基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法与流程

本发明涉及一种光学显微成像技术，特别涉及一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法。

背景技术：

远场光学受限于光学衍射极限，其成像系统的空间分辨率取决于入射波长和显微物镜的数值孔径，通常不会小于入射光波长的一半。为突破衍射极限，最常用的技术为近场扫描光学显微镜。该技术利用有孔或者无孔探针，位于样品表面上方数百纳米的范围内，收集样品表面倏逝波的强度，由此获取样品的轮廓信息。其分辨率理论上由探针尺寸决定，目前可以达到20至50纳米的空间分辨率。然而该技术最大的缺陷就是成像速度慢，通常需要几秒甚至几十秒来完成一幅图，因此无法应用于实时的成像测量。

在成像过程中，如果使用的显微物镜具有相同的数值孔径，明场和暗场显微镜的分辨率相同。由于采用了边缘光束照明技术，相比于明场显微镜，暗场显微镜抑制了背景光线的影响，具有更好的信噪比和图像对比度，更加适合物体边界和轮廓的观测。

技术实现要素：

本发明是针对现在近场扫描光学显微镜成像速度受限的问题，提出了一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，相比于逐点扫描的近场扫描光学显微镜，本方案具有更快的成像速度，同样可以获得超越衍射极限的空间分辨率。

本发明的技术方案为：一种基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，包括如下步骤：

1）在现有的暗场光学显微镜的基础上增加三维移动设备，三维移动设备控制微米级的微粒移动；

2）将待测样品置于显微物镜的焦平面上；

3）将微粒移动接近待测样品表面，距离待测样品不超过1微米；

4）入射光从侧面入射，暗场光学显微镜对微粒周围被散射光照亮的区域进行成像，并完成图像采集；

5）利用三维移动设备控制微粒在样品表面逐步按次序移动，并控制微粒距离待测样品表面的间隔不超过1微米，每移动一步，用暗场光学显微镜采集一次图像，直至完成待测样品表面的图像采集；

6）将所有采集图像按次序拼接，实现待测样品表面超分辨图像。

所述微粒大小为1至50微米，用来散射显微镜的入射光。

所述三维移动设备包括三维位移平台和微粒支架，微粒支架一端为尖端结构，尖端结构端吸附或者粘贴微粒，另一端连接至三维位移平台，三维位移平台通过微粒支架控制微粒在三维空间内自由移动。

本发明的有益效果在于：本发明基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像方法，利用微粒的散射光作为显微镜的照明光源，实现了空间超分辨成像。相比于普通的明场或暗场显微镜，本发明具有更高的空间分辨率。相比于近场扫描光学显微镜，本发明具有更快的成像速度，不需要在样品表面逐点扫描，每次成像范围可以达到10 μm²。

附图说明

图1为本发明基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像示意图；

图2为本发明成像样品的扫描电子显微镜图；

图3为本发明三种显微镜模式下对同一样品的成像效果比较图。

具体实施方式

一种基于散射光近场照明的超分辨显微镜，利用大小为微米级的微粒来散射入射光，再用散射光作为显微镜的照明光源。由于微粒距离样品表面很近，散射光中高频分量经过样品表面的调制后，将有倏逝波转化成传播波，再有显微物镜收集，成像与像平面上。由于更高空间频率的倏逝波参与成像过程，本发明能够突破衍射极限，获得更高的空间分辨率。

如图1为基于微粒散射光近场照明的超分辨光学显微成像示意图，该图为实现微粒散射光照明的超分辨显微镜的一种例证，首先将样品2置于显微物镜1的焦平面上，利用三维位移平台6来控制微粒支架的移动，微粒支架5端口的微粒4也随之移动，使得微粒非常接近样品表面，通常两者距离不超过一微米。由于微粒4对入射光的散射， 使得微粒4附近的区域3被散射光照亮，其他区域仅有入射光照明。在暗场显微镜下，入射光从侧面入射，反射时不被显微物镜1收集，因此只有微粒4散射光照亮的区域3能清晰成像。再通过三维位移平台6移动来控制微粒4来扫描整个样品表面，即可获得大面积超分辨图像。微粒支架5具有尖端结构，可以吸附或者粘贴微粒，另一端连接至三维位移平台6，控制微粒4在三维空间内自由移动。微粒用来散射显微镜的入射光，其大小为1至50微米，材料不限，形状不限。

如图2为成像样品的扫描电子显微镜图。本样品为蓝光光盘，其表面材料为非金属高分子聚合物。此样品的表面结构为线状结构，其中线宽为180纳米，相邻两条线之间的间隔为120纳米。

如图3为三种显微镜模式下对同一样品的成像效果比较，所用样品如附图2所示。将样品放置于普通明场显微镜下，并使用数值孔径为0.8的100×显微物镜观察位移焦平面上的样品，获得的图像如图3（a）所示，除了个别杂质外，样品表面的线状结构并不可见；换成暗场模式，线状结构依然不可见，如图3（b）所示；当使用本发明提到的散射光照明模式，其结果如图3（c）所示，其中白色圆形物体为本发明中使用的微粒4，其直径大约为7微米，在微粒旁边有两块区域，见虚线框，散射光光强最大，样品被成像到像平面，线条结构清晰可见，但成像范围较小。为说明本发明可应用于不同数值孔径的显微物镜，又采用了数值孔径0.9的150×显微物镜来重复上述三种成像模式，其中图3（d）为明场照明，图3（e）为暗场照明，图3（f）为微粒的散射光照明。在明场和暗场条件下，样品表面的线条结构无法分辨，而在微粒的散射光照明下，结构清晰可见。图3（f）中微粒直径为4微米，相比于图3（c）中7微米的微粒，具有更大的成像区域。所有以上结果中照明光源均为溴钨灯，其光谱范围包括整个可见光波段，中心波长为550纳米。

在本发明中，采用暗场显微镜为基础，用来降低入射光的影响，只接收散射光信号。不同于普通的暗场显微镜的传播波照明，本技术采用样品表面附近的微粒的散射光照明技术，即入射光照射在微粒上之后产生的散射光来照明样品表面，从而获得更高的空间分辨率。