一种土鳖虫生物活性小肽组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有祛斑美白作用的中药有效部位组合物及其制备方法，具体的 说从土鳖虫中提取的土鳖虫生物活性小肽，从熟地黄中提取的熟地黄总多糖、从当归中提 取的当归总酚酸、从甘草中提取甘草总黄酮组成的中药有效部位组合物及其制备方法，属 于中药领域。
【背景技术】
[0002] 人类皮肤的颜色主要由黑色素细胞合成黑色素的活力决定，紫外线、废气、活性氧 等环境因素，富含铜、铁、锌等金属的食物以及某些疾病例如营养不良性疾病、体内氧化与 抗氧化平衡失调、内分泌失调、微生态失衡、代谢紊乱、机体微量元素含量异常等均可导致 皮肤颜色加深。当黑色素过度增长或者分布不均时，就会造成局部皮肤过黑及色素沉着，形 成色素斑，这严重影响了人类皮肤的美观，因此及时研究色素形成过程和减少色素沉淀具 有重要的意义。
[0003] 目前西医对于祛除色素斑和美白皮肤治疗主要采用维生素 C、汞、砷、铅等重金属 的漂白作用，是一种假性祛斑美白，停止使用后斑点会反复出现，不能达到根本的祛斑美白 作用。
[0004] 皮肤颜色变化及色素斑的形成在中医的角度分析是由于气血阻滞、肝气郁结、肾 阴不足和劳神伤脾等原因。气血运行不畅，肝气郁结不通，使皮肤不能得以滋养，血液中的 杂质沉积在皮肤表面，从而造成皮肤颜色的变化，甚至形成色素斑。目前传统中医药在祛斑 美白方面采用具有补血、活血和理气作用的植物中草药，通过养血、活血和舒肝解郁来减少 色素沉着，取得了显著疗效。而从我国传统中草药（中药复方或单味药）中提取得到祛斑美 白的药物已经成为当前国内中医药现代化研究的重要组成部分，中草药来源广泛，品种繁 多，为新的祛斑美白药物的研制开发提供了良好的基础。
[0005] 现有祛斑美白的药物复方成分低，服用量大，疗效差，而采用中药有效部位组合物 则能大大减少药物的服用量，祛斑美白的有效成分含量高，从而提高了药物的疗效。土鳖虫 破血逐瘀，可用于治疗血瘀经闭，产后瘀阻腹痛等症。而土鳖虫小肽具有溶解静脉血栓、抑 制血小板集聚抗凝血等药理活性，促进气血运行，从而可达到祛斑美白的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种具有祛斑美白作用的中药有效部位组合物； 本发明的另一个目的在于提供上述中药组合物的制备方法和用途。
[0007] 本发明的第一个目的：以土鳖虫小肽、熟地黄总多糖、当归总酚酸和甘草总黄酮为 原料，加入适当的药用辅料，制成相关的剂型。
[0008] 本发明药物的组合物的原料药的组成及配比为:土鳖虫小肽2~4重量份;熟地黄 总多糖4~6重量份;当归总酸酸3~5重量份;甘草总黄酮1~5重量份。
[0009] 本发明中药药物组合物优选的组成及配比为:土鳖虫小肽3重量份;熟地黄总多 糖5重量份;当归总酚酸4重量份;甘草总黄酮3重量份。
[0010]上述土鳖虫小肽有效部位中小肽的含量不低于60%，总多糖有效部位中总多糖的 含量不低于38%，总酚酸有效部位中总酚酸的含量不低于45%，总黄酮有效部位中总黄酮含 量不低于60%。
[0011] 该药物组合物可以加入相应辅料，制成软膏剂、凝胶剂中的任一种。然后可以再加 入其他具有祛斑美白的有效部位、有效成分、化学合成品或者半合成品，然后再加入相应辅 料，制成软膏剂、凝胶剂中的任一种。
[0012] 本发明中药组合物的制备方法包括以下步骤： ①土鳖虫小肽的制备:取土鳖虫药材，粉碎过80目筛，加10倍量水煮沸15 min，待冷至 40°C，以稀盐酸溶液调节pHl. 5~2.0，加入1%土鳖虫量的胃蛋白酶，40°C保温酶解Ih，以 20%氢氧化钠溶液调节pH7.5~8.0，加入1%土鳖虫量的胰蛋白酶，40 °C保温酶解3 h，加热 煮沸15min，减压浓缩，干燥，得土鳖虫小肽;其中土鳖虫小肽的含量不低于60%。
[0013] ②熟地黄总多糖的制备:取熟地黄干燥品，加入8倍量的水，于98°C中浸提2次，每 次4h，溶液滤过，合并滤液，减压浓缩至相当于生药量0.5mg/mL。加95%的乙醇使醇沉浓度达 到80%，静置24h。抽滤，得粗多糖，再加95%乙醇反复洗涤，脱脂和除去部分单糖。将沉淀放至 无醇味，加水溶解，过滤，定容，减压浓缩，干燥，得熟地黄总多糖;其中熟地黄总多糖的含量 不低于38%。
[0014] ③当归总酚酸的制备：取适当粉碎的当归药材，加入12倍量70%的乙醇提取3次， 每次lh，合并提取液，离心，取上清液，减压浓缩，干燥，得醇提取物干粉，加水溶解，离心，取 上清液，用的稀盐酸调至PH为3,通过D-101大孔树脂柱，然后用水洗至流出液无色，再用8倍 量柱体积70%的乙醇溶液以4mL/min的流速进行洗脱，收集醇洗脱液，挥干溶剂，干燥得提取 物干粉，用等量的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用少量水洗涤萃取液，分取乙酸乙酯层， 挥干溶剂，干燥得提取物;其中当归总酚酸的含量不低于45%。
[0015] ④甘草总黄酮的制备:取适量甘草药材粗粉，用95%乙醇提取2次，乙醇第1次用量 为甘草的8倍量，第2次用量为甘草的6倍量，合并提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩物加入5 倍量蒸馏水溶解，过滤，弃去沉淀;将过滤液上AB-8树脂柱，继而以蒸馏水、80%乙醇洗脱树 脂柱，用量分别为4倍量树脂柱体积，收集80%乙醇洗脱部位，减压回收乙醇，浓缩物真空干 燥得甘草总黄酮提取物;其中甘草总黄酮的含量不低于60%。
[0016] ⑤按照比例取上述土鳖虫小肽、熟地黄总多糖、当归总酚酸、甘草总黄酮，不加辅 料或加入药剂学常规辅料，制成药学上可以接受的剂型。
[0017] 各树脂的型号可以是 SP-700、X-5、AB-8、S-8、D_101。
[0018] 土鳖虫小肽、熟地黄总多糖、当归总酚酸、甘草总黄酮的含量测定方法为： ①土鳖虫小肽的含量测定方法为:取比伐芦定对照品适量，精密称定，加水溶解并制 成每ImL含15.08 mg的溶液，精密量取对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置具塞 试管中，各加水至l.OmL，再分别加入双缩脲试剂4.0mL，立即混匀，室温放置30 min，照紫 外-可见分光光度法，在540nm的波长处测定 吸光度(A);同时以0号管为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度(A)计算线 性回归方程。另精密取土鳖虫仿生酶解小肽0.4 g，精密加水40mL，超声处理(功率250 W， 频率40Hz)30min，滤过，精密量取续滤液I .OmU同法测定。从线性回归方程计算供试品溶 液中蛋白浓度，并乘以稀释倍数，计算，即得。
[0019] ②熟地黄总多糖的含量测定方法为:精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准25.02mg， 加水溶解定容，配制成〇. 10008mg/mL对照溶液备用。精密吸取葡萄糖对照溶液0.2，0.3， 0. 4.0.5.0.6.0.7mL置于IOmL的干燥具塞刻度试管中，依次加水使体积均为1.0 mL，另取 1. OmL蒸馏水作空白对照，再分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速用酸式滴定管滴加浓 H2SCk 5.0 mL，充分摇匀，室温放置30 min,在最大吸收波长488 nm处测定吸光度值，数据 处理得回归方程。将定容好的多糖溶液按同法操作，测得吸光度，带入回归方程，计算多糖 含量。
[0020] ③当归总酚酸的含量测定方法为:精密称取阿魏酸对照品3.70mg，置于50mL棕色 容量瓶中，加入无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为T^g/mL的对照品溶液。分别 精密吸取对照品溶液0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0 mL，1.2mL，1.4mL，置于25mL容量瓶中，752nm 处测定吸光度值，计算标准曲线的回归方程;精密称取总酚酸供试品按同法操作，测得吸光 度，带入回归方程，计算总酚酸含量。
[0021] ④甘草总黄酮的含量测定方法:精密称取柚皮苷标准品2.5