: 1的蛋白的核酸序列编码的多 肽。
[0097] 本发明所述多肽可以相应地通过微生物法或通过转基因哺乳动物产生。此外预见 到本发明多肽还从转基因植物回收得到。或者可以合成或半合成地产生本发明多肽。
[0098]例如，化学合成，例如 Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985),5131-5135 中记载的固相法。另一种方法是体外翻译mRNA。优选的方法涉及如前述宿主细胞中蛋白 的重组产生。例如，能够通过PCR合成包含根据本发明核苷酸序列中任一个的全部或部分 的核苷酸序列，其被插入表达载体中，然后利用所述表达载体转化宿主细胞。之后，培养宿 主细胞以产生所需的多肽，将其分离和纯化。可以通过若干已知技术中任一种实现蛋白分 离和纯化；所述技术例如但不限于离子交换色谱法、凝胶过滤层析和亲和层析、高压液相色 谱法（HPLC)、反相HPLC、制备性凝胶圆盘电泳。另外，能够使用无细胞翻译系统来产生本 发明所述多肽。根据本发明使用的合适的无细胞表达系统包括兔网织细胞溶胞产物、小麦 胚芽提取物、犬胰腺微粒体膜、大肠杆菌S30提取物和耦合转录/翻译系统例如TNT-系统 (Promega)。这些系统允许以下表达：加入克隆载体后的重组多肽或肽，DNA片段，或包含编 码区和适当启动子元件的RNA序列。如前所述，蛋白分离/提纯技术可能需要使用常规方 法来修饰本发明所述的蛋白。例如，可以将组氨酸标签加入蛋白中来实现在镍柱上进行纯 化。其它修饰可引致更高或更低的活性，允许更高水平的蛋白产生或简化蛋白纯化。其它 标签还包括flag-标签。标签优选用于真核宿主。
[0099] 本发明所述蛋白优选具有由本发明所述核酸分子编码的氨基酸序列，或者是通过 表达本文所述核酸序列而得到的或可得到的。因此，包含SEQ ID NO: 1的载体如表达载体 可以用于实现通过表达SEQ ID NO: 1的核酸序列而得到或可得到的蛋白的表达。
[0100] 例如，大肠杆菌菌株BL21(DE3)可以用于介导SEQ ID NO: 1的蛋白表达或载体表 达，所述载体包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列。本领域已知例如用于在IPTG 诱导型T7-启动子的控制下表达的载体的构建。电感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞能够用 质粒DNA、例如上述表达载体转化。然后将处理后的细胞置于培养基中生长。培养后，离心 收获所述细胞，或可以直接将所述细胞裂解，例如通过超声来裂解，然后悬浮液经离心或如 实例中示例处理。随后，片状沉淀物即粗包涵体，可以在缓冲液例如裂解缓冲液中重悬浮。 然后溶解所述湿包涵体。再一次离心后，可以获得感兴趣的蛋白，或如实例所示例，在离心 处理前可以再折叠所述蛋白。如本领域已知得进行蛋白表达、细胞裂解、回收包涵体、再折 叠包涵体，例如如本文实施例中所述。
[0101] 纯化蛋白的一种途径包括硫酸铵沉淀，所述方法通过改变蛋白溶解度而用于纯化 蛋白。它是已知为盐析的更一般技术的具体案例。通常使用硫酸铵，因为硫酸铵的溶解度 高，可以获得具有高离子强度的盐溶液。蛋白的溶解度随溶液的离子强度而变化，因此随盐 浓度而变化。观察到两个不同效果：盐浓度低时，蛋白的溶解度随盐浓度增大（即离子强 度增大）而增大，称为盐溶效应。当盐浓度（离子强度）进一步增大，蛋白的溶解度开始下 降。在离子强度足够高时，蛋白将几乎完全从溶液中沉淀出来（盐析）。
[0102] 由于蛋白在离子强度高时的溶解度变化显著，盐析作为非常有用的操作步骤，帮 助给定蛋白的纯化。通过添加离液序列低的（kosmotropic)硫酸按，折叠副产品如未折叠 和错误折叠的物质以及源自宿主细胞的杂质如细胞壁组分和蛋白被沉淀。随着沉淀浓度增 大，沉淀效率将增大，因而得到高度纯化的FcR制备物，只要FcR变体在如此高的硫酸铵浓 度下抵抗沉淀即可。因此，理想的是具有在硫酸铵浓度等于或甚至超过I. 5M时仍高度可溶 的FcR变体。
[0103] 通过离心移除沉淀的蛋白，随后将硫酸铵浓度增大到沉淀绝大部分感兴趣的蛋 白、同时将最大量的蛋白污染物仍然留在溶液中的值。通过离心回收感兴趣的所沉淀的蛋 白，并将其溶解于新鲜的缓冲液中，用于纯化的下一个阶段。
[0104] 优选地，本发明蛋白具有在硫酸铵浓度等于或超过I. 5M时的高溶解度。
[0105] 本发明进一步涉及由根据SEQ ID NO:6的核酸序列编码的蛋白。
[0106] 可以由根据SEQ ID N0:6的核酸序列编码根据SEQ ID N0:2、3、4、5或9的蛋白； 其中
[0107] (i)第一个密码子（ATG)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:2的蛋白，
[0108] (ii)第一个密码子（ATG)和第二个密码子（GCA)从SEQ ID NO:6省略，得到根据 SEQ ID NO:3 的蛋白，
[0109] (iii)第一个密码子（ATG)、第二个密码子（GCA)和第三个密码子（CCG)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:4的蛋白，
[0110] (iv)第一个密码子（ATG)、第二个密码子（GCA)、第三个密码子（CCG)、第四个密码 子（CCG)和第五个密码子（AAA)从SEQ ID NO:6省略，得到根据SEQ ID NO:5的蛋白，
[0111] (V)将编码N-端至C-端氨基酸TPA的密码子加入在SEQ ID NO: 6的第一个密码 子（ATG)和第二个（GCA)之间，并且将编码氨基酸序列MGI的密码子以3'加入至SEQ ID NO:6的倒数第二个密码子（CCG)，得到根据SEQ ID NO:9的蛋白。
[0112] 本发明还涉及药物组合物，其包含通过表达编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸 序列而得到的或可得到的蛋白，或通过表达载体而得到的或可得到的蛋白，所述载体包含 编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列，或者包含由SEQ ID N0:6的核酸序列编码的蛋 白。
[0113] 根据本发明使用的术语"组合物"涉及：
[0114] (a)包含通过表达编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸序列而得到得或可得到的 至少一个蛋白的组合物；
[0115] (b)或者包含编码根据SEQ ID N0:l、2、3、4、5或9的蛋白的核酸的载体；
[0116] (c)或者由SEQ ID N0:6的核酸序列编码的蛋白；
[0117] (d)或者编码根据SEQ ID N0:l、2、3、4、5或9的蛋白的核酸序列。
[0118] 预见到下文描述的本发明组合物还包含任意组合的前述蛋白。可选择地，所述组 合物还可包含能够结合其它蛋白的分子例如抗体或淋巴细胞。所述组合物可以是固体、液 体或气体形式，尤其可以是粉末、片剂、溶液、气溶胶、颗粒、丸剂、悬浮液、乳状液、胶囊、糖 浆、液体、酏剂、提取物、酊剂或流浸膏的形式或是特别适合口服或非肠道或局部用药的形 式。
[0119] 本发明另一个优选组合物为药物组合物，其可选择性地包含药学上可接受的载体 和/或赋形剂。所述药物组合物尤其包含本发明所述核酸序列或本发明所述多肽，所述多 肽可以被耦合到另外的多肽，例如抗体或血清中存在的其它蛋白。
[0120] 如本文所述，所述药物组合物可以与生理上可接受的载体一起施用给患者。在一 个特定实施方案中，术语"药学上可接受的"是指经监管机构或其他公认的药典批准的用于 动物，更尤其是用于人。
[0121] 术语"载体"是指所述药物组合物与其一起施用的稀释剂、佐剂或溶媒。此类药物 载体可以是无菌液体，如水和油。所述药物组合物经静脉内施用时，优选载体为水。盐水溶 液、水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。
[0122] 适当的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸醋、滑石粉、钠离子、脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇以 及类似物。如需要，所述组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或PH缓冲剂。这些组合物的 形式可以是溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂以及类似物。利用传统 的粘结剂和载体例如甘油三脂，所述组合物能够被配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载 体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药物载体的实例 记载于 E. W. Martin 的"Remington's Pharmaceutical Sciences"。此类组合物包含治疗有 效量的上述化合物，优选为具有适量载体的纯化形态，以提供用于适当施用至受试者的形 式。所述制剂应当适合给药形式。
[0123] 在另一个优选实施方案中，按照常规方法配制组合物，作为适于人静脉内施用的 药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物为溶于无菌等渗水性缓冲液的溶液。必要时， 所述组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。通常，所 述成分被独立供应或以单位剂量形式混合在一起，例如，作为在指示活性剂的量的气密性 容器如安瓿或sachette中的干冻干粉末或无水浓缩物。在组合物以输注形式给药时，可以 通过包含无菌药品级水或生理盐水的输注瓶分配。在组合物通过注射给药时，可以提供注 射用无菌水或生理盐水的安瓿，使得所述成分可以在给药前混合。
[0124] 本发明药物组合物能够以中性或盐的形式配制。药学上可接受的盐包括用阴离子 例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的那些盐，还包括用阳离子例如源自 钠、钾、铵、钙、铁的氢氧化物、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形 成的那些盐。
[0125] 可选择地采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。在制剂中采用的精确剂量还将 取决于给药途径、疾病或障碍的严重性，另外还应根据实际操作者的判断以及每个患者的 状况而决定。可以从来自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推算有效剂量。优选 地，将所述药物组合物直接给药或与佐剂组合给药。
[0126] 可以设计用于基因治疗中应用的药物组合物。前述已经记载了与本发明宿主细胞 相关的基因治疗技术，而上述记载的所有应用同样也适用于所述药物组合物。例如，所述药 物组合物中的核酸分子或包含通过表达SEQ ID NO: 1的核酸而得到的或可得到的蛋白的蛋 白或包含编码根据SEQ ID NO: 1的蛋白的核酸的载体或由SEQ ID N0:6的核酸序列编码的 蛋白，均优选以允许其导入、表达和/或稳定整合到待治疗的个体患者的细胞的形式。
[0127] 对基因治疗而言，可以利用各种病毒载体，如腺病毒、疱瘆病毒、牛痘或者优选RNA 病毒如逆转录病毒。单个外源基因可插入其中的逆转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛 尼鼠白血病病毒（MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒（HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒（MuMTV)以及劳斯 肉瘤病毒（RSV)。另外许多逆转录病毒载体还可以结合多个基因。所有这些载体均能够传 递或结合用于可选择标记的基因，从而可以确认和产生被转导的细胞。通过插入例如编码 糖、糖脂或蛋白的多核苷酸而使逆转录病毒载体成为靶标特异性的。本领域技术人员熟知 或能够通过常规试验而容易地确定具体的多核苷酸序列，所述序列可以被插入到逆转录病 毒基因组中以允许包含插入的多核苷酸序列的逆转录病毒载体的靶标特异性递送。
[0128] 由于重组逆转录病毒优选是缺陷型的，因此它们需要辅助以便产生感染性载体粒 子。这种辅助可以例如通过使用辅助细胞系而提供，所述辅助细胞系含有编码处于LTR内 调控序列的控制下的逆转录病毒中所有结构基因的质粒。这些质粒缺失这样的核苷酸序 列，所述核苷酸序列使得包装机制能够识别出用于衣壳化的RNA转录体。具有包装信号缺 失的辅助细胞系包括但不限于例如w2、PA317和PA12。因为没有包装的基因组，这些细胞 系将产生空病