一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，包括法夫酵母菌体破壁、丙酮粗提虾青素、脱脂去除低极性类胡萝卜素、去除二甲基亚砜及结晶等步骤，通过有机试剂的高效提取及简单分离纯化步骤相结合，实现了快速分离虾青素的目的，所制得的虾青素纯度高，杂质少，避免了使用常规的柱层析步骤，可以有效保持虾青素的活性官能团，以在分离纯化步骤中，维持虾青素产品质量的稳定。
【专利说明】一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及虾青素的【技术领域】，尤其涉及一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法。
【背景技术】[0002]虾青素(astaxanthin)的化学名为:3，3’ - 二羟基-β，β ’ -胡萝卜素_4，4’ 二酮，是一种极具开发潜力的营养色素和抗氧化剂，具有强抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗机体着色、抗癌等许多重要的生物学功能，在食品、医药、化妆品、水产养殖、畜禽养殖、化工等行业具有广阔的应用前景。
[0003]虾青素的生产方法可分成化学合成和生物合成。目前，化学法合成虾青素工艺成熟，生产成本低，但与天然虾青素相比，化学合成的虾青素生物活性显著较低。法夫酵母因显著的虾青素合成能力而备受关注，是天然虾青素的重要来源。自法夫酵母被发现至今，有关法夫酵母的研究主要集中在高产菌株的选育、虾青素发酵条件的优化、虾青素提取工艺的优化。有关虾青素提取工艺的优化都是以虾青素提取率作为指标，往往杂质含量高，不利于虾青素的后续分离纯化。现今报道的从法夫酵母中分离纯化高纯度虾青素的方法都是采用柱层析法。柱层析不但操作繁琐费时，且层析过程不利于虾青素的稳定。
[0004]专利号为200410013634.7的发明专利“一种从法夫酵母中高效提取纯化虾青素的新工艺”公开了其纯化虾青素的方法，它是将物料与提取溶媒按比例混合后进行负压空化混旋固液萃取，经离心得提取液，提取液减压浓缩至小体积与萃取溶剂进行负压空化混旋液萃取，萃取液水洗、脱水后减压浓缩至油状物，再经负压柱层析和正压柱层析纯化得98%成品。该方法虽然虾青素得率高，但纯化工艺复杂，生产成本高，采用了负压柱层析和正压柱层析法，会造成虾青素有效活性的丢失，因此不利于虾青素的稳定。
[0005]郭建瑞等人在期刊《天然产物研究与开发》2007年第19期发表了一篇“红酵母RY-4中虾青素的分离纯化研究”的文章，该研究以红酵母为原料，通过破壁提取得粗色素油，再经层析法进一步分离纯化得虾青素，所得虾青素产品纯度达97%。在文章中，该方法也是采用了柱层析法进行虾青素的纯化，同样对于虾青素来说，也会造成其有效活性的丢失。
[0006]有关法夫酵母中虾青素高效提取和简单分离纯化相结合的发明尚未见报道，因此，如何对虾青素进行高效提取，采用简单的分离纯化步骤，避免采用柱层析法是本领域技术人员研究的重点。
[0007]有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，本
案由此产生。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，通过有机试剂的高效提取及简单分离纯化步骤相结合，实现快速分离虾青素的目的，并避免使用常规的柱层析步骤，以在分离纯化步骤中，保护虾青素的活性官能团。[0009]本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是:
一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，包括以下步骤:
步骤一、法夫酵母菌体破壁:采用二甲基亚砜对法夫酵母菌体破壁，破壁条件为:菌体与二甲基亚砜按质量体积比，即g/ml，比例为1/2，在55°C温度下，破壁5min ；
步骤二、丙酮粗提虾青素:破壁后用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比为法夫酵母菌体与丙酮的质量体积比，即g/ml，提取2次，合并提取液，低温旋转蒸发去除丙酮，残留的组分为二甲基亚砜溶解的虾青素粗提物，残留组分即为虾青素一次粗提液；
步骤三、脱脂及去除低极性类胡萝卜素:用石油醚萃取虾青素一次粗提液，萃取比例为虾青素一次粗提液:石油醚体积比1:2，萃取次数为2次，弃去上层石油醚，收集下层溶液，下层溶液即为虾青素二次粗提液；
步骤四、去除二甲基亚砜:虾青素二次粗提液与预冷到4°C的饱和氯化钠水溶液按体积比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的用量为虾青素二次粗提液的3倍体积；收集乙酸乙酯相，低温旋转蒸发至干，制得纯度较高的虾青素粉末；
步骤五、结晶:将步骤四制得的虾青素粉末，加入二氯甲烷溶解，以溶解完虾青素粉末为止，再往溶液中加入甲醇至有结晶析出为止，静置，二氯甲烷自然挥发，使得虾青素晶体析出^4°C、9961Xg离心条件下，离心10min，收集底部结晶即为虾青素。
[0010]作为实施例的优选方式，在步骤一之前，还包括法夫酵母菌体收集的步骤，即法夫酵母发酵液 5534Xg，离心8min，弃上清，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作2次，制得法夫酵母菌体。
[0011]作为实施例的优选方式，在步骤五之后，还包括高效液相色谱分析的步骤，所述高效液相色谱分析条件为:色谱条件为:35°c柱温；474 nm检测波长；洗脱剂为甲醇/水体系:0-40min 甲醇 85%_100% ;41_58min 甲醇 100% ;59_66min 甲醇 100%_85%;流速0.2ml/min ;色谱柱为:Angilent 2.1X1 OOmm C18 柱，3 μ m 粒径。
[0012]由于本发明采用了上述技术方案，即本方案包括法夫酵母菌体破壁、丙酮粗提虾青素、脱脂去除低极性类胡萝卜素、去除二甲基亚砜及结晶等步骤，通过有机试剂的高效提取及简单分离纯化步骤相结合，实现了快速分离虾青素的目的，所制得的虾青素纯度高，杂质少，避免了使用常规的柱层析步骤，可以有效保持虾青素的活性官能团，以在分离纯化步骤中，维持虾青素产品质量的稳定。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为石油醚萃取后薄层色谱分析图谱；其中，标号1、2、3、4分别为提取液、石油醚萃取体系的下相二甲基亚砜、石油醚萃取体系的上相石油醚、虾青素标准品；
图2为加碘处理图1后的图谱，即石油醚萃取后薄层色谱分析后，再加碘处理；其中，标号1、2、3、4分别为提取液、石油醚萃取体系的下相二甲基亚砜、石油醚萃取体系的上相石油醚、虾青素标准品；
图3为乙酸乙酯萃取后薄层色谱分析图谱；其中，标号1、2、3分别为乙酸乙酯萃取液、重结晶产物、虾青素标准品；
图4为加碘处理图3后的图谱，即乙酸乙酯萃取后薄层色谱分析后，再加碘处理；其中，标号1、2、3分别为乙酸乙酯萃取液、重结晶产物、虾青素标准品；图5为结晶奸青素后的奸青素HPLC图。
【具体实施方式】
[0014]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明。
[0015]本发明揭示了一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，包括以下步骤:
步骤一、法夫酵母菌体破壁:采用二甲基亚砜对法夫酵母菌体破壁，破壁条件为:菌体
与二甲基亚砜按质量体积比，即g/ml，比例为1/2，在55°C温度下，破壁5min ;采用二甲基亚砜破壁率高，提取效果好；处理短时间短(5min)，处理温度低(55°C )有利于虾青素结构的稳定;
步骤二、丙酮粗提虾青素:破壁后用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比为法夫酵母菌体与丙酮的质量体积比，即g/ml，提取2次，合并提取液，低温旋转蒸发去除丙酮，残留的组分为二甲基亚砜溶解的虾青素粗提物，残留组分即为虾青素一次粗提液；
步骤三、脱脂及去除低极性类胡萝卜素:用石油醚萃取虾青素一次粗提液，萃取比例为虾青素一次粗提液:石油醚体积比1:2，萃取次数为2次，弃去上层石油醚，收集下层溶液，下层溶液即为虾青素二次粗提液；
石油醚萃取后，对提取液(虾青素一次粗提液)、石油醚萃取体系的下相二甲基亚砜、石油醚萃取体系的上相石油醚及虾青素标准品进行薄层色谱分析，本发明中薄层色谱的展开剂为丙酮/石油醚体积比=1/5，分析图谱如图1所示，从图1可以看出，低极性的类胡萝卜素被萃取到石油醚相，二甲基亚砜相主要为虾青素，其原因是虾青素分子中有两个羟基，极性比其他类胡萝卜素大。
[0016]后续再对图1所示的图谱`加碘处理，如图2所示，从图2结果可知，经石油醚萃取后，脂质等低极性的杂质基本上都萃取到石油醚相中，二甲基亚砜相基本不含脂质等低极性的杂质。
[0017]步骤四、去除二甲基亚砜:虾青素二次粗提液与预冷到4°C的饱和氯化钠水溶液按体积比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的用量为虾青素二次粗提液的3倍体积；收集乙酸乙酯相，低温旋转蒸发至干，制得纯度较高的重结晶产物虾青素粉末；
此步的目的是从二甲基亚砜中回收虾青素，因为二甲基亚砜的沸点很高(189°C)，不能通过旋转蒸发的方法除去，此外，二甲基亚砜与水混合放热，饱和氯化钠水溶液在与二甲基亚砜混合前事先冷却；氯化钠可以帮助体系分层，避免乳化液的产生，形成清晰的两相；不加氯化钠体系不分层，因此氯化钠在此操作过程中是不可或缺的；
步骤五、结晶:将步骤四制得的虾青素粉末，加入二氯甲烷溶解，虾青素在二氯甲烷中的溶解度是30mg/ml，以溶解完虾青素粉末为止，再往溶液中加入甲醇至有结晶析出为止，静置，二氯甲烷自然挥发，使得虾青素晶体析出；在4°C、9961 X g离心条件下，离心10min，收集底部结晶即为虾青素。
[0018]结晶后，对乙酸乙酯萃取液、结晶产物及虾青素标准品进行薄层色谱分析，分析图谱如图3所示，后续再对图3所示的图谱加碘处理，如图4所示。从图3和图4可知，结晶将与虾青素极性相近的其他类胡萝卜素从虾青素中去除掉，进一步提高了虾青素的纯度。
[0019]对结晶产物虾青素进行高效液相色谱HPLC分析，所述高效液相色谱分析条件为:色谱条件为:35°C柱温；474 nm检测波长；洗脱剂为甲醇/水体系:0-40min甲醇85%-100% ；41-58min 甲醇 100% ;59_66min 甲醇 100%_85% ;流速 0.2ml/min ;色谱柱为:Angilent 2.1 X 100mm C18柱,3 μ m粒径；HPLC分析图谱如图5所示,该图谱只显示一个主峰，其中17.7 min为虾青素峰；1.5 min为溶剂峰，用溶解样品的溶剂(甲醇)替代样品进样，此峰依然存在。
[0020]作为实施例的优选方式，在步骤一之前，还包括法夫酵母菌体收集的步骤，即法夫酵母发酵液5534Xg，离心8min，弃上清，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作2次，制得法夫酵母菌体。
[0021]本发明包括法夫酵母菌体破壁、丙酮粗提虾青素、脱脂去除低极性类胡萝卜素、去除二甲基亚砜及结晶等步骤，通过有机试剂的高效提取及简单分离纯化步骤相结合，实现了快速分离虾青素的目的，所制得的虾青素纯度高，杂质少，避免使用常规的柱层析步骤，可以有效保持虾青素的活性官能团，以在分离纯化步骤中，维持虾青素产品质量的稳定。
[0022]以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依次限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作`的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【权利要求】
1.一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、法夫酵母菌体破壁:采用二甲基亚砜对法夫酵母菌体破壁，破壁条件为:菌体与二甲基亚砜按质量体积比，即g/ml，比例为1/2，在55°C温度下，破壁5min ； 步骤二、丙酮粗提虾青素:破壁后用丙酮按料液比1:15提取，所述料液比为法夫酵母菌体与丙酮的质量体积比，即g/ml，提取2次，合并提取液，低温旋转蒸发去除丙酮，残留的组分为二甲基亚砜溶解的虾青素粗提物，残留组分即为虾青素一次粗提液； 步骤三、脱脂及去除低极性类胡萝卜素:用石油醚萃取虾青素一次粗提液，萃取比例为虾青素一次粗提液:石油醚体积比1:2，萃取次数为2次，弃去上层石油醚，收集下层溶液，下层溶液即为虾青素二次粗提液； 步骤四、去除二甲基亚砜:虾青素二次粗提液与预冷到4°C的饱和氯化钠水溶液按体积比1:3.5混合，混合液用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯的用量为虾青素二次粗提液的3倍体积；收集乙酸乙酯相，低温旋转蒸发至干，制得纯度较高的虾青素粉末； 步骤五、结晶:将步骤四制得的虾青素粉末，加入二氯甲烷溶解，以溶解完虾青素粉末为止，再往溶液中加入甲醇至有结晶析出为止，静置，二氯甲烷自然挥发，使得虾青素晶体析出^4°C、9961Xg离心条件下，离心10min，收集底部结晶即为虾青素。
2.如权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，其特征在于:在步骤一之前，还包括法夫酵母菌体收集的步骤，即法夫酵母发酵液5534X g，离心8min，弃上清，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作2次，制得法夫酵母菌体。
3.如权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化虾青素的方法，其特征在于:在步骤五之后，还包括高效液相色谱分析的步骤，所述高效液相色谱分析条件为:色谱条件为:35°C柱温；474 nm检测波长；洗脱剂为甲醇/水体系:0_40min甲醇85%_100% ;41_58min甲醇 100% ；59-66min 甲醇 100%-85% ;流速 0.2ml/min ;色谱柱为=Angilent 2.1XlOOmmC18柱，3 μ m粒径。`
【文档编号】C07C403/24GK103848769SQ201410058649
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】杜希萍, 倪辉, 黄高凌, 杨远帆, 李利君, 肖安风, 蔡慧农 申请人:集美大学