专利名称：疏水蛋白的分离提纯方法
技术领域：
本发明涉及蛋白的分离提纯方法，特别是涉及疏水蛋白的分离提纯方法。
背景技术：
真菌疏水蛋白(hydrophobin)是广泛存在于丝状真菌中的一簇具有不同寻常生理生化性质的小型蛋白质(约含100个氨基酸残基)，在其它有机体中尚未发现。根据疏水性图谱和其组装薄膜的溶解性特征，可将疏水蛋白分为两类I型和II型。为了更具体的了解疏水蛋白，科学家对它们的结构及生物物理和生物化学等方面的特性进行了大量研究。研究发现，疏水蛋白对真菌类的生长和繁殖起到非常重要的作用，包括真菌对表面的吸附、稳定性，果肉和空中菌丝的形成，以及对真菌结构的覆盖保护等。由水中的菌丝所分泌的疏水蛋白可以在水中扩散且在与其它介质或空气的界面上发生自组装，使水的表面张力大幅下降，从而使得菌丝能够冲破水环境向空气中生长。其中，疏水蛋白SC3可以使50μg/mL水溶液的表面张力从最大72mj/m2降低至24mj/m2，说明疏水蛋白也是很好的表面活性剂。这种蛋白质之所以拥有如此强大的功能，是因为它们具有在亲水-疏水界面上(例如水-空气界面、水-油界面或水与类似特氟龙的疏水性固体界面)通过自组装形成两亲性薄膜的特性。
疏水蛋白大约包含有100个氨基酸残基，通过自组装在界面形成两亲性薄膜从而改变表面的自然特性。疏水蛋白薄膜十分稳固，可以在100℃下抵抗住2％的SDS。疏水蛋白既无细胞毒性也无强免疫原性，因此，它们不仅在生物领域具有很高的科研价值，在医药和工业领域同样具有非常好的应用前景。疏水蛋白可以在固体上面将其它蛋白质固定，或将溶化的蛋白质净化。例如，在医学移植物的表面使疏水蛋白自组装，能显著提高这些移植物的生物相容性或能防止致病的细菌粘附到如导管的表面，并且促进人类纤维原细胞的生长。这种疏水蛋白还可以作为一种媒介，或者称为“粘附剂”，将细胞、蛋白质以及其它种类的分子固定在疏水的固体表面，比如生物传感器。利用组装后疏水蛋白的化学惰性，可以预测在稳定固定酶的活性方面会有优势，同时成型的薄膜具有的多孔性有利于一些小分子进入传感器。在纳米技术领域，经过某些处理的疏水蛋白可以携带不同的功能基团，在表面可以形成纳米精度的不同分子图形，因为组装后的I型疏水蛋白的棒状结构大约只有10nm宽，但化学性质非常稳定。另外，疏水蛋白有非常高的表面活性能(SC3大约是30mj/m2)，与传统的生物表面活性剂十分相似，例如糖脂类、脂肽酶/脂蛋白、磷脂、中性油脂和脂多糖。这样，就可以将疏水蛋白应用于制药业，以替代传统的表面活性剂。
疏水蛋白的这些特性已经引起了科学界的广泛关注，目前的研究主要集中在如何实现其工业化生产及其在各领域中的具体应用方面。但疏水蛋白的生产能力还十分有限，在分离提纯方面也有很大的困难，因而大大阻碍了其发展速度。因此很多国际科技工作者一直致力于此方面的研究，比如de Vocht等人提出的《Method of purifyinga hydrophobin present in a hydrophobin-containing solution》，已于2001年申请了世界范围的知识产权专利保护，公开号为WO/2001/057076。利用疏水蛋白对固体基板的吸附对溶液进行提纯，将固体基板浸入提纯溶液长时间后取出，使用强表面活性剂再将吸附在固体表面的疏水蛋白溶解，最后通过层析法及离心分离法再将疏水蛋白与表面活性剂分离提纯。
我国南开大学在国内杂志《生物活性物质分离与提纯》2005年第31卷第7期上发表的文章《瑞氏木霉疏水蛋白HFBI的分离纯化》，报道了疏水蛋白HFBI的抽提纯化方法，是依次用1％ SDS抽提，KCl沉淀后，经过Berol 532双水相萃取可得到疏水蛋白粗提品，然后再通过Sephadex G-25和Q-Sepharose进一步纯化。
物质中常见的疏水基团有烷基、芳香基等，物质中含疏水性基团越多，其疏水性就会越大，比如聚乙烯，聚苯乙烯，聚丙烯等都属于疏水性物质。特氟龙(Teflon)化学名称叫做聚四氟乙烯，是把乙烯(C2H4)中的四个氢(H)都置换成氟(F)，变成四氟乙烯(C2F4)，再经聚合作用形成。由于特氟龙是由碳原子和氟原子制成，不含氢，所以疏水性能特别强。特氟龙还具有耐热、耐低温、耐蚀性、优异的非粘着性及自润性、低磨擦系数等特性。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用疏水性物质的粒子对疏水蛋白的吸附及异相成核生长效应对其进行分离提纯的方法。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案疏水蛋白的一种分离提纯方法，是先将表面分布有疏水性物质粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白溶液中浸泡，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中进行超声振荡，使在疏水性粒子表面吸附且成核生长的疏水蛋白脱落后溶于水中，最后将基板从溶液中取出，得到经纯化的疏水蛋白溶液。
在上述疏水蛋白的分离提纯方法中，由于疏水蛋白能够在所有的疏水性物质表面吸附，因而所述疏水性物质的选择是多种多样的，如特氟龙(Teflon)等。
所述固体基板表面分布的疏水性物质的粒子的多少会影响疏水蛋白成核生长的大小，一般粒子越多，疏水蛋白生长的尺寸越大，粒子越少，疏水蛋白生长的尺寸越小，对疏水蛋白的提纯效率不高，但是密度太高则会形成疏水性物质薄膜，不利于疏水蛋白的成核生长，因此，所述固体基板上分布的疏水性物质粒子的密度一般为1×E2-3×E15个/cm2。
所述用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有疏水性物质粒子的固体基板的制备方法有很多，如物理化学刻蚀，物理化学沉积，化学腐蚀，粒子轰击，物理吸附，粘附，涂覆等。考虑到粒子在基板表面附着力的大小及粗糙度等问题，使用离子束溅射镀膜机是比较好的方法，具体操作为使用离子束溅射镀膜机在真空条件下向光滑洁净的固体基板表面轰击疏水性物质靶，使疏水性物质的粒子附着于洁净固体基板表面，并通过对溅射时间的控制，对固体基板分布的疏水性物质的粒子密度进行调控，以制成表面分布有所需密度疏水性物质粒子的固体基板。通常，溅射时间太长，容易形成疏水性薄膜，不利于疏水蛋白的成核生长，而溅射时间太短，则疏水性粒子密度太小，对疏水蛋白的提纯效率不高。所述溅射时间一般为1-600s，优选为5s。所述固体基板的材质是多种多样的，如石英、硅片或玻璃板等均可。
此外，表面分布有疏水性物质粒子的固体基板在待提纯的疏水蛋白溶液中的浸泡时间的长短也会影响疏水蛋白成核生长的大小，一般浸泡时间越长，疏水蛋白生长的尺寸越大，浸泡时间越短，疏水蛋白生长的尺寸越小，可根据疏水蛋白溶液的浓度及疏水性物质的粒子密度对浸泡时间进行调整，一般为0.01-72小时。
通过对疏水蛋白样品进行不同功率的超声振荡处理，发现并不是功率越大分离提纯效果越好，功率过大，反而会促进已溶于水中的疏水蛋白向疏水性物质粒子上聚集，因此，超声振荡的功率密度一般为0.01-500W/mL(优选为1.35-1.45W/mL)，振荡频率为1-300KHz，振荡时间为0.01-300min。
用上述方法分离纯化的疏水蛋白也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种疏水蛋白的分离纯化方法。该方法是利用疏水蛋白能够在疏水性物质的表面吸附且疏水性物质的粒子对疏水蛋白有很强的异相成核生长作用，从而达到对疏水蛋白进行分离提纯的目的。用本发明的方法能够便捷地得到纯度较高的疏水蛋白溶液，并且该方法具有操作简单，条件要求低，成本低廉，分布有疏水性物质粒子的基板可以重复使用，易于进行工业化应用的优点。本发明将在疏水蛋白的分离纯化中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为表面分布有Teflon粒子的石英基板的原子力显微图像图2为表面分布有Teflon粒子的石英基板在疏水蛋白HFBII溶液中浸泡12小时取出后的原子力显微图像及图像分析结果图3为将吸附有疏水蛋白的基板经不同功率的超声振荡处理后的原子力显微图像具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、疏水蛋白的分离提纯及检测不同功率的超声振荡处理对纯化效果的影响一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的抛光石英基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射5s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板，原子力显微镜观测结果如图1所示(图A的尺寸为5微米，图B的尺寸为1微米)，洁净抛光石英基板表面的粗糙度很低，由经溅射镀膜后的原子力图像中可以看到基板表面分布了许多颗粒，通过对表面进行水接触角的测试发现接触角变大，由此证明这些在基板表面分布的点就是Teflon粒子，Teflon粒子的密度约为8×E11个/cm2。
二、疏水蛋白的分离提纯及检测不同功率的超声振荡处理对纯化效果的影响将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡12小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，观测及图像分析结果如图2所示(图A为原子力显微图像，尺寸为5微米；图B为图像分析结果)，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，使Teflon粒子吸附且成核生长的疏水蛋白脱落后溶于水中，超声振荡功率密度分别设为0.85W/mL、1.42W/mL、1.90W/mL，其它条件一样，频率为20-25KHz，振荡时间为15min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果如图3所示(图A为在0.85W/mL下振荡后基板的原子力显微图像，图B为在1.42W/mL下振荡后基板的原子力显微图像，图C为在1.90W/mL下振荡后基板的原子力显微图像，尺寸均为5微米，Z轴高度为15nm)，由图3可以看出对样品采用不同功率进行超声处理后所得的效果并不一样，在1.42W/mL下超声振荡的基板上剩余的疏水蛋白最少，大的聚集颗粒明显消失，达到了分离提纯的效果，由此说明并不是超声功率越大效果越好，这是因为疏水蛋白具有很高的活性，功率过大反而又会促进溶液中的疏水蛋白向Teflon粒子上聚集，1.35-1.45W/mL为最佳的振荡功率密度。上述检测结果表明，用本发明的方法可得到纯度较高的疏水蛋白。
实施例2、疏水蛋白的分离提纯一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的玻璃基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射300s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板。
二、疏水蛋白的分离提纯将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡72小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。然后用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，超声振荡功率密度分别设为0.01W/mL，振荡频率为200KHz，振荡时间为300min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果表明玻璃基板上剩余的疏水蛋白较少，大的聚集颗粒明显消失，得到了纯度较高的疏水蛋白。
实施例3、疏水蛋白的分离提纯一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的玻璃基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射600s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板。
二、疏水蛋白的分离提纯将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡24小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。然后用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，超声振荡功率密度分别设为300W/mL，振荡频率为100KHz，振荡时间为60min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果表明玻璃基板上剩余的疏水蛋白较少，大的聚集颗粒明显消失，得到了纯度较高的疏水蛋白。
实施例4、疏水蛋白的分离提纯一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的硅片基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射1s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板。
二、疏水蛋白的分离提纯将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡1小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。然后用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，超声振荡功率密度分别设为500W/mL，振荡频率为300KHz，振荡时间为200min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果表明硅片基板上剩余的疏水蛋白较少，大的聚集颗粒明显消失，得到了纯度较高的疏水蛋白。
实施例5、疏水蛋白的分离提纯一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的石英基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射50s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板。
二、疏水蛋白的分离提纯将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡36小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。然后用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，超声振荡功率密度分别设为1.45W/mL，振荡频率为150KHz，振荡时间为150min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果表明石英基板上剩余的疏水蛋白较少，大的聚集颗粒明显消失，得到了纯度较高的疏水蛋白。
实施例6、疏水蛋白的分离提纯一、用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有Teflon粒子的固体基板的制备将洁净的石英基板放入离子束溅射镀膜机，安装上Teflon靶，真空抽至1.3E-3pa，溅射100s后取出，得到表面分布有Teflon粒子的固体基板。
二、疏水蛋白的分离提纯将步骤一制备的表面分布有Teflon粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白HFBII溶液中浸泡48小时，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，在原子力显微镜下观测并对图像进行分析，可以看到基板表面生长出了很大的形状不规则的疏水蛋白聚集体，这是由于疏水蛋白在Teflon粒子表面吸附并成核生长所致。由原子力显微镜配套的分析软件可得聚集体的高度可达约130nm，直径能达到约550nm，说明疏水蛋白的生长速率很高。然后用水对吸附有疏水蛋白的基板漂洗后，将其再放入盛有水的容器中进行超声振荡，超声振荡功率密度分别设为1.35W/mL，振荡频率为250KHz，振荡时间为30min，超声结束后将基板从溶液中取出，在原子力显微镜下观测，观测结果表明石英基板上剩余的疏水蛋白较少，大的聚集颗粒明显消失，得到了纯度较高的疏水蛋白。
权利要求
1.疏水蛋白的分离提纯方法，是先将表面分布有疏水性物质粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白溶液中浸泡，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中进行超声振荡，最后将基板从溶液中取出，得到经纯化的疏水蛋白溶液。
2.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于所述疏水性物质为特氟龙。
3.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于所述固体基板上分布的疏水性物质的粒子的密度为1×E2-3×E15个/cm2。
4.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于所述用于分离提纯疏水蛋白的表面分布有疏水性物质粒子的固体基板的制备方法为使用离子束溅射镀膜机在真空条件下向光滑洁净的固体基板表面轰击疏水性物质靶，得到表面分布有疏水性物质粒子的固体基板。
5.根据权利要求4所述的分离提纯方法，其特征在于所述溅射时间为1-600s。
6.根据权利要求1所述的分离提纯方法，其特征在于所述表面分布有疏水性物质粒子的固体基板在待提纯的疏水蛋白溶液中的浸泡时间为0.01-72小时。
7.根据权利要求1-6任一项所述的分离提纯方法，其特征在于所述超声振荡的功率密度为0.01-500W/mL，振荡频率为1-300KHz，振荡时间为0.01-300min。
8.根据权利要求7所述的分离提纯方法，其特征在于所述超声振荡的功率密度为1.35-1.45W/mL。
9.用权利要求1-8任一项所述方法得到的经分离纯化的疏水蛋白。
全文摘要
本发明公开了疏水蛋白的分离提纯方法。该方法是先将表面分布有疏水性物质粒子的固体基板置于待提纯的疏水蛋白溶液中浸泡，然后将基板从疏水蛋白溶液中取出，用水漂洗，再放入盛有水的容器中进行超声振荡，最后将基板从溶液中取出，得到经纯化的疏水蛋白溶液。该方法是利用疏水蛋白能够在疏水性物质表面吸附且疏水性物质的粒子对疏水蛋白有很强的异相成核生长作用，从而达到对疏水蛋白进行分离提纯的目的。用本发明的方法能够便捷地得到纯度较高的疏水蛋白溶液，并且该方法具有操作简单，条件要求低，成本低廉，疏水性物质表面可重复使用，易于进行工业化应用的优点。本发明将在疏水蛋白的分离纯化中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C07K1/14GK101054407SQ20071009964
公开日2007年10月17日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者胡振彦, 李良彬, 田扬超 申请人:中国科学技术大学