用于定位点状样本的光学显微机构的制作方法

本实用新型涉及一种用于定位试样中的点状样本的光学显微方法，按照该方法，借助成像镜头使得设置在样本空间中的试样成像到探测器上，该成像镜头在样本空间中沿着其光轴具有预定轴向延展距离的清晰深度区域，在清晰深度区域内对在试样中含有的点状样本定位，其方式为，对因试样成像到探测器上而产生的第一试样图像加以分析，其中，为了在光轴方向上定位相应的点状样本，求取第一试样图像的表示点状样本的光斑的特征参数，并根据预定的指配信息给该特征参数指配涉及点状样本的轴向位置。

背景技术：

近来研发出了光学显微成像法，采用这种方法可以基于对各个标记特别是荧光分子的顺序的随机的定位来显示比传统的光学显微术的由运动引起的分辨率极限更小的试样结构。这种方法例如记载在WO 2006/127692 A2；DE 10 2006 021 317 B3；WO 2007/128434 A1、US 2009/0134342 A1；DE 10 2008 024 568 A1；WO 2008/091296 A2；“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)(采用随机光学重建显微法(STORM)的子衍射极限成像)”，Nature Methods(自然，方法)3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution of Lambda/10in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching(在采用几乎单分子光切换的荧光显微术中的λ/10分辨率)”，Geisler C.等人，Appl.Phys.A，88,223-226(2007)中。显微术的这种新分支也称为定位显微术。所采用的方法在例如名为(F)PALM((Fluorescence)Photoactivation Localization Microscopy)、PALMIRA(PALM with Independently Running Acquisition)、GSD(IM)(Ground State Depletion Individual Molecule Return)Microscopy)或(F)STORM((Fluorescence)Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)的文献中已知。

这些新方法的共同点是，制备要成像的带有点状样品即所谓的标记的试样结构，这些标记具有两个可区分开的状态，即“亮”态和“暗”态。如果例如使用荧光颜料作为标记，则亮态就是能够发荧光的状态，而暗态就是不能发荧光的状态。

在优选的实施方式中，例如在WO 2008/091296 A2和WO 2006/127692 A2中，使用了可光切换或可光激活的荧光分子。替代地，如在DE 10 2006 021 317 B3中，可以使用标准荧光分子的固有的暗态。

为了以高于成像镜头的传统的分辨率极限的分辨率来对试样结构予以成像，现在重复地将小部分量的标记转变为亮态。在此，在最简单的情况下，适当地选择形成这些激活的部分量的标记的密度，使得在亮态下进而在可采用光学显微术成像的状态下相邻标记的平均距离大于成像镜头的分辨率极限。形成激活的部分量的那些标记被成像在有空间分辨性的光学探测器例如CCD摄像机上，从而由每个点状标记检测光斑形式的光分布，所述光斑的大小由镜头的分辨率极限确定。

通过这种方式来摄取多个原初数据-单图像，在这些图像中分别成像了另一个激活的部分量。然后在图像分析过程中，在每个原初数据-单图像内确定光分布的重心位置，其显示出处于亮态的点状标记。由原初数据-单图像求取的那些光分布重心位置然后在整个显示中以整个图像-数据组的形式被汇总。通过该整个显示产生的高分辨率的整个图像反映了标记的分布。

为了有代表性地反映要成像的试样结构，必须探测足够多的标记信号。但由于在激活的各部分量中标记的数量受限于两个标记在亮态下相互间必须具备的最小的平均距离，所以必须摄取很多原初数据-单图像，以便完全对试样结构予以成像。原初数据-单图像的数量通常处于10000-100000的范围内。

除了按上述在样本平面(下面也称为x-y平面)上对标记进行横向的位置确定外，也可以在轴向(下面称为z方向)上进行位置确定。轴向在此系指在成像镜头的光轴上的方向，即光的主要传播方向。

三维的定位由所谓的“粒子追踪”实验已知，比如在Kajo等人，1994，Biophysical Journal，67、Holtzer等人，2007，Applied Physics Letters，90和Toprak等人，2007，Nano Letters，7(7)中有所记载。所述定位也已经应用在图像产生方法中，这些方法基于上述对单分子的切换和定位。为此参见Huang等人，2008，Science，319和Juette等人，2008，Nature Methods。对于现有技术，还参见Pavani等人，2009，PNAS，106。

在z方向上对点状样本的定位在原则上可以采用如下方式来进行：对在摄像机的探测面上检测到的光斑的变化加以分析，当点状样本从在光学方面变成探测面的清晰平面或聚焦平面移出时就能看到这种变化。在此，点状样本在下文中系指一种样本，其尺寸小于成像镜头特别是探测物镜的由衍射引起的分辨率极限。在这种情况下，探测物镜使得这种样本以三维聚焦光分布的形式在图像空间中成像。该聚焦光分布在摄像机的探测面上产生光斑，该光斑通过所谓的“点扩散函数”即点成像函数或简写为PSF来表征。如果现在点状样本在通过焦点的z方向上即垂直于清晰平面移动，PSF的大小和形状就会改变。如果在PSF的大小和形状方面分析与所检测的光斑相应的探测信号，就能由此推断出样本的实际z位置。

如果点状样本离开清晰平面太远，在摄像机的探测面上产生的光斑就会模糊不清，从而在通常的测量噪声内无法再感知到相应的测量信号。因而在样本空间内在z方向上有个围绕中央的聚焦平面或清晰平面的区域，在这个区域内，点状样本在探测面上产生光斑，该光斑仍足够清晰，以便能够被利用来在z方向上定位点状样本。在z方向上的含有清晰平面的这个区域在下文中称为“清晰深度区域”。

然而在三维定位时存在一个基本问题：由点状样本引起的PSF关于探测面是对称的。这意味着，虽然在点状样本从清晰平面中移出时PSF发生改变，从而可以确定点状样本相距清晰平面的间距，但是，PSF的变化在清晰平面的两侧是对称的，因而无法判定点状样本在清晰深度区域内处于清晰平面的哪一侧。

已知有各种不同的可以用来解决上述问题的方法。这些方法在本领域内例如有“Astigmatismusverfahren(散光法)”(上述文献Kajo等，Holtzer等人和Huang等人)、“Bi-Plane-Verfahren(双平面法)”(参见Toprak等和Juette等)和“Doppelhelixverfahren(双螺旋法)”(参见Pavani等)。这些方法的共同点是，为了在z方向上定位点状样本，对在探测器上产生的光斑加以分析，以便确定特征参数，并给该特征参数指配点状样本的z位置。这种指配借助于事先确定的指配信息来进行，所述指配信息使得特征参数与点状样本的z位置相关。作为特征参数，比如在散光法中考虑能表征光斑形状的参数，或者，比如在双平面方法的情况下，考虑能使得两个光斑的延展距离彼此相关的参数，这些光斑来自于同一个光斑且由探测面产生，这些光斑的指配的清晰平面在样本空间内在z方向上彼此错开。

现在问题在于，在真正的光学显微测量之前确定的指配信息往往不准确，因而无法准确地确定z位置，所述指配信息能实现在测量中求取的特征参数与点状样本的轴向z位置之间的指配。指配信息因而与试样的光学特性的变化有关。对于定位显微术中所需要的大功率镜头而言，光学特性的微小变化就已经导致成像错误，例如导致球形的像差。这造成由光斑产生的PSF的形状发生改变，例如以校准曲线形式求取的指配信息因而对于新的光学条件来说不再正确。在这种情况下，给在探测器上检测到的光斑指配错误的z位置。

对于使用者来说，往往难以在最终要予以测量的生物试样中施加能用来产生上述校准曲线的校准件，比如发荧光的小球。尤其是当这些校准件为了避免因色像差所致的错误而要以不同的颜色发荧光时就是这种情况。因此，在实践中优选的方案是，以自己的校准试样进行校准，即确定指配信息。然而在这里，错误校准的问题有很大影响，因为校准试样的光学特性从来都不与真正的测量试样的光学特性一致。盖片玻璃厚度方面的微小差异或者试样嵌入介质方面的微小差异就已经会导致校准曲线形状的显著偏差。

即使直接在要测量的试样中以巨大的试验代价开设出校准试样，如此得到的校准曲线也可能有误。因此，微小的温度变化例如就已经导致通常的浸渍油改变其折射系数，这又 造成在成像中出现球形的像差。因而即使在同一个试样中也可能在校准试样摄取时间点与真正的测量的时间点之间出现校准曲线变化。此外，用作校准试样的一定大小的荧光小球的信号始终不同于形成点状样本的单分子的信号，这又导致了有错误的校准曲线。

在实践中，这些问题导致往往无法绝对精确地确定点状样本的z位置。因此，虽然完全可以确定z位置方面的相对差异，进而也能以高的分辨率区分开相邻的结构，但难以判断可能的相邻的结构相互间的距离到底有多远。在此重要的是，在分辨率与绝对的位置确定之间进行区分，所述分辨率即为将紧密相邻的结构彼此分开的可能性。因此，现有技术中所采用的例如校准曲线形式的指配信息虽然通常能实现所希望的分辨率，却无法精确地确定点状样本的绝对的z位置。这种情况也可以称为三维图像在z方向上严重的(通常为非线性的)失真，这种失真由光学像差引起。恰恰在现代生物学中，这是个很大的问题。因此，例如蛋白质(Protein)的确切形态及布置方式显著地影响着其工作方式。因此，为了得到关于结构布置的信息，转而要在全部的三个空间方向上都进行精确的且绝对的测量。而在现有技术中存在的用于在z方向上定位的不足的校准方案无法允许实现足够的可靠性。

技术实现要素：

本实用新型的目的因此是，对开篇所述类型的用于定位点状样本的光学显微方法加以改进，从而可以在z方向上相比于目前更为精确地定位点状样本。

本实用新型揭示了一种用于定位试样中的点状样本的光学显微机构，带有：成像镜头，其在样本空间中沿着其光轴(O)具有预定轴向延展距离(t)的清晰深度区域；探测器，成像镜头把设置在样本空间内的试样成像到该探测器上；和控制单元，该控制单元在清晰深度区域内部对试样中含有的点样样本予以定位，其方式为，成像镜头在探测器上产生第一试样图像，该控制单元分析该第一试样图像；其中，为了在光轴(O)的方向上定位相应的点状试样，控制单元求取第一试样图像的表示点状样本的光斑的特征参数(d)，并根据预定的指配信息给该特征参数指配涉及点状样本的轴向的z位置，其特征在于，在清晰深度区域内对点状样本进行定位，受控制单元控制的移调单元使得该清晰深度区域在样本空间内相对于试样沿着光轴(O)移动预定的轴向移调路程，该移调路程小于清晰深度区域的轴向延展距离(t)；在清晰深度区域轴向地移动时，成像镜头使得试样重新成像到探测器上，并产生第二试样图像；控制单元在该第二试样图像中根据预定的轴向移调路程来求取点状样本的z位置；控制单元把点状样本的在第一试样图像中求取的z位置与同一点状样本的在第二试样图像中求取的z位置相比较；控制单元根据这种比较来产生矫正信息，控制单元借助于该矫正信息对点状样本的根据指配信息求取的z位置予以矫正。，

本实用新型实现该目的的方式为，在清晰深度区域内对点状样本进行定位，该清晰深 度区域在样本空间内相对于试样沿着光轴移动预定的轴向移调路程，该移调路程小于清晰深度区域的轴向延展距离；在清晰深度区域轴向地移动时，试样借助于成像镜头重新成像到探测器上，并产生至少一个第二试样图像；在该第二试样图像中根据预定的轴向移调路程来求取点状样本的z位置；把点状样本的在第一试样图像中求取的z位置与同一点状样本的在第二试样图像中求取的z位置相比较；根据这种比较来产生矫正信息，借助于该矫正信息对点状样本的根据指配信息求取的z位置予以矫正。

如开篇已述，根据本实用新型的在样本空间内的清晰深度区域系指在z方向上的在中央的聚焦平面或清晰平面周围的区域，在该区域内部，点状样本在探测器上产生一个光斑，该光斑仍足够清晰，以便能够被利用来在z方向上定位点状样本。在此无需完全用尽 该最大可能的清晰深度区域。因而可以有利地根据所希望的定位精度来有意识地缩小清晰深度区域，进而可以从分析中提取出已经很模糊不清的但本身仍可利用的光斑。

本实用新型的方案规定，在测量期间对可能由于光学成像错误所致的有误的指配信息予以矫正，所述指配信息例如以存储的校准函数的形式存在。为此使得成像镜头的清晰深度区域相对于试样移动一段轴向的移调路程，所述清晰深度区域的沿着光轴的轴向延展距离是已知的，所述移调路程小于清晰深度区域的轴向延展距离。换句话说，这种移动适当地进行，从而在样本空间内在最初的清晰深度区域与移动了的清晰深度区域之间沿着光轴存在一定的重叠。

这种重叠因而按下述方式实现：清晰深度区域沿着光轴移动的轴向移调路程小于清晰深度区域的轴向延展距离。因此，该移调路程例如处于清晰深度区域的轴向延展距离的5％-90％、10％-80％、15％-70％、20％-60％或25％-50％的范围内。不言而喻，这些值范围仅仅是示范性的。

根据本实用新型，使得清晰深度区域移动一段小于清晰深度区域的轴向延展距离的轴向移调路程，这应理解为，所考察的两个清晰深度区域即最初的清晰深度区域和移动了的清晰深度区域沿着光轴有重叠。这意味着，本实用新型也覆盖清晰深度区域的移动的一组步骤，按照该组步骤，在一个单独的步骤中，清晰深度区域移动一段大于清晰深度区域的延展距离的移调路程，只要该组步骤在总体上导致在所考察的清晰深度区域之间实现前述的轴向重叠。

清晰深度区域以一个或多个步骤在样本空间内移动的轴向移调路程小于清晰深度区域的轴向延展距离，这种情况意味着，清晰深度区域在z方向上的移动以一精度进行，该精度超过成像镜头的在z方向上的分辨率精度。这例如可以通过一种压电执行器来实现，该压电执行器要么使得成像镜头要么使得试样在z方向上移动。同样可行的是，为了移动清 晰深度区域，使用合适的光学器件，例如可变形的透镜、可变形的或可移动的反射镜或立体的光调制器。

根据本实用新型的矫正能实现超出清晰深度区域进行三维的显微成像，这在以前由于图像在z方向上失真而无法直截了当地实现。虽然在原则上即使针对通常的方法也可考虑在摄取一个图像之后使得该图像在z方向上精确地移动一个与清晰深度区域的轴向延展距离相等的量值，然后摄取另一个图像，以便最后把这两个图像在z方向上组合起来，这样就可得到一个在z方向上延伸经过两个清晰深度区域的总图像，但这种做法却要求在z方向上以一精度对点状样本进行定位，而该精度在以前是无法达到的。采用本实用新型的方法实现的精度才允许在z方向上把多个图像组合起来，而不会在图像之间出现错误的重叠或空隙。

如果用来矫正点状样本的z位置的矫正信息以矫正规则的形式被提供，根据本实用新型采用该矫正规则给点状样本的利用最初的(错误的)指配信息求取的z位置指配经矫正的z位置，那么，有时在前述情况下为每个在z方向上相继的清晰深度区域都要求取一个自己的矫正规则，并应用于在该清晰深度区域中对点状样本定位。

本实用新型的方法尤其在如下情况下可得到卓有成效的应用：校准曲线可通过试样或经过试样的光路的光学特性的变化而改变。因而可以有不同的校准适用于试样的不同的区域。这样的例子有浸在水状介质中的试样。成像的清晰深度区域浸入到试样中越深，光就必须穿过越多的水，水具有不同于其它光学材料比如浸渍油和玻璃的折射系数。因此，光学图像进而校准曲线也根据清晰深度区域的z位置而改变。

根据本实用新型，第一或第二试样图像分别是图像数据组，该图像数据组例如通过开篇所述的原初数据-单图像来实现。

优选在清晰深度区域内部沿着光轴规定至少一个相对于清晰深度区域偏移的z偏差位置。由至少一个在清晰深度区域轴向移动后在探测器上产生的第二试样图像构成一些光斑，这些光斑形成了在轴向移动的清晰深度区域中布置在z参考位置的点状样本，把所述光斑中的至少一个规定为参考光斑。用参考光斑表示的点状样本的z位置在样本空间内根据清晰深度区域的轴向移调路程和z参考位置来确定。第一试样图像形成了与第二试样图像的参考光斑相同的点状样本，由该第一试样图像构成的光斑之一被确定为比较光斑。根据由比较光斑形成的点状样本的z位置相对于由参考光斑形成的同一点状样本的z位置的偏差，产生矫正信息，利用该矫正信息来矫正点状样本的根据指配信息求取的z位置。

因而在清晰深度区域内部规定了至少一个相对于清晰深度区域偏移的z参考位置。后者意味着，z参考位置与清晰深度区域一样地在样本空间内移动。例如可以把清晰深度区域的在样本空间内的轴向上边界或轴向下边界规定为z参考位置。清晰深度区域的中央的清 晰平面所在的z位置也适宜作为z参考位置。此外可行的是，在清晰深度区域内部并非仅规定一个唯一的z参考位置，而是规定多个z参考位置，它们在样本空间内的位置是已知的，因而能实现无误地确定位于z参考位置的点状样本的z位置。

该实施方式因而规定，清晰深度区域的不受光学成像错误影响的精确的移动被利用来在当前测量期间例如以一定的时间间隔在试样中进行参考测量，借助于这些参考测量可以对错误的校准予以矫正。这种矫正的依据是，在清晰深度区域轴向地移动后摄取的试样图像中，可以无误地确定在移动了的清晰深度区域内部位于z参考位置的那些点状样本，因为所述z参考位置是已知的。根据本实用新型，在知道这些正确的z位置情况下，可以产生矫正信息，所述矫正信息于是可以用来在清晰深度区域移动之前摄取的试样图像中对点状样本的在该试样图像内求取的z位置予以矫正。如果通过清晰深度区域的连续移动使得矫正信息逐渐完善，就可以采用这种方式对整个图像的因错误的校准引起的失真予以矫正。

优选使得清晰深度区域按多个步骤轴向地移动。于是在这些步骤的任一步骤中都借助相应的参考光斑和相应的比较光斑来产生矫正信息。最后，借助逐步地产生的矫正信息对点状样本的根据指配信息求取的z位置予以矫正。通过清晰深度区域的逐步移动，最初的即未移动的清晰深度区域同z参考位置一起被扫描。由于z参考位置在每一步骤中都是已知的，所以可以在最初的清晰深度区域内部，对在与分别移动的z参考位置重叠的z位置上确定的那些点状样本予以精确定位。于是基于这些精确地确定的z位置，借助矫正信息也可以求取在最初的清晰深度区域内部的位于这些位置之间的z位置。

优选在每个步骤中都用针对相应的参考光斑求取的z位置来代替根据指配信息针对相应的比较光斑求取的z位置，并通过这种代替来产生形成矫正信息的矫正函数。在此，该矫正函数优选覆盖已用来摄取第一试样图像的整个清晰深度区域。

按照一种特别优选的设计，通过插值法来求取矫正函数的中间值，对于这些中间值来说，通过清晰深度区域的逐步移动并无比较光斑和参考光斑可供使用。在这种情况下，通过z参考位置的移动精确地求取的z位置形成了取值点，基于这些取值点可以进行插值，例如进行简单的样条插值。因而例如选择合适的对通常的校准错误予以考虑的模型函数，该模型函数与前述取值点适配，以便得到所希望的矫正函数。

点状样本的通过清晰深度区域的逐步移动求取的z位置优选重叠成总的定位图像。因此，(第二)试样图像并非仅仅用来矫正在最初的(第一)试样图像中求取的z位置，而且用来产生总的定位图像，其在z方向上延伸经过比最初的清晰深度区域大的区域。

清晰深度区域在样本空间内移动的轴向移调路程优选借助于传感器来检测。由此确保在对点状样本的所求取的z位置进行矫正中予以考虑的轴向移调路程始终都精确地已知。清晰深度区域相对于试样的移动可以按下述方式进行：要么使得试样相对于成像镜头要么 使得成像镜头相对于试样沿着光轴移动。但本实用新型并不局限于此。因而例如也可以使用可变形的透镜、可变形的反射镜、立体的光调制器等，以便使得清晰深度区域在样本空间内沿着成像镜头的光轴移动。

在一种特殊的实施方式中，使用一种置于探测器之前的柱形透镜，该柱形透镜导致在探测器上产生的光斑的可区分的形状变化，如果指配于该光斑的点状样本沿着光轴从位于清晰深度区域内的清晰平面的一侧移动至其另一侧。光斑的形状变化于是可以用作在z方向上进行定位之用的特征参数。

这里需要指出，术语“光斑的形状”根据本实用新型系指，它不仅具有单光斑的形状，而且包括由多个光斑构成的整体的形状，这种整体比如在开篇所述的双螺旋方法中提到过。在那里例如考察了两个光斑，这些光斑同样进行相互间的相对旋转运动。

通过比较光斑形成的比较结构优选在考虑其亮度的情况下来确定，即在考虑有助于该结构的单光斑总数的情况下确定。该实施方式尤其是当在清晰深度区域移动时求取的z位置不仅用于矫正事先借助指配信息确定的z位置，而且被考虑用于产生总的定位图像时是有利的。通过该改进方案来避免在总的定位图像中有干扰性的亮度差异。

指配信息的获取方式例如可以为，使得校准点状样本在清晰深度区域内部沿着光轴移动，并根据校准点状样本的z位置来检测在探测器上产生的校准图像的形成校准点状样本的光斑的特征参数。作为所述特征参数，例如考虑采用探测器上的光斑的形状和/或延展距离。

为了实施本实用新型的方法，根据权利要求14，规定了一种用于定位试样中的点状样本的光学显微机构。

附图说明

下面参照附图详述本实用新型。其中：

图1为示意图，其示出用于在z方向上定位点状样本的一个实施方式；

图2为示意图，其示出用于在z方向上定位点状样本的一个替代的实施方式；

图3示出一种指配规则，按照该规则，参照点状样本相对于清晰平面的z位置来放置在探测面上检测到的光斑的形状；

图4为示意图，在该图中示出了根据本实用新型所使用的清晰深度区域；

图5为示意图，其示出在z方向上因错误的指配信息引起的试样图像失真；

图6为示意图，其示出如何通过清晰深度区域的根据本实用新型发生的移位来矫正点状样本的z位置；和

图7为曲线图，其示范性地示出采用根据图6的方法产生的矫正函数。

具体实施方式

首先参照图1-3介绍两个实施方式，在这些实施方式中以不同的方式求取特征参数，所述特征参数允许在z方向上定位点状样本。

图1示出一种光学显微机构10，其带有作为图像镜头的物镜12和探测面14。根据图1的装置具有两个分开的探测通道，在这些探测通道中，图1中左边的那个通道主要由物镜12和第一筒状透镜16构成，而图1中右边的那个通道则由物镜12和第二筒状透镜18构成。来自点状样本20的光以相同的部分被射线分配器22以及换向镜24、26和28引到两个探测通道中。

两个探测通道在其聚焦位置方面略有不同。这意味着，第一探测通道具有在光学方面变成(konjugieren)第一清晰平面32的第一图像面30，而另一探测通道具有在平行于物镜12的光轴O的方向上即在z方向上相对于第一图像面30错开的第二图像面34，该第二图像面在光学方面变成也在z方向上相对于第一清晰平面32错开的第二清晰平面36。

如果要定位的点状样本20位于一个探测通道的清晰面上，它就被物镜12在那里清晰地成像，而它在另一探测通道中被不清晰地成像。如果它位于两个清晰平面32和36之间，它就会在两个探测通道中被不清晰地成像。

前述情况在图1中通过光斑38、40、42和44来表示，这些光斑根据点状样本20相对于清晰平面32和36的z位置在探测面14上产生。光斑38、40、42和44在图1中因而在x-y平面的俯视图中示出。光斑38、40、42和44分别用PSF来表征，PSF由通过物镜12产生的在探测面14上的聚焦光分布而得到。

如果点状样本20位于第一清晰平面32上，就在探测面14上在左边的探测通道中得到比较小的光斑38，而在右边的探测通道中得到相比之下较大的光斑42。而若点状样本20布置在清晰平面36中，就在探测面14上在左边的探测通道中得到较大的光斑40，而在右边的探测通道中得到较小的光斑44。

于是可以由在探测面14上产生的光斑38、40、42和44导出一个特征参数，该特征参数是点状样本20相对于清晰平面32和36的z位置的量度。作为该特征参数，例如可以使得在左边的探测通道中产生的光斑38或44的延展距离与在右边的探测通道中产生的光斑42或44的延展距离按比例相比。

图2示出了一种实施方式，在该实施方式中采用其它方式检测前述特征参数，该特征参数能实现求取点状样本的z位置。在此，图2首先在部分图a)中示出了通常的设置情况，按照这种设置，点状样本20利用由物镜透镜50和筒状透镜52构成的成像镜头54被成像到探测面56上。在这里，点状样本20将位于清晰平面58上，该清晰平面就是在光学方面 变成探测面56的面。

成像镜头54使得来自点状样本20的光形成为投射到探测面56上的三维的聚焦光分布。探测面56因而检测到一个光斑60，这个光斑是所述聚焦光分布的垂直于z方向的平面的剖切面。为了更清楚地示出这种情况，在图2中以探测面56的俯视图即在x-y平面上示出了该光斑60。

在图2的部分图a)中所示的情况下，点状样本20位于清晰平面58上，探测面56上的光斑60具有圆形的形状，即一种关于在x-z平面和y-z平面上的镜面对称的形状。

图2在部分图b)中示出了根据本实用新型的一种变型设计，按照这种设计，除了物镜50和筒状透镜52外，还设置了柱状透镜62。柱状透镜62具有在x方向和y方向上不同的折射力，因而对于x方向和y方向来说具有不同的聚焦位置。相应地，探测面56上的光斑60在x方向和y方向上呈十字形地变形。点状样本20在部分图b)中恰好位于现在不同的两个清晰平面的中间，其中，该中间位置也标有58。但十字形的光斑60却保持在前述意义下的对称。

据图2在部分图c)中所示的情况，点状样本20布置在清晰平面58的上方。从清晰平面58错开导致了探测面56上的光斑60非对称地变形为一个椭圆。在此，点状样本20离开清晰平面58越远，光斑60的椭圆形状就越明显。

在图2于部分图d)中所示的情况下，点状样本20位于清晰平面58的下方。在这里，探测面56上的光斑60也椭圆形地变形，然而是在与部分图c)中的光斑60的方向不同的方向上变形。因此，借助光斑60的形状可以辨别出点状样本20布置在清晰平面40的上方还是下方。如由根据图2的视图可见，可以借助探测面56上的光斑60的形状和延展距离来确定点状样本20相对于清晰平面58的z位置。这在当前设计中借助例如在图3中示出的指配规则来实现。这种指配规则可以通过校准测量来得到，在这些校准测量中，有个校准-点状样本沿着z方向从清晰平面58的一侧移至其另一侧，并在这种情况下针对现在已知的z位置来确定光斑的形状。这样就得到了指配规则，其能实现在以后测量时给测得的光斑指配正确的z位置。在实践中，为此使用一种专用的校准试样，例如一种带有发荧光的小球或者带有被照明的且散射性的纳米微粒作为校准点状样本。

图3示出了一种按照上述设计建立起来的指配规则。这里把光斑在x方向上的标有s_x的延展距离与光斑PSF在y方向上的标有s_y的延展距离的差规定为特征参数d。这样就得到了一种指配规则d(z)，该规则能实现在真正的图像摄取时针对测得的每个光斑都确定一个z位置。这个位置然后与x-y位置一起存储起来，且供产生高分辨率的三维图像使用。

对可以用来检测点状样本的z位置的指配规则的确定并不局限于上述实施方式。因而例如开篇所述的双螺旋法也适合于产生这种指配规则。

还要指出，图3中所示功能形式的指配规则仅仅是一种示范性的设计。因而例如也可以采用在测得的PSF与事先存储的或计算的PSF之间的关系的形式来进行图像比较。与测得的PSF具有最大的相似性的所存储的或计算的PSF的z位置于是被视为正确的z位置。如果测得的PSF在其形状方面并不与所存储的或计算的PSF之一一致，则可以例如通过插值法给它指配一个z位置，这个位置位于所存储的或计算的PSF的与测得的PSF最相似的z位置之间。

下面参照图4-7示范性地介绍如何能够根据本实用新型基于前述类型的指配规则来矫正对点状样本的定位。

图4以纯示意性的视图示出根据本实用新型的显微机构的一个实施例，其中，在图4中仅仅示出了用来介绍本实用新型的矫正方法的那些组件。在图4中尤其省去了探测器。

在根据图4的设置中，物镜70通过浸渍介质78将安置在盖片玻璃72上的试样76成像到探测器上。物镜70具有一个清晰深度区域78，该区域沿着物镜70的光轴O即在z方向上具有轴向的延展距离t。清晰深度区域78是这样确定的：位于清晰深度区域78内部的点状样本被物镜70以光斑的形式成像到探测器上，其清晰度足以例如在考虑图3中所示类型的指配规则情况下能实现在z方向上进行定位。清晰深度区域78在样本空间内的位置和延展距离因而被预先确定且是已知的。

根据图4的机构还包括控制单元80，该控制单元对机构的全部运行加以控制。控制单元80尤其具有计算元件，该计算元件进行对于定位点状样本所需要的计算和分析。控制单元80还控制着压电执行器82，利用该压电执行器可以使得物镜70沿着光轴O移动，以便使得清晰深度区域78按规定的方式沿着光轴O移动。物镜70进而清晰深度区域78在样本空间内移动一段移调路程，与控制单元80耦接的传感器84检测这段移调路程。

试样76含有各种不同的结构90、92、94、96和98，这些结构在清晰深度区域78中布置在不同的z位置上。这些结构90、92、94、96和98带有标记，所述标记形成了要定位的点状样本。在摄像期间，位于结构90、92、94、96和98中的那些标记分别单独地作为光斑成像到探测器上，这些光斑在其位置和形状方面被控制单元80分析。通过这种方式将产生在z方向上高分辨率的图像。

在图5的视图中示出了错误的指配规则是如何导致图像在z方向上失真的。因而在图5的左边部分中示出了带有清晰深度区域78的样本空间，在该样本空间中布置着所述结构90、92、94、96和98，而在图5的右边部分中示出了这些结构在该图像空间内的成像。在图像空间内的与样本空间的z位置相应的z位置标有符合“′”。

在根据图5的例子中，错误的指配规则导致了图像在z′方向上压缩。

在图6中示出因错误的指配规则引起的这种图像压缩是如何被逐渐消除的，其方式为， 使得清晰深度区域78分多个步骤在z方向上移动。在此，图6的部分图a)相应于图5中所示的情况。

首先在清晰深度区域78中规定一个z参考位置，这个参考位置相对于清晰深度区域78是位置固定的，也就是说，与清晰深度区域78一起在样本空间内移动。在当前例子中，清晰深度区域78的标有z_s的下面的边界被确定为z参考位置。由于该z参考位置是已知的，所以可以准确无误地检测位于z参考位置的结构在试样内的z位置。这种情况在图6的部分图a)中适用于结构90，在该部分图中，清晰深度区域78尚未移动。

如果现在将试样成像到探测器上，并随后使得清晰深度区域78连同其z参考位置移动至位置z_s＝z₁，就会得到在图6的部分图b)中示出的情况。在那里，结构92位于清晰深度区域78的z参考位置。对于布置在z参考位置的结构92所含有的那些点状样本来说，现在可以准确地确定z位置。由布置在z参考位置的点状样本在探测器上产生的光斑在下面称为参考光斑。现在，借助这些参考光斑，在先前摄取的第一试样图像(图6的部分图a)中确定出与在清晰深度区域78移动后摄取的第二试样图像的参考光斑相应的光斑。在第一试样图像中含有的这些光斑在下面称为比较光斑。

如对图6的部分图a)和b)的比较所示，在第一试样图像内，由于指配规则错误，在结构92中含有的点状样本的z位置是错误的，即已用一个太小的值z_x′求取。这个错误的值现在可以用在第二试样图像内被正确地求取的值来代替，并因而予以矫正。该正确的值已知为z₁＝z₁′。

如图7中所示，现在可以在曲线上参照错误的位置z_x′，即针对结构92在第一试样图像、部分图a)中已找到的位置，绘出结构92的正确的位置z₁。

现在使得清晰深度区域78又移动一段规定的移调路程，这段移调路程小于清晰深度区域78的轴向的延展距离t。相同长度的各个轴向移调路程的总和基本上等于清晰深度区域(78)的轴向延展距离。在这个例子中，在第二移动步骤中规定的移调路程又等于量值D_z，从而z参考位置移动至位置z₂。同样摄取试样图像，也要考察布置在z参考位置即布置在清晰深度区域78的下边界处的结构。根据图6的部分图c)，这在当前就是结构94，该结构的在探测器上的点状样本产生了相关的参考斑点。借助于这些参考斑点又在第一试样图像(图6的部分图a)中确定出相关的比较光斑，也就是说，在第一试样图像中搜寻结构94。在第一试样图像中给结构94指配z位置z₊′。在根据图7的曲线上，参照该位置z₊′绘出正确的位置z₂。

采用前述方式以适当数量的步骤进行操作，如图6中部分图d)和e)所示，直到覆盖在图6的部分图a)中示出的整个最初的清晰深度区域。

对于在第一试样图像中已再次找到的全部结构来说，现在可以借助根据图7的曲线在 纵坐标上读出正确的位置。基于所示的测量点，可以借助于合适的对通常的校准错误予以考虑的模型函数来得到矫正规则。也可以有选择地采用简单的样条插值法或其它类型的插值法，以便得到矫正规则。图7中标有c(z′)的该矫正规则现在可以用来矫正第一试样图像(图6的部分图a)。由此针对在第一试样图像中求取的全部位置z′根据矫正规则c(z′)得到各自正确的z位置。

需要指出，前述方法纯粹是示范性的。不言而喻，也可以采用不同于所述的其它算法。尤其在实践应用中可以并非仅仅确定在清晰深度区域内的一个唯一的位置固定的z参考位置，比如在图4-7中所示的例子就是这种情况。因而可以在清晰深度区域的其它位置规定其它z参考位置。

也可以考虑的是，不仅考察第n个图像相对于第一个试样图像的偏差，而且获取第n个图像的结构相对于第m个图像的结构的位置偏差，其中，n和m是等于或大于1的自然数。这样就得到了更多的测量点，从而可以得到更精确的矫正规则。也可以采用直接确定与在第m个图像中同样出现的结构相比而言第n个图像的失真的图像处理算法。重要的仅仅是，通过清晰深度区域的非常准确的移动，得到关于所考察的结构的z位置的附加信息，该信息用于定位点状样本。

也可以在样本空间和图像空间内部灵活地调整z或z′的值范围，即调整清晰深度区域和相应的图像区域，如果矫正规则不能应用于相应的整个试样区域。

此外也可行的是，利用移动的清晰深度区域已得到的位置信息不仅用于矫正在第一试样图像中得到的z位置，而且可以在图像产生本身中考虑该位置信息。