专利名称：一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵工程技术领域，具体涉及ー株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用。
背景技术：
虾青素(3，3' -ニ羟基-4，4' ニ酮基-β，β'胡萝卜素)是ー种酮式类胡萝卜素，天然呈红色。虾青素最初被用做水产业的饲料添加剤，后来药理学和生理学研究表明虾青素有极强的抗氧化、淬灭自由基的功能，井能促进抗体的产生，增强宿主的免疫功能，在食品、医药和化妆品等领域有广阔的应用前景，具有很高的经济价值。
红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是卩隹一天然可产奸青素的酵母,其反式奸青素已于2000年获得FDA批准，用于食品添加剤。它是真菌界、真菌门、半知菌亚门、隐球酵母科、红法夫酵母属的唯一种。作为虾青素的生产菌，红法夫酵母具有许多优势可利用多种糖进行快速异养代谢，培养时间短，不需光照及可以实现高密度培养等。但野生型红法夫酵母(DCW)的虾青素含量低(300 450 μ g/g干细胞)，发酵成本高，无法与化学合成竞争，无法满足エ业化生产，因此需要对虾青素产菌株进行选育和改良，以提高产品质量，降低成本。由于红法夫酵母的遗传背景并不清楚，虾青素的合成路径也很复杂。因此，目前多采用传统的诱变和原生质体融合等方法对其进行改造。申请号为200910188300. 6的中国发明专利文献公开ー种红法夫酵母菌株的复合诱变方法，首先将红法夫酵母菌株进行两次紫外诱变，得到一株五代内遗传性状稳定的突变株，然后又将此突变株低温处理，经低温处理的突变株，又经过单线态氧诱变处理，得到一株在10代内有良好遗传稳定性的突变株，将突变株进行发酵培养，測定器生物量和色素含量，均高于原始菌株。申请号为91105886. 9的专利文献公开了ー种红法夫酵母细胞的球状体融合技术及由球状体融合得到的几株新的红法夫酵母菌株，比亲本菌株的虾青素产量闻。但是诱变育种具有盲目性、随机性，导致工程量巨大，时间漫长，菌株突变面临回复现象的难题。原生质体融合技术可以扮演类似于有性生殖途径基因信息交流的作用，但是有性生殖途径只能允许在双亲本之间的基因重组。因此，寻找ー种简单、高效的育种方法尤为重要。目前，国外已有利用红法夫酵母进行虾青素生产的企业，如美国的红星公司、Igene生物有限公司、Tate&Lyle发酵产品有限公司和Igene生物技术有限公司合资エ厂等。但国内还没有虾青素的生产企业，因此研究一种适于エ业生产的虾青素生产途径具有很好的研究意义和很大的发展空间。
发明内容
本发明提供了一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用。以红法夫酵母为亲本菌株，采用基因组重排技术，选育出一株高产虾青素的红法夫酵母菌株，无需了解其基因组学、代谢组学等具体背景，操作简单，见效快，适于エ业生产。一株红法夫酵母菌株,命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10,保藏号为CGMCC No. 6355。本发明所选育出的红法夫酵母菌株于2012 年7月12日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏号为CGMCC No. 6355。本发明还提供了ー种利用所述的红法夫酵母菌株生产虾青素的方法，包括将所述的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接种到发酵培养基中进行发酵培养,发酵完成后，提取所述虾青素。所述的发酵培养基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O蛋白胨，5. O浓缩酵母浸出粉，
0.2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0所述发酵条件为22±1で，1501'/11^11，培养48-7211。虾青素提取的方法有很多种，本发明中所述提取虾青素的方法为取发酵液，第一次离心、收集菌体，将菌体破碎，萃取、第二次离心，获得虾青素。优选地，所述萃取采用的萃取剂为丙酮；所述第二次离心的转速为4500 5000r/m ;所述菌体破碎的方法为将所述菌体悬浮在预热后的ニ甲基亚砜中，振荡。具体操作步骤为取5mL发酵液于5000r/m下离心IOmin,去离子水洗漆两次，收集菌体，加入ImL 55°C预热的ニ甲基亚砜(DMSO)，振荡悬浮，加入丙酮4mL，漩涡震荡20_30s, 4°C, 5000r/m 离心 IOmin 去沉淀。采用紫外分光光度方法检测虾青素的产量，本发明选育出的红法夫酵母菌株发酵产生虾青素，其虾青素的产量可达到68mg/L。本发明还提供了一种所述的红法夫酵母菌株的选育方法，包括(I)选取亲本菌株，分为两组，分别进行LiCl-紫外复合诱变和6tlCo-Y射线诱变，筛选后分别得到经LiCl-紫外复合诱变的若干株诱变株I和经6tlCo- Y射线诱变的若干诱变株II。所述的LiCl-紫外复合诱变的条件为菌悬液中加入10% LiCl溶液，30cm、15W紫外灯照射。所述的菌悬液浓度为IO6个/mL，所述的LiCl溶液与菌悬液的体积比为3 50。具体操作过程为将亲本菌株用无菌生理盐水配制成菌悬液，菌悬液用无菌生理盐水稀释至一定浓度，优选为IO6个/mL,然后取5ml菌悬液于带磁力转子的培养皿中,加入300 μ L 10% LiCl混匀后开盖进行紫外线照射。诱变条件30cm，15W紫外灯。照射7min，黑暗处理后适当稀释涂板，在22°C恒温培养箱中暗培养4-6d。同时，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率。致死率的计算方法如下
未经诱变平板上的菌落数-经诱变后平板上的菌落数
未经诱变平板上的菌落数060Co-Y射线诱变可采用现有技术中常规的方法，本发明中送至浙江省农科院钴室进行诱变，诱变的条件为菌悬液浓度为IO6个/mL，诱变剂量为3500Gy。
(2)将所述的诱变株I和诱变株II进行原生质体融合、再生和筛选，得到若干株虾青素产量高于诱变株I和诱变株II的F-I代融合菌株。(3)将步骤(2)所得的F-I融合菌株进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。递归式原生质体融合(recursive protoplast fusion),也称多轮循环原生质体融合技术，即将各种亲本制成原生质体-融合-再生-再制成原生质体-融合-再生的技木。本发明中通过LiCl-紫外复合诱变和6tlCo-Y射线诱变分别筛选出其虾青素产量高于亲本菌株的诱变株。将上述分别经过LiCl-紫外复合诱变和6ciCo-Y射线诱变的诱变株脱去细胞壁，进行原生质体融合、再生，得到第一轮融合后的融合菌株。通过现有技术中常规的筛选方法筛选出虾青素产量高于所述诱变株的融合菌株进入下ー轮融合，每ー轮融合结束后筛选出虾青素产量高于该轮融合的亲本菌株的融合菌株进入下ー轮融合，如此进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。 所述的筛选为采用含不同浓度梯度的YM- ニ苯胺筛选培养基进行筛选。本发明所需的亲本菌株，没有特别的要求，一般可获得的红法夫酵母菌株都可以，优选的亲本菌株为红发夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其来源为浙江エ商大学食品与生物工程学院保藏，由梁新乐(浙江杭州)赠送。本发明的有益效果本发明的选育方法采用基因组重排技术，即结合了传统诱变技术和细胞融合技木，是ー项对整个微生物基因组重排的新型育种技木。基因组重排技木通过多亲本原生质体递归融合，可以使工程菌快速获得多祥复杂优良表型，并且无须了解其基因组学、代谢组学等具体背景。此外，基因重组技术操作简单，容易推广，不需要昂贵的试验仪器，而且见效快。因此，基因组重排育种很适合エ业菌株的改造，不仅体现成本经济效应，还具备高效性。选育出来的新菌株其虾青素产量比亲本菌株高14. 3倍。
具体实施例方式YM培养基(g/L) :10. O葡萄糖，5. O浓缩酵母浸出粉，5. O蛋白胨，pH 5. O0若为固体培养基需加入2. 5%琼脂粉。发酵培养基(g/L) 10. O葡萄糖，5. O蛋白胨，5. O浓缩酵母浸出粉，0. 2CaCl2 · 2H20, 2. 75MgS04 · 7H20,1. 5KH2P04, 3. 0 (NH4)2S04, pH 5. 0。YM- ニ苯胺选择性培养基待YM培养基冷却至50°C时加入一定量的无菌ニ苯胺溶液。再生培养基KT溶液配置的YM固体培养基。选择性再生培养基待再生培养基冷却至50°C加入一定剂量的无菌ニ苯胺溶液。PTC溶液的配制分别准确称取70g PEG-4000,0. 22g无水CaCl2, KT溶液溶解并定容至200mL。KT 缓冲液的配制0. 8mol/L KCl,0. 01mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH 7. 4)配制。溶壁酶混合液分别称取0. 6g溶菌酶，0. 6g蜗牛酶，I. 2g纤维素酶，分别溶于30mLKT缓冲液中，分别用0.2μπι的无机微孔膜过滤灭菌，4°C保存，使用时按纤维素酶溶菌酶蜗牛酶=2:1:1混合。
实施例I(I) LiCl-紫外复合诱变育种亲本菌株为红发夫酵母(Phaffia rhodozyma) 02,其来源为浙江エ商大学食品与生物工程学院保藏，由梁新乐(浙江杭州)赠送，活化后用无菌生理盐水配制成菌悬液，菌悬液用无菌生理盐水稀释至IO6个/mL，取5mL菌悬液于带磁力转子的培养皿中，加入300 μ L 10% LiCl混匀后开盖进行紫外线照射。诱变条件30cm，15W紫外灯。照射时间为7min,黑暗处理后稀释IO3倍，YM培养基涂板，在22°C恒温培养箱中暗培养4_6d。同吋，以未经诱变的菌悬液同样操作作为对照，计算致死率为83%。(2) 60Co- Y射线诱变育种将制备好的菌悬液浓度调整为IO6个/mL，取菌悬液于无菌试管中，送浙江省农科院钴室进行6ciCo-Y射线诱变，诱变剂量为3500Gy。 (3)原生质体制备对经过步骤(I)和步骤(2)诱变后的诱变株进行划板筛选(筛选方法同步骤(5))，分别筛选出虾青素产量高于亲本菌株的若干诱变株，然后分别在新鮮液体培养基(YM培养基)中培养，从培养成熟的新鲜液体培养基中取细胞悬液10mL，5000r/m离心lOmin，弃上清液。细胞沉淀物用无菌生理盐水洗涤两次，离心后即得菌体。将亲本细胞(即经过诱变得到的产量较高的菌株)悬浮于IOmL溶液(25mL
O.05mol/L EDTA和ImL O. 5mol/L β-疏基こ醇混合液)中，22°C振荡处理lOmin。离心收集菌体，用KT缓冲液洗涤2次，离心后再次得菌体。将所得菌体中加入SmL溶壁酶混合液之后放于22°C下90r/m的摇床中轻微振荡，以使菌体充分悬浮在酶液中。随时使用ImL枪头反复吸取酶解液促使原生质体的释放，同时用显微镜观察细胞形成原生质体的情况。酶解结束后5000rpm离心lOmin，用KT缓冲液洗涤2次收集菌体后，用KT缓冲液配置成IO7个/mL原生质体悬液I (LiCl-紫外复合诱变株)。对6tlCo- Y射线诱变的诱变株进行相同的操作，配制成IO7个/mL原生质体悬液II (60Co- Y射线诱变株)。(4)原生质体融合与再生实验中采用PEG诱导融合法，即原生质体悬液I和原生质体悬液II中各取2mL浓度为IO7个/mL的原生质体悬浮液,混勻后,3000r/m离心IOmin,弃上清。在原生质体沉淀中加入4mL PTC溶液后，用移液枪吸吹混匀，22°C保温15min后，3000r/m离心lOmin，弃上清，之后KT缓冲液洗涤两次。最后重悬于2mL KT缓冲液中，稀释104后涂布于再生培养基选择平板上。22°C在恒温培养箱中培养6d。原生质体形成率和再生率的计算
原生质体形成率=hxioo%
原生质体再生率=·^χ οο%
A-BA :酶解前菌落总数；B :酶解后未脱壁细胞形成的菌落数；C :酶解后未脱壁细胞形成的菌落数加上原生质体再生细胞菌落数。本实施例中原生质体形成率和再生率分别为90. 41%和4. 93%。
(5)筛选将融合菌株分别划线于含有不同浓度的ニ苯胺的YM- ニ苯胺选择性培养基平板上，22°C培养后观察不同平板上菌落的生长情况，记录顔色由红到浅黄或无色菌落的ニ苯胺浓度，即为ニ苯胺对该菌的最小抑制浓度(MIC)，同时以亲本菌株(步骤(I)中所用的亲本菌株)做对照，最小抑制浓度(MIC)相对亲本菌株增加较大的几株即为我们需要的菌株。(6)递归融合将步骤(5)中筛选出的虾青素产量相对高的几株融合株菌株继续进行步骤(3) (5)的操作，每ー轮操作结束后筛选出虾青素产量相对较高的融合菌株重复步骤(3)
(5)，进行5轮递归融合，最后筛选出虾青素产量相对较高的几株，进行稳定性测试。(7)稳定性测试 将步骤(6)选育出的虾青素产量较高的几株，进行稳定性试验，在装有发酵培养基的三角瓶中连续摇瓶发酵3次得发酵液，发酵条件22 土 1°C，150r/m，培养48h。每次均以出发菌株(步骤(I)中的亲本菌株)作为对照，提取发酵液中的虾青素，測定其虾青素产量，虾青素产量较稳定。编号为CZlO的融合菌株其虾青素产量提高到68mg/L，而亲本菌株的虾青素产量仅为4. 75mg/L。该菌株即为我们需要的的虾青素高产菌株。将该虾青素高产菌株于于2012年7月12日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为，红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZ10，保藏号为 CGMCC No. 6355。虾青素的提取及測定方法紫外分光光度測定法测定虾青素含量。取5mL发酵液于5000rpm下离心lOmin，去离子水洗涤两次，收集菌体，用滤纸吸干管壁水滴，加入ImL 55°C预热的ニ甲亚砜(DMSO)，振荡悬浮，加入丙酮4mL，漩涡振荡20-30s，4°C，5000r/m离心lOmin，上清液用分光光度计测0D474。如菌泥仍有色可重复抽提至白色为止，虾青素含量计算公式如下
(P(10000)
虾青素 Ungl L) = ~^--
2150K式中A——OD474mm值V1——有机溶剂的总体积(L)；2150——比消光系数V2——发酵液体积(L)；100 :单位换算后的作数(mg/L)实施例2利用实施例I选育出的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO进行发酵培养生产
虾青素。取实施例I中选育的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接种至装有发酵培养基的三角瓶中连续摇瓶发酵3次，22± I°C，150r/m,培养48h，提取发酵液中的虾青素，測定虾青素的含量，重复试验，其虾青素产量均稳定在68mg/L(每L发酵液产虾青素的量)。发酵液中虾青素的提取和測定方法同实施例I。
权利要求
1.一株红法夫酵母菌株,其特征在于,命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10,保藏号为 CGMCC No. 6355。
2.ー种利用如权利要求I所述的红法夫酵母菌株生产虾青素的方法，其特征在于，包括将所述的红法夫酵母(Phaffia rhodozyma) CZlO接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵完成后，提取所述虾青素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基以IL计含有以下组分.10.Og 葡萄糖，5. Og 蛋白胨，5. Og 浓缩酵母浸出粉，O. 2g CaCl2 · 2H20，2.75g MgSO4 · 7H20，I.5g KH2PO4, 3. 0g(NH4)2504, pH 5.0。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为21 23°C。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为48-72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取虾青素的方法为取发酵液，第一次离心、收集菌体，将菌体破碎，萃取、第二次离心，获得虾青素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述萃取采用的萃取剂为丙酮。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二次离心的转速为4500 5000r/m0
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌体破碎的方法为将所述菌体悬浮在预热后的ニ甲基亚砜中，振荡。
10.一种如权利要求I所述的红法夫酵母菌株的选育方法，其特征在于，包括 (1)选取亲本菌株，分为两组，分别进行LiCl-紫外复合诱变和6tlCo-Y射线诱变，筛选后分别得到经LiCl-紫外复合诱变的若干株诱变株I和经6ciCo- Y射线诱变的若干诱变株II; (2)将所述的诱变株I和诱变株II进行原生质体融合、再生和筛选，得到若干株虾青素产量高于诱变株I和诱变株II的F-I代融合菌株； (3)将步骤(2)所得的F-I融合菌株进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。
全文摘要
本发明公开了一株高产天然虾青素的红法夫酵母菌株及其选育方法和应用，该菌株命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)CZ10，保藏号为CGMCC No.6355。通过如下方法选育选取亲本菌株，分为两组，分别进行LiCl-紫外复合诱变和60Co-γ射线诱变，筛选后若干株诱变株I和若干诱变株II；将诱变株I和诱变株II进行原生质体融合、再生和筛选，得到若干株虾青素产量高于诱变株I和诱变株II的融合菌株；将步骤(2)所得的融合菌株进行递归式原生质体融合，至少进行5轮，得到所述的红法夫酵母菌株。本发明的菌株应用于工业上生产虾青素，其虾青素产量达到68mg/L，相对选育前的亲本菌株提高了14.3倍。
文档编号C12P23/00GK102864087SQ201210321949
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者胡向东, 朱静, 梁新乐 申请人:浙江皇冠科技有限公司