专利名称：灰树花疏水蛋白及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物生物技术，特别涉及一种食用真菌疏水蛋白及其基因。
背景技术：
灰树花又称舞茸、栗子蘑、莲花菇，学名贝叶多孔菌(Polyporus frondosus)，来源中国科学院典型培养物保藏委员会，编号ACCC 50246。疏水蛋白是由丝状真菌分泌的一类小分子量、疏水性蛋白质，这类蛋白可以在两相界面处自我装配，形成一层两性蛋白膜，可以改变介质表面的亲水或疏水性，即可以将疏水性表面变为亲水表面或者将亲水表面转变为疏水表面，并具有透气不透水的优良性质及良好的耐热性，在理论上和应用上均有着极高的价值。
1986年，Rosenberg和Kjelleberg小组在研究细菌与寄主吸附机理时首先提出了疏水蛋白这一概念，意指微生物细胞表面的任何疏水物质(林福呈，真菌疏水蛋白的研究进展，微生物学报，2001，4518-521)。随后，荷兰Wessels研究小组对裂褶菌疏水蛋白SC系列进行了深入研究，为疏水蛋白的研究方法开辟了新的思路(HAB.Wosten.Interfacial Self-Assembly ofa Fungal Hydrophobin into a Hydrophobic Rodlet Layer，PLANT CELL，1993；51567)，从此疏水蛋白的研究工作广泛开展。目前世界上已经报道的疏水蛋白有近70种，其中报道的食用真菌疏水蛋白却不是很多，国内还没有真菌疏水蛋白及其相关基因的报道。
真菌疏水蛋白具有在两相界面处自我装配成膜的特殊性质，这使它含有很多潜在的应用价值。例如，在食品制造业上，疏水蛋白可改善食品对抗相变能力在不通气状态下形成稳定泡沫；在果蔬保鲜方面，疏水蛋白可以在果蔬表面形成一层防腐保鲜被膜，这层被膜不仅可以防止多种微生物对果蔬的侵害，由于被膜本身是从食用真菌中提取出来的，因此可以直接食用，不用除去，甚为方便，弥补了保鲜膜及蜡封技术的缺陷；在日用产品中，疏水蛋白可通过自我装配而将面部的油脂等疏水的成分包裹起来，再用水清洗将其除去，也可以作为保护头发的天然膜，使发部维持清洁并保持一定水分；在蛋白质固定化方面，疏水蛋白可以将疏水性的酶类固定于亲水性的介质表面，如生物芯片技术上，可以将探针更牢固的固定在载体表面。
灰树花又称舞茸、栗子蘑、莲花菇，学名贝叶多孔菌(Polyporus frondosus)，是一种具有很高食用价值和药用价值的蘑菇，其分泌的多糖物质可以抑制癌细胞的生长并有抗艾滋病的作用。因灰树花疏水蛋白具有食用安全性，所以其理论和应用研究具有特殊的意义。
发明内容
本发明的目的是分离一种新型天然表面膜材料，应用于蛋白质的固定化、生物芯片、保湿美容、果蔬保鲜和医疗卫生中的伤口处理。
本发明的技术方案灰树花疏水蛋白基因含324个核苷酸，编码107个氨基酸的蛋白质，其中前19个氨基酸为信号肽，该基因的碱基序列、编码蛋白及成熟蛋白的氨基酸序列如下基因的碱基序列ATGTTCTCCAAGCTCGCCATCTTCGCTACTGCGGCCTTCGCCGTTCTTGCGGCTGCCACCCCTGTCCGCCGCCAACAGTGCACCACTGGCCAGCTCCAGTGCTGCGAGTCTACCTCCACTGCGAACGA
CCCGGCCACCAGCGAGCTCCTCGGTCTGATCGGCGTCGTCATCTCTGATGTCGACGCACTCGTCGGTCTCACCTGCTCGCCGATCTCCGTCATCGGCGTTGGCAGTGGCTCTGCGTGCACCGCGAACCCAGTGTGCTGTGACTCGTCGCCCATTGGTGGACTCGTCTCCATCGGATGTGTTCCGGTTAACGTCTGA编码蛋白的氨基酸序列MFSKLAIFATAAFAVLAAATPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV成熟蛋白的氨基酸序列TPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV该基因序列经过NCBI数据库比对，核酸序列未发现同源性基因；蛋白序列比对表明，由基因翻译后的疏水蛋白HGFI为107个氨基酸，其中前19个氨基酸为信号肽序列，与其同源性最高的为多年异担子菌中的疏水蛋白2(hydrophobin 2)，其同源性为51％，属于不同的疏水蛋白基因。
还包括与上述序列同源性等于或大于85％的核酸和蛋白序列。
编码的蛋白质可以用于蛋白质的固定化(应用于生物芯片和生物传感器)，也可以作为生物膜活性材料(应用于果蔬保鲜、保湿美容和医疗卫生中的创面保护等方面)。
本发明的灰树花疏水蛋白基因的分离方法是平皿培养灰树花菌丝，采用异硫氰酸胍法提取灰树花菌丝总RNA，用PolyATtractmRNA Isolation System(Promega公司)分离得到的灰树花mRNA。通过M-MLV RTase cDNA synthesis Kit(宝生物工程公司)建立灰树花cDNA文库，以mRNA为模板，带有XhoI酶切位点的Oligo(dT)12为引物，用逆转录法合成双链cDNA。将双链cDNA末端补平后与EcoRI接头连接，磷酸化后用XhoI酶切，连接到EcoRI和XhoI双酶切的载体pBluescript II SK(+)上，转化到大肠杆菌DH10B中，构建灰树花的cDNA文库。随机筛选50个cDNA克隆进行测序，其中两个cDNA序列包括相同的、完整的开放阅读框，含有324个核苷酸，是灰树花疏水蛋白基因的编码区。
本发明的灰树花疏水蛋白的分离方法是用2％的SDS沸水浴处理灰树花菌丝10分钟，用蒸馏水清洗干净，用氯仿/甲醇(3∶1)65℃水浴处理10分钟，冷冻干燥得到备用菌丝。将备用菌丝用100％的三氟乙酸(TFA)冰水浴超声波处理1分钟，12000r/min离心除去菌丝，用氮气将TFA吹干后，溶解于50％的乙醇中，冷冻干燥后电泳得到8.6kDa的条带，经序列分析证明为灰树花疏水蛋白基因编码的蛋白质。
本发明的有益效果是真菌疏水蛋白可以在两相界面自我装配，形成约10纳米厚的两性蛋白膜，其成膜效率非常高，形成的两性蛋白膜约10nm厚，每毫克的疏水蛋白足以形成一平方米大小的膜，覆盖于物质的表面。本发明灰树花疏水蛋白来源于食用真菌，所以具有食用安全性，此外，还可用于蛋白质的固定化、生物芯片、保湿美容、果蔬保鲜和医疗卫生中的伤口处理。
图1灰树花总RNA的电泳图谱图2采用Oligotex mRNA midi kit分离得到的灰树花mRNA图3cDNA合成过程中单链和双链cDNA的电泳4，图5目的片段切胶回收的过程图6切胶回收的双链cDNA目的片段图7水源性图谱图8，图9灰树花疏水蛋白编码的蛋白质前19个氨基酸为信号肽序列图10灰树花疏水蛋白的凝胶电泳具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1灰树花菌丝的培养1.灰树花种子液的制备种子液培养基配方为葡萄糖40g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO4·7H2O3g/L，胰蛋白胨5g/L，维生素B1 30mg/L，pH5.5～6.0，在250mL的三角瓶中培养，装液量为20％，每瓶种子液中加入3.5～4.0g的玻璃珠。取3cm2的灰树花平皿菌丝接菌，25℃，150r/min培养5天。
2.灰树花菌丝的培养灰树花菌丝培养基配方为葡萄糖20g/L，L-天冬氨酰1.5g/L，酵母抽提物1g/L，K2HPO41g/L，KH2PO40.46g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeCl3·6H2O 5mg/L，维生素B10.12mg/L，琼脂粉15g/L，pH5.5～6.0，在90cm平皿中培养，装液量为30mL，取种子液2mL接菌，25℃培养8～10天，刮下菌丝，-70℃冰箱中保存备用。
实施例2灰树花疏水蛋白基因的分离1.总RNA提取取0.3g灰树花菌丝置于研钵中，加入液氮研磨成粉末，迅速转移至11mL的离心管中，加入3mL变性液(6mol/L异硫氰酸胍，37.5mmol/L柠檬酸，0.75％十二烷基肌酸钠，0.15mol/Lβ-巯基乙醇)，混匀；加入300μL 2mol/L NaAc溶液(pH4.0)，反复颠倒离心管；加入3mL水饱和酚(pH≤4.0)和1mL氯仿/异戊醇(24∶1)，剧烈振荡10秒，冰浴15分钟；4℃ 10000r/min离心20分钟，转移上清，用等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)再抽提两次；转移上清，加入等体积的异丙醇，-70℃沉淀20分钟，4℃ 10000r/min离心20分钟；弃上清，将RNA沉淀用0.5mL无RNase的水溶解，加入1.5mL 4mol/L NaAc(pH7.0)，0℃过夜；4℃ 8000r/min离心15分钟，75％乙醇洗涤沉淀两次，将RNA溶解于适量无RNase的水中，-70℃保存。
图1是灰树花总RNA的电泳图谱。
2.mRNA的分离通过Promage mRNA提取试剂盒(PolyATtractmRNA Isolation System)，从灰树花总RNA中提取mRNA。
(1)探针的退火在一个无RNase的3mL离心管中，加入5mg总RNA，补充无RNase的去离子至总体积2.43mL；65℃水浴10分钟；加入10μL生物素标记的Oligo(dT)探针及60μL的20×SSC溶液，轻轻混匀，在室温下使其冷却。
(2)反应液的制备在一个无RNase的11mL离心管中，加入0.125mL的20×SSC和4.875mL的无RNase的去离子水，制备5mL的0.5×SSC溶液；在无RNase的11mL离心管中，加入50μL的20×SSC和9.95mL的无RNase的去离子水，制备10mL的0.1×SSC溶液。
(3)洗涤抗生物素蛋白链菌素磁球颗粒(SA-PMPs)轻轻敲打离心管底部，使SA-PMPs溶解，将其放置在磁圈上，使SA-PMPs吸附在管壁上，这个过程大约30秒；小心的吸去上清；用1.5mL的0.5×SSC洗涤SA-PMPs三次，每次小心吸去上清；将洗脱后的SA-PMPs溶解于0.5mL的0.5×SSC中。
(4)获得Oligo(dT)-mRNA复合体在含有的SA-PMPs溶液中加入退火试剂，室温下孵育10分钟，每1-2分钟轻轻混匀；通过磁圈获得SA-PMPs，并小心吸去上清；用1.5mL的0.1×SSC洗涤SA-PMPs四次，最后一次洗脱时，尽可能吸去上清。
(5)洗脱mRNA将最终的SA-PMPs溶于1.0mL的无RNase的水中，轻轻敲打试管底部，使其混匀；通过磁圈吸取上清，并转移至无RNase的2mL离心管中，醋酸钠沉淀获得mRNA。
图2是分离得到的灰树花mRNA。
泳道1为TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2为灰树花mRNA。
3.cDNA第一链的合成以mRNA为模板，带有XhoI酶切位点的Oligo d(T)12为引物，在反转录酶M-MLV Rtase作用下转录出cDNA第一链。
(1)在微量离心管中配置下表中反应液，总量20μL，轻轻搅拌混匀。
(2)室温放置10分钟后，移至42℃水浴锅中水浴1小时。
(3)反应结束后置于冰中2分钟。
4.cDNA第二链的合成先用RNaseH消化mRNA，然后以断裂的mRNA作为第二链合成的引物，以cDNA一链为模板在DNA Polymerase I作用下合成cDNA第二链。
5.双链cDNA末端补平在T4DNA polymerase的作用下将双链cDNA的末端补平，补平后的cDNA需要经过酚/氯仿/异戊醇纯化，去除多余的蛋白等杂质。
(1)在第一条链合成后的微量离心管中再加入下表中的反应液，总量146μL。
(2)加入2μL DNA Polymerase I和2μL RNaseH/DNA Ligase Mixture，轻轻搅拌混匀。
(3)16℃反应2小时。
(4)70℃加热10分钟，加入4μL T4DNA polymerase，轻轻搅拌。
(5)37℃反应10分钟，加入15μL 0.25M EDTA(pH8.0)以及15μL 10％SDS溶液，混和使反应停止。
(6)加入200μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀后12000r/min离心10分钟。
(7)向水相中加入200μL氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀后12000r/min离心10分钟。
(8)取水相，加入150μL 4M醋酸铵和850μL无水乙醇，充分混匀，室温放置10分钟。
(9)4℃ 15000r/min离心5分钟，用70％乙醇洗涤两次，用20μL TE Buffer溶解，-20℃保存备用。
图3是cDNA合成过程中单链和双链cDNA的电泳图。
泳道1为TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2为双链cDNA；泳道3为单链cDNA。
6.EcoRI接头的加接EcoRI接头(EcoRI Adaptor)在T4DNA连接酶(T4DNA Ligase)的作用下连接72小时，摩尔比为10∶1。
7.双链cDNA末端的磷酸化和XhoI酶切加完接头的cDNA双链先在T4PNK(T4多聚核糖苷激酶)的作用下进行末端磷酸化，然后经内切酶XhoI酶切消化后，产生XhoI粘性末端。
8.胶回收目的片断采用宝生物琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit)回收0.5-2kb的目的片断。
(1)使用TAE缓冲液配置1％琼脂糖凝胶，电泳合成的灰树花cDNA。
(2)在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，切碎，装入1.5mL离心管中。
(3)加入800μL胶块融化液DR-I Buffer，混匀后75℃水浴10分钟，使胶块完全融化。
(4)加入400μL DR-II Buffer，均匀混和，转移至Spin Column中，3600r/min离心1分钟，弃滤液。将500μL的Rinse A加入Spin Column中，3600r/min离心30秒，弃滤液。
(5)将700μL的Rinse B加入Spin Column中，3600r/min离心30秒，弃滤液，并重复此步骤。
(6)将Spin Column安置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25μL的无菌蒸馏水，室温静置1分钟。
(7)12000r/min离心1分钟洗脱DNA。
图4和图5为目的片段切胶回收的过程。
图中两侧泳道为TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；中间泳道为回收的片段。
图6为切胶回收的双链cDNA目的片段。
泳道1为TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2为切胶回收的0.5-2kb长度的片段；泳道3为切胶回收的大于2kb长度的片段。
9.连接和转化(cDNA文库构建完成)以Insert∶vector＝3∶1的比例将insert和载体pBluescript II SK(+)在T4DNA Ligase的作用下连接过夜。所有的连接产物在做转化前通过Millipore的膜纯化去除盐离子，纯化后得到14μL连接产物。取1μL连接产物电转化商品感受态细胞DH10B，37℃过夜培养后观察生长情况。
转化结果20μL涂板长了289个白色单菌落，蓝白斑比例为61∶289，转化后共得1000μL菌液，所以库容为289×50×14＝2.0×105个克隆。
10.灰树花疏水蛋白基因的筛选随机筛选50个转化子进行核苷酸序列分析，其中两个序列相同，含有八个保守的半胱氨酸位点，其水源性图谱(图7)及核苷酸序列说明它是疏水蛋白的基因。
11.灰树花疏水蛋白的序列分析通过http://au.expasy.org网站推测，所得到的灰树花疏水蛋白基因编码的蛋白质分子量为10561.22Da，等电点为4.23。
通过http://www.cbs.dtu.dk网站推测，所得到的灰树花疏水蛋白编码的蛋白质前19个氨基酸为信号肽(图8，图9)，则除去信号肽后成熟的疏水蛋白分子量约为8664.90，等电点为3.96。
实施例3灰树花疏水蛋白的分离1.菌丝的预处理用2％的SDS沸水浴处理灰树花菌丝10分钟，用蒸馏水清洗干净，用氯仿/甲醇(3∶1)65℃水浴处理10分钟，冷冻干燥得到备用菌丝。
2.灰树花疏水蛋白的抽提将备用菌丝用100％的TFA冰水浴超声波处理1分钟，12000r/min离心除去菌丝，用氮气将TFA吹干后，溶解于50％的乙醇中，冷冻干燥后得到灰树花疏水蛋白。
3.灰树花疏水蛋白的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳检测灰树花疏水蛋白，得到8.5kDa的条带，经过氨基酸序列测定，为灰树花疏水蛋白。
图10为灰树花疏水蛋白的电泳结果。
泳道1为上海生工低分子量蛋白质标准品；泳道2和泳道3为分离得到的疏水蛋白样品SEQUENCE LISTING<110>天津森乔生物科技发展有限公司
<120>灰树花疏水蛋白及其基因<130>20060125<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>324<212>DNA<213>真菌灰树花<220>
<221>CDS<222>(1)..(324)<400>1atg ttc tcc aag ctc gcc atc ttc gct act gcg gcc ttc gcc gtt ctt48Met Phe Ser Lys Leu Ala Ile Phe Ala Thr Ala Ala Phe Ala Val Leu1 5 10 15gcg gct gcc acc cct gtc cgc cgc caa cag tgc acc act ggc cag ctc96Ala Ala Ala Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu20 25 30cag tgc tgc gag tct acc tcc act gcg aac gac ccg gcc acc agc gag144Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu35 40 45ctc ctc ggt ctg atc ggc gtc gtc atc tct gat gtc gac gca ctc gtc192Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val50 55 60ggt ctc acc tgc tcg ccg atc tcc gtc atc ggc gtt ggc agt ggc tct240Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser65 70 75 80gcg tgc acc gcg aac cca gtg tgc tgt gac tcg tcg ccc att ggt gga288Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly85 90 95ctc gtc tcc atc gga tgt gtt ccg gtt aac gtc tga324Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val100 105<210>2<211>107<212>PRT<213>真菌灰树花
<400>2Met Phe Ser Lys Leu Ala Ile Phe Ala Thr Ala Ala Phe Ala Val Leu1 5 10 15Ala Ala Ala Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu20 25 30Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu35 40 45Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val50 55 60Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly85 90 95Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val100 105<210>3<211>107<212>PRT<213>真菌灰树花<220>
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1.食用真菌灰树花的疏水蛋白，其特征在于，其编码基因含324个核苷酸，编码107个氨基酸的蛋白质，含有19个氨基酸的信号肽，该基因序列如下ATGTTCTCCAAGCTCGCCATCTTCGCTACTGCGGCCTTCGCCGTTCTTGCGGCTGCCACCCCTGTCCGCCGCCAACAGTGCACCACTGGCCAGCTCCAGTGCTGCGAGTCTACCTCCACTGCGAACGACCCGGCCACCAGCGAGCTCCTCGGTCTGATCGGCGTCGTCATCTCTGATGTCGACGCACTCGTCGGTCTCACCTGCTCGCCGATCTCCGTCATCGGCGTTGGCAGTGGCTCTGCGTGCACCGCGAACCCAGTGTGCTGTGACTCGTCGCCCATTGGTGGACTCGTCTCCATCGGATGTGTTCCGGTTAACGTCTGA编码蛋白的序列如下MFSKLAIFATAAFAVLAAATPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV成熟蛋白的序列如下TPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
2.根据权利要求1所述的食用真菌灰树花的疏水蛋白，其特征在于，还包括与上述序列同源性等于或大于85％的核酸和蛋白序列。
3.食用真菌灰树花的疏水蛋白在蛋白质的固定化方面的应用，包括生物芯片和生物传感器，和在生物膜活性材料方面的应用，包括果蔬保鲜、保湿美容和医疗卫生中的创面保护。
全文摘要
本发明公开了真菌灰树花疏水蛋白及其基因，属于微生物生物技术领域。本发明分离并测定了含有324个核苷酸的灰树花疏水蛋白基因，分离并纯化了灰树花疏水蛋白。灰树花疏水蛋白基因编码107个氨基酸的蛋白质，含有19个氨基酸的信号肽。该蛋白可以安全地用于蛋白质的固定化，包括生物芯片和生物传感器；也可以作为生物膜活性材料，应用于果蔬保鲜、保湿美容和医疗卫生中的创面保护等方面。
文档编号C07K14/37GK1944650SQ20061001311
公开日2007年4月11日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者乔明强, 于雷, 徐海津, 张强 申请人:天津森乔生物科技发展有限公司