的功率和光电倍增管的增益来优化信噪比。对于一些双标记实验，使用每个波长的顺序获取，并且当与同时扫描相比较时未显示出超越该波长的信号渗漏或差异。使用LEICA Scanware软件来获取以1024×1024像素格式单向扫描的共焦图像，具有2行加3帧平均值。在20x物镜下使用计算机控制的数码连续变焦系统来增大放大倍数至最大的2.5X。使用LCS软件(LEICA Microsystems Inc.)来整理数字图像并调节对比度和亮度。
实施例7通过蛋白质印迹分析的味觉感受器细胞特异性标记的表达对于培养的味细胞的味转导素和PLC-β2表达，根据以下所述的方案使用蛋白质印迹。
将测试的培养的味细胞按照实施例1中所述培养1周和2个月，按照实施例1中所述的在根据本发明改良的含有Iscove氏培养基的胶原涂盖的培养皿上进行培养。
测试这些细胞中的分化味细胞特异性生物标记味转导素和PLC-β2的表达。作为阳性对照，使用从新鲜分离的大鼠舌叶状和轮廓状组织裂解物的样品。在所有样品中均显示出味转导素和PCL-β2表达。对于PLC-β2，使用抗PLC-β2抗体，显示出之前已经报道过的两个不同的条带(Wei和Neer 2001，J.Biological Chemistry 276，pp.2503-2508)。对于两种生物标记，阳性对照与培养的细胞相比较具有较强的信号和表达水平。在培养1周或2个月的细胞之间，不存在信号水平的差异。按照实施例1中所述的分离和培养的味细胞维持它们的特异性生物标记至少2个月。
使用本领域公知的标准免疫印迹技术，例如，Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A laboratory Manual”(分子克隆，实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory所述的方法进行蛋白质印迹。
将培养的大鼠初级味细胞(培养7-10天和1-2个月的)裂解，并将来自大鼠轮廓和叶状乳头的组织样品在含有蛋白酶抑制剂(104mMAEBSF，80μM抑肽酶，2mM亮抑肽酶、4mM抑氨肽酶素b和1.5mM抑肽素A)的RIPA缓冲液(150mM NaCl、10mM Tris pH7.2、0.1％ SDS、1％曲通X-100、1％脱氧胆酸盐、5mM EDTA)中均质化。按照本领域公知的，例如，根据制造商的方案，使用Bio-Rad Dc蛋白质估算试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)估算每种样品的蛋白质浓度。将蛋白质样品与含有β-巯基乙醇的SDS加样缓冲液混合，煮沸5分钟，然后置于冰上5分钟。通过SDS-聚丙烯酰胺(5-15％)梯度凝胶(Bio-Rad Labs)电泳分离细胞匀浆并将其转移至PVDF膜(Bio-RadLabs)上，用1％脱脂奶粉在4℃孵育过夜。使用多克隆兔子抗-味转导素(抗体味转导素I-20，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，产品编号为sc-395)(稀释度1∶1000)和多克隆兔子抗-PLC-β2(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(稀释度1∶1000)来鉴定味细胞。用这些初次抗体在室温孵育1.5小时后，将膜洗涤和漂洗3次，每次在含有0.05％吐温20的0.1M磷酸盐缓冲液(“PBS/T”)中孵育15分钟，在室温下与HRP缀合的二次抗兔子抗体(稀释度1∶5000，NA 934，Amersham)反应1小时。将膜洗涤和漂洗3次，每次在大量的PBS/T中孵育15分钟。按照本领域公知的，例如，根据制造商的说明，用增强化学发光(ECL)免疫印迹检测系统(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)来检测信号。之后用扫描仪扫描X-射线膜，用于分析。
实施例8通过Ca-成像测定的味细胞对不同味觉刺激物的应答将使用的味细胞按照实施例1中所述的分离并在1型鼠尾胶原涂盖的盖玻片上培养1周或2个月。
如下进行Ca-成像。在补充了1mM Fura-2AM(Molecular ProbesInc.，Eugene，OR)和20mg/ml PLURONIC F127(Molecular ProbesInc.)的改良MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mMCaCl2、1mM丙酮酸钠和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl将摩尔渗透压浓度调节至300-310)中将盖玻片与钙敏感性染料一起孵育15-30分钟。钙敏感性染料fura-2AM分裂成fura-2，其是荧光的并且可以得到检测。
孵育后，将盖玻片置于记录室中并用用作表面灌流液的改良MHNK林格溶液连续浸泡。
将刺激物(苯酸苄铵酰胺2mM和0.5mM，丁磺氨钾250ppm，谷氨酸一钠(MSG)3mM，放线菌酮25μM，甘氨酸125mM，和高钾缓冲液(改良的改良MHNK林格溶液，含有5mM NaCl、80mM KCl、1mM MgCl2、lmM CaCl2、1mM丙酮酸钠和20mM Hepes-Na，pH7.2，用5M NaCl将摩尔渗透压浓度调节至300-310)施加至盖玻片，通过将表面灌流液改换成刺激物溶液来进行，这使得在10秒钟内将记录室内的浸泡溶液完全更换。
使用Restrepo D.，M.Zviman和N.E.Rawson所述的标准成像技术(“The measurement of intracellular calcium in chemosensorycells”(化学感受细胞中胞内钙的测量)，在Methods in ChemosensoryResearch(化学感受研究中的方法)，A.Spielman和J.Brand编辑，CRC出版社，1995)来进行钙成像记录。通过连接显微镜的LSRSPECTRAMASTER单色仪提供照明。将200x放大倍数下细胞中fura-2发射的光在510nm处过滤并用冷却的CCD相机(Olympix，Perkin ElmerLife Sciences，Bethesda MD)记录。使用宽带滤波器，激发波长是340-380nm，发射波长是510nm。使用Merlin成像工作站(PerkinElmer Life Sciences，Bethesda MD)将图像数字化，该工作站控制照明器、相机和获取，并进行图像压缩和伪彩色图像的展示。引入记录设置后，细胞保持存活超过2天并每次可以连续成像2小时而没有染料褪色的显著效应。
将刺激物稀释于改良MHNK林格溶液中并通过自流式表面灌注装置施加约10-60秒，这取决于刺激物。如通过对所选的至少一个细胞的Fura-2AM阳性信号所示的，可以用所有测试的刺激物来刺激细胞。通常测试几个细胞。
实施例9用于测定的改良缓冲液中味细胞的维持使用的培养的味细胞和实施例8中所述的一样。将盖玻片上培养的味细胞在室温(22-25℃)在培养箱外在改良的测定缓冲液中孵育过夜。改良的测定缓冲液是改良MHNK林格溶液(80mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM丙酮酸钠和20mM Hepes-Na，pH7.2)，用5M NaCl将摩尔渗透压浓度调节至300-310。
在该测定缓冲液中和在以上孵育条件下，将细胞维持长达24小时并且仍然应答刺激物(比较实施例10中所用的刺激物)，如通过阳性Fura-2AM信号所测定的(按照实施例8中所述的进行)。与检查前24小时相比较，细胞显示出相同的结果。当暴露于320或更高的较高摩尔渗透压浓度时，细胞死亡且没有被fura-2AM染色。这种测定缓冲液中原代味细胞培养物的维持对于测定来说是有用的。
实施例10培养的味细胞的转染在分离后第5-7天用5-8μg pGFP2-MCS-Rluc(h)表达载体(BioSignal Packard，Montreal，Canada，产品编号为6310051)和FuGene 6转染试剂(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)根据Roche Diaguostics“FuGene 6转染试剂”说明手册，版本5，2000年9月，来转染按照实施例1所述分离的在胶原涂盖的盖玻片上培养的味细胞。将15-24微升Fugene 6转染试剂加入到50微升无血清培养基中。所用的培养基是如实施例1中所述的补加Iscove氏培养基，但它是无血清的。用手轻轻地混合混合物。加入5-8微克DNA(pGFP2-MCS-Rluc(h)表达载体)，用手轻轻地混合混合物。将混合物在室温孵育15-30分钟，然后逐滴加入到细胞上。将平板轻轻地旋转，并在细胞培养箱中37℃孵育2天。
另外，可以使用用于转染真核细胞的标准方法转染细胞，如本领域公知的，例如如Murray，EJ，编辑(1990)，Gene Transfer andExpression ProtocolsMethods in Molecular Biology(基因转移和表达方案分子生物学方法)，Vol.7，Humana出版社，Clifton，New Jersey；Perkus ME等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1572)；Felgner，J.等(1993，J.Tiss.Cult.Meth.1563)所述的。
24-48小时后，将细胞在PBS中的4％低聚甲醛(PFA)中固定10分钟并通过共焦显微镜来检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号。易于观察GFP的表达。
这表明了根据本发明的味细胞提供了可行的表达系统，与通常所用的细胞系相比在该系统中更相似于在体内。与所用的测试-DNA(pGFP2-MCS-Rluc(h)表达载体)相似，味觉感受器的DNA可以被超表达。
实施例11用mT2R5和hT2R16转染培养的味细胞和钙成像按照实施例10中所述的进行实施例11中的转染，改变之处如下-所用的盖玻片是大鼠尾胶原-1-涂盖的盖玻片；-在分离后第3-7天进行转染；和-转染的DNA是带有GFP的实施例10的表达载体或携带DNA插入片段的表达载体，以小鼠T2R5 DNA(sstmT2R5HSV/pcDNA3.1-zeo，6053bp)或者人T2R16 DNA作为插入片段(在这两种情况中，可以按照Bufe等，Nat Genet.2002年10月；32(3)397-401所述的人TAS2R基因的克隆来形成构建体)。
使用抗标记蛋白(单纯疱疹病毒糖蛋白D(Herpes Simplex VirusGlycoprotein D)，HSV-D)的抗体检测在培养的味细胞中的表达。用抗味转导素抗体(兔子多克隆抗味转导素，(Santa Cruz，1∶1000)将转染的和未转染的细胞在4℃孵育过夜，用PBS洗涤(3次，每次15分钟)，然后用山羊抗兔子ALEXA-633(Molecular Probe，1∶500)在室温孵育30分钟，用PBS洗涤(3次，每次15分钟)，然后用小鼠抗-HSV-标记单克隆抗体(Novagen # 69171-1，1∶1000)在4℃孵育过夜，用PBS洗涤(3次，每次15分钟)，然后用山羊抗小鼠ALEXA488(Molecular Probe，1∶500)在室温孵育30分钟。然后将盖玻片在PBS中洗涤三次，每次10分钟，在水中洗涤三次，每次10分钟，用封固剂(Vectashield，或含有DAPI的Vectasheld，VectorLabs，USA)封固并在共焦或落射荧光装备的显微镜上观察。非特异性免疫反应性的对照包括省略初次抗体并用兔子和小鼠IgG替代初次抗体，在这种情况中没有检测到免疫染色。
GFP和HSV-D标记探针都显示出表示超表达的强烈荧光信号。HSV-D标记免疫荧光的信号分别与T2R5或T2R16蛋白的表达相关。这些结果证明了根据本发明培养的味细胞提供了可行的表达系统。
另外，将转染的细胞用于如实施例8中所述的钙成像测定。如所述的，用T2R5转染的细胞呈现出应答1μM放线菌酮有效浓度的放线菌酮的胞内钙的增加，所述浓度与用该受体转染的HEK293细胞中观察到的浓度相当，Ueda等，J.Neurosci.，2003.23(19)7376-7380。
如所述的，用T2R16转染的细胞呈现出应答1mM有效浓度的苯基-β-D-吡喃葡糖苷的胞内钙的增加，所述浓度与用该受体转染的HEK293细胞中观察到的浓度相当，Bufe等，Nat Genet.2002年11月；32(3)397-401。
此外，这些结果证明了根据本发明培养的味细胞提供了可行的表达系统。
应当认识到本发明不限于上述的具体实施方案，而是包括后面的实施方案所限定的变化、改良和等价的实施方案。此外，所公开的所有实施方案不一定是必择其一的，因为可以组合本发明的各种实施方案来提供所需的特征。
权利要求
1.培养哺乳动物味细胞的方法，包括a.在合适的培养基中和有涂层的细胞培养容器上培养味细胞，和b.从第一次更换培养基开始，以至少约5天的间隔更换培养基。
2.根据权利要求1的方法，其中所述味细胞包括味觉感受器细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细胞培养基包括含有15-20％MCDB 153、10％FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。
4.根据权利要求1的方法，其中所述细胞培养容器涂盖了胶原。
5.分离并培养哺乳动物味细胞的方法，包括a.分离舌上皮，其中将舌上皮中的味细胞暴露于水解蛋白酶的时间长度最小化，b.在合适的细胞培养基中和有涂层的细胞培养容器上孵育分离的味细胞上皮片，和c.从第一次更换培养基开始，以至少5天的间隔更换培养基。
6.权利要求5的方法，其中味细胞暴露于蛋白水解酶的时间长度约为30分钟或更短。
7.权利要求5的方法，其中所述味细胞包括味觉感受器细胞。
8.权利要求5的方法，其中所述细胞培养基包括含有15-20％MCDB153、10％FBS、10ng/ml胰岛素和抗生素的Iscove氏培养基。
9.权利要求5的方法，其中所述细胞培养容器涂盖了胶原。
10.根据权利要求1的方法培养的味细胞。
11.根据权利要求10的细胞，其中所述细胞是味觉感受器细胞。
12.权利要求11的细胞，其中所述细胞应答味觉刺激物。
13.权利要求10的细胞，将其在约37℃培养超过10天。
14.权利要求10的细胞，其中将所述细胞在约18-37℃培养超过20天。
15.权利要求10的味细胞的培养物。
16.根据权利要求5的方法分离并培养的味细胞。
17.根据权利要求16的细胞，其中所述细胞是味觉感受器细胞。
18.权利要求17的细胞，其中所述细胞应答味觉刺激物。
19.权利要求16的细胞，将其在约37℃培养超过10天。
20.权利要求16的细胞，其中将所述细胞在约18-37℃培养超过20天。
21.权利要求16的味细胞的培养物。
22.维持味细胞的方法，包括在含有约300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和约7.0至约7.3pH的缓冲液中维持味细胞。
23.在细胞培养物中分裂超过48小时的哺乳动物味觉感受器细胞。
24.权利要求23的细胞，其中所述细胞在细胞培养物中分裂超过约5天。
25.权利要求23的细胞，其中所述细胞在细胞培养物中分裂超过约2周。
26.转染的培养的哺乳动物味细胞。
27.权利要求26的细胞，其中用载体DNA转染所述细胞。
28.权利要求27的细胞，其中所述载体DNA包括病毒载体DNA或质粒载体DNA。
29.转染培养的味细胞的方法，包括使培养的哺乳动物味细胞接触核酸。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸包括载体DNA。
31.权利要求30的方法，其中所述载体DNA包括病毒载体DNA或质粒载体DNA。
32.测定对候选味觉刺激物的味觉应答的方法，包括a.将培养的味细胞暴露于候选味觉刺激物，和b.将所述味细胞对候选味觉刺激物的一种或多种细胞应答与培养的味细胞对标准味觉刺激物的应答相比较，其中培养的味细胞对候选味觉刺激物与对标准味觉刺激物相同的细胞应答表示候选味觉刺激物引起与标准味觉刺激物相同的在味细胞中的味觉应答。
33.测定候选味细胞的味觉应答的方法，包括a.将候选的培养的味细胞暴露于已知味觉刺激物，和b.将候选的培养的味细胞对已知味觉刺激物的细胞应答与标准味细胞对已知味觉刺激物的细胞应答相比较，其中候选味细胞和标准味细胞对已知味觉刺激物的相同细胞应答表示候选味细胞和标准味细胞都具有对味觉刺激物的应答。
34.鉴定味觉调节剂的方法，包括a.在已知味觉刺激物存在下，将培养的味细胞暴露于候选味觉调节剂，和b.将所述味细胞对候选味觉调节剂的一种或多种细胞应答与候选调节剂不存在下的细胞应答相比较，其中在候选调节剂存在下对刺激物的所述细胞应答的改变表示是味觉调节剂。
35.含有300-320毫渗摩的摩尔渗透压浓度和7.0至7.3pH的味细胞测定缓冲液。
全文摘要
本发明提供了培养哺乳动物味细胞的方法，味细胞包括味觉感受器细胞。将细胞维持长达三个月和更长的时间，同时维持成熟味细胞的分子和功能特征。将细胞在有涂层的培养容器上培养，从第一次更换培养基开始，以至少5天的间隔更换培养基。本发明进一步提供了味细胞的分离和培养方法，其中将使细胞暴露于分离溶液和蛋白水解酶的时间最小化并将细胞在有涂层的培养容器中培养，从第一次更换开始以至少5天的间隔更换培养基。本发明进一步提供了培养的味细胞、转染和测定方法，以及具有约300－320的摩尔渗透压浓度和约7.0－7.3pH的味细胞测定缓冲液。
文档编号C12N5/00GK101065479SQ200580040235
公开日2007年10月31日 申请日期2005年10月13日 优先权日2004年10月15日
发明者N·E·罗森, M·H·厄兹代内尔 申请人:蒙奈尔化学感觉中心