专利名称：干酪乳杆菌及其在发酵生产l-乳酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于有机酸发酵技术领域，具体涉及一种干酪乳杆菌及生产L-乳酸或其 盐的方法。
背景技术：
乳酸(Lactic acid)又名 a-羟基丙酸(a-hydrxy-propioricacid)，分子式: C2H5OCOOH,相对分子量为90. 08，是一种简单的羟基酸。分子中有一个不对称碳原子，具有 旋光性，因此有L-乳酸与D-乳酸两种旋光异构体。L-乳酸为右旋性，D-乳酸为左旋性， DL-乳酸为消旋性，理化性质除旋光性外基本相同。乳酸是一种重要的多用途有机酸之一，广泛存在于人体、动植物和微生物体中。 L-乳酸及其盐在食品、医药、农业、化工等领域有广泛的应用。尤其是以它作为单体用于制 备生物可降解塑料-聚L-乳酸，能够很好的缓解环境和能源问题，因此，引起了世界的广泛 关注，应用前景非常广阔。乳酸的光学纯度对聚乳酸的物理性质有着重要的影响，发酵法是目前获得高光学 纯度L-乳酸的理想方法，但是在发酵生产L-乳酸过程中，由于菌种、培养基和发酵工艺的 千差万别，导致L-乳酸的生产效率和成本相差甚远。因此适宜的菌种和低成本L-乳酸发 酵工艺是促进聚乳酸产业的蓬勃发展的关键所在。发酵生产乳酸的菌种主要是根霉属、乳杆菌属、芽孢乳杆菌属。乳酸菌对葡萄糖的 发酵可以分为同型发酵和异型发酵。同型发酵只形成乳酸一种代谢产物，乳杆菌属和芽孢 乳杆菌属属于同型发酵；而异型发酵除形成乳酸外，还有乙醇、乙酸、二氧化碳等，根霉属属 于异型发酵。目前国内外主要对乳杆菌属、芽孢乳杆菌属发酵生产L-乳酸进行研究。普拉克生化公司在CN03814886. 2提出用凝结芽孢杆菌、热噬淀粉芽孢杆菌、史氏 芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌或其混合物，在最佳PH 5. 50 5. 60条件下采用淀粉同时 糖化发酵生产乳酸或其盐，得到的产物对映体纯度大于99%，残糖小于2g/L，同时认为乳 杆菌属等乳酸菌在它们生长温度30 50°C影响乳酸的对映体纯度，不适于乳酸工业生产， 且这些微生物的生长温度范围不适宜采用同时糖化发酵。上海新立工业微生物科技有限公司在CN02145142. 7中提出用嗜热乳酸杆菌并行 厌氧发酵生产L-乳酸的方法，在pH 5. 0 6. 5和温度45 55°C条件下进行厌氧发酵，加 入无机和有机氮源给菌种提供营养，增加了发酵成本，且由于这些氮源的加入使得产品提 取过程更加复杂。吉林大学在CN200510119041. 3中提出用干酪乳杆菌厌氧生产L-乳酸的方法，使 用的原料为葡萄糖等单糖或乳糖，氮源为无机和有机氮，众所周知葡萄糖或乳糖的价格远 大于含淀粉的物质，必然会增加发酵和提取成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种干酪乳杆菌及生产L-乳酸或其盐的方法，以降低生产成本，获得高光学纯度L-乳酸产品，满足聚乳酸生产的需要。本发明用于生产L-乳酸的微生物是一种干酪乳杆菌(LactcAacillus casei)的 突变菌株FY-04。该菌种有如下特点本发明提供的干酪乳杆菌Lactobacillus casei FY-04已于2009年9月11日保 藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(简称CGMCC)，其保藏号为CGMCCNO. 3洸9。本发明的干酪乳杆菌属Lactobacillus casei FY-04具有如下性质1、形态特征杆状细菌，不运动，无芽孢，常排列为短链。2、生理特征过氧化氢酶阴性，乳酸消旋酶阴性，格兰氏染色显阴性，兼性好氧。本发明的干酪乳杆菌FY-04种子的培养过程为(1)将菌种FY-04接入种子培养基中于40 45°C活化M 48小时，镜检无异常 形态细胞和杂菌，菌体生长旺盛。(2)取步骤(1)培养好的种子移入三角瓶，在摇床上于40 45°C下培养M 48 小时。(3)将步骤( 培养好的种子接入种子罐中，于40 45°C下培养M 48小时， 采用逐级扩大培养的方式直至种子用量满足发酵需求为止。步骤⑴中所述的种子培养基为葡萄糖2%，酵母膏0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏l%，NaCl 1 %，醋酸钠0. 5%，柠檬 酸铵0.2%，MgSO4. 7H20 0. 02%，碳酸钙2%，自来水配置，自然pH值，121°C灭菌20分钟。本发明的干酪乳杆菌FY-04用于发酵生产乳酸的发酵培养基为玉米粉、除油后的藻粉、木薯粉、大米粉等含淀粉物质的一种或几种混合物，同时 加入适量的自来水配制。本发明利用FY-04发酵生产L-乳酸的方法，包括(1)将60 200目的淀粉质粉体加水配制成10% 30% (质量分数)的溶液， 加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 池，然后加入糖化酶80 200U/g淀 粉，40 50°C保温0. 5 乩，进行预糖化；(2)当葡萄糖浓度达到20g/L 70g/L时，加入中和剂，同时接入培养好的干酪乳 杆菌FY-04种子培养液，接种量为5 % 20 % (V/V)，搅拌转数50 300rpm，发酵温度40 50°C，发酵全程通入空气，体积空速(每小时进入发酵罐的空气与发酵体积之比称为空间 速度，简称空速)为2. Oh—1 60. Oh—1。本发明方法中，所述的淀粉质原料粉体目数为60 200目，优选为80 100目， 这样在液化时可以减少酶的用量，同时避免高目数的淀粉质原料在发酵过程中产生大量的 泡沫而影响发酵。本发明方法中，所选用淀粉质原料为玉米粉、除油后的藻粉、木薯粉、大米粉等含 淀粉物质的一种或几种混合物。本发明方法中，进行预糖化的温度为40 50°C，时间为0. 5 他，优选预糖化温 度为40 45°C，时间为3 4h。本发明方法中，当预糖化的葡萄糖浓度达到20g/L 70g/L，优选50g/L 60g/L 时，此时接入FY-04菌种既可以保证充足的碳源，又可避免高葡萄糖浓度对菌体产生抑制，从而获得高产酸速率。本发明方法中，发酵温度优选40 45°C。本发明方法中，所述的中和剂为碱土金属氢氧化物和/或碱土金属碳酸盐、或氨 水。本发明方法中优选碳酸钙作为中和剂。中和剂加入方式为一次性加入或分批或流加。本发明利用FY-04发酵生产L-乳酸的方法中，发酵全程通入空气，通空气的体积 空速为2. Oh-1 60. Oh-1，优选10. Oh-1 20. Oh-1。因为本发明所用的干酪乳杆菌FY-04为 兼性好氧菌种，这与现有公开工艺中的菌种及发酵工艺是有着显著区别的，众所周知兼性 好氧菌种增殖期，微量的氧气可以促进菌体增殖生长，同时空气的通入可以携带二氧化碳 从发酵体系中逸出，保发酵体系中PH的稳定利于菌种生长，与厌氧菌种(需要向发酵体系 中通入惰性气体如氮气置换氧气)发酵工艺相比PH更稳定，产酸效率高。生物材料保藏说明本发明提供的Lactobacillus casei FY-04菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究 所；保藏编号=CGMCC No. 3269 ；保藏日期:2009年9月11日。
图1是本发明实施例1用干酪乳杆菌FY-04发酵玉米粉试验中，在通入空气情况 下，糖和乳酸浓度随发酵时间变化的情况。图2是本发明比较例1用干酪乳杆菌FY-04发酵玉米粉试验，在未通入空气情况 下，糖和乳酸浓度随发酵时间变化的情况。
具体实施例方式本发明利用FY-04发酵生产L-乳酸的方法，具体步骤包括将60 200目的淀粉质粉体加水配置成10% 30 %的溶液，加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 2h，然后加入糖化酶80 200U/g淀粉，40 50°C保温 0. 5 Mi，进行预糖化；当葡萄糖浓度达到20g/L 70g/L时加入中和剂，同时接入培养好的干酪乳杆菌 FY-04种子，接种量为5% 20% (V/V)，搅拌转数50 300rpm，发酵温度40 50°C。下面通过具体实施例提供本发明的Lactobacillus casei FY-04菌株在发酵淀粉 生产L-乳酸中的具体应用。实施例1本实施例为通入空气情况下的发酵试验2. 4kg玉米粉加入自来水配置成17. 1 %的溶液，加入轻质碳酸钙1kg，2. OmL高温 淀粉酶，98°C液化lh，降温到42°C，加入7. 2mL淀粉糖化酶，保温预糖化3h，测定葡萄糖浓度 为 55g/L。干酪乳杆菌FY-04经培养基培养至对数期，加入发酵罐，于42°C，150rpm, pH 6. 0 条件下发酵，以空速10. Oh-1通入空气，发酵42h，乳酸浓度达到最大值为160g/L，葡萄糖 0.5g/L。比较例1
比较例为未通入空气情况下的发酵试验。2. 4kg玉米粉加入自来水配置成17. 1 %的溶液，加入轻质碳酸钙1kg，2. OmL高温 淀粉酶，98°C液化lh，降温到42°C，加入7. 2mL淀粉糖化酶，保温预糖化3h，测定葡萄糖浓度 为 55g/L。干酪乳杆菌FY-04经培养基培养至对数期，加入发酵罐，于42°C，150rpm, pH 6. 0 条件下发酵，发酵52h，乳酸浓度达到最大值为146g/L，葡萄糖14g/L。实施例1和比较例1的试验结果如表1。表 权利要求
1.一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)FY_04，CGMCC No. 3269。
2.按照权利要求1所述的干酪乳杆菌，其特征在于，所述的干酪乳杆菌具有如下性质(1)形态特征杆状细菌，不运动，无芽孢，常排列为短链；(2)生理特征过氧化氢酶阴性，乳酸消旋酶阴性，格兰氏染色显阴性，兼性好氧。
3.权利要求1或2所述的干酪乳杆菌(LactcAacilluscasei) FY-04在生产L-乳酸中 的应用。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵方法包括如下步骤(1)将60 200目的淀粉质粉体加水配制成10% 30%的溶液，加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 2h，然后加入糖化酶80 200U/g淀粉，40 50°C保温 0. 5 Mi，进行预糖化；(2)当步骤(1)中葡萄糖浓度达到20g/L 70g/L时，加入中和剂，同时接入培养好的 干酪乳杆菌FY-04种子培养液，接种量为5 % 20 %，搅拌转数50 300rpm，发酵温度40 50°C，发酵全程通入空气，体积空速为2. Oh—1 60. Oh—1。
5.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的中和剂为为碱土金属氢氧化物、碱 土金属碳酸盐或氨水中的一种或几种。
6.按照权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述中和剂的加入方式为一次性加 入、分批加入或流加加入。
全文摘要
本发明涉及一种用于生产L-乳酸的干酪乳杆菌及其应用。该菌株为干酪乳杆菌Lactobacillus casei FY-04，于2009年09月11日保藏于CGMCC，保藏号为CGMCC No.3269。该菌株格兰氏染色呈阴性，兼性好氧。本发明的菌株用于淀粉发酵生产L-乳酸时，在发酵过程中通入空气，微量的氧气可以促进菌体增殖生长，同时空气的通入可以携带二氧化碳从发酵体系中逸出，确保发酵体系中pH值的稳定利于菌种生长，与厌氧菌种发酵工艺相比pH值更稳定，产酸效率更高。
文档编号C12R1/245GK102051336SQ200910188108
公开日2011年5月11日 申请日期2009年10月27日 优先权日2009年10月27日
发明者佟明友, 刘树臣, 宋喜军, 张霖, 袁毅, 高大成, 黎元生 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院