光学显微成像系统及其成像方法与流程

本发明涉及显微成像技术领域，尤其涉及一种光学显微成像系统及其成像方法。

背景技术：

显微成像技术作为观测微生物形态结构的有力手段之一，已在微生物检测领域获得广泛关注和应用。对于光学显微成像技术，按其工作原理的不同，可以分为传统光学显微成像、远场生物荧光显微成像和相差对比显微成像。传统光学显微成像技术主要是利用光学透镜对物体起到放大或者成像的作用，通过透镜组合可以把物体放大近千倍。然而，光衍射效应的存在，限制了传统光学显微成像技术中透镜无限放大的可能。远场生物荧光显微成像主要是通过荧光染料标记物体，利用短波长的光源去激发物体内部的标记，使其发射出荧光，从而提高物体在成像中的对比度，同时还提供了特异性标记，便于在大规模族群中的追踪和识别。相差对比显微成像是利用光学干涉的原理，将入射光通过透明物体产生的光程差转变为光强差，体现在ccd检测器中，突出透明物体的内部细节，便于观测物体内部的细微结构。

大多数微生物都是透明的，传统显微成像技术主要依赖其自身的透镜，而透镜对于透明的微小物体成像能力有限，所以成的像对比度差、不清晰，不利于观测。采用荧光标记的方法，虽然可以提高成像分辨率，但是操作繁琐，耗时长，而且由这种方法导致光漂白和光毒性反应，对微生物或者活细胞造成无法恢复的损伤。相差对比显微技术利用干涉的原理，将相位差转变为强度差，这种方法避免了荧光标记，在一定程度上保证了微生物样品的完整性。由于只能拍摄强度图像而得不到相位图像，有一定的局限性。同时晕轮和渐暗效应的存在，稳定性差，使得所成图像效果大大降低。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提出一种光学显微成像系统及其成像方法，能够提高图像分辨率，稳定性好。

本发明提出的具体技术方案为：提供一种光学显微成像系统，所述光学显微成像系统包括光源、依次远离所述光源并设置于所述光源的出射光路上的第一扩束准直器、显微镜、分光器、第二扩束准直器及图像获取装置，所述光源出射的光束依次经过所述第一扩束准直器、显微镜后形成具有样品信息的样品光，所述样品光经过所述分光器分光后形成两个光束，所述两个光束经过所述第二扩束准直器后成像在所述图像获取装置上。

进一步地，所述第一扩束准直器包括第一透镜、第二透镜及设置于所述第一透镜与所述第二透镜之间的第一滤波器，所述第二透镜位于所述第一滤波器与所述显微镜之间，所述第一滤波器位于所述第一透镜的后焦平面处，所述第一透镜的后焦平面与所述第二透镜的前焦平面重合。

进一步地，所述第二扩束准直器包括第三透镜、第四透镜及设置于所述第三透镜与所述第四透镜之间的第二滤波器，所述第四透镜位于所述图像获取装置与所述第二滤波器之间，所述图像获取装置位于所述第四透镜的后焦平面处，所述第二滤波器位于所述第三透镜的后焦平面处，所述第三透镜的后焦平面与所述第四透镜的前焦平面重合。

进一步地，所述光学显微成像系统还包括设置于所述光源的出射光路上的光阑，所述光阑位于所述显微镜与所述分光器之间。

进一步地，所述光学显微成像系统还包括设置于所述光源的出射光路上的第三扩束准直器，所述第三扩束准直器位于所述分光器与所述第二扩束准直器之间。

进一步地，所述第三扩束准直器包括第五透镜和第六透镜，所述第五透镜位于所述分光器与所述第六透镜之间，所述分光器位于所述第五透镜的前焦平面处，所述第五透镜的后焦平面与所述第六透镜的前焦平面重合。

进一步地，所述光学显微成像系统还包括设置于所述光源的出射光路上的光路调整器，所述光路调整器位于所述第三扩束准直器与所述第二扩束准直器之间。

进一步地，所述光路调整器包括第一反射镜和第二反射镜，所述第一反射镜位于所述第三扩束准直器与所述第二反射镜之间。

进一步地，所述光源为激光器，和/或所述分光器为光栅，和/或所述图像获取装置为ccd。

本发明还提供了一种如上所述的光学显微成像系统的成像方法，所述成像方法包括：

开启激光器，所述图像获取装置获取第一干涉图；

将所述分光器移动预定距离，所述图像获取装置获取第二干涉图；

将所述第二干涉图像与所述第一干涉图像作差，获得第三干涉图像；

提取所述第三干涉图像的相位信息，获得相位图。

本发明提供的光学显微成像系统，光源出射的光束被所述分光器分光后形成两个光束，所述两个光束经过所述第二扩束准直器后发生干涉并成像在所述图像获取装置上，两个光束经过了相同的光程，避免了噪声的影响，通过第一扩束准直器、显微镜和第二扩束准直器对图像进行放大，提高了图像分辨率。本发明提供的成像方法通过第二干涉图像与第一干涉图像作差得到第三干涉图像，这样使得第三干涉图像中不包括直流分量，大大提高了信号功率谱的带宽占有量，避免了信号在空间传播上的损失。

附图说明

通过结合附图进行的以下描述，本发明的实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：

图1为光学显微成像系统的结构示意图；

图2为光学显微成像系统的成像方法的流程图；

图3a为第一干涉图像的示意图；

图3b为第二干涉图像的示意图；

图4a为第一干涉图像的功率谱图；

图4b为第三干涉图像的功率谱图。

具体实施方式

以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为局限于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。

参照图1，本实施例提供的光学显微成像系统包括光源1、依次远离光源1并设置于光源1的出射光路上的第一扩束准直器2、显微镜3、分光器4、第二扩束准直器5及图像获取装置6。光源1出射的光束依次经过第一扩束准直器2、显微镜3后形成具有样品信息的样品光，样品光经过分光器4分光后形成两个光束，分别为信号光和参考光，信号光和参考光经过第二扩束准直器5后产生干涉并成像在图像获取装置6上。

显微镜3包括依次远离光源1并设置于光源1的出射光路上的第三反射镜31、聚光镜32、物镜33、第四反射镜34及筒镜35。其中，样品放置于显微镜3的聚光镜32与物镜33之间。光源1发射的光束经过第一扩束准直器2后从第三反射镜31反射至聚光镜32，聚光镜32将光线汇聚到样品上，经过样品后形成携带有样品信号的样品光，样品光入射至物镜33，样品光被物镜33放大后经第四反射镜34反射至筒镜35，从筒镜35出射的样品光再被分光器4分成两个光束即信号光和参考光。

本实施例中的分光器4为光栅，光源1为激光器，图像获取装置6为电荷藕合器件图像传感器(charge-coupleddevice，ccd)。光栅能够将样品光分成两个衍射光束即信号光和参考光。本实施例通过将激光器作为光源1可以避免光晕，提高了分光器4分成的两个光束的相干性，降低了空间噪声的影响。

具体的，第一扩束准直器2包括第一透镜21、第二透镜22及设置于第一透镜21与第二透镜22之间的第一滤波器23。第二透镜22位于第一滤波器23与显微镜3之间即第二透镜22位于第一滤波器23与第三反射镜31之间，第一滤波器23位于第一透镜21的后焦平面处，第一透镜21的后焦平面与第二透镜22的前焦平面重合。本实施例中的第一滤波器23为针孔滤波器，第一滤波器23上设置有一个孔，该孔的孔径d通过下式计算：

其中，λ表示的是光源1出射光束的波长，r表示的是光源1出射光束的半径，f表示的是第一透镜21的焦距。

光源1发射的光束经过第一透镜21汇聚后入射至第一滤波器23，第一滤波器23对入射到其上的光束进行滤波即滤除杂散光，经过第一滤波器23滤波后的光束再经第二透镜22进行光束扩展，扩展后的光束从第三反射镜31入射至显微镜3中。可以根据实际需要改变第一透镜21和第二透镜22的焦距，从而获得所需要的扩展光束。

第二扩束准直器5包括第三透镜51、第四透镜52及设置于第三透镜51与第四透镜52之间的第二滤波器53。第四透镜52位于图像获取装置6与第二滤波器53之间，图像获取装置6位于第四透镜52的后焦平面处，第二滤波器53位于第三透镜51的后焦平面处，第三透镜51的后焦平面与第四透镜52的前焦平面重合。本实施例中的第二滤波器53为针孔滤波器，第二滤波器53上设置有两个孔，一个大孔和一个小孔，大孔是为了保证信号光完整无损的通过并且只通过信号光，小孔起到对参考光进行滤波的作用，两孔的距离即入射到第三透镜51上的0级衍射光和1级衍射光之间的距离δx通过下式计算：

其中，f1表示的是第三透镜51的焦距，λ表示是光源1出射光束的波长，λ表示分光器4的光栅周期。

通过第二滤波器53上小孔的参考光的亮斑的半径ρ通过下式计算：

其中，f2表示的是第四透镜52的焦距，d表示的是小孔的孔径。

为了使得从第四透镜52出射的光束能够覆盖图像获取装置6的入射面，参考光的亮斑的半径ρ需要满足以下条件：

即小孔的孔径d需要满足以下条件：

其中，d表示的是图像获取装置6的入射面的对角线长度。

分光器4将样品光分成信号光和参考光，信号光和参考光分别入射至第三透镜51并经过第三透镜51汇聚后入射至第二滤波器53，第二滤波器53分别对入射到其上的两个光束进行滤波，其中，信号光经过大孔后完整出射，参考光经过小孔过滤后形成均匀的球面波，经第二滤波器53滤波后的两个光束再经第四透镜52进行光束扩展，扩展后的两个光束发生干涉并成像在图像获取装置6上。

本实施例中的光学显微成像系统还包括设置于光源1的出射光路上的光阑7，光阑7位于显微镜3与分光器4之间。光阑7可以控制从显微镜3中出射的光束的光斑大小。

光学显微成像系统还包括设置于光源1的出射光路上的第三扩束准直器8，第三扩束准直器8位于分光器4与第二扩束准直器5之间。第三扩束准直器8包括第五透镜81和第六透镜82。第五透镜81位于分光器4与第六透镜82之间，分光器4位于第五透镜81的前焦平面处，第五透镜81的后焦平面与第六透镜82的前焦平面重合。通过第三扩束准直器8可以对光束进行准直，减少像差的影响，以提升图像分辨率。

为了对整个光学显微成像系统的光路进行调整，光学显微成像系统还包括设置于光源1的出射光路上的光路调整器9，光路调整器9位于第三扩束准直器8与第二扩束准直器5之间。光路调整器9包括第一反射镜91和第二反射镜92，第一反射镜91位于第六透镜82与第二反射镜92之间。第一反射镜91将经过第六透镜82的光束反射至第二反射镜92，第二反射镜92再将入射到其上的光束反射至第三透镜51上。

本实施例还提供了一种如上所述的光学显微成像系统的成像方法，所述成像方法包括：

步骤s1、开启激光器，图像获取装置6获取第一干涉图，如图3a所示。其中，第一干涉图像是由两个光束即信号光和参考光干涉后形成，其中，两个衍射光束会产生一个互相关函数分量，即功率谱图中的直流分量，图4a表示的是第一干涉图像的功率谱图，功率谱图中的中间部分为直流分量，从中可以看出直流分量占了很大的带宽。

步骤s2、将分光器4移动预定距离，图像获取装置6获取第二干涉图，如图3b所示。

其中，本实施例中的分光器为光栅，经过分光器分光后的两个光束即信号光和参考光的频率为λ是光栅周期，即一个光栅周期对应2π。通过相移角度α便可以得到分光器4需要移动的预定距离x，其中，例如，第一干涉图像为相位为0°时的干涉图像，第二干涉图像为相位为π时的干涉图像，则分光器4需要移动的预定距离

步骤s3、将第二干涉图像与第一干涉图像作差，获得第三干涉图像。图4b表示的是第三干涉图像的功率谱图，从中可以看出，通过将第二干涉图像与第一干涉图像作差可以去除直流分量，滤波器的滤波半径变大，使得第三干涉图中的一级频谱分量增加，在整个频带宽度不变的情况下，大大提高了一级频谱的带宽占有量，一级频谱分量携带的信息会更多，避免了信号在空间传播上的损失。

步骤s4、提取第三干涉图像的相位信息，获得相位图。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。