生物活性组合物、产生它们的天然方法和用于设计天然生产方法的计算方法

专利名称：生物活性组合物、产生它们的天然方法和用于设计天然生产方法的计算方法
背景技术：
1990年代的基因组学-蛋白组学变革引起大量小分子药物和有潜力药物的鉴定和设计。在许多情况下这些化合物非天然存在，且许多是有毒的、抗原性的或具有不适合的药物动力学特征。
许多生物活性分子作为大前体分子的部分天然存在于粮食中。由于它们是常规食用食品的组分，这类物质具有对人和动物更小毒性的潜力。如果可以发现将这些化合物从其前体食物来源中释放的方法，这些分子可用于加浓食物或可分离并用作营养剂或治疗剂。
例如，PYY是Y2 G蛋白偶联受体(GPCR)的高亲和力正激动剂并代表了治疗肥胖症及其他疾病的相对新的种类。它是由肠中特化的内分泌L细胞产生的与膳食热量含量成比例的天然激素。PYY通过调节下丘脑食欲回路减少胃口和摄食起作用。该物质显示在受试者(肥胖或不肥胖)接受90分钟静脉灌注后两小时减少30％的热量摄入。这些受试者也经受了累积的24小时热量摄入显著减少。在其他研究中，观察到肥胖个体具有更低水平的循环PYY。
本发明提供用于分离天然存在生物活性剂如PYY的方法，并涉及产生的发明组合物自身。其还涉及用于开发这些方法的方法。本发明的这些和其他优点以及其他发明特征将从本文提供的发明描述而显而易见。
发明概述本发明提供用于产生富含功能性生物分子的功能性食物的方法、用于产生这些方法的方法和用这些方法制备的组合物。方法首先涉及鉴定要产生的功能性生物分子。然后通过分析生物分子结构和功能之间的关系鉴定功能必需的这些生物分子的属性。然后通过电子搜索多种前体食物来源的基因组数据库鉴定含有共有基序的前体分子，所述共有基序具有活性必需的所有化学和结构属性。可能的前体分子和食物来源被鉴定后，进行另一数据库搜索以鉴定可用于从前体分子释放更小化合物的生物或酶，所述更小化合物含有所有鉴定为功能必需的属性。然后可通过用加工物质处理前体并从其前体释放功能性生物分子产生功能性分子。功能性分子包括生物活性分子或生物材料，其中功能分别为生物活性和自组织和装配。前体食物来源包括粮食或食品级别蛋白质及其混合物。
该方法提供在设计未加工营养来源和生物的组合时用于加工基因组信息的新方法，所述生物能够原位释放活性小分子以增强摄入的功能性食品的营养和健康增强效应。
为此本发明提供用于从前体食物或蛋白质来源产生生物活性分子的方法。该方法包括步骤鉴定生物活性分子、鉴定生物活性分子对生物活性必需的属性、鉴定含有具有生物活性必需属性的前体分子的前体食物来源、鉴定能够用于从前体分子释放含有生物活性必需属性的化合物的物质，和用加工物质处理前体食物来源从而从前体分子释放含有生物活性必需属性的分子。
在本方法的另一方面，生物活性分子可以是肽、蛋白质或核酸多聚体。
另一方面，该方法还包括鉴定生物活性分子中生物活性必需的化学属性。
另一方面，该方法还包括鉴定生物材料中自我组织/装配为更高级结构必需的化学属性。
另一方面，该方法还包括鉴定生物活性分子中生物活性或自我组织/装配必需的拓扑(二维)和/或结构(三维)属性在该方法的另一方面，前体食物来源可来自植物例如稻、大豆、玉米、马铃薯、咖啡、乳、肉等。
另一方面，该方法涉及使用物质制备生物分子，所述物质为细胞并且细胞可以是乳酸菌(lactobacteria)，包括约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)(LaI)或双岐杆菌，例如长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)(B129)。
另一方面，该方法涉及使用酶制备生物分子。
另一方面，该方法涉及使用酶，例如蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、氧化酶或脂肪酶或其组合制备生物分子。
在本发明的另一方面，生物分子与受体结合。
本发明的某些实施方案涉及生物活性剂，包括由粮食或食品级蛋白质产生的肽，所述肽包含氨基酸序列LNLV[TS][RK]X[RK][YFW]，其中X可以是任何天然存在的氨基酸，括号表示逻辑上的OR操作，且F、H、K、L、Q、R、W、Y为标准的氨基酸缩写。
在本发明的某些实施方案中，功能性剂分离自粮食且粮食为稻。
在本发明的某些实施方案中，粮食为稻(Oryza sativa)。
在某些实施方案中，生物活性剂为包含下述序列的肽或蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)amylogenin蛋白质RGP的YSCRYFGYLVSKKKY(SEQ ID No.1)或来自可食用植物稻的其最接近的类似物肽序列蛋白质RGP2中发现的HSCRYFGYLVSRKKY(SEQ IDNo.2)或蛋白质RGP1的SACRCFGYMVSKKKY(SEQ ID No.3)或BiP蛋白质的FDGVDFSEPLTRARF(SEQ ID No.4)。
在某些实施方案中，生物活性剂为包含下述序列的肽或蛋白质均来自稻oryzacystatin的VWEKPWMDFK(SEQ ID No.5)、PWMDFK(SEQID No.6)、PWMDFKELQEFK(SEQ ID NO.7)、PWMDF(SEQ ID No.8)或VWEKPWMDF(SEQ ID No.9)。
在本发明的某些实施方案中，功能性剂通过将其从前体分子上释放产生。
在本发明的某些实施方案中，功能性剂通过将其从前体分子上释放产生，其中前体分子在稻中。
本发明的其他特征和优点描述于发明详述并将由其阐明。
发明详述为了该说明书的目的，术语生物活性分子和生物材料均认为是功能性生物分子。只要记住它们的独特功能，这些术语可互换使用。因此，该说明书中关于生物活性分子描述的方法和组合物同样适用于生物材料。
通常认为生物材料是能够自我组织和装配的分子。因此，生物材料可以是从它们前体分子释放后能够形成丝和纤丝、水凝胶、表面活性剂和肽杂合分子的肽。
本发明提供使用天然粮食来源和食品级蛋白质产生功能性食品的方法，所述食品富含生物材料或生物活性分子，例如生物活性肽、蛋白质或核酸多聚体。另外，本发明涉及这样设计的食品。
在一个实施方案中，本发明涉及用于开发天然生物加工步骤的方法，所述天然生物加工步骤用于通过天然存在的生物分子处理产生浓缩食品，加工选定生物或这类生物提取物或其他天然加工物质的活性。除生物活性分子及其制备方法外，本发明还包括可通过该步骤制备的多种食品组合物。
对生物活性分子而言，方法通常涉及鉴定生物活性分子产生、鉴定对生物活性必需的生物活性分子属性、鉴定包含有这些属性的前体分子的前体食品来源、鉴定能够用于从前体分子释放包含生物活性必需属性的化合物的物质。适当的加工方法被鉴定后，该方法可通过用加工物质处理前体食品来源引起释放具有生物活性必需的属性的分子来进行。
该方法还期望包括用于评价可能前体分子丰度的步骤。另外，功能性剂来自前体蛋白质时，该方法也期望包括评价可能前体蛋白质对肽酶和其他酶或可用于将其释放的处理的稳定性。
功能性剂可以是具有期望活性的任何合适的生物分子，特别是肽、蛋白质、核酸多聚体及其衍生物，所述衍生物可以是脂质、糖、肽和核酸或其组合的衍生物。功能性剂可以通过本方法分离自粮食，包括食品级别蛋白质或其他农业来源。通常在能够得自食品加工的浓度下，目的生物活性分子将与靶受体特异结合并激活或失活受体。在某些功能性剂的浓度低于期望的实施方案中，选择的功能性剂可在食品来源中浓缩。另外，可制备具有提高的功能性剂浓度的加工的食物提取物。纯化方法也可用于部分纯化物质或纯化至基本纯净的形式。用于制备浓缩剂、提取物和用于纯化功能性剂的方法必然根据靶功能性剂的性质改变，但这些方法为本领域公知并可由本领域技术人员容易地操作。
前体分子也可浓缩或纯化并处理以释放生物活性分子，其然后可如所期望的添加回食物中。
多种方法可用于鉴定生物活性分子的生物活性必需的属性。例如，可以使用文献搜索并可以收集信息以确定肽、蛋白质或核酸多聚体结构内的改变如何影响目的活性并鉴定所有的保守氨基酸或肽或蛋白质活性剂中存在的其他结构如碳水化合物结构、核苷酸或脂质。另外，通常可通过诱变产生改变并确定产生的化合物的活性。最后，可获得负责活性的共有基序。共有基序将期望含有生物活性分子内生物活性必需的所有属性并定义了已知具有活性的最简单分子构架。分子构架除修饰(例如糖基化、酰化等)外可包括分子内活性必需的化学属性，例如一级、二级和三级结构要求。
然后可鉴定包含分子的前体食品来源，所述分子具有生物活性必需的所有属性。通过在基因组信息的大集合(包括例如ENSEMBL，Nestle基因组数据库)和食品原材料(例如稻、大豆、玉米、马铃薯、咖啡和牛乳)的公共基因组测序计划中搜索序列和结构水平上共有基序的存在，可以鉴定这类食品来源。这些食品来源中发现的前体分子可以是蛋白质、肽或核酸多聚体及其衍生物，取决于目的生物分子的性质。优选地，当物质为肽时，这类搜索使用BLAST通过搜索几乎精确的匹配和/或用EMBOSS模式匹配模块″patmatdb″通过搜索短的几乎精确的匹配来进行。必需三维结构基序时，这些结构可使用本领域已知的结构预测软件找到。
可以预见多种可能的前体分子可通过该方法鉴定。在这些情况下，可期望确定前体分子的丰度从而鉴定将产生适当数量目的物质的前体。
另外，可获得含有共有基序的食品级别蛋白质并用于制备生物分子。
然后可鉴定加工物质，所述加工物质能够用于从前体分子释放化合物从而释放的化合物包含生物活性必需的所有属性。所选择的物质当然取决于待释放的功能性剂的性质和发现其的母体的特性。可能的物质包括微生物、微生物提取物、蛋白水解酶、糖酵解酶、核水解酶和脂解酶、氧化酶、糖苷酶和化学物质。在一些情况下，这些活性可在细胞(例如益生细菌)的基因组成分中发现。
必需蛋白酶时，可使用由ExPASy网站提供的称为PeptideCutter的自动化服务、来自生物信息学软件包EMBOSS的模块DIGEST和/或MEROPS蛋白酶数据库鉴定合适的酶活性。众所周知，基于PeptideCutter知识的算法可用于鉴定由大于20种不同蛋白酶在蛋白质序列上产生的切割位点。(Keil，B.，Specificity of Proteolysis，Springer-VerlagBerlin-Heidelberg-New York，1992)某些方法使用微生物将功能性剂从其母体中释放。为了鉴定具有目的活性(如蛋白酶活性)的微生物，可将认为有用的酶序列与已知的细菌基因组比较以鉴定这些基因组中类似的蛋白酶序列。例如，长双岐杆菌(B129)基因组包含74个注释为蛋白酶或肽酶的蛋白质序列。其中之一与Arg-C蛋白酶高度类似，其切割结果可通过PeptideCutter模型由计算机预测。因此，当Arg-C蛋白酶活性鉴定为用于将生物活性剂从其来源中释放的可能活性时，可使用包含该序列的细菌长双岐杆菌(B129)。长双岐杆菌(B129)基因组也具有与sedolisin高度相似的序列。其可在两种活性都能够用于将生物活性剂从其前体食品来源中释放的条件下使用。该方法同样适用于其他酶活性。
另外，可以不需相关酶性质的具体知识，鉴定并利用益生细菌菌株活性。至少对蛋白酶而言，已报道细胞内和细胞外活性谱。也可以以相似方法筛选糖酵解、核水解和脂解活性并评价整个NCC细菌结合以选择最有希望的菌株。
一旦在食品来源中鉴定了两种前体分子并鉴定了用于释放功能性剂的加工物质，可通过用加工物质处理食品来源以从前体分子上释放含有共有基序的分子进行该方法。优选用单次发酵或处理中足够释放功能性剂的物质处理食品来源。然而，当必需多种加工物质且它们不相容或要求不同的使用环境时，可进行多次加工步骤。
功能性剂可来自蛋白质或肽序列。在这类情况下，可例如通过检索所有已知的植物表达序列标签和含有生物活性剂序列的蛋白质鉴定前体分子。可通过公开的结构-活性关系分析和通过比对所有已知相似序列鉴定序列中的可变或非关键氨基酸和关键氨基酸。可用该共有基序搜索含有所有已知植物蛋白质的数据库以鉴定更大前体蛋白质中的共有基序。也可使用三级结构的计算机评估鉴定已鉴定的前体的内部序列，所述前体将采用生物活性剂活性必需的结构。这可使用本领域已知标准方法完成。例如肽序列非常类似已知的三维结构时，可使用同源性建模。当肽序列与已知结构差异较大时，可使用折叠识别方案。当可获得生物活性剂受体三维结构信息时，可通过多种已知的建模方法分析鉴定的序列以确定它们的预测结构是否可能与受体结合。然后评价前体蛋白质列表。然后可通过已知方法(例如用于种子和作物中差异表达基因的微阵列)进行分析以确定前体分子是否足够丰富而能够从前体制备生物学相关量的功能性剂。另外，可确定前体分子对蛋白酶的灵敏度从而评价释放靶生物活性剂的可能性。可进行鉴定的肽序列的肽合成然后可检测肽的活性。
在一个示范实施方案中，可选择生物活性肽PYY3-36的类似物的产生。该化合物是GPCR肽激素受体Y的配体，以Y1，Y2，Y4和Y5亚型存在。该受体涉及饱满感、饥饿感的调节。PYY3-36肽在约0.5nM浓度时激活其靶受体Y1和Y2。该方法还可用于鉴定并产生其他针对疾病(例如糖尿病和肥胖症)的调节肽，例如胆囊收缩素(CCK)、人生长激素(HGH)和黑皮质素。
公开本发明的实施例作为示例而非限制。
实施例1该实施例例证了具有类似PYY3-36的阳性激动剂活性的生物活性剂的制备。PYY3-36是GPCR肽激素受体Y的配体，以Y1，Y2，Y4和Y5亚型存在。该受体涉及饱满感、饥饿感和血压的调节。其在约0.5nM浓度时激活其靶受体Y1和Y2。
最简单生物活性分子构架的定义
进行大范围文献搜索并用于确定PYY3-36肽C端部分只有一个小序列对于食欲调节和与同源受体结合是必需的。该序列段周围的变异已经公开。表1收集并显示了一些公开的序列。表1中粗体的氨基酸是组成PYY3-36最简单生物活性构架的高度保守氨基酸。
NMR结构测定技术显示PYY3-36肽采用了非常特定的三维形状，已知为PP-转角或折叠。N端区未成结构，而C端区形成特征性的α-螺旋结构。使用该信息鉴定具有类似序列和三级结构的肽以找到天然PYY3-36配体肽的可能的同源物。
使用EMBOSS″patmatdb″用进行搜索，″patmatdb″具有最多复制PYY3-36C端片段化学性质的下式-XXX[RK]X[YFW]XXXX[TS][RK]X[RK][YFW]。有趣的是，鉴定了多种植物基因组中存在的数十种匹配片段，其若干实例在表1中给出。靶片段的必需α-螺旋结构的存在使用肽结构预测软件确认。
表1靶标 SEO IDNo.
人肽PYY3-36YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY活性表位ASLRHYLNLVTRQRY公开的序列序列11，US5604203 ASLRHYLNLVARQRY序列4，US5604203 SLRHFLNLVTRQRY序列10，US6075009FINLITRQRF序列7，US5604203 SLRHFLNLVTRQRY序列13，US5604203 ASLRHYENLVARQRY拟南芥基因组中序列AtRGP，gi15237362，aa YSCRYFGYLVSKKKY
81-95稻基因组中序列OsBIP，gi50904765，aa FDGTDFSEPLTRARF317-331OsRGP1，gi34915190，SACRCFGYMVSKKKYaa 93-105体外检测的生物活性肽阳性对照ASLRHYLNLVTRQRYAtRGP2肽片段YSCRYFGYLVSKKKY 1OsRGP1肽片段SACRCFGYMVSKKKY 2OsBIP肽片段 FDGVDFSEPLTRARF 3PYY22-36类似物的鉴定的命中表1还定义了使用EMBOSS程序从已知EST的搜索得到的三种可能的生物活性肽。这些序列包括来自蛋白质Amylogenin的两种肽，一种来自拟南芥(AtRGP2)，另一种来自稻(OsRGP1)。另一可能的肽序列来自稻中发现的结合蛋白质(OsBiP)。
Amylogenin被认为负责植物中的淀粉生物合成并也称作可逆糖基化蛋白质(RGP)。拟南芥种子微阵列分析和微生物学数据提示它是种子和根中富含的蛋白质，并且其基本上仅位于植物高尔基体膜上。BiP或结合蛋白质负责增强作物对环境胁迫的耐受。微生物学数据提示BiP合成与作物中活性储藏蛋白的开始相一致。
来自蛋白质AtRGP2、OsRGP1和OsBiP的肽以5mg数量合成并纯化至大于约90％的纯度。在对PYY22-36的竞争性结合测试中检测肽与GPCR受体的结合。
鉴定靶生物活性分子构架。在Nestle益生细菌基因组所有组成成分中搜索足够的蛋白水解酶使用由ExPASy网站提供的称为“PeptideCutter”的自动化免费服务和来自生物信息学软件包EMBOSS的模块Digest鉴定能够释放PYY3-36类似物的蛋白酶。Arg-C蛋白酶和sedolisin鉴定为具有能够将生物活性剂从其天然母体释放的活性。将PeptideCutter、MEROPS和Digest使用的蛋白酶序列与若干细菌基因组比较以检查高度相似序列的存在。例如长双岐杆菌基因组中74个蛋白质序列注释为蛋白酶或肽酶。其中只有一种与Arg-C蛋白酶类似，其切割结果可通过PeptideCutter模型由计算机预测。Arg-C蛋白酶活性单独不能产生所需的活性肽。然而在长双岐杆菌基因组中鉴定了类似sedolisin的序列。这两种蛋白酶在长双岐杆菌中的组合活性显示能够将稻前体蛋白质加工成目的PYY同源物。
生物活性的体外/体内检测体外基于受体筛选受体亚型Y1、Y2和Y3根据本领域已知方案进行(Munoz等，MoI.Cell.Endocrinol.107，77(1995)，Fuhlendorf等，PNAS 87，182(1990))。筛选OsBiP、ZmRGP1和AtRGP1在Y2-GPCR上如上所述使用已知方法进行，并测量活性为抑制与内源配体PYY22-36序列结合的百分比。使用PYY22-36序列作为阳性对照。在检测的肽中，当结合测定中使用10μM浓度的PYY22-36和OsBiP肽时，来自AtRGP1蛋白质的肽能够抑制20-40％的PYY22-36结合。期望稻蛋白质OsRGP2中发现的来自拟南芥蛋白质AtRGP1的肽的相近类似物(仅相差一个化学上等同的氨基酸)应具有类似的活性。使用该技术，OsBIP蛋白质还显示结合Y2受体。体内基于组织对大鼠结肠细胞培养物的筛选可根据已知方案进行，例如Dumont等，Eur.J.Pharmacol.238，37(1993)所描述的。
实施例2该实施例例证了抑制肽CCK-4激活剂对CCK-B亚型受体的作用的生物活性剂的制备。CCK-8和CCK-4肽是GPCR肽激素受体CCK的配体，所述CCK以至少两种亚型A和B存在。CCK受体亚型A被认为在肠中表达并涉及饱满感和饥饿感的调节。CCK受体亚型B(也称为胃泌素受体)被认为涉及胃酸的分泌和病理学疾病(如胃溃疡和癌症)的发展。CCK-B受体拮抗剂可用于治疗这些疾病。
最简生物活性分子构架定义拮抗剂设计的常见策略是模仿阳性激动剂并引入分子结构改变，其增强与同源受体的结合从而使得拮抗剂占据结合位点，从而阻止激动剂结合。使用广泛的文献搜索和序列比较确定人CCK肽只有C端部分的一个小序列对受体结合是必需的。该信息的概述在表2中提供。表2中粗体的氨基酸是构成CCK肽最简生物活性构架的高度保守氨基酸。
使用EMBOSS″patmatdb″用代表CCK肽C端片段化学性质的下式进行搜索-P[YFW]X[DE][YFW]。鉴定了多种植物基因组中存在的数十种匹配片段，其若干实例在表2中给出。
表2靶标 SEO ID No.
人肽CCK-22NLQNLDPSHRISDRDYMGWMDF人肽CCK-8激活 DYMGWMDF人CCK-A受体人肽CCK-4激活 WMDF人CCK-B受体体外检测的生物活性肽放射性标记的CCK-8 DYMGWMDF胰蛋白酶水解的稻oryzacystatin-VWEKPWMDFK5合成肽1胰蛋白酶水解的稻oryzacystatin-PWMDFK6合成肽2胰蛋白酶水解的稻oryzacystatin-PWMDFKELQEFK 7合成肽3
胰蛋白酶+羧肽酶水解的稻PWMDF8oryzacystatin VWEKPWMDF9经鉴定的命中表2还通过用EMBOSS程序搜索已知EST鉴定了两种可能的生物活性肽。这两个序列包括来自蛋白质oryzacystatin的两个肽片段，所述oryzacystatin来自生物稻。
oryzacystatin是半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白。文献分析说明该蛋白质在稻作物中大量产生，可达到每千克作物1mg蛋白质。合成5mg量的肽VWEKPWMDFK、PWMDFK和PWMDFKELQEFK并纯化至大于约90％的纯度。在针对CCK-8的竞争性结合测定中检测该肽对CCK-B GPCR受体的结合。
鉴定靶生物活性分子构架。搜索足够的蛋白水解酶已使用市售蛋白水解酶如胰蛋白酶或羧肽酶从稻产生活性片段。
体外检测生物活性体外基于受体筛选受体亚型CCK-A和CCK-B根据本领域已知方案进行。肽VWEKPWMDFK、PWMDFK和PWMDFKELQEFK对CCK-A和CCK-B GPCR的结合活性测量为对内源配体CCK-8序列结合的抑制百分比。使用CCK-8序列作为该测定中的阳性对照。结果显示肽VWEKPWMDFK、PWMDFK和PWMDFKELQEFK在10μM浓度下分别抑制CCK-8与CCK-B受体的结合的27％、16％和5％。测试的肽在高达10μM浓度下均不激活CCK-A受体，可能因为缺乏磺化——激动CCK-A受体所需的化学修饰。
从分离自稻的重组表达和纯化的oryzacystatin蛋白产生水解产物。使用标准条件用胰蛋白酶水解10mg各样品。从这些水解产物中鉴定和纯化出两种肽，即VWEKPWMDFK和PWMDFK肽，因为它们在第一次筛选中显示了最高活性。将水解产物和两种纯化的肽再进行基于受体的筛选。水解产物自身在100μM水解产物浓度下将CCK-8对CCK-B受体的结合抑制21％，而纯化的肽VWEKPWMDFK和PWMDFK在10μM浓度下抑制16％和14％的CCK-8结合。
通过胰蛋白酶和有限的羧肽酶消化的组合的连续作用进行水解的最终优化，其目的在于通过去除C末端赖氨酸残基获得肽VWEKPWMDF和PWMDF。富含这些肽的水解产物显示对CCK-8与CCK-B受体结合的提高的抑制，该抑制在10μM浓度的活性肽下达到38％，相比在10倍高的100μM浓度下不进行胰蛋白酶处理时抑制为21％。
通过向200μloryzacystatin蛋白(2mg)中添加96mg尿素并在室温温育直至尿素溶解(终浓度约4M尿素)进行胰蛋白酶消化。向尿素溶液中添加900μl 1mM CaCl2中的100mM碳酸氢铵溶液，然后添加120μl乙腈。添加40μg胰蛋白酶(Promega重悬缓冲液中的40μg Promega测序级胰蛋白酶)并在37℃过夜温育溶液。添加另一10μg胰蛋白酶的等分试样，然后在37℃温育3小时。
50％的oryzacystatin消化溶液储藏于-20℃用于通过使用C18反相材料通过固体萃取脱盐，50％的稻oryzacystatin消化溶液进行羧肽酶消化。
羧肽酶Y消化在720μl(约1mg)oryzacystatin胰蛋白酶消化溶液中进行，向所述溶液中添加1080μl 10％乙腈中的200mM乙酸缓冲液(pH5)。向溶液中加入100μg羧肽酶Y(Sigma Aldrich，羧肽酶Y溶液在三天前制备。按照Sigma Aldrich可保持一周良好)并在室温温育30分钟然后加入910μl的1％甲酸。
各样品的小级分通过nano LC-ESI-MSMS表征。
用0.1％甲酸作为洗涤溶液和80％乙腈/0.1％甲酸作为洗脱溶液，使用500μl C18固体萃取柱对两个样品脱盐。
应该理解本文所述的当前优选的实施方案的多种改变和修饰为本领域技术人员显而易见的。可进行这类改变和修饰而不不偏离本发明的思想和范围并不缩小希望的优势。因此期望这类改变和修饰被附带的权利要求书覆盖。
权利要求
1.用于开发用于从前体产生功能性生物分子的方法的方法，其包括a.鉴定要产生的功能性生物分子，b.鉴定所述功能性生物分子内功能必需的属性，c.鉴定含有具所述功能必需属性的前体分子的前体食品来源，d.鉴定可用于从前体释放的具有功能必需的属性的物质。
2.权利要求1的方法，其中功能性分子为生物活性分子。
3.权利要求1的方法，其中功能性分子为能够自我组织/装配的生物材料。
4.权利要求1的方法，其中功能性分子选自肽、蛋白质、核酸多聚体或它们的组合。
5.权利要求1的方法，其还包括鉴定功能性分子内功能必需的化学属性。
6.权利要求1的方法，其还包括鉴定功能性分子内功能必需的结构属性。
7.权利要求1的方法，其中前体食品来源为粮食。
8.权利要求1的方法，其中前体食品来源为富集的蛋白质来源。
9.权利要求1的方法，其中前体食品来源选自稻、大豆、玉米、马铃薯、咖啡和乳。
10.权利要求1的方法，其中所述物质为细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述物质为选自乳酸菌和双岐杆菌菌株的细胞。
12.权利要求1的方法，其中所述物质为酶。
13.权利要求1的方法，其中所述物质为选自蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、氧化酶、脂肪酶及它们的组合的酶。
14.权利要求1的方法，其中所述物质为蛋白酶。
15.权利要求1的方法，其中功能性分子为结合受体的生物活性分子。
16.用于制备富含功能性生物分子的功能性食品的方法，其包括a.鉴定要产生的功能性生物分子，b.获得含有具功能必需属性的前体分子的前体食品来源，c.获得可用于从前体分子释放包含功能必需属性的化合物的物质，和d.用加工物质处理前体食品来源以从前体分子释放功能性生物分子。
17.权利要求16的方法，其中功能性生物分子为生物活性分子。
18.权利要求16的方法，其中功能性生物分子为能够自我组织/装配的生物材料。
19.权利要求16的方法，其中生物活性分子选自肽、蛋白质、核酸多聚体或它们的组合。
20.权利要求16的方法，其中前体食品来源选自稻、大豆、玉米、马铃薯、咖啡和乳。
21.权利要求16的方法，其中前体食品来源为食品级蛋白质。
22.权利要求16的方法，其中所述物质为细胞。
23.权利要求16的方法，其中所述物质为酶。
24.权利要求16的方法，其中所述物质为选自蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、氧化酶和脂肪酶及它们的组合的酶。
25.权利要求16的方法，其中所述物质为蛋白酶。
26.生物活性剂，其包含具有SEQ ID No.8的氨基酸序列的肽。
27.权利要求26的生物活性剂，其中粮食为稻。
28.权利要求26的生物活性剂，其中粮食为稻(Oryza sativa)。
29.权利要求26的生物活性剂，其中肽序列包含SEQ ID NO 9。
30.权利要求26的生物活性剂，其中通过从前体分子释放产生所述肽。
31.权利要求26的生物活性剂，其中通过从稻中的前体分子释放产生所述肽。
32.包含肽的生物活性剂，所述肽包含选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO 3的序列。
33.制备功能性分子的方法，其包括a.鉴定要产生的功能性生物分子，b.鉴定功能性生物分子中功能必需的属性，c.鉴定前体食品来源，其含有具有功能必需属性的前体分子，d.鉴定可用于从前体分子释放包含功能必需属性的化合物的物质，和e.用所述加工物质处理前体食品来源以从前体分子释放含有功能必需属性的分子。
34.权利要求33的方法，其还包括从加工的前体食品来源中纯化功能性生物分子。
35.权利要求33的方法，其还包括浓缩经加工的前体食品来源中的功能性生物分子。
36.权利要求33的方法，其还包括制备经加工的前体食品来源的提取物，所述提取物含有浓度提高的生物分子。
37.权利要求33的方法，其中所述加工物质从前体分子释放生物分子。
38.食品，其包含经消化的前体分子和在消化期间从前体分子释放的生物分子。
全文摘要
本发明涉及通过所选生物、这类生物的提取物或其他天然加工物质中存在的加工活性对天然存在的生物分子进行可控的天然生物加工的方法。本发明还包括用于开发这些方法的方法和用所述方法制备的组合物。
文档编号A23J3/34GK101056987SQ200580038688
公开日2007年10月17日 申请日期2005年10月7日 优先权日2004年10月7日
发明者M·格里戈罗夫, P·范布拉德伦, U·扎查理亚, S·考克哈尔, L-B·费, I·科尔特赛-图拉兹, M-A·朱利拉特, M·阿福尔特尔 申请人:雀巢技术公司