与新生儿Fc受体的结合增强的变体Fc多肽的制作方法
【专利摘要】本文描述了在环内或邻近处含有插入序列的变体Fc片段，如与对照Fc片段相比较，所述变体Fc片段在pH5-6下以较高亲和力和/或较高结合活性并且在生理pH值下以大致相同或较低的亲和力结合于新生儿Fc受体(FcRn)，即在生理pH值下具有极低或无结合活性。还描述了包含这些变体Fc片段的变体Fc多肽。另外描述了制备和鉴别此类Fc片段的方法以及用于制备和使用此类Fc多肽的方法。
【专利说明】与新生儿Fe受体的结合增强的变体Fe多化
[000。 优先权
[0002] 本申请要求分别于2011年12月21日、2012年1月12日和2012年11月21日提 交的美国临时申请No. 61/578, 780、61/585, 993和61/729, 050的权益，其各自整体并入本 文。
[0003] 领域
[0004] 本发明涉及了包含变体化片段的多肤，与对照化片段相比较，所述变体化片段 W较高亲和力和/或较强结合活性结合于新生儿化受体。本发明还涉及了分离、制备和使 用此类多肤的方法。
[000引背景
[0006] 治疗性单克隆抗体已经被成功地用作多种疾病的治疗。抗体的相对较长的体内 半衰期至少部分是由抗体化区与新生儿化受体（化化）的相互作用介导的。参见例如， (ihetie等（1996)，Elur. J. Immunol. 26 ;69〇-96。化化在小于或等于6. 0的抑值下W纳摩 尔浓度的亲和力（Kd为约IOOnM)结合于IgG抗体的化区，但在血液抑值（即，约抑7. 4) 下不结合。Tesar 和巧加km她（2001) ,Qirr. Opin. Struct. Biol. 20 似；226_233。当细胞 例如通过胞饮作用将抗体内化之后，在核内体的酸性环境下，IgG可W被化化结合。同上。 与进入核内体内默认的分解代谢路径相对，IgG当在核内体内结合FcRn时将被引导回到细 胞表面。同上。在细胞表面处的大体上生理抑值环境中，IgG可W与化化解离并且再进 入循环中。该一过程使得抗体在细胞内进行内化之后又回到循环中，与在细胞中核内体内 降解相对。
[0007] 本领域中需要具有增加的体内半衰期W减少给药量和/或给药频率的治疗性抗 体。此类抗体由于具有增加的患者便利性并因此也可能具有增加的患者顺应性和/或降低 的成本而特别有益。在当前有成本意识的卫生保健环境中，成本可W是治疗产品的实际效 用的决定因素。
[000引发明概述
[0009] 本文提供了变体化片段，该些变体化片段在略呈酸性的抑值下W比对照化片 段高的亲和力和/或高的结合活性结合于化化，并且在生理抑值下W与对照化片段大致 相同或比对照化片段低的亲和力（即，具有极低或无结合活性）结合于化化。还提供了 变体化多肤，该些变体化多肤含有变体化片段W及结合于祀分子的结合区。本文中已证 实，含有具有W上提到的结合特性的变体化片段的变体化多肤还具有比对照化多肤长的 体内半衰期。另外提供了编码该些化片段和化多肤的核酸W及使用该些核酸制备该些蛋 白质的方法。还包括了用于延长化多肤的体内半衰期的方法，W及用于鉴别变体化片段 的方法，如与对照化片段相比较，该些变体化片段在抑5-6下W较高亲和力结合于化化 并且在生理抑值下W相当或较低的亲和力结合化化。
[0010] 此处描述了变体化多肤，该变体化多肤包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4变体化 片段，其中该变体化片段在该变体化片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3到 20、10到20、20到40、40到60或60到80个氨基酸的插入序列，其中相比于与该变体化多 肤具有相同的氨基酸序列但在环5、8和/或10内或邻近处不含所述插入序列的对照化多 肤，该变体化多肤在约5. 0到约6. 0的抑值下和/或在约5. 0、5. 2、5. 5、5. 7或6. 0的抑 值下W较高亲和力和/或较高结合活性结合于人新生儿化受体化化化），并且其中如与该 对照化多肤相比较，该变体化多肤在生理抑值和/或在约7. 4、7. 5或7. 6的抑值下W 大致相同或较低的亲和力或结合活性（即，具有极低或无结合活性）结合于该人新生儿Fc 受体化化化）。在该变体化片段内或邻近处的插入序列可W是至少六个氨基酸长、不超过 25个氨基酸长、6到16个氨基酸长和/或至少12个氨基酸长。在一些实施方案中，该插入 序列不含甲硫氨酸和/或色氨酸残基。在该变体化片段内或邻近处的插入序列可W在前 四个插入的氨基酸中包含至少一个半脫氨酸并且在后四个插入的氨基酸中包含至少一个 半脫氨酸。任选地，该插入序列可W除在该插入序列的前四个或后四个氨基酸中存在任何 半脫氨酸残基外不含半脫氨酸残基。在一些实施方案中，使用表1中所示的EU编号系统，该 插入序列是在该变体化片段的环10内或邻近处，任选地在该变体化片段的氨基酸384与 385之间。使用该抓编号系统，该插入序列可W在氨基酸383到387内。在一些实施方案 中，使用表1中所示的抓编号系统，在该变体人化片段中的插入序列可W在氨基酸382与 383、383 与 384、385 与 386、386 与 387、387 与 388、388 与 389、389 与 390 或 390 与 391 之 间。或者，使用表1中所示的抓编号系统，氨基酸384-386可W缺失，并且该插入序列可W 在氨基酸383与387之间。在该变体化片段中的插入序列可W包含SEQ ID NO; 13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、90-356 及 359-379 中任一种的氨基酸序列。此外， 在该变体化片段中的插入序列可W包含W下任一序列的氨基酸序列；SEQ ID NO :41-67; 沈Q ID NO :90-246 ;沈Q ID NO :247-356 ;SEQ ID NO ;367、369、372、373及375-379;沈9 10 NO ;41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379 及 392-399、 401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464 及 470、475、477-489、 491-496 中任一种的氨基酸 4-9 ;SEQ ID NO ;164、252 及 490 的氨基酸 4-10,及 SEQ ID NO: 215 或 216 的氨基酸 4-8 ;沈Q ID NO ;248-288、290-306、342、400、410、427、440、448、454、 455、457、458、460、465-469、471-474及476 中任一种的氨基酸4-11适69 10側；289或307 的氨基酸4-12 ;及SEQ ID NO :308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。
[0011] 本文中还描述了变体化多肤，该变体化多肤包含人IgGU IgG2、IgG3或IgCM变体 化片段，其中该变体化片段在环10内或邻近处包含具有3到20、10到20、20到40、40到 60或60到80个氨基酸的插入序列，其中相比于与该变体化多肤相同但在环10内或邻近处 不含所述插入序列的对照化多肤，该变体化多肤在约5. 0到约6. 0范围内的抑值下和/ 或在约5. 0、5. 2、5. 5、5. 7或6. 0的抑值下W较高亲和力和/或较高结合活性结合于hFc化， 并且其中如与该对照化多肤相比较，该变体化多肤在生理抑值和/或在约7. 4、7. 5或 7.6的抑值下W大致相同或较低的亲和力（即，具有极低或无结合活性）结合于该hFc化。 该插入序列可W为至少六个氨基酸长，可W为不超过25个氨基酸长，可W为6到16个氨基 酸长，可W为至少12个氨基酸长，和/或可W在该插入序列的前四个氨基酸中含有至少一 个半脫氨酸并且在该插入序列的后四个氨基酸中含有至少一个半脫氨酸。该插入序列可W 在该插入序列的其它位置处不含半脫氨酸残基。该插入序列可W不含甲硫氨酸和/或色氨 酸残基。根据抓编号系统，在该变体化片段中的插入序列可W在氨基酸383-387内。使 用表I中所示的抓编号系统，在该变体化片段中的插入序列可W在氨基酸382与383、383 与 384、384 与 385、385 与 386、386 与 387、387 与 388、388 与 389、389 与 390 或 390 与 391 之间。或者，使用该抓编号系统，氨基酸384-386可W缺失，并且该插入序列可W出现在 氨基酸383与387之间。在该变体化片段中的插入序列可W包含SEQ ID NO; 13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、90-356、359-379 及 392-496 中任一种的氨基酸序 列。此外，在该变体化片段中的插入序列可W包含W下任一序列的氨基酸序列；SEQ ID NO: 41-67 ;SEQ ID NO :90-246 ;沈Q ID NO :247-356 ;SEQ ID NO ;367、369、372、373及375-379; SEQ ID N0;41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379 及 392-399、401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464 及 470、475、 477-489、491-496 中任一种的氨基酸 4-9 ;SEQ ID NO ;164、252 及 490 的氨基酸 4-10 ;及 沈Q ID N0;215 或 216 的氨基酸4-8;沈Q ID N0;248-288、290-306、342、400、410、427、440、 448、454、455、457、458、460、465-469、471-474及 476 中任一种的氨基酸4-11适69 10側： 289或307的氨基酸4-12 ;及SEQ ID NO :308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。该 变体Fc多肤可W是包含非抗体多肤的变体Fc融合蛋白。在特定实施方案中，针对该变体 化融合蛋白的对照化融合蛋白可W是阿法赛特（ale化cept)、利隆西普Crilonac巧t)、 阿柏西普（aflibercept)、依那西普（etanercept)、罗米司亭（romiplostim)或阿己西普 (abatac巧t)。在其它实施方案中，该变体化多肤可W包含任何抗体的重链可变区（Vh)和 /或轻链可变区（Vl),并且还可W包含第一重链恒定区（ChI)和轻链恒定区（片）。在一些实 施方案中，该变体化多肤可W包含；（a)含Vh区、第一重链恒定区（ChI)、较链区、Ch2区及 Ch3区的重链；和化）含￥^区和轻链恒定区也）的轻链。该变体化多肤可^是单价的。该 变体化多肤可W是二聚体或可W是四聚体。
[0012] 在其它实施方案中，本文描述了编码如本文所描述的变体Fc多肤或变体Fc片段 的核酸，W及在该些变体化片段的环内或邻近处的插入序列。还描述了含有此类核酸的宿 主细胞。还涵盖了制备变体化多肤或变体化片段的方法，该方法包括；（a)将编码该变体 化多肤或化片段的核酸引入宿主细胞中，化）在使得该核酸表达的条件下培养包含该核酸 的宿主细胞，及（C)从培养基或细胞团回收表达的变体Fc多肤或Fc片段，其中该变体Fc片 段，或含有变体化片段的变体化多肤在该变体化片段的环5、8和/或10内或邻近处包含 具有3到20、10到20、20到40、40到60或60到80个氨基酸的插入序列，并且其中相比于 对照化多肤或化片段，该变体化多肤或化片段在约5. 0到约6. 0范围内的抑值下和/ 或在约5. 0、5. 2、5. 5、5. 7或6. 0的抑值下W较高亲和力和或较高结合活性结合于h化化， 并且其中如与该对照化多肤或对照化片段相比较，该变体化多肤或化片段在生理抑值 下和/或在约7. 4、7. 5或7. 6的抑值下W大致相同或较低的亲和力或结合活性（即，具有 极低或无结合活性）结合于人新生儿化受体化化化）。
[0013] 还描述了用于制备本文所描述的任何变体化片段或化多肤的方法，该方法包括： (a)将编码该变体化多肤或化片段的核酸引入宿主细胞中，化）在使得该核酸表达的条件 下培养包含该核酸的宿主细胞，及（C)从培养基或细胞团回收表达的变体化多肤或化片 段。
[0014] 在另一个实施方案中，本文描述了用于延长包含人IgG化片段的化多肤的半 衰期的方法，该方法包括W下步骤：在环5、8和/或10内或邻近处选择供插入的位点；及 将肤插入所选位点中，其中该肤包含选自W下序列的氨基酸序列；SEQ ID NO :41-67 ;SEQ ID NO :90-246 ;沈Q ID NO :247-356 ;SEQ ID NO ;367、369、372、373 及 375-379 ;SEQ ID NO;41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379 及 392-399、 401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464 及 470、475、477-489、 491-496 中任一种的氨基酸 4-9 ;SEQ ID NO; 164、252 及 490 的氨基酸 4-10;及 SEQ ID NO: 215 或 216 的氨基酸 4-8 ;沈Q ID NO ;248-288、290-306、342、400、410、427、440、448、454、 455、457、458、460、465-469、471-474及476 中任一种的氨基酸4-11适69 10側；289或307 的氨基酸4-12 ;及SEQ ID NO =308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。所选位点可W 在环10内或邻近处，并且该插入位点可W在根据抓编号系统编号的氨基酸384与385之 间。使用该抓编号系统，该插入位点可W在氨基酸383到387内。使用表1中所示的抓 编号系统，在该变体化片段中的插入序列可W在氨基酸382与383、383与384、384与385、 385与386、386与387、387与388、388与389、389与390或390与391之间。或者，使用该 抓编号系统，氨基酸384-386可W缺失，并且该插入序列可W出现在氨基酸383与387之 间。
[0015] 本文还提供了用于鉴别人IgG变体化片段的方法，该人IgG变体化片段赋予包 含该变体化片段的变体化多肤比对照化多肤长的体内半衰期，该方法包括W下步骤；（a) 建立编码在环10内或邻近处含有插入序列的化片段的核酸文库，该插入序列包含4-20、 10-20、20-40、40-60或60-80个随机化氨基酸；化）对由该文库编码的化片段进行筛选W 鉴别出变体化片段，该变体化片段（i)在抑5.5下和/或在约5-6的抑值下W比对照化 片段高的亲和力和/或高的结合活性结合于人化化并且（ii)与该对照化片段相比较，在 生理抑值下和/或在抑7. 4、7. 5或7. 6下W相同或较低亲和力或结合活性（即，具有极低 或无结合活性）结合于人化化；（C)构建出编码包含化）中所鉴别的变体化片段的变体化 多肤的核酸，其中已知当在体内施用给动物时，包含对照化片段而非该变体化片段的对照 Fc多肤的浓度随时间呈线性降低；（d)将（C)的核酸引入宿主细胞中并在使得由该核酸编 码的变体化多肤能够表达的条件下培养该宿主细胞；（e)从细胞团或细胞培养基中回收该 变体Fc多肤；（f)将该变体Fc多肤施用给一只动物，并将该对照Fc多肤施用给另一只动 物；及（g)在施用之后，随时间监测外周血中该变体化多肤和该对照化多肤的浓度，由此 鉴别出赋予变体化多肤较长体内半衰期的变体化片段。使用表1中所说明的抓编号系 统，步骤（a)的插入序列可W在384位与385位之间。使用该抓编号系统，该插入位点可 W在氨基酸383到387内。使用表1中所示的抓编号系统，在该变体化片段中的插入序 列可 W在氨基酸 382 与 383、383 与 384、384 与 385、385 与 386、386 与 387、387 与 388、388 与389、389与390或390与391之间。或者，使用该抓编号系统，氨基酸384-386可W缺 失，并且该插入序列可W出现在氨基酸383与387之间。
[0016] 在另一个方面，提供了用于治疗慢性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施 用如本文所描述的变体化多肤。
[0017] 附图简述
[0018] 图1 ;人化化化化Rn)和人IgGlFc片段中在化化与化片段结合时最紧密接触的 部分的预测H维结构的带状图。顶图是hFc化的H级结构的一部分的带状图。底图是人 IgGl化片段当结合于化化时与化化最紧密接触的一部分的带状图。环是W细线示出，而 a螺旋和目折叠是W条带示出。进行插入的六个位点是W如下文所描述来构建的八个文 库的名称来指示，即，11、L2A、L2B、L3、L4、L5、L6A 及 L6B。
[001引图2 ;插入序列文库的格式。人IgGl化片段的序列（SEQ ID NO ;1)示于上部。在 进行插入或邻近于插入的环内的氨基酸是通过带下划线的粗体字型指示。文库名称（即， 11、L2A等）呈现在该特定文库中进行插入的区域上方。插入序列的格式于下文指示。在 最左边的是文库名称，即，LU L2A等。在文库名称右边紧挨着的是在任何氨基酸插入之前 在插入位点周围的原始序列。斜体字母指示在插入之前缺失的氨基酸。垂直的虚线指示在 未缺失氨基酸的文库中的插入位点。最右边的是在插入位点周围的序列W及在适合位置处 的插入序列。名称"（19R)/'或"（19R)e"分别是指五个或六个随机化氨基酸，该些氨基酸可 W是除半脫氨酸外的19种氨基酸中的任一种。名称"（20R)8"是指八个随机化氨基酸，该 些氨基酸可W是二十种氨基酸中的任一种。
[0020] 图3 ;来自文库L5的变体化片段分别在抑6和抑7. 4下的缔合和解离曲线。左 侦揃曲线显示了使用^deBio Oc化t?系统检测的反应（如实施例4中所解释），其中该些 曲线在中央垂线左边的部分显示了在P册下各种化片段与化化的缔合的相对量，并且该 些曲线在中央垂线右边的部分显示了在抑7. 4下化片段与化化的解离。右侧的表格提供 了在P册下检测到的每一变体W及野生型化片段（FcWT)的最大结合反应。
[0021] 图4 ;在食蟹縣猴中含变体化片段和对照化片段的抗体的平均浓度随注射后时 间的变化。X轴指示了注射后的时间，W小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹縣 猴的外周血中的抗体浓度，W纳克/毫升（ng/mL)为单位。
[002引图5巧10的变体的序列。示出了人IgGlFc片段中环的野生型或变体型式的氨基 酸序列，其在任一侧带有H个相邻氨基酸。所示氨基酸序列依据图2的编号方案是氨基酸 残基166-178,或根据如本图和表1中所示的抓编号（SEQ ID NO ;563)是氨基酸381-393。 未变化的野生型环区序列称为"野生型序列"。化变体5-1 (由来自文库L5的分离株编码） 中该一环区的序列称为"5-1" (SEQ ID N0;564)。插入的氨某酸序列是W带下划线的釉体 宝示出。下方示出了来自5-1的各种变体的同一环区的序列，该些变体具有相同的肤插入 该环内或邻近处的不同位置中，在一些情形中有一些环氨基酸缺失。
[002引图6 ;在环10的不同位置处具有相同插入序列的变体化片段分别在抑6和抑7. 4 下的缔合和解离曲线。左侧示出了各种变体化片段W及野生型化片段（FcWT)在P册下 的缔合曲线（在中央垂线的左侧）和在抑7. 4下的解离曲线（在中央垂线的右侧）。右侧 W表格形式示出了所检测的每一变体在P册下的最大结合反应。
[0024] 图7 ;来自在酵母中筛选的文库L5的变体化片段在抑6和抑7. 4下的缔合和解离 曲线。左侧示出了各种变体化片段W及野生型化片段（FcWT)在抑6下的缔合曲线（在 中央垂线的左侧）和在pH7. 4下的解离曲线（在中央垂线的右侧）。右侧W表格形式示出 了所检测的每一变体在P册下的最大结合反应。
[002引 图8 ;来自在酵母中筛选的文库心8和心10的变体化片段在抑6和抑7. 4下的 缔合和解离曲线。左侧示出了各种变体化片段W及野生型化片段（FcWT)在P册下的缔 合曲线（在中央垂线的左侧）和在抑7. 4下的解离曲线（在中央垂线的右侧）。右侧W表 格形式示出了所检测的每一变体在P册下的最大结合反应。
[0026] 图9 :在食蟹猕猴中含变体Fe片段和对照Fe片段的抗体的平均浓度随注射后时 间的变化。X轴指示了注射后的时间，以小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹猕 猴的外周血中的抗体浓度，以纳克/毫升（ng/mL)为单位。
[0027] 图10 :在食蟹猕猴中含变体Fe片段和对照Fe片段的抗体的平均浓度随注射后时 间的变化。X轴指示了注射后的时间，以小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹猕 猴的外周血中的抗体浓度，以纳克/毫升（ng/mL)为单位。如所指示的，实心圆代表了注射 Y-5-112的食蟹猕猴的个别数据点，并且实线代表了这些数据的平均值。类似地，三角形代 表了注射抗体Y的食蟹猕猴的个别数据点，并且虚线代表了这些数据的平均值。
[0028] 序列的简要说明
[0029]
【权利要求】
1. 一种变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段， 其中所述变体Fc片段在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3 到20个氨基酸的插入序列， 其中相比于与所述变体Fc多肽具有相同的氨基酸序列但在环5、8和/或10内或邻近 处不含所述插入序列的对照Fc多肽，所述变体Fc多肽在pH6. 0下以较高的结合活性结合 于人新生儿Fc受体（hFcRn)，并且 其中所述变体Fc多肽在pH7. 4下对于结合于nFcRn具有极低或无结合活性，并且在 pH7. 4下检测到的残留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0. 1 纳米。
2. 如权利要求1所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或 邻近处的插入序列为至少六个氨基酸长。
3. 如权利要求2所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或 邻近处的插入序列是6到16个氨基酸长。
4. 如权利要求1到3中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8 和/或10内或邻近处的插入序列为至少12个氨基酸长。
5. 如权利要求1到4中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8 和/或10内或邻近处的插入序列在前四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸并且在 后四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸。
6. 如权利要求1到5中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列是在所述变体 Fc片段的环10内或邻近处。
7. 如权利要求6所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号系统，所述插入序 列是在氨基酸383到387内。
8. 如权利要求7所述的变体Fc多肽， 其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变 体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385、氨基酸385与386、 氨基酸386与387或氨基酸387与388之间，或 其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383 与387之间。
9. 如权利要求8所述的变体Fc多肽， 其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变 体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385或氨基酸385与386 之间，或 其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383 与387之间。
10. 如权利要求1到9中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述变体人Fc片段是变体 IgGIFc 片段。
11. 如权利要求1到9中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述变体人Fc片段是变体 IgG2Fc 片段。
12. 如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插 入序列具有SEQ ID NO :13-24中任一种的氨基酸序列。
13. 如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插 入序列包含 SEQ ID NO :41-67、90-356、359-367、369、372、373 及 375-379 中任一种的氨基 酸序列。
14. 如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插 入序列包含选自以下序列的氨基酸序列： (a) SEQ ID NO :2比的氨基酸 4_8 ; (b) SEQ ID NO :41-53、67、90-163、165-215 及 217-247 和 359-378 中任一种的氨基酸 4_9 ； (c) SEQ ID NO :1M 的氨基酸 4-10 ; (d) SEQ ID NO :248-288、290-306 及 342 中任一种的氨基酸 4-11 ; (e) SEQ ID NO :289 或 307 的氨基酸 4-12 ;及 (f) SEQ ID NO :308-341 和 343-356 中任一种的氨基酸 4-13。
15. -种变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段， 其中所述变体Fc片段在环10内或邻近处包含具有3到20个氨基酸的插入序列， 其中所述变体Fc多肽在pH6. 0下与hFcRn的结合活性高于与所述变体Fc多肽相同但 在环10内或邻近处不含所述插入序列的对照Fc多肽的结合活性，并且 其中所述变体Fc多肽在pH7. 4下对于结合于hFcRn具有极低或无结合活性，并且在 pH7. 4下检测到的残留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0. 1 纳米。
16. 如权利要求15所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列为至少六个氨基酸长。
17. 如权利要求15或16所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列在所述插入序列的前 四个氨基酸中含有至少一个半胱氨酸并且在所述插入序列的后四个氨基酸中含有至少一 个半胱氨酸。
18. 如权利要求15到17中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列是6到16个 氨基酸长。
19. 如权利要求15到18中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列为至少12个 氨基酸长。
20. 如权利要求15到19中任一项所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号 系统，所述插入序列是在氨基酸383到387内。
21. 如权利要求20所述的变体Fc多肽， 其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变 体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385、氨基酸385与386、 氨基酸386与387或氨基酸387与388之间，或 其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383 与387之间。
22. 如权利要求21所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变 体Fc片段中的插入序列是在氨基酸384与385之间。
23. 如权利要求15到22中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插 入序列具有SEQ ID NO :13-24中任一种的氨基酸序列。
24. 如权利要求23所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列包含SEQ ID NO :41、42、43、44、45、50、97、180 及 216 中任一种的氨基酸序列。
25. 如权利要求15到22中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插 入序列包含SEQ ID NO :54、55、56、57或58的氨基酸序列。
26. 如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgGl 变体Fc片段。
27. 如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG2 变体Fc片段。
28. 如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG4 变体Fc片段。
29. 如权利要求1到28中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是包含非抗体 多肽的变体Fe融合蛋白。
30. 如权利要求29所述的变体Fc多肽，其中针对所述变体Fc融合蛋白的对照Fc融合 蛋白是阿法赛特、利隆西普、阿柏西普、依那西普、罗米司亭或阿巴西普。
31. 如权利要求1到28中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含抗体的重 链可变区（VH)和/或轻链可变区（VJ。
32. 如权利要求31所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽另外包含第一重链恒定区 (CH1)和轻链恒定区（CJ。
33. 如权利要求31或32所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含VH区和 '区。
34. 如权利要求39到41中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含 (a) 包含Vn区、第一重链恒定区（Cnl)、铰链区、Cn2区及Cn3区的重链，和 (b) 包含八区和轻链恒定区（Q)的轻链。
35. 如权利要求31到34中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是单价的。
36. 如权利要求1到35中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是二聚体。
37. 如权利要求31到34中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是四聚体。
38. -种核酸，所述核酸编码如权利要求1到37中任一项所述的变体Fc多肽。
39. -种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求38所述的核酸。
40. -种用于制备变体Fc多肽的方法，所述方法包括 将编码所述变体Fc多肽的核酸引入宿主细胞中， 在使得所述核酸表达的条件下培养包含所述核酸的所述宿主细胞，及 从所述培养基或所述细胞团回收表达的变体Fc多肽， 其中所述变体Fc多肽包含在变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3 到20个氨基酸的插入序列的所述变体Fc片段，并且 其中所述变体Fc多肽在pH6. 0下结合于hFcRn的结合活性高于对照Fc多肽，并且 其中所述变体Fc多肽在pH7. 4下具有极低或无结合活性，并且在pH7. 4下检测到的残 留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0. 1纳米。
41. 如权利要求40所述的方法，其中所述核酸是如权利要求38所述的核酸。
42. -种用于延长包含人IgG Fc片段的Fc多肽的半衰期的方法，所述方法包括以下步 骤： 在环5、8和/或10内或邻近处选择供插入的位点；和 将肽插入所述所选位点中，其中所述肽包含选自以下序列的氨基酸序列： (a) SEQ ID N0:41-67、90-356、359-367、369、372、373 及 375-379; (b) SEQ ID NO :2比的氨基酸 4_8 ; (c) SEQ ID N0:41-53、67、90-163、165-215 及 217-247 和 359-378 中任一种的氨基酸 4_9 ； (d) SEQ ID NO :1M 的氨基酸 4-10 ; (e) SEQ ID NO :248-288、290-306 及 342 中任一种的氨基酸 4-11 ; (f) SEQ ID NO :289 或 307 的氨基酸 4-12 ;及 (g) SEQ ID NO :308-341 和 343-356 中任一种的氨基酸 4-13。
43. 如权利要求42所述的方法，其中所述位点是在环10内或邻近处。
44. 如权利要求43所述的方法，其中所述插入位点是在根据EU编号系统编号的氨基酸 383 到 387 内。
45. 如权利要求44所述的方法， 其中使用所述EU编号系统，所述插入序列是在所述变体Fc片段的氨基酸382与383、 氨基酸383与384、氨基酸384与385或氨基酸385与386之间，或 其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383 与387之间。
46. -种用于鉴别人IgG变体Fc片段的方法，所述人IgG变体Fc片段赋予包含所述变 体Fc片段的变体Fc多肽比对照Fc多肽长的体内半衰期，所述方法包括以下步骤： (a) 建立编码在环10内或邻近处含有插入序列的Fc片段的核酸文库，所述插入序列包 含4-20个随机化氨基酸； (b) 对由所述文库编码的Fc片段进行筛选以鉴别出⑴在pH6下以比对照Fc片段高 的结合活性结合于hFcRn并且（ii)在pH7. 4下对于结合于hFcRn具有极低或无结合活性 的变体Fc片段； (c) 构建出编码包含（b)中所鉴别的变体Fc片段的变体Fc多肽的核酸，其中已知当在 体内施用给动物时，包含对照Fc片段而非所述变体Fc片段的对照Fc多肽的浓度随时间呈 线性降低； (d) 将（c)的所述核酸引入宿主细胞中并在使得由所述核酸编码的变体Fc多肽能够表 达的条件下培养所述宿主细胞； (e) 从所述细胞团或细胞培养基中回收所述变体Fc多肽； (f) 将所述变体Fc多肽施用给一只动物，并将所述对照Fc多肽施用给另一只动物；及 (g) 在施用之后，随时间监测外周血中所述变体Fc多肽和所述对照Fc多肽的浓度，由 此鉴别出赋予变体Fc多肽较长的体内半衰期和较多的暴露的变体Fc片段。
47. 如权利要求46所述的方法，其中使用如表1中说明的EU编号系统，步骤（a)的插 入序列是在384位与385位之间。
48. -种用于治疗慢性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1 到37中任一项所述的变体Fc多肽。
【文档编号】C07K16/00GK104302665SQ201280070180
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】J.孙, S.J.韩, S.M.哈里斯, R.R.克彻姆, J.卢, M.L.迈克尔斯, M.W.雷特, M-M.蔡 申请人:安姆根有限公司