专利名称：：疏水蛋白用作可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的包被剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有含疏水蛋白包被的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，和其制备方法。
背景技术：
：为了使可发型聚苯乙烯能够无故障的运输，并减少预发泡聚苯乙烯泡沫颗粒上的静电荷，通常用抗静电物质涂布EPS颗粒。时常由于包被剂从颗粒表面被刮掉或洗掉而导致抗静电性质不令人满意。抗静电包被也会导致颗粒结块和流动性能较弱。EP-A470455描述了具有含季铵盐和细粒二氧化硅包被的串珠状抗静电可发型苯乙烯聚合体，其具有良好的流动性能。疏水蛋白是约100-150个氨基酸的小蛋白，其为丝状真菌(例如普通裂褶菌(^/^印/^//"附"附附"加))的特征蛋白。它们通常含有8个半胱氨酸单位。疏水蛋白对于接触面有显著的亲和力，因此适合用于包被表面。因此可能通过用疏水蛋白涂布例如聚四氟乙烯(Teflon)来获得亲水表面。疏水蛋白可以从天然物质中分离出来。我们先前的申请DE102005007480.47>开了制备疏水蛋白的方法。疏水蛋白对于多种应用的用途也已经在现有技术中提出。WO96/41882提出疏水蛋白作为乳化剂、增稠剂、表面活性剂，用于使疏水表面亲水、改良亲7JC底物的抗水性、制备水包油型乳剂或油包水乳剂的用途。也提出了在药物上的应用，例如制备软膏或乳膏，还有在化妆品上的应用，例如护肤或制备洗发香波或洗发剂。WO01/57528公开了在30-80。C温度下用含有疏水蛋白的溶液涂布窗户、隐性眼镜、生物传感器、医疗器械、用于实验或储存的器皿、船外壳、固体颗粒或载客运输工具的底盘或车体。WO03/53383公开了疏水蛋白用于处理化妆品应用中的角蛋白材料的用途。WO03/10331公开了疏水蛋白包被的传感器，(例如测量电极)，该传感器上非共价连有其他物质如电活性物质、抗体或酶。
发明内容因此本发明的主题是除去所提及的缺点，并找到可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的抗静电包被剂，其减少颗粒在发泡前或发泡过程中结块而降低密度的趋势。相应地，找到了上述的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒。根据热塑性聚合体，包被优选包含1-5000ppm、尤其10-1000ppm的疏水蛋白。包被可能还包含防静电剂和/或包被辅剂，或者可能被应用于含有不同包被剂的进一步涂布。尤其优选只由疏水蛋白或疏水蛋白混合物组成的包被，并且其在可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒上形成单分子层。优选用于可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒苯乙烯聚合体，例如聚苯乙烯(EPS)，或聚烯烃(polyolefin)，例如聚乙烯(EPE)或聚丙烯(EPP)。可发型热塑性聚合体颗粒是那些能够例如借助热空气或蒸汽而发泡产生膨"长的热塑性聚合体颗粒。它们通常包含化学的或物理的发泡剂，其量为热塑性聚合体重量的2-10%，优选3-7%。优选的物理发泡剂是气体，例如氮或二氧化碳或具有2-7个碳原子的脂肪族烃、乙醇、酮、醚或卤代烃。尤其优选使用异丁烷、(正)-丁烷、异戊烷、(正)-戊烷、新戊烷、己烷或其混合物。可发和膨胀型热塑性聚合体颗粒可能还包含有效量的常用辅剂，例如染料、色素、填充剂、IR吸收剂(例如碳黑、铝或石墨)、稳定剂、阻燃剂例如六溴环十二烷(HBCD)、增效阻燃剂例如二异丙苯或过氧化二异丙苯、成核剂或助流剂。依赖于制造过程，根据本发明的可发型热塑性聚合体颗粒可能是球形、小珠形或圓柱形的，且通常其平均颗粒直径在0.05-5mm范围内，尤其在0.3-2.5mm范围内，而且如果适当可以通过筛选分为独立的部分。膨胀型热塑性聚合体颗粒的平均颗粒直径在1-10mm范围内，尤其在2-6mm范围内，且相应于膨胀程度其密度在10-200kg/m3范围内。可发型热塑性聚合体颗粒可以例如通过将热塑性聚合体颗粒用发泡剂在池中压力浸渍而获得，通过在发泡剂存在下进行悬浮聚合或通过在挤压机或静电混合机中进行融解浸渍并且随后在水下进行压力成粒而获得。膨胀型热塑性聚合体颗粒可以通过将可发型热塑性聚合体颗粒使用例如热空气或蒸汽在压力预起泡机中发泡而获得，通过将热塑性聚合体颗粒用发泡剂在池中压力浸渍并且随后还原压力而获得，或通过包含发泡剂的融解挤压发泡和随后的成粒而获得。术语"疏水蛋白"根据本发明指具有如下通用结构式(l)的蛋白质Xn-G、Xi隱5o-G2-Xo-5—G3-Xi.ioo画G4-Xi-ioo一C!5"X"5o-G6"Xo-5—G7-Xi-5o-G8-!Xm(1)，其中X可能是任意的20个天然存在的氨基酸(苯丙氨酸Phe、亮氨酸Leu、丝氨酸Ser、酪氨酸Tyr、半胱氨酸Cys、色氨酸Trp、脯氨酸Pro、组氨酸His、谷氨酰胺Gln、精氨酸Arg、异亮氨酸Ile、甲硫氨酸Met、苏氨酸Thr、天冬酰胺Asn、赖氨酸Lys、缬氨酸Val、丙氨酸Ala、天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly)。X也可能在各情况下是相同或不同的。X旁边的指数表示在各情况下的氨基酸数，C是半胱氨酸，指数n和m是不依赖于彼此的0-500，优选15-300之间的自然数。此外，根据公式(l)的多肽的特征在于，相对于相同大小的水滴与未包被的玻璃表面形成的接触角，该多肽的特性可使(玻璃表面包被后)水滴接触角增加至少20。，优选至少25。，和尤其优选30。，其中每一测量均在室温进行。表示为d到C8的半胱氨酸可以是还原状态或者彼此形成二硫键。尤其优选在分子内形成C-C桥，尤其至少l个，优选2个，尤其优选3个和特别尤其优选4个分子内二石充键。本发明优选应用具有通式(ll)的疏水蛋白进行，Xn-C1-X3-25-C2-Xo-2-C3-X5_50-C4-X2-35-C5-X2-i5-C6-Xo-2-C7-X3_35-C8-Xm(II)其中X、C及X和C旁边的指数与上述定义一致，然而指数n和m在0-300之间，而且通过上述接触角的变化来区分蛋白质。尤其优选应用具有通式(lll)的疏水蛋白Xn-C、Xs-9一C2匪C3-Xii一39-C4-X2-23—C5-X5-9-C6-C7-X6陽i8—C8-Xm(III)其中X、C及X和C旁边的指数与上述定义一致，指数n和m在0-200之间，而且通过上述接触角的变化来区分蛋白质。Xn和Xm残基可能是天然连接于疏水蛋白的肽序列。然而，也可能其各自或两者都不是天然连接于疏水蛋白的肽序列。也包括那些疏水蛋白中天然存在的肽序列由非天然存在于疏水蛋白中的肽序列所延长的Xn和/或X加残基。如果Xn和/或Xm不是天然连接于疏水蛋白的肽序列，此类序列通常长度为至少20个氨基酸，优选至少35个，尤其优选至少50个和特别尤其优选至少100个氨基酸。此类非天然连接于疏水蛋白的残基也指下文中的融合配偶体。这是为了说明所述蛋白质可能由至少一个疏水蛋白部分和一个融合配偶体组成，自然条件下它们并不以这种形式共同存在。融合配偶体可能选自多种蛋白质。对于多数融合配偶体，其也可能连接一个疏水蛋白部分，例如连接于所述疏水蛋白部分的氨基端(Xn)和羧基端(XJ。然而，也可能例如两个融合配偶体连接于本发明蛋白质的一个位点(Xn或Xm)。尤其合适的融合配偶体部分是在微生物、特别是大肠杆菌(ECO/Z)或枯草芽孢杆菌(5fl"7/wssw/^7/s)中天然存在的蛋白质。此类融合配偶体部分的实例是序列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)、和硫氧还蛋白。同样高度适用的是前述序列的片段或衍生物，其只含有所述序列的部分、优选70-99%、尤其优选80-98%，或相对于所述序列其中个别氨基酸或核苷晚t生了改变，在各情况中所述百分比指M酸数。还可另外修饰根据本发明使用的蛋白质的多肽序列，例如通基化、乙酰化，或者化学交联(例如通过戊二醛交联)。根据本发明使用的蛋白质的一个特征是当使用所述蛋白包被表面时，该表面性质改变。通过测量用蛋白质包#_表面前后的水滴接触角并确定两次测量之差，可以试验性确定表面特性的改变。接触角的测量原则上是技术人员所公知的。测量基于室温和5升水的小水滴。适合于实施例的用于测量接触角的方法的精确实验条件在实验部分说明。在其中所述的条件下，根据本发明使用的蛋白质与未包被的玻璃表面与同样大小水滴的接触角相比具有增加接触角至少20。，优选至少25°,尤其优选30。的特性。目前已知的疏水蛋白中，疏水蛋白部分的极性和非极性氨基酸的位置是保守的，导致特征性的疏水性图谱。根据生物物理学性质和疏水性的差异将目前已知的疏水蛋白分为两类，I类和II类(Wessels等人1994，Ann.Rev.Phytopathol.，32，413-437)。I类疏水蛋白组装的膜高度不可溶(即使是升高温度在1%的十二烷基硫酸钠(SDS)中也是如此)，并且只能通过浓缩的三氟乙酸(TFA)或曱酸而再次解离。与之相反，II类疏水蛋白的组装形式较不稳定。它们通过60%浓度的乙醇或1。/oSDS(在室温)即可再次解离。氨基酸序列的比较揭示，在II类疏水蛋白中(:3和C"半胱氨酸之间区域的长度明显小于I类疏水蛋白。此外，II类疏水蛋白比I类疏水蛋白具有更多带电荷的氨基酸。实施本发明尤其优选的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型的疏水蛋白，下文的序列表对其进行了结构表征。它们也可能仅为所述类型的部分或衍生物。也可能将多个相同或不同结构的多个疏水蛋白部分(优选2个或3个)一起连接于并非天然连接疏水蛋白的相应适宜多肽序列上。实施本发明尤其适合的还有具有SEQIDNO:20、22、24中所示多肽序列的融合蛋白质及其编码核酸序列，尤其是根据SEQIDNO:19、21、23的序列。尤其优选的实施方案还包括由SEQIDNO:20、22或24所示多肽序列起始，通过取代、插入或缺失至少l个至多10个、优选5个、更优选所有氨基酸的5%而产生的蛋白质，所述蛋白质仍然具有起始蛋白质至少50%的生物特性。此处蛋白质的生物学特性指上述接触角至少增加20。。根据本发明使用的蛋白质可以通过肽合成的成熟技术化学制备，例如通过Merrifidd固相合成。可以通过合适的手段将天然存在的疏水蛋白从天然来源分离出来。例如可见W6sten等人，Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。融合蛋白质优选通过基因工程方法制备，其中一个编码融合配偶体的核酸序列(特别是DNA序列)与一个编码疏水蛋白部分的核酸序列(特别是DNA序列)组合，从而通过组合核^列的基因表达在宿主生物体中产生所需要的蛋白质。在我们的在先申请DE102005007480.4中公开了此类制备方法。此处用于所述构建方法的合适的宿主生物体(生产生物体)是原核生物(包括古细菌04rc/^"efl))或真核生物，尤其是细菌包括嗜盐菌(/ifl/o^cteWfl)和甲烷球菌(柳e沩fl朋cd)，真菌，昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞，尤其优选大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(5fl"7/船/M"flteWM柳)、米曲霉(/4s/7e/"gz7/MS、构巢曲霉(y45/7^^7/附肌V/w/flW力、黑曲霉045/;erg///MSZger)、巴斯德毕赤酵母(尸Zc/iZfl/mstoWs)、假单胞菌属物种(i^wfifo附o"as15/7ec.)、乳酸軒菌(/flcto6a"7//)、多形汉逊酵母(^Tam^"w/fl/7((K附or/^fl)、里氏木霉(rnV^otife/7Wffzr^"〕、SF9(或相关细胞)等等。本发明还涉及表达构建体的用途，所述表达构建体包含在调控核列的遗传控制下编码根据本发明使用的多肽的核酸序列，并且本发明也涉及包含至少一个此类表达构建体的载体。所用构建体优选包含特定编码序列的5，上游启动子和3，下游终止序列，适用的情况下还包含各自与编码序列有效连接的其他常用调控元件。"有效连接，，指启动子、编码序列、终止子和适用情况下的其他调控元件的有序排列，从而使每个调控元件能够实现其表达编码序列所需的功能。有效连接序列的实例为寻耙序列以及增强子、多腺苷酸化信号等等。其它调控元件包含可选标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控元件在例如Goeddel，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，SanDiego，CA(19卯)中描述。除这些调控序列以外，可能在实际结构基因的上游仍存在对这些序列的天然调控，且适用的情况下可对之进行遗传修饰，从而通过关闭天然调控而增强基因表达。优选的核酸构建体最好还包含一个或多个与启动子功能性连接的上述增强子序列，以增强核酸序列的表达。其他有利的序列，例如其他的调控元件或终止子也可插入到DNA序列的3，末端。构建体中可能具有一个或多个拷贝的核酸。如果为筛选所述构建体所需，构建体也可能包含其他标记，例如抗生素抗性或营养缺陷型补偿基因。例如，所述方法有利的调控序列存在于启动子如cos、tac、trp、tet、trp、tet、lpp、lac、lpp匪lac、lacIq醒T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、入-PR启动子或U启动子中，这些启动子最好在革兰氏阴性菌中使用。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SP02,和酵母或真菌启动子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。也可以〗吏用人工启动子进行调控。为了在宿主生物体中表达的目的，有利地是将核酸构建体插入例如能够使基因在宿主细胞中最优表达的载体(例如质粒或噬菌体)。除质粒和噬菌体以外，载体也指技术人员所公知的任何其它载体，即例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)，转座子，IS元件，噬粒，粘粒，和线性或环状DNA，以及农杆菌系统。这些载体可以在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。这些载体构成本发明的其他实施方案。合适质粒的实例是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN國III，，3-Bl、tgtll或pBdCI,链霉菌(5^印to附j;cey)的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，杆菌的pUB110、pC194或pBD214，棒状杆菌(C。/j"Wfl"eWw附)的pSA77或pAJ667,真菌的pALSl、pIL2或pBB116，酵母中的2ot、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23，或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒是可能质粒的一小部分选择。其它质粒是技术人员所公知的，并且能够在例如《克隆载体》(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)中找到。为了表达其它存在的基因，核酸构建体也有利地包含3，-末端和/或5，-末端调控序列来增强表达，所述序列根据宿主生物和基因的选择而加以选择，以达到最佳表达。这些调控序列旨在使基因和蛋白质特异性表达。这意味着取决于宿主生物体，例如基因只在诱导后表达或过表达，或者立即表达和/或过表达。在这点上，优选引入的调控序列或因子具有正面影响，并且增强其被引入的基因的表达。因此，使用强转录信号(例如启动子和/或增强子)在转录水平增强调控元件是有利的。然而，除此之外，也可能通过例如改良mRNA稳定性来增强翻译。在载体的另一实施方案中，包含本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可能以线性DNA的形式被有利地引入微生物中，并通过异源或同源重组的方式整合到宿主生物体的基因组中。此线性DNA可能由线性化载体(例如质粒)组成，或仅由核酸构建体或核酸组成。为实现生物中异源基因的最佳表达，最好根据生物中特定的密码子使用来修饰核酸序列。通过计算机分析所研究生物的其他已知基因，可以确定密码子的使用。将合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止信号或多聚腺苷酸信号融合来制备表达盒。常规重组和克隆技术见于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M丄.Berman和L.W.Enquist，基因融合实验，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)以及在Ausubel，F.M.等人，现代分子生物学实验方法，GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987)中的描述。为了实现在合适宿主生物体中的表达，最好将重组核酸构建体或基因构建体插入宿主特异性载体中，这可使基因在宿主中最优表达。载体是技术人员所熟知的，并且能够在例如"克隆载体"(PouwelsP.H.等人，Eds.，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中找到。可以利用载体制备例如由至少一个载体转化的可用于生产本发明所用多肽的重组4敫生物。最好将上述重组构建体引入合适的宿主系统并表达之。在此情况下，优选使用技术人员熟知的常用克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等，以引起所述核酸在特定表达系统中表达。合适的系统在例如现代分子生物学实验方法，F.Ausubel等人编辑，WileyInterscience,NewYork1997,或Sambrook等人，分子克隆实验室操作手册，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述。也可以制备同源重组微生物。为此，可制备包括至少一部分本发明所用基因或编码序列的载体，适用的情况下，所述编码序列中引入至少一个氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸取代，从而修饰(例如功能性破坏)该序列(敲除载体)。引入的序列可为例如相关微生物的同源物或由哺乳动物、酵母或昆虫来源衍生而来。或者，可设计用于同源重组的载体，从而使内源性基因在同源重组时发生突变或其他改变，但仍然编码功能性蛋白质(例如改变上游调控区域由此改变内源性蛋白质的表达)。本发明所用的基因的改变的部分位于同源重组载体中。适合同源重组的载体的构建在例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中描述。适合本发明4吏用的核酸或核酸构建体的重组宿主生物体原则上是任何原核或真核生物体。最好使用微生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物体。革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选肠杆菌科(五"fe/Y/^ctef7'flceae)、假单胞菌科(i^ew/o附o/ia^iceae)、根瘤菌科(及/^oMfl"ae)、链霉菌科(5^印to附ycetoc^^)或诺卡氏菌科(iVoainftVice"e)的细菌，特别优选使用的细菌为埃希氏菌属(E^&Wc/t/fl)、假单胞菌属、链酶菌属、诺卡氏菌属、伯克霍尔德菌属(5"rA:Ao/rfeW")、沙门氏菌属(5^/附0^//")、农杆菌属或红球菌属(及/^&C0CC做)的细菌。依据宿主生物体，按技术人员公知的方法生长或培养制备融合蛋白质的过程中使用的生物体。微生物通常生长在液体培养基中，其中包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有机氩源的形式例如酵母提取物，或例如疏酸铵等盐类)、微量元素(例如铁盐、锰盐和镁盐)、以及适用情况下的维生素，生长温度在0。C到100。C之间，优选10。C到60。C,同时供以氧气。此种情况培养液pH值可以维持或不维持在固定值，即在培养过程中可以调节或不调节。可以进行分批发酵、半分批发酵或连续培养。可以在发酵最初开始时引入营养素，或以半连续或连续方式进行随后加料。可以通过实施例中所描述的方法从生物体中分离酶，或者在反应中使用酶粗提物。可以用重组方法制备本发明使用的蛋白质或其功能生物活性片段，通过培养产生蛋白质的微生物，适用的情况下诱导表达蛋白质，而且从培养液中分离所述蛋白质。如杲需要，也可以通过此种方法在工业上生产蛋白质。可以通过已知方法培养和发酵重组孩1生物。例如细菌可以在20-40。C,pH6-9条件下，在TB培养基或LB培养基中繁殖。合适的培养条件例如在T.Maniatis,E.F.Fritseh和J.Sambrook，分子克隆实验室操作手册，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)中详细描述。如果本发明使用的蛋白质并非分泌至培养基中，那么就要破坏细胞，通过已知的蛋白质分离方法从溶菌产物中获得产品。正如所预期的，通过高频超声、高压(例如在弗氏压碎器中)、渗透、使用去污剂、水解酶或有机溶剂、匀浆等手段，或通过所列出的方法中两个或更多的组合来破坏细胞。本发明使用的蛋白质可以用已知的层析方法纯化，例如分子篩层析(凝胶过滤法)，例如Q琼脂糖层析，离子交换层析和疏水层析，以及使用其它常用方法，例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper,F.G"BiochemischeArbeitsmethoden，VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R.，蛋白质纯化，SpringerVerlag，NewYork,Heidelberg,Berlin中描述。通过载体系统或寡核苷酸分离重组蛋白质可能有利，所述寡核苷酸以特定核苷酸序列延伸了cDNA,从而编码改变的多肽或融合蛋白质，可用于例如简化纯化。此类合适的修饰的实例是作为锚起作用的"标签"，例如六组氨酸锚的修饰、或能够作为抗原被抗体识别的表位(例如在Harlow,E.和Lane,D.，1988，抗体:实验室操作手册，ColdSpringHarbor(N.Y.)Press中描述)。其它合适的标签是例如HA、钩调节蛋白-BD、GST、MBD;几丁质-BD、链霉亲和素-BD-avi-标签、Flag-标签、T7等等。这些锚可以用于将蛋白质附着在固体栽体上，例如聚合体基质，例如其可填充到层析柱中，或用于微孔滴定板或其它载体。相应的纯化方法可以从商品化的亲和标签供应商那里获得。如所述制备的蛋白质可以作为融合蛋白直接使用或切割除去融合配偶体后以"纯化的"疏水蛋白使用。当需要移除融合配偶体时，推荐在融合蛋白中疏水蛋白部分和融合配偶体部分之间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特定识别位点)。合适的切割位点具体包括通过生物信息学工具能够确定的那些否则将既不存在于疏水蛋白部分也不存在于融合配偶体部分中的肽序列。尤其合适的是例如在甲硫氨酸的BrCN切割或蛋白酶介导的Xa因子切割、肠激酶切割、凝血酶、TEV切割(烟草蚀紋病毒蛋白酶)。可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒可以在发泡之前或之后涂布疏水蛋白，例如通过用L6dige搅拌混合器在圆筒中涂布疏水蛋白，或者通过例如浸渍或喷雾法用含有疏水蛋白的溶液接触所述聚合体颗粒表面。通过挤压含有发泡剂的熔化物的制备方式还包括向水下装置的水回路中加入疏水蛋白。可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒优选用浓度为1-100g/l和pH值在5-9范围内的疏水蛋白的水溶液包被。含有疏水蛋白的溶液通常在0-140。C温度范围，优选在30-80'C范围内应用。根据本发明的可发和膨胀型热塑性聚合体颗粒是抗静电的，其在发泡过程中结块的倾向较低，但是当发泡后塑形时有很好的融合性。实施例实施例1克隆yaad-HisJyaaE-His^的准备工作用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是枯草芽孢杆菌基因组DNA。获得的PCR片段包含枯草芽孢杆菌yaaD/yaaE基因的编码序列，和分别在其末端的Ncol和BglII限制性切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段克隆到来自Qiagen的载体pQE60中，该载体预先用限制性内切酶Ncol和BglII线性化。这样获得的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5分别用于表达含有YAAD::HIS6和YAAE::HIS6的蛋白质。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagecgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc实施例2yaad疏水蛋白DewA-Hist的克隆用寡核苷酸KaM416和KaM417进行多聚酶链式反应。所使用的模板DNA是构巢曲霉基因组DNA。获得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列，和N-末端因子Xa蛋白酶切割位点。纯化PCR片段，并用限制性内切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段克隆到载体pQE60YAAD#2中，该载体预先用限制性内切酶BglII线性化。这样获得的载体#508用于表达含有YAAD::Xa::dewA::HIS6的融合蛋白质。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC实施例3vaad疏水蛋白RodA-His^的克隆质粒#513的克隆类似于质粒#508,使用寡核苦酸KaM434和KaM435。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG实施例4vaad疏水蛋白BASF1-His^的克隆质粒#507的克隆类似于质粒#508，4吏用寡核苷酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASFl-(见附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例5vaad疏7jC蛋白BASF2-His^的克隆质粒#506的克隆类似于质粒#508,4吏用寡核苦酸KaM417和KaM418。使用的模板DNA是人工合成DNA序列-疏水蛋白BASF2(见附件)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG实施例6vaad疏7jC蛋白SC3-His^的克隆质粒#526的克隆类似于质粒#508，使用寡核芬酸KaM464和KaM465。使用的模板DNA是SchyzophyllumcommunecDNA(见附录)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT实施例7vaad疏水蛋白DewA-Hisi重组大肠杆菌菌林的发酵将含有表达yaad疏水蛋白DewA-His6的大肠杆菌菌林的3mlLB液体培养基接种于15mlGreiner管中。于37。C在振荡器上以200rpm培养8小时。将1ml此预培养液各自接种于2个1升有塞子锥形瓶中的250mlLB培养基中(+100ng/ml氨节青霉素)，在37。C以180rpm振荡培养9小时。将0.5升的预培养液(相对于水测量OD6。。^nl:10)接种于13.5升的LM培养基(+100网/ml氨苄青霉素)中，置于20升的发酵罐。在OD咖腿约3.5时添加140ml的100mMIPTG。3小时以后，将发酵罐冷却到10°C，并通过离心除去发酵液。细胞沉淀用于进一步的纯化。实施例8重组疏水蛋白融合蛋白的纯化f带有C-末端His6标签的疏水蛋白融合蛋白的纯化)100g的细胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)用50mMpH7.5的磷酸钠緩沖液补足到总体积为200ml，并将沉淀重悬。悬浮液用T25型高速分散器UItraturrax(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)处理10分钟，随后为了降解核酸，再与500单位benzonase核酸酶(Merck，Darmstadt;orderNo.1.01697.0001)在室温培育1小时。在破坏细胞之前使用玻璃萃取柱(P1)进行过滤。为了破坏细胞和剪断剩余的基因组DNA,用匀浆器在1500巴进4亍2次处理(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。将勻浆液离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4°C，12000rpm，23000g)，上清置于水上，用100mlpH7.5的磷酸钠緩沖液重悬沉淀。重复3次离心和重悬，在第3次重复时磷酸钠緩冲液中包含1%SDS。重悬以后，将溶液搅拌1小时，然后进行最终离心(SorvallRC-5B，GSA转子，250ml离心筒，60分钟，4。C，12000rpm，23000g)。根据SDS-PAGE分析，疏水蛋白存在于最终离心的上清液部分(图1)。实验显示疏水蛋白可以以包涵体的形式存在于相应大肠杆菌中。50ml含疏水蛋白的上清液应用于以50mMpH8.0的Tris-Cl緩沖液平衡的50ml镍-琼脂糖高性能17-5268-02柱(Amersham)。用50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液洗柱，随后用包含200mM咪唑的50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液洗脱疏水蛋白。为了去除咪唑，溶液用50mMpH8.0的Tris-Cl緩冲液透析。图1描述所制备的疏水蛋白的纯化1泳道应用于镍-琼脂糖柱的溶液(l:10稀释)2泳道流出液=清洗步骤的洗脱液3-5泳道洗脱级分的OD280峰图1的疏水蛋白分子量约为53kD。一些较小条带代表疏氷蛋白的降解产物。实施例9性能测试疏水蛋白改变水滴在玻璃上接触角的特性基质玻璃(窗玻璃，SttddeutscheGIas，Mannheim,Germany):-疏7jc蛋白浓度100pg/mL画玻璃片在50mMpH4的醋酸钠+0.1%聚氧乙烯(20)去水山梨醇单月桂酸S旨(Tween⑧20)中培育过夜(温度80°C)-随后包被，在蒸馏水中清洗-然后于80。C在1。/。十二烷基琉酸钠(SDS)的蒸馏水溶液中培育10分钟-在蒸馏水中清洗样品在空气中干燥，且在室温下测定5水滴的接触角(单位为度)。接触角的测量用03131^8^接触角系统(^^15+仪器，软件为SCA20.2.0.(2002年11月)。根据制造商的说明书进行测量。未处理的玻璃接触角为30±5。，以根据实施例8的功能性疏水蛋白(yaad-dewA-his6)包被的玻璃接触角为75±5。。实施例10和11以疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6包被EPS小珠包4皮剂疏水蛋白pQE60+YaaD+Xa+dewA+HIS6(SEQIDNO:19)的水溶液，根据实施例8进4亍预处理(50mMNaH2P04，pH7.5，疏水蛋白浓度6.08g/l)。未包被的可发型聚苯乙烯(EPS)小珠直径在0.7-1.0mm范围内，其通过悬浮聚合(StyroporF315/N)的方法制备，按如下方法进行干燥和包被称量50gEPS小珠置于500ml有旋转瓶盖的玻璃瓶中，分别与10ml和20ml的疏水蛋白溶液混合，并且在滚筒混合器中室温搅拌24小时。然后用滤纸滤出疏水蛋白包被的EPS小珠，在室温干燥5小时。比较实验VI重复实施例IO，但是不同之处在于用10ml蒸馏水代替疏水蛋白溶液。实施例10和11以及比较实验中包被的EPS小珠，各自在预膨胀器(Rauscher)中于100。C预发泡2分钟，以形成聚苯乙烯泡沫珠，并且在存储3天后融合塑形。通过在存储2天以后破坏塑形的一半来评估塑形的品质。通过测量预发泡和干燥的聚苯乙烯泡沫珠的表面电阻来评估抗静电特性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>序列表中DNA和多肽序列的序列名<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1.具有含疏水蛋白的包被的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒。2.根据权利要求l的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其中基于热塑性聚合体，该包被包含1-5000ppm的疏水蛋白。3.根据权利要求l的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其中热塑性聚合体由聚苯乙烯或聚烯烃组成。4.根据权利要求1到3的任一项的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其平均颗粒直径在0.05-5mm范围内。5.根据权利要求1到4的任一项的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其中该包被包含通式(II)的疏水蛋白(11)，其中X是任意的20个天然存在的氨基酸，n和m是0-500之间的数值，C是半胱氨酸。6.根据权利要求4的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其中该包被包含通式(III)的疏水蛋白Xn-C、X5-9-C2-C3-Xu-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm(III)。7.根据权利要求1到4的任一项的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，其中该包,皮包含dewA、rodA、hjypA、hypB、sc3、basfl或basf2型疏水蛋白。8.包^f皮可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒的方法，其中将聚合体颗粒的表面与含疏水蛋白的溶液接触。9.根据权利要求1到4的任一项的方法，其中所使用的含疏水蛋白的溶液是疏水蛋白浓度为1-100g/1且pH值在5-9范围内的水溶液。10.根据权利要求1到5的任一项的方法，其中将该表面在0-140。C温度范围内与含疏7JC蛋白的溶液接触。全文摘要本发明涉及具有包被的可发或膨胀型热塑性聚合体颗粒，所述包被包含疏水蛋白，尤其是通用结构式(I)的蛋白质X<sub>n</sub>-C<sup>1</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>2</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>3</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>4</sup>-X<sub>1-100</sub>-C<sup>5</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>6</sup>-X<sub>0-5</sub>-C<sup>7</sup>-X<sub>1-50</sub>-C<sup>8</sup>-X<sub>m</sub>(I)，其中X代表任意的20个天然存在的氨基酸，n和m代表0-500之间的数值，且C代表半胱氨酸。本发明还涉及所述颗粒作为抗静电剂的用途。文档编号C08J9/00GK101189290SQ200680020055公开日2008年5月28日申请日期2006年6月9日优先权日2005年6月10日发明者C·博尔施韦勒,C·埃克斯纳,H-G·勒迈尔,J·霍洛赫,M·考罗什,T·萨布科夫斯基,U·鲍斯申请人:巴斯福股份公司