新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法

专利名称：新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc结合蛋白及其相关方法
新生儿Fc受体(FcRn)-结合多肽变体、二聚体Fc 结合蛋白及其相关方法相关申请本申请要求2003年11月12日提交的、题为"含有改变的恒定区的抗体 及其变体，，的美国临时申请系列号60/519,744的利益。本申请还要求2003 年ll月12日提交的、题为"Fc受体结合多肽、通过静电优化衍生的pH特 异性变体及其用途"的美国申请系列号60/519,743的利益。本申请还要求 2003年11月12日提交的题为"通过在能够调节人抗体半衰期的人Fc结构 域中进行静电模建而定义的突变体"的美国申请系列号60/519，733的利益。 本申请还涉及与本申请同一日期提交的、题为"Fcy受体结合多肽变体及其 相关方法，，的PCT申请XXXXXXXX。所有这些申请的完整内容并入此处作 为参考。
背景技术：
许多生物学过程由一种蛋白质与另一种蛋白质的特异相互作用来介 导。例如，酶是特异地结合其底物的蛋白质，而配体(例如神经递质和激素) 与它们的关连受体结合时发生实质性信息自细胞向细胞的传递。在免疫应 答情况中发生的相互作用是最为吸引人的相互作用，其中抗体(也称作免 疫球蛋白)产生以赋予身体对抗能够引起感染或疾病的外源物质的防御力。 抗体含有特异地与抗原以及与"效应"细胞(例如吞噬细胞)上的受体相互作用的截然不同的结构域。尽管结合抗原是有用的(因为这可以防止抗原和其 内源靶标相互作用)，但最有效的免疫应答破坏抗原。因此，最有效的抗体 是具有介导高亲和力抗原结合的结构域和介导有效效应子功能的结构域的 那些抗体。天然抗体通常是异源四聚体；它们含有通过二硫键连接在一起的两条 相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链。每条重链具有后随数个恒定区(CH,， CH2和CH3)的一个可变区(VH)，而每条轻链具有后随仅一个恒定区的一个 可变区(VO。轻链的恒定区与重链的第一恒定区对齐，V^与VH对齐。可变
变区也称作互补决定区(CDR),负责每个特定抗体对其特定抗原的结合特异 性。每个可变区含有3个CDR，这些CDR由高度保守的区域(称作构架区， FR)分开。每条链中的CDR通过FR区而紧靠在一起，并与来自其它链的 CDR —起参与抗体的抗原位点的形成。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是基于其和细胞受体或者补 体分子的结合而介导各种效应子功能。依据重链恒定区的氨基酸序列，可 以将抗体或免疫球蛋白分配至不同类型(A， D， E， G和M)。最常用的治疗性 抗体是"G"类型的(即，它们是IgG)。这些类型可以进一步划分。例如，IgG 抗体进一步分成同种型IgGl， IgG2， IgG3和IgG4。人IgG Fc区的晶体结构 已经确定(Deisenhofer， Biochemistry 20: 2361-2370， 1981;对于Fc区的i兌明， 参见美国专利号6,242,195的

图1)。Fc区介导效应子功能，这些功能被划分成两类。第一类是独立于抗原 结合而发生的功能；这些功能赋予在循环中的持久性和通过胞吞转运作用 跨细胞屏障转移的能力(见Ward和Ghetie， Therapeutic Immunology 2:77-94, 1995)。第二类是抗体与抗原结合后运转的功能；这些功能涉及到补体级联 或携带Fc受体(FcR)的细胞的参与。FcR是造血细胞上特化的细胞表面受体， 其介导被覆抗体的病原体的去除(通过吞噬免疫复合物)，并介导被覆相应 抗体的红细胞和各种其它细胞靶(例如肿瘤细胞)的裂解。裂解通过抗体依赖 性细胞介导的细胞毒性(ADCC;见Van de Winkel和Anderson, J. Leuk. Biol. 49: 511-24, 1991)发生。FcR基于其对免疫球蛋白同种型的特异性而定义。 例如，IgG抗体的Fc受体称作FcyR。另一 Fc受体FcRn调节IgG的血清半衰期。Fc(或者含有Fc的多肽)半 衰期的增加或减少可以分别通过Fc区对FcRn (新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor))的亲和力的增加或减少来反映(Ghetic等，Nature Biotechnol. 15: 637-640， 1997; Kim等，Eur. J. Immunol. 24: 542-548, 1994; Della，Acqua等(J. Immunol. 169:5171-5180,2002)。 FcRn结合亲合性与血清半衰期的相关性与 提出的FcRn自溶酶体降解作用中拯救抗体的生物学作用是一致的。此外， FcRn将IgG自母体转移至胎儿。力介导。据认为，抗体在正常情况下自循环中被内皮细胞内化，并靶向细 胞的酸性内体和溶酶体以降解。FcRn能够在内体的酸性pH(〈6.5)下结合抗 体Fc区、与内皮细胞膜融合，并在血流的中性pH(〉7.4)下释放抗体，由此 抢救抗体使之免遭破坏。当血清抗体水平减少时，可以获得更多的FcRii分 子用于IgG结合，由此抢救增加量的IgG。相反地，如果血清IgG水平上升， 则FcRn变得饱和，由此被内化和降解的抗体的比率将增力口(Ghetie和Ward, Annu. Rev. Immunol. (2000), 18: 739-66)。与以上模型一致，预期改变的多肽如果其对新生儿Fc受体的结合亲合 性增加则具有更长的半衰期。相反地，如果改变的多肽对新生儿Fc受体的 结合亲合性降低，则预期其具有较短的半衰期。单克隆抗体(mAb)目前已经用于治疗人类患者的疾病(King和Adair， Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2: 110-117， 1999; Vaswani和Hamilton, Ann. Allergy Asthma Immunol. 81: 105-119， 1998;和Hollinger和Hoogenboom， Nature Biotechnol. 16: 1015-1016, 1998)。但这不是说目前基于抗体的治疗已 经完全成功；在一些情况下，治疗剂的有限循环时间和/或低生物利用度导 致相对低百分数的患者对基于抗体的治疗表现出完全应答，或者在其它情 况下，由于延长的循环半衰期或暴露于非靶组织所致的毒性可能使得抗体 不能用作治疗剂。因此，需要抗原非依赖性效应子功能已经根据抗体的预期用途而被定 制的抗体(和其它含有Fc的多肽，例如融合蛋白)。相似地，需要允许预测 可以引起抗原非依赖性效应子功能变化的抗体序列改变的方法(由此避免 依赖于繁重的边试边改过程)。在一些情况下，可能期望增加抗体的半衰期。 例如，血液中具有增加的半衰期的蛋白质治疗剂具有同时地降低药物的周 期性给药或者备选地降低药物剂量的优点。此类抗体也具有增加对疾病位 点(例如肿瘤)的接触的优点。相反地，具有减少的半衰期的蛋白质治疗 剂预期将具有更低的毒性，而保持了使用更高并耐受性更差的剂量的未改 变药物时观察到的效力。这些治疗剂和制备它们的方法将具有极大的益处。发明概述本发明涉及在例如Fc区或者其FcRn结合片段内具有特定氨基酸替代 的改变的多肽(例如，在IgG恒定区中具有氨基酸替代的多肽)，所述替代 造成抗原非依赖性效应子功能(例如，循环半衰期)的改变。本发明还提供制
备该改变的多肽的方法和利用其作为基于蛋白质的治疗剂的方法。本发明还提供新的FcRn形式及其应用方法。本发明至少部分地基于人类Fc区(特别地，来自IgG抗体的Fc区)恒定 结构域(Fc)中特定氨基酸残基的鉴定，所述氨基酸残基当通过一个或多个氨 基酸突变而改变后将改变抗体的抗原非依赖性效应子功能，特别是抗体的 循环半衰期。因此，本发明涉及含有全部或部分的Fc区的多肽，例如抗体 和融合蛋白，其中所述Fc区已经在一个或多个氨基酸残基处发生突变，从 而增加或降低所述多肽的抗原非依赖性效应子功能。本发明还提供鉴定期望氨基酸突变的技术和制备包含此突变的多肽的 方法。所述方法包括分子模建，其可以用于预测氨基酸序列中的氨基酸变 化，由此改变与Fc受体(例如人类新生儿Fc受体)的结合(例如，增强或降 低)。 一般地，所述方法始于"起始"或"靶"多肽或者含有与FcRn结合的第一 多肽的复合物(例如，晶体结构或同源模型)，之后第一多肽的修饰导致与第 一多肽不同以致在特定的治疗或诊断应用中具有更好性能的"第二，，或者"改 变的，，多肽。例如，第二多肽可以更有效地执行一种或多种抗原依赖性效应 子功能(例如改变的半衰期)。模建可以在计算机上(insilico)进行。一方面，本发明涉及至少包括Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽， 其中所述多肽与起始多肽相比包含至少一个突变，并且其中所述至少一个 突变选自在EU氨基酸位置248位替代为带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置249位替代为带正电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置251位替代为极性氨基酸或赖氨酸；在EU氨基酸位置252位替代为极性氨基酸；在EU氨基酸位置255位替代为极性氨基酸；在EU氨基酸位置256位替代为赖氨酸；在EU氨基酸位置257位替代为带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置258位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置277位替代；在EU氨基酸位置279位替代为带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置280位替代为带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置281位替代为带电荷的氨基酸或者谷氨酰胺；
在EU氨基酸位置282位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置284位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置285位替代为带正电荷的氨基酸、极性氨基酸或者 天冬氨酸；在EU氨基酸位置286位替代为谷氨酸、苏氨酸或者曱硫氨酸； 在EU氨基酸位置287位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置288位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置289位替代；在EU氨基酸位置304位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置305位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置306位替代；在EU氨基酸位置307位替代为极性的或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置308位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置309位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置310位替代为带电荷的氨基酸或者极性氨基酸； 在EU氨基酸位置311位替代为带正电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置312位替代为带正电荷的氨基酸或者极性氨基酸； 在EU氨基酸位置313位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置315位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置316位替代为带正电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置317位替代为带电荷的氨基酸或者极性氨基酸； 在EU氨基酸位置340位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置343位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置344位替代为亮氨酸；在EU氨基酸位置345位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置376位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置378位替代为丝氨酸； 在EU氨基酸位置383位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置385位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置389位替代为带负电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置424位替代为带电荷的氨基酸；
在EU氨基酸位置426位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置430位替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置431位替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置432位替代为极性氨基酸； 在EU氨基酸位置434位替代为赖氨酸、精氨酸或者亮氨酸； 在EU氨基酸位置436位替代为带负电荷的氨基酸;和 在EU氨基酸位置438位替代为带电荷的氨基酸。 另一方面，本发明涉及至少包含Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽与起始多肽相比包含至少一个突变，并且其中所述至少一个突变选自将EU氨基酸位置248位的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置249位的天冬氨酸替代为带正电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置251位的亮氨酸替代为极性氨基酸或者赖氨酸； 替代EU氨基酸位置252位的曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置255位的精氨酸替代为极性氨基酸； 将EU氨基酸位置256位的苏氨酸替代为赖氨酸； 将EU氨基酸位置257位的脯氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置258位的谷氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；替代EU氨基酸位置277位的色氨酸；将EU氨基酸位置279位的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置280位的天冬氨酸替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置281位的甘氨酸替代为带电荷的氨基酸或者谷氨酰胺；将EU氨基酸位置282位的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置284位的缬氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；将EU氨基酸位置285位的组氨酸或者丙氨酸替代为带电荷的氨基酸 或者极性氨基酸；将EU氨基酸位置285位的组氨酸或者丙氨酸替代为带正电荷的氨基 酸、极性氨基酸或者天冬氨酸；
将EU氨基酸位置286位的天冬酰胺或者赖氨酸替代为谷氨酸、苏氨 酸或者曱硫氨酸；将EU氨基酸位置287位的丙氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；将EU氨基酸位置288位的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 替代EU氨基酸位置289位的苏氨酸；将EU氨基酸位置304位的丝氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置305位的缬氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；替代EU氨基酸位置306位的亮氨酸或者缬氨酸； 将EU氨基酸位置307位的苏氨酸或者缬氨酸替代为极性的或者带电 荷的氨基酸；将EU氨基酸位置308位的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置309位的亮氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置310位的组氨酸替代为带电荷的氨基酸或者极性氨 基酸；将EU氨基酸位置311位的谷氨酰胺替代为带正电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置312位的天冬氨酸或者亮氨酸替代为带正电荷的氨 基酸或者极性氨基酸；将EU氨基酸位置313位的天冬酰胺替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置315位的天冬酰胺替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置316位的天冬酰胺替代为带正电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置317位的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸或者极性氨基酸；将EU氨基酸位置340位的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置343位的脯氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；将EU氨基酸位置344位的精氨酸替代为亮氨酸； 将EU氨基酸位置345位的谷氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；
将EU氨基酸位置376位的天冬氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的 氨基酸；将EU氨基酸位置378位的丙氨酸替代为丝氨酸； 将EU氨基酸位置383位的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置385位的甘氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置389位的天冬酰胺替代为带负电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置424位的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置426位的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置430位的谷氨酸替代为极性氨基酸或者带电荷的氨 基酸；将EU氨基酸位置431位的亮氨酸替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置432位的组氨酸替代为极性氨基酸；将EU氨基酸位置434位的天冬酰胺替代为赖氨酸、精氨酸或者亮氨酸；将EU氨基酸位置436位的酪氨酸替代为带负电荷的氨基酸；和 将EU氨基酸位置438位的谷氨酰胺替代为带电荷的氨基酸。 另一方面，本发明涉及权利要求1或2的改变的多肽，其中EU氨基酸位置277、 289、 306、 344或者378中的至少一个位置处的氨基酸替代为带电荷的氨基酸、极性氨基酸或者非极性氨基酸。一个实施方案中，带电荷的氨基酸是带负电荷的氨基酸。 一个实施方案中，带负电荷的氨基酸选自天冬氨酸和谷氨酸。 一个实施方案中，带电荷的氨基酸是带正电荷的氨基酸。 一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自精氨酸、组氨酸和赖氨酸。 一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是赖氨酸。 一个实施方案中，极性氨基酸选自甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。一个实施方案中，非极性氨基酸选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸和脯氨酸。一个实施方案中，改变的多肽是抗体或其片段。 一个实施方案中，改变的多肽是融合蛋白质。 一个实施方案中，Fc区或其FcRn结合部分来源于人类抗体。多肽包含完整的Fc区。 起始多肽包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。 Fc区或其Fc结合部分是IgG同种型的。 IgG同种型是IgGl亚型。多肽在Vl或Vh的互补决定区(CDR)中包含一个或多多肽结合(a)抗原和(b) FcR。抗原是肿瘤相关抗原。多肽结合(a)配体和(b) FcR。FcR是FcRn。多肽以不同于不含突变的起始多肽的结合亲合性与 所述改变的多肽的结合亲合性比起始多肽高大约1.5 所述改变的多肽的结合亲合性比起始多肽低大约1.5一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中 个非人氨基酸残基。一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中一个实施方案中 FcR结合。一个实施方案中 倍至大约100倍。一个实施方案中 倍至大约100倍。一个实施方案中，所述改变的多肽在第一 pH显示出对FcR的一种结合 亲合性，而在第二pH显示出对FcR的一种不同的结合亲合性。一个实施方案中，所述改变的多肽的结合亲合性在第一pH时比在第二 pH时高大约1.5倍至大约100倍。一个实施方案中，所述改变的抗体的结合亲合性在第一 pH时比在第二 pH时低大约1.5倍至大约100倍。一个实施方案中，改变的多肽在施用给患者时显示出与不含突变的起 始多肽不同的循环半衰期。一个实施方案中，改变的多肽的半衰期比不含突变的起始多肽的半衰 期长大约1小时至大约1周。一个实施方案中，改变的多肽的半衰期比不含突变的起始多肽的半衰 期短大约1小时至大约1周。一个实施方案中，改变的多肽结合蛋白质A或G。一个实施方案中，涉及权利要求1或2的改变的多肽。一个实施方案中，本发明涉及编码权利要求1或2的多肽的核苦酸序列。一个实施方案中，所述核酸是表达栽体。 一个实施方案中，表达载体在宿主细胞中。一个实施方案中，本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括给患者施用至少包含Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述 多肽包含至少一个选自下组的突变在EU氨基酸位置284位替代为谷氨酸；在EU氨基酸位置285位替代为谷氨酸；在EU氨基酸位置286位替代为天冬氨酸；在EU氨基酸位置288位替代为谷氨酸或者天冬氨酸；在EU氨基酸位置290位替代为谷氨酸；和在EU氨基酸位置304位替代为天冬氨酸，其中，改变的多肽与不含突变的起始多肽相比显示出更长的循环半衰期。一个实施方案中，本发明涉及治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括给患者使用至少包含Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，所述多肽包含至少一个选自下组的突变将EU氨基酸位置284位的缬氨酸替代为谷氨酸；将EU氨基酸位置285位的组氨酸替代为谷氨酸；将EU氨基酸位置286位的天冬酰胺替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置288位的赖氨酸替代为谷氨酸或者天冬氨酸；将EU氨基酸位置290位的赖氨酸替代为谷氨酸；和将EU氨基酸位置304位的丝氨酸替代为天冬氨酸，其中，改变的多肽与不含突变的起始多肽相比具有更长的循环半衰期。一个实施方案中，本发明涉及治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用至少包含Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，所述多肽包含至少一个选自下组的突变将EU氨基酸位置248位替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置249位替代为精氨酸或者赖氨酸；将EU氨基酸位置250位替代为精氨酸或者赖氨酸；将EU氨基酸位置251位替代为精氨酸、赖氨酸或者天冬酰胺；
将EU氨基酸位置252位替代为丝氨酸或者苏氨酸；
将EU氨基酸位置254位替代为丝氨酸或者苏氨酸；
将EU氨基酸位置256位替代为精氨酸，谷氨酸，或者赖氨酸；
将EU氨基酸位置255位替代为亮氨酸、天冬氨酸或者甲硫氨酸；
将EU氨基酸位置260位替代为赖氨酸；
将EU氨基酸位置257位替代为精氨酸、天冬氨酸，谷氨酸或者赖氨酸; 将EU氨基酸位置277位替代为精氨酸、天冬氨酸，谷氨酰胺或者赖氨酸；
将EU氨基酸位置279位替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置281位替代为谷氨酰胺；
将EU氨基酸位置282位替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者赖氨酸; 将EU氨基酸位置287位替代为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸或 者苏氨酸；
将EU氨基酸位置284位替代为天冬氨酸；
将EU氨基酸位置285位替代为天冬氨酸或者苯丙氨酸；
将EU氨基酸位置286位替代为谷氨酸或者曱硫氨酸；
将EU氨基酸位置288位替代为天冬氨酸；
将EU氨基酸位置290位替代为天冬氨酸；
将EU氨基酸位置304位替代为天冬氨酸或者谷氨酸；
将EU氨基酸位置305位替代为精氨酸；
将EU氨基酸位置306位替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或者赖氨酸;
将EU氨基酸位置307位替代为精氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸；
将EU氨基酸位置309位替代为精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸或者谷氨酸;
将EU氨基酸位置310位替代为精氨酸、亮氨酸、赖氨酸或者天冬酰胺;
将EU氨基酸位置312位替代为精氨酸、天冬酰胺、或者赖氨酸；
将EU氨基酸位置313位替代为天冬氨酸、精氨酸或者赖氨酸；
将EU氨基酸位置315位替代为天冬氨酸或者谷氨酸；
将EU氨基酸位置343位替代为谷氨酰胺或者赖氨酸；
将EU氨基酸位置345位替代为精氨酸或者谷氨酰胺；
将EU氨基酸位置374位替代为精氨酸、赖氨酸或者亮氨酸；
将EU氨基酸位置376位替代为天冬酰胺；
将EU氨基酸位置426位替代为精氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸； 将EU氨基酸位置428位替代为精氨酸、谷氨酰胺或者赖氨酸； 将EU氨基酸位置430位替代为赖氨酸； 将EU氨基酸位置431位替代为脯氨酸； 将EU氨基酸位置432位替代为精氨酸； 将EU氨基酸位置434位替代为亮氨酸或者赖氨酸；和 将EU氨基酸位置438位替代为谷氨酸，其中，改变的多肽与不含突变的起始多肽相比具有更短的循环半衰期。 另一方面，本发明涉及治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用至少包含Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，所述多肽包含至少一个选自下组的突变将EU氨基酸位置248位的赖氨酸替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置249位的天冬氨酸替代为精氨酸或者赖氨酸；将EU氨基酸位置250位的苏氨酸替代为精氨酸或者赖氨酸；将EU氨基酸位置251位的亮氨酸替代为精氨酸、赖氨酸或者天冬酰胺;将EU氨基酸位置252位的曱硫氨酸替代为丝氨酸或者苏氨酸；将EU氨基酸位置254位的曱硫氨酸替代为丝氨酸或者苏氨酸；将EU氨基酸位置256位的苏氨酸替代为精氨酸、谷氨酸或者赖氨酸；将EU氨基酸位置255位的精氨酸替代为亮氨酸、天冬氨酸或者曱疏氨酸；将EU氨基酸位置260位的苏氨酸替代为赖氨酸； 将EU氨基酸位置257位的脯氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或 者赖氨酸；将EU氨基酸位置277位的色氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺， 或者赖氨酸；将EU氨基酸位置279位的缬氨酸替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置281位的甘氨酸替代为谷氨酰胺； 将EU氨基酸位置282位的缬氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或 者赖氨酸；将EU氨基酸位置287位的丙氨酸替代为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、 脯氨酸或者苏氨酸；
将EU氨基酸位置284位的缬氨酸替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置285位的组氨酸替代为天冬氨酸或者苯丙氨酸； 将EU氨基酸位置286位的天冬酰胺替代为谷氨酸或者曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置288位的赖氨酸替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置290位的赖氨酸替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置304位的丝氨酸替代为天冬氨酸或者谷氨酸； 将EU氨基酸位置305位的缬氨酸替代为精氨酸； 将EU氨基酸位置306位的亮氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或 者赖氨酸；将EU氨基酸位置307位的苏氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸; 将EU氨基酸位置309位的亮氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸或 者谷氨酸；将EU氨基酸位置310位的组氨酸替代为精氨酸、亮氨酸、赖氨酸或者 天冬酰胺；将EU氨基酸位置312位的天冬氨酸替代为精氨酸、天冬酰胺，或者赖 氨酸；将EU氨基酸位置313位的色氨酸替代为天冬氨酸、精氨酸或者赖氨酸; 将EU氨基酸位置315位的天冬酰胺替代为天冬氨酸或者谷氨酸； 将EU氨基酸位置343位的脯氨酸替代为谷氨酰胺或者赖氨酸； 将EU氨基酸位置345位的谷氨酸替代为精氨酸或者谷氨酰胺； 将EU氨基酸位置374位的脯氨酸替代为精氨酸、赖氨酸或者亮氨酸； 将EU氨基酸位置位的天冬氨酸376替代为天冬酰胺； 将EU氨基酸位置426位的丝氨酸替代为精氨酸、天冬氨酸或者谷氨酸; 将EU氨基酸位置428位的甲硫氨酸替代为精氨酸、谷氨酰胺，或者赖 氨酸；将EU氨基酸位置430位的谷氨酸替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置431位的丙氨酸替代为脯氨酸；将EU氨基酸位置432位的亮氨酸替代为精氨酸；将EU氨基酸位置434位的天冬酰胺替代为亮氨酸或者赖氨酸；和将EU氨基酸位置438位的谷氨酰胺替代为谷氨酸，其中，改变的多肽与不含突变的起始多肽相比显示出更短的循环半衰期。
一个实施方案中，本发明涉及制备权利要求1或2的改变的多肽的方 法，所述方法包括(a) 用包含编码所述改变的多肽的核苷酸序列的核酸分子转染细胞；和(b) 从所述细胞或细胞上清液纯化该改变的多肽。 一个实施方案中，本发明涉及制备权利要求11或13的抗体的方法，所述方法包括序列的第一核酸分子；(b) 提供包含编码所述抗体的重链的可变区(VH)和恒定区(CH,， CH2和 CH3)的核香酸序列的第二核酸分子；(c) 在允许包含所述编码的轻链和重链的所述改变的抗体表达的条件 下，用第一和第二核酸分子转染细胞；和(d) 从所述细胞或细胞上清液纯化所述抗体。一个实施方案中，本发明涉及包含第一和第二多肽链的二聚体Fc结合 蛋白，其中所述第一和第二多肽链各包含至少一个与Fc结合结构域可操作 连接的Fc区结构域。一个实施方案中，所述Fc结构域被突变以降低或消除与FcRn的结合。 一个实施方案中，所述第一和第二多肽链共价连接。 一个实施方案中，Fc结合结构域包舍FcRn的胞外域。 一个实施方案中，Fc结合结构域与P2微球蛋白结合。 一个实施方案中，Fc结合结构域来源于人FcRn。一个实施方案中，所述结合蛋白包含SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列。一个实施方案中，本发明涉及测量至少包含Fc区的FcRn结合部分的 多肽针对FcR的结合亲合力(affimty)的方法，所述方法包括使至少包含Fc 区的FcRn结合部分的多肽与权利要求44的二聚体Fc结合蛋白接触，并确 定该相互作用的亲合力。一个实施方案中，本发明涉及从至少包含Fc区的FcRn结合部分的多 肽的文库中筛选对FcRn具有改变的结合亲合力的多肽的方法，该方法包括(a)使文库成员与权利要求44的二聚体Fc结合蛋白接触；和 (b) 测量多肽对二聚体Fc结合蛋白的结合亲合力；和(c) 选择对FcRn具有改变的结合亲合力的多肽。一个实施方案中，本发明涉及从多肽混合物中纯化至少包含Fc区的 FcRn结合部分的多肽的方法，该方法包括将混合物加载至含有权利要求44 的二聚体Fc结合蛋白质的亲和柱上，洗脱至少包含Fc区的FcRn结合部分 的多肽，由此纯化该多肽。一个实施方案中，在第一pH时将所述混合物加载至亲和柱上，并在第 二 pH时从亲和柱上洗脱所述多肽。一个实施方案中，多肽在纯化过程中不变性。一个实施方案中，本发明涉及鉴定与起始多肽相比对FcRn具有改变的 结合亲合性的多肽的方法，该方法包括(a) 确定结合在溶剂中FcRn时起始多肽的氨基酸的最佳电荷分布的空 间表现以及起始多肽的结合自由能的相关变化；(b) 鉴定起始多肽中待修饰以改变起始多肽与FcRn结合时的结合自由 能的至少一个候选氨基酸残基位置；和(c) 鉴定在该氨基酸位置选择的氨基酸，以便在该起始多肽中掺入该突 变后导致对FcRn具有改变的结合亲合性(affinity)的改变的多肽。一个实施方案中，所述方法还包括将选择的氨基酸掺入起始多肽中。一个实施方案中，所述方法还包括计算所述含有Fc的改变的多肽与起 始多肽相比在结合FcRn时的结合自由能的变化。一个实施方案中，所述计算步骤首先包括在计算机上模建起始多肽中 的突变，然后计算结合自由能的变化。一个实施方案中，所述计算步骤使用至少一种选自下组的确定方法 使用基于Poisson-Boltzmann公式的方法确定的静电结合能以及范德瓦尔氏 结合能、并使用基于溶剂可及表面面积的方法确定结合能。一个实施方案中，突变是氨基酸替代。一个实施方案中，氨基酸替代导致掺入与候选氨基酸具有不同电荷的 当选氨基酸。一个实施方案中，突变增加了含有Fc的改变的多肽和FcRn在溶剂中 结合时的结合自由能，由此降低了含有Fc的改变的多肽对FcRn的结合亲 合性。
一个实施方案中，突变降〗氐了含有Fc的改变的多肽和FcRn在溶剂中 结合时的结合自由能，由此增加了含有Fc的改变的多肽对FcRn的结合亲合性。一方面，本发明涉及鉴定在两个不同的pH水平对FcRn具有改变的结 合亲合性的、含有Fc的改变的多肽的方法，所述方法包括(a) 确定在第一 pH水平在溶剂中与FcRn结合时起始多肽的氨基酸的 最佳电荷分布的空间表现以及起始多肽的结合自由能的相关变化；(b) 确定在第二 pH水平在溶剂中与FcRn结合时起始多肽的氨基酸的最 佳电荷分布的空间表现以及起始多肽的结合自由能的相关变化；(c) 通过比较电荷分布、在第一和第二pH水平下的显示不同电荷分布 的残基，鉴定起始多肽中有待修饰以改变起始多肽与FcRn结合时的结合自 由能的至少一个候选氨基酸残基位置；和(d) 选择位于所述氨基酸位置的当选氨基酸，以便该当选氨基酸掺入起 始多肽后导致对FcRn具有改变的结合亲合性的、含有Fc的、改变的多肽。在一个实施方案中，第一pH是大约7.4。一个实施方案中，多肽的亲合性在第一pH时比在第二pH时高大约1.5 倍至大约100倍。本发明的一个或多个实施方案的细节将在附图和以下描述中阐述。基 于此描述和附图以及权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将是显而 易见的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它参考文献的内容特 此完整地并入作为参考。附图简述图lA显示用作本发明方法中的起始多肽的成熟huCBEll重链的DNA 序列。该DNA序列在pEAG1787表达载体中编码。图1B显示预测的成熟 huCBEll重链的氨基酸序列。图2显示用作本发明方法中的起始多肽的huCBE11重链的Fc区的氨基 酸序列。按在Kabat中的EU编号方式，指示氨基位置。图3A显示huCBEll轻链的DNA序列。该DNA序列在pEAG1754表 达栽体中编码。图3B显示预测的huCBEll轻链的氨基酸序列。图4A显示人卩微球蛋白的DNA序列。该DNA序列在pEAG1761表
达载体中编码。图3B显示预测的人(3微球蛋白的氨基酸序列。图5A显示编码人FcRn/Fc/融合蛋白的cDNA的核苷酸序列。该DNA 序列在pEAG1761表达载体中编码。图3B显示预测的该FcRn/Fc/融合蛋白的氨基酸序列。图6显示使用基于FRET的试验评价本发明的改变的多肽的FcRn结合 亲合性得到的结果。在结合亲合性方面具有可测量的增加的突变(H285E， N286D，K290E,和S304D)用向下指的箭头指示。结合亲合性显著降低的突 变(N434L)以向左指的箭头指示。图7显示使用AlphaScreen试验评价本发明的改变的多肽的FcRn结合 亲合性得到的结构。结合亲合性可测量地增加的突变(V284E, H285E， N286D， 和K290E)用向下指的箭头指示。结合亲合性显著降低的突变(Q438E)以向左 指的箭头指示。图8显示本发明中使用的huCBEll重链的Fc区的结构模型。具有增强 的FcRn亲合性的特定"上突变体(up mutant)"(V284E， H285E， N286E， K290E) 和具有降低的FcRn亲合性的特定"下突变体(down mutant)，，(V282E， M252T， N434L， Q438L)的位置相对于FcRn的其它结构域作了指明。图9中的A图显示FcRn结合环的位置，该环从图9中有关FcRn结构 域显示的天冬氨酸280延伸至苏氨酸299。 B图显示有关FcRn结构域在15 埃FcRn接触区中残基的位置(例如，243 F; 244 P; 245 P; 246 K; 247 P; 248 K; 249 D; 250 T; 251 L; 252 M; 253 I; 254 S; 255 R; 256 T; 257 P; 258 E; 259 V; 260 T; 261 C; 275 F; 276 N; 277 W; 278 Y; 279 V; 280 D; 282 V; 283 E; 284 V; 285 H; 286 N; 287 A; 288 K; 289 T; 290 K; 291 P; 292 R; 293 E; 302 V; 303 V; 304 S; 305 V; 306 L; 307 T; 308 V; 309 L; 310 H; 311 Q; 312 D; 313 W; 314 L; 315 N; 316 G; 317 K; 318 E; 319 Y; 336 I; 337 S; 338 K; 339 A; 340 K; 341 G; 342 Q; 343 P; 344 R; 345 E; 346 P; 347 Q; 348 V; 367 C; 369 V; 372 F; 373 Y; 374 P; 375 S; 376 D; 377 I; 378 A; 379 V; 380 E; 381 W; 382 E; 383 S; 384 N; 385 G; 386 Q; 387 P; 388 E; 389 N; 391 Y; 393 T; 408 S; 424 S; 425 C; 426 S; 427 V; 428 M; 429 H; 430 E; 431 A; 432 L; 433 H; 434 N; 435 H; 436 Y; 437 T; 438 Q; 439 K;和440 S)。图10显示生物素化的hlgG与按3 、 6和9jig/ml的不同浓度包被在ELISA 板上的hFcRnFc的结合。生物素化的hlgG的浓度按所示进行变化，并以1:20,000的浓度使用HPR-链霉亲和素，并用标准方案显影。终止反应后， 读取450nm的吸光度。9吗/ml (口)和6pg/ml (o)的hFcRnFc在结合曲线上显 示无变化，而3pg/ml(A)hFcRnFc显示出降低的与包被的hlgG的结合。阴 性对照(O)显示在hFcRiiFc不存在的情况下链霉亲和素HRP的背景结合。发明详述本发明至少部分地基于对如下多肽的鉴定，所述多肽(例如抗体和融 合蛋白质)包括对新生儿Fc受体(FcRn)显示出改变的结合的Fc区的至少一 个部分(例如免疫球蛋白如IgGl的恒定区)。该改变的多肽与野生型多肽相 比显示出增加的或减少的与FcRn的结合，因此在血清中分别具有增加的或 降低的半衰期。对FcRn具有提高的亲合性的Fc区预期将具有更长的血清 半衰期，此类分子可以用于期望施用的多肽具有长半衰期的哺乳动物动物 治疗方法中，例如用于治疗慢性疾病或病症。相反地，具有降低的FcRn结 合亲合性的Fc区变体预期具有较短的半衰期，此类分子也可以用于例如在 缩短的循环时间可能是有利的情况下向哺乳动物施用，例如，用于体内诊 断成像或者用于起始多肽在循环中长期存在时具有毒副作用的情况中。具 有降低的FcRn结合亲合性的Fc区变体也具有更小的跨越胎盘的可能性， 由此也可以用于治疗孕妇的疾病或病症。此外，可能期望降^^的FcRn结合 亲合性的其它应用包括期望定位脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性 实施方案中，本发明的改变的多肽显示出自脉管系统跨肾小球上皮的转运 降低。在另一实施方案中，本发明改变的多肽显示出自脑跨血脑屏障(BBB) 进入血管间隙的转运降低。本发明还涉及制备此改变的多肽的方法和使用此多肽的方法。本发明 还涉及FcRn的新形式及其使用方法。本发明的各个方面在以下小节中进一步详细描述 I.定义术语"蛋白质"、"多肽，，和"肽，，在本文中可以互换使用。蛋白质可以包含 一个或多个天然氨基酸或者非天然氨基酸。"起始多肽"或者"第一多肽"是包含如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序 列缺少本文所公开的一个或多个Fc区修饰并且与改变的或修饰的多肽具有 不同的效应子功能。起始多肽是包含Fc区或其FcRn结合部分的天然或人
工多肽。起始多肽可以包含天然Fc区序列或者具有先已存在的氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或替代)的Fc区。本发明的起始多肽按本文所示进 行修饰以调节(增加或降低)与FcRn的结合亲合性。本文中，术语"改变的多肽"或者"第二多肽"指包含在Fc区含有至少一 个突变的非天然Fc结合部分的多肽。当提及改变的多肽显示出"改变的效应 子功能，，时，意指所述改变的多肽与起始多肽相比或多或少地有利于其一种 或多种(并且可能地，但不是必需的，所有)效应子功能。本文中，术语"Fc区"包括来源于抗体重链恒定区的氨基酸序列。Fc区 是抗体重链恒定区的一部分，自木瓜蛋白酶切割位点(根据EU索引，大约 216位)处的铰链区N端起始，包括铰链、CH2和CH3结构域。起始多肽可以至少包含介导与FcRn结合的Fc区的一部分。例如，在一个实施方案中，起始多肽是抗体或者Fc融合蛋白。本文中，"融合蛋白，，指包含与第二氨基酸序列连接的第 一氨基酸序列的嵌合多肽，其中所述第 一和第二氨基酸序列在天然情况下不连接。例如，融合蛋白质可以包含编码Fc区的至少一个部分(例如赋予和FcRn的结合性质的Fc区部分)的氨基 酸序列和编码非免疫球蛋白多肽(例如受体的配体结合结构域或配体的受 体结合结构域)的氨基酸序列。这些氨基酸序列通常存在于分开的蛋白质 中，但在融合多肽中被拉在一起；或者它们可以在正常情况下存在于同一 蛋白质中，但是在融合多肽中被放置在新的排列位置上。融合蛋白质可以 通过例如化学合成、或者通过构建和翻译按期望关系编码这些肽区的多核 苷酸来产生。本文中，术语"连接"、"融合"和"融合的"可互换使用。这些术语指两个 或者两个以上的元件或者成分通过任何方式(包括化学缀合或重组方法) 连接在一起。"框内融合"或"可操作连接"指两个或两个以上阅读框(ORF)以 保持这些原始ORF的正确阅读框的方式连接以形成一个连续的更长ORF。 因此，所得的重组融合蛋白质是含有两个或多个区段的单一蛋白质，其中 所述区段相应于原始ORF编码的多肽(这些区段在正常情况下并不天然如 此连接)。尽管由此制备的阅读框在整个融合区段上是连续的，但是这些区 段可能在物理上或者空间上由例如框内接头序列分隔开。一个实施方案中，本发明多肽包含免疫球蛋白抗原结合位点或受体分 子中负责配体结合的部分或配体分子中负责受体结合的部分。 本文中，术语"效应子功能"指Fc区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞并介导各种生物学效应的功能性能力。效应子功能可以是抗原依赖 性的或者抗原非依赖性的。本文中，术语"抗原依赖性效应子功能，，指正常在抗体结合相应抗原后诱 导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白质(例如， Clq)的能力。例如，补体Cl组分与Fc区的结合可以激活经典补体系统， 导致调理作用和细胞病原体的裂解，该过程称作补体依赖性细胞毒性 (CDCC)。补体的激活也刺激炎症反应，并还可能涉及自身免疫超敏反应。其它抗原依赖性效应子功能由抗体通过其Fc区和细胞上的某些Fc受 体("FcR")的结合所介导。有多种对不同抗体类型，包括IgG(Y受体，或者 Ig丫R)、 IgE(e受体,或IgsR)、 IgA(a受体，或IgaR)和IgM(p受体，或Ig^R), 具有特异性的Fc受体。抗体与细胞表面上Fc受体的结合触发许多重要的 不同生物学反应，包括免疫复合物的内吞、抗体包被的颗粒或微生物的吞 食和破坏(也称作抗体依赖性吞噬作用，或ADCP)、免疫复合物的清除、杀 伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性， 或ADCC)、炎性介质的释放、免疫系统细胞活化的调节、免疫球蛋白产物 的胎盘转移和控制。某些Fc受体，Fcy受体(FqR),在取消或增强免疫募集方面扮演着关鍵 角色。FcyR表达在白细胞上，由三个不同类型组成FcyRI， FcyRII和FcyRIII。 IgG免疫球蛋白同种型的Fc区(Gessner等，Ann. Hematol.， (1998), 76: 231-48)。结构上，这些FcYR均是免疫球蛋白超家族的成员，具有结合IgG 的a链，该a链具有由两个或三个Ig样结构域组成的胞外部分。人FcyRI (CD64)表达在人单核细胞上，表现出对单体IgGl、 IgG3和IgG4的高亲和 力结合(Ka-l()8-109]Vr1)。人FcyRII(CD32)和FcyRI11 (CD16)对IgGl和IgG3 具有低亲和力(Ka<107M")，并仅能够结合复合形式的或者多聚体形式的这 些IgG同种型。此外，FcyRII和FcyRIII型包含"A"和"B"形式。FcyRIIa (CD32a) 和Fc丫RIIIa (CD16a)通过3争膜结构i或结合在巨嗟细月包、NK细月包和一些T细 胞表面，而FcyRIIb (CD32b)和FcYRIIIb (CD16b)通过磷脂酰肌醇聚糖(GPI) 锚选择性地结合在粒细胞(例如嗜中性粒细胞)的细胞表面。人FcyRJ、 FcyRII 和FcyRIII的相应鼠同源物是FcyRIIa、 FcyRIIb/1和FcyRlo。本文中，术语"抗原非依赖性效应子功能"指无论抗体是否已结合其相应
抗原均可以被抗体诱导的效应子功能。典型的抗原非依赖性效应子功能包括免疫球蛋白的细胞转运、循环半衰期和清除速率。结构独特的Fc受体， "新生儿Fc受体"或者"FcRn"，也称作补救受体(salvage receptor),在调节这 些功能方面具有关键作用。优选地，本发明多肽所结合的FcRn是人FcRn。与属于免疫球蛋白超家族的Fc丫R不同，人FcRn在结构上类似于I型 主要组织相容性复合物(MHC)的多肽(Ghetie和Ward, Immunology Today, (1997)， 18 (12): 592-8)。 FcRn典型地以异二聚体形式表达，该异二聚体由跨 膜a链或重链与可溶性p链或轻链①2微球蛋白)形成的复合物组成。FcRn 与I型MHC分子有22-29%序列同一性，具有非功能性形式的MHC肽结合 沟(Simister和Mostov, Nature, (1989)， 337: 184-7)。与MHC —样，FcRn的a 链由三个胞外i或(al， a2, a3)组成， 一个短的胞质尾将蛋白质锚定在细胞表 面。al和a2结构域与抗体Fc区中的FcR结合位点相互作用(Raghavan等, Immunity, (1994)， 1: 303-15)。FcRn在哺乳动物的母体胎盘或者卵黄嚢中表达，并且参与IgG自母体 向胎儿的转移。FcRn也在新生啮齿动物的小肠中表达，在此处FcRn参与 母体IgG自摄入的初乳或乳跨刷状缘上皮细胞的转移。FcRn也表达在许多 物种的许多其它组织中，以及各种内皮细胞系中。其也在成人血清内皮、 肌肉脉管系统和肝窦状隙中表达。据认为FcRn通过结合IgG并将IgG回收 至血清，也参与维持IgG的循环半衰期或血清水平。FcRn与IgG分子的结 合是严格地pH依赖性的，在小于7.0的pH时具有最佳结合。本文中，术语"半衰期"指特定含有Fc的多肽在体内的生物学半衰期。 半衰期可以通过从动物的循环和/或其它组织中清除掉施用给受试者的半数 量所需要的时间来表示。在以时间函数的形式构建了给定的含有Fc的多肽 的清除曲线时，曲线通常是双相的，具有快速的a相和较长的|3相。a相典 型地表示施用的Fc多肽在血管内间隙和血管外间隙之间的平衡，其部分地 取决于多肽的大小。卩相典型地表示Fc多肽在血管内间隙中的代谢。因此， 在优选的实施方案中，本文所用的术语"半衰期"指卩相的Fc多肽的半衰期。 人类抗体的典型|3相半衰期是21天。本文中，术语"突变"包括起始多肽中氨基酸的替代、添加或缺失以获得 改变的多肽。"氨基酸替代"指将预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少
一个现有氨基酸残基替代为另 一不同的"置换"氨基酸残基。所述一个或多个置换残基可以是"天然氨基酸残基"(即，遗传密码子编码的)，并选自丙氨 酸(A);精氨酸(R);天冬酰胺(N);天冬氨酸(D);半胱氨酸(C);谷氨酰胺(Q); 谷氨酸(E);甘氨酸(G);组氨酸(H);异亮氨酸(I);亮氨酸(L);赖氨酸(K); 曱硫氨酸(M);苯丙氨酸(F);脯氨酸(P);丝氨酸(S);苏氨酸(T);色氨酸(W); 酪氨酸(Y);和缬氨酸(V)。用一个或多个非天然氨基酸残基替代也包括在本 文的氨基酸替代的定义中。"非天然氨基酸残基"指非以上列出的天然氨基酸 残基、能够在多肽链中共价结合相邻氨基酸残基的残基。非天然氨基酸残 基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基 类似物，例如Ellman等Meth. Enzym. 202:3(M-336 (1991)中描述的那些。为 了制备这些非天然氨基酸残基，可以使用例如Noren等Science 244:182 (1989)和Ellman等,同上引文的方法。简言之，这些方法包括用非天然氨基 酸残基化学活化抑制型tRNA之后体外转录和翻译该RNA。本文中，术语"非极性"包括具有不带电荷的侧链的氨基酸(例如，A，L,I， V，QP)。这些氨基酸通常参与疏水性相互作用。本文中，术语"极性"包括具有零净电荷但在其侧链的不同部分具有非零 的部分电荷的氨基酸(例如，M,F, W，S，Y，N，Q，C)。这些氨基酸可以参与疏 水性相互作用和静电相互作用。本文中，术语"带电荷的"包括在侧链上可以具有非零净电荷的氨基酸 (例如，R, K， H， E， D)。这些氨基酸可以参与疏水性相互作用和静电相互作 用。"氨基酸插入"指至少一个氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。尽管插入通 常是一个或多个氨基酸残基的插入，但可以进行本发明更大的"肽插入"，例 如插入大约3至大约5个或甚至多达大约10个氨基酸残基。如以上公开的， 插入的残基可以是天然的或非天然的。"氨基酸缺失"指从预定氨基酸序列中除去至少 一个氨基酸残基。 本文中，术语"足够大的空间体积"包括具有占据较大的3维空间的侧链 的氨基酸。具有足够大空间体积的侧链化学的示例性氨基酸包括酪氨酸、 色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和曱疏氨酸、或其 类似物或模拟物。本文中，术语"溶剂可及表面面积"指接触溶剂分子的原子的表面面积。
溶剂可及表面面积可以使用本领域熟知的方法计算。简言之， 一个原子或 一组原子如果可以和规定大小的溶剂(水)分子发生范德瓦尔氏接触时，被定 义为可及的。范德瓦尔氏接触是当溶剂分子沿着蛋白质滚动造成最大允许 接触时溶剂分子的中心的位置。术语"结合亲合性，，在本文中包括结合相互作用的强度并由此包括实际 的结合亲合性和表观结合亲合性。实际结合亲合性是结合速率与解离速率 的比。因此，赋予或优化结合亲合性包括改变这些成分之一或两者以得到 期望水平的结合亲合性。表观亲合性可以包括例如相互作用的亲合力(avidity)。术语"结合自由能"或"结合的自由能"在本文中包括其本领域认可的意 义，并尤其应用于溶剂中Fc-Fc受体相互作用。结合自由能的降低将增强亲 合性，而结合自由能的增加将降低亲合性。术语"结合结构域"或"结合位点，，在本文中指多肽中介导与靶分子(例如 抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的特异性结合的一个或多个区域。示例 性结合结构域包括抗体可变区、配体的受体结合结构域、受体的配体结合 结构域或酶结构域。术语"配体结合结构域"在本文中指任何天然受体(例如 细胞表面受体)或保留了至少定性的配体结合能力以及优选地相应天然受体 的生物学活性的天然受体的任何区域或衍生物。术语"受体结合结构域"在本 文中指任何天然配体、或保留了至少定性的受体结合能力以及优选地相应 天然配体的生物学活性的天然配体的任何区域或衍生物。在一个实施方案 中，多肽具有至少一个对定向降低或消除的分子(例如细胞表面抗原或可 溶性抗原)具有特异性的结合结构域。在优选实施方案中，结合结构域是 抗原结合位点。在一个优选实施方案中，本发明多肽包含至少一个结合位点(例如，抗 原结合位点、受体结合位点或配体结合位点)。 一个实施方案中，本发明多 肽包含至少两个结合位点。 一个实施方案中，本发明多肽包含三个结合位 点。在另一实施方案中，本发明多肽包含四个结合位点。本发明多肽可以是单体或多聚体。例如， 一个实施方案中，本发明多 肽是二聚体。 一个实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包含两个相同的单体亚基。 一个实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，包含两个 不同的单体亚基。二聚体的亚基可以包含一条或多条多肽链。例如， 一个
实施方案中，二聚体包含至少两条多肽链。 一个实施方案中，二聚体包含 两条多肽链。另一实施方案中，二聚体包含四条多肽链(例如，在抗体分子 的情况下)。术语"暴露的"氨基酸残基在本文中包括当存在于溶剂中的多肽中时，其 表面的至少一部分在某种程度上暴露于溶剂的氨基酸残基。优选地，暴露 的氨基酸残基是至少大约三分之一的側链表面面积暴露于溶剂的氨基酸残 基。可以获得多种方法用于确定残基是否是暴露的，包括分子模型或多肽 结构的分析。术语"变体"、"改变的多肽"、"修饰的多肽"、"含有修饰的氨基酸的多 肽，，及同类术语在本文中包括具有与起始多肽的氨基酸不同的氨基酸序列 的多肽。典型地，此类多肽具有一个或多个突变，例如一个或多个氨基酸 残基被另外的氨基酸残基替代或者发生一个或多个的氨基酸残基插入或缺失。优选地，多肽包含含有非天然的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。该 变体必然与起始抗体具有少于100%的序列同一性或相似性。在一个优选实 施方案中，变体具有与起始多肽的氨基酸序列有大约75%至少于100%的氨 基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，更优选地大约80%至少于100%、 更优选地大约85%至少于100%、更优选地大约90%至少于100%、最优 选地大约95%至少于100%的氨基酸同一性或相似性。 一个实施方案中， 起始抗体和本发明的修饰抗体之间存在一个氨基酸差异。关于此序列的同序列同 一性百分数后，候选序列中与起始氨基酸残基相同的氨基酸残基(即， 相同残基)的百分数。本发明的修饰多肽可以进行表达，或者备选地可以在 计算机上进行模建。本文中短语"候选氨基酸残基位置"包括在本发明多肽中鉴定到的氨基 酸位置，其中候选氨基酸位置的替代被模建、预测或经验性地发现可以在 改变、缺失、插入或用另一氨基酸替代后调节多肽的FcRn结合亲和力。术语"选定的氨基酸"在本文中用于指通过本发明方法选出的用于作为 置换氨基酸掺入多肽中候选氨基酸位置的氨基酸残基。 一个实施方案中， 候选氨基酸残基位置被当选氨基酸替代使得静电在Fc-FcRn复合物的结合 自由能中所起的作用降低或增加。
体。例如，抗体可以是从啮齿类动物例如小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠或豚鼠； 从较大动物例如兔、猫或狗；从通常作为牲畜祠养的动物(例如猪、牛、马、 绵羊或山羊)；或从灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)获得的或者产生 的抗体。术语"抗体"也包括免疫球蛋白分子和修饰的免疫球蛋白分子，例如 含有结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点和至少Fc区中介导与 FcRn结合的部分的分子。本文中，术语"抗体"也包括包含Fc区的至少一个 部分的修饰的或合成的抗体分子。本文中，术语"铰链区"包括重链分子中连接CHl结构域和CH2结构域 的部分，例如，根据EU编号系统从大约216位至230位。该铰链区包含大 约25个残基，并具有柔性，由此允许两个N端抗原结合区独立地移动。铰 链区可以细分成三个不同结构域上、中和下铰链结构域(Roux等，J. Immunol. 1998， 161:4083)。本文中，术语"CH2结构域"包括重链分子中从例如大约EU位置231位 延伸至340位的部分。CH2结构域是独特的，因为其不与另一结构域紧密 配对。相反地，两个N连接的分支糖链介入完整天然IgG分子的两个CH2 结构域之间。本文中，术语"CH3结构域"包括重链分子中自CH2结构域的N端延伸 大约IIO个残基的部分(例如大约残基341位至446位，EU编号系统)。 CH3结构域典型地形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可 以从CH3结构域延伸出额外的结构域以形成该分子的C端部分(例如，IgM 的|1链和IgE的s链中的CH4结构域)。一个实施方案中，在Fc区的"FcRn结合环"中进行一个或多个氨基酸突 变。FcRn结合环由280, 281, 282, 283， 284， 285, 286， 287, 288, 289， 290, 291， 292， 293， 294, 295， 296， 297, 298和299位氨基酸残基(根据EU编号)组成。 该环描述在图9中。另一实施方案中，在15AFcRn"接触区"中进行一个或多个氨基酸突变。 本文中，术语15AFcRn"接触区"包括位于如下位置的残基(也列出了用于这 些位置的示例性氨基酸)243 F; 244 P; 245 P; 246 K; 247 P; 248 K; 249 D; 250 T; 251 L; 252 M; 253 I; 254 S; 255 R; 256 T; 257 P; 258 E; 259 V; 260 T; 261 C; 275 F; 276 N; 277 W; 278 Y; 279 V; 280 D; 282 V; 283 E; 284 V; 285 H; 286 N; 287 A; 288 K; 289 T; 290 K; 291 P; 292 R; 293 E; 302 V; 303 V; 304 S;305 V; 306 L; 307 T; 308 V; 309 L; 310 H; 311 Q; 312 D; 313 W; 314 L; 315 N; 316 G; 317 K; 318 E; 319 Y; 336 I; 337 S; 338 K; 339 A; 340 K; 341 G; 342 Q; 343 P; 344 R; 345 E; 346 P; 347 Q; 348 V; 367 C; 369 V; 372 F; 373 Y; 374 P; 375 S; 376 D; 377 I; 378 A; 379 V; 380 E; 381 W; 382 E; 383 S; 384 N; 385 G; 386 Q; 387 P; 388 E; 389 N; 391 Y; 393 T; 408 S; 424 S; 425 C; 426 S; 427 V; 428 M; 429 H; 430 E; 431 A; 432 L; 433 H; 434 N; 435 H; 436 Y; 437 T; 438 Q; 439 K;和440S(EU编号)。本文中提及"计算分析"时指实施本文描述的所有或一些操作的计算机 执行过程。该过程包括向用户展示信息的输出装置(例如，CRT显示器、LCD、 打印机、通讯装置例如调制解调器、音频输出等)。该计算机执行过程不限 于特定的计算机平台、特定的处理器、或特定的高级编程语言。术语"结构"、或"结构数据"在本文中包括被原子、分子、化合物、氨基 酸残基或其部分、以及大分子或其部分、以及尤其是在溶剂中与抗原结合 的多肽占据的、已知的、预测的和/或才莫建的三维空间位置。可以使用多种 用于在分子/原子水平鉴定和/或预测结构的方法，例如X射线晶体学、NMR 结构模建等。短语"最佳电荷分布的空间表现"在本文中包括针对Fc区或Fc-FcRn复 合物模建电子分布，其中相对于起始多肽和/或与FcRn结合的起始多肽的已 知和/或模建的电荷分布表现，优化(最小化)静电在多肽与FcRn结合时的 自由能中的贡献。最佳电荷分布的模建可以通过在计算机上的程序实现， 其中通过输入将已知的和/或模建的Fc区或Fc-FcRn复合物的结构并入所述 程序。可以使用反应连续体模建(response continuum modeling)(例如，线性 Poisson-Boltzmann公式)将复合物在溶剂中的静电结合自由能表示为Fc去 溶剂化项、Fc-FcRn相互作用项和FcRn去溶剂化项的和。此计算机上程序 的特征在于能够在表现本发明模建的电荷分布中的电荷分布时并入单极、 双极和四极项，此计算机上程序允许广泛地评价多肽氨基酸残基在Fc区或模建多肽-FcRn复合物的最佳电荷分布的空间表现的该方法还可以并入对 范德瓦尔氏力、溶剂可及表面面积力等的模建。术语"溶剂"在本文中包括其广义的本领域认可含义，指其中溶解和/或 存在本发明多肽的任何液体。优选地，溶剂是生物学相容性溶剂。优选的
溶剂包括PBS、血清等。优选的起始多肽包含来源于人类抗体的氨基酸序列。"来源于"指定多肽 或来源物种的多肽或氨基酸序列指该多肽的起源。优选地，来源于特定起 始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与起始序列或其部分基本上相同的氨基酸序列(其中所述部分由至少10至20个氨基酸组成，优选地 至少20-30个氨基酸，更优选地至少30-50个氨基酸)，或者具有可以被本 领域普通技术人员按照其它方式鉴定为起源于起始序列的氨基酸序列。例 如，来源于人类多肽的多肽可以包含来自另一哺乳动物物种的一个或多个 氨基酸。例如，本发明多肽中可以包括灵长类动物的重链部分、铰链部分、 或结合位点。或者，起始多肽，例如抗体的抗原结合位点(CDR)中可以存在 一个或多个鼠源氨基酸。本发明的优选多肽不具有免疫原性。术语"PEG化部分"、"聚乙二醇部分"、或"PEG部分，，包括聚(亚烷基)二 醇化合物或其衍生物，其可以具有或不具有偶联剂或被偶联或活化部分衍 生化(例如，具有巯基、三氟甲基磺酸酯、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮杂环 丙烷、氧杂环丙烷、或优选地具有马来酰亚胺部分，例如PEG-马来酰亚胺)。 其它合适的聚(亚烷基)二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺基一曱氧基 PEG、活化的PEG聚丙二醇、以及带电荷的或中性的如下类型的聚合物 葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸、或其它基于糖的聚合物、氨基酸的聚合物、 及生物素衍生物。术语"功能部分"包括优选地向变体多肽添加期望功能的部分。优选地， 添加功能而不显著改变多肽的内在期望活性，例如在抗体的情况下，不显 著地改变该分子的抗原结合活性。本发明变体多肽可以包含一个或多个功 能部分，这些部分可以相同或不同。有用的功能部分的例子包括但不限于 PEG化部分、封闭部分、可检测部分、诊断部分和治疗部分。示例性可检 测部分包括焚光部分、放射性同位素部分、不透射线部分等。示例性诊断 部分包括适用于揭示疾病或病症的指征是否存在的部分。示例性治疗部分 包括例如抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗感染剂。功能部分也可以具 有上述功能中的一种或多种。其它有用的功能部分是本领域已知的并描述本文中，术语"抗癌剂"或"化疗剂"包括损害赘生性细胞或肿瘤细胞的生 长和/或增殖并可以用于降低、抑制或破坏恶性肿瘤的药剂。此类药剂的例
子包括但不限于细胞抑制剂、烷基化试剂、抗生素、细胞毒性核芬、微管 蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂等。可以起到阻滞或减緩免疫反应性细胞 或恶性细胞生长的作用的任何药剂均在本发明范围内。术语"栽体"或"表达载体"在本文中为了说明书和权利要求的目的，指根 据本发明用作将期望多核苷酸引入细胞并使该期望多核苷酸在细胞中表达的运载体的载体。本领域技术人员已知，该载体可以容易地选自质粒、 噬菌体、病毒和逆转录病毒。 一般地，与本发明相容的载体包含选择标记、 适当的限制性位点以利于期望基因的克隆、以及进入真核或原核细胞并/或 在其中复制的能力。术语"宿主细胞，，指已被载体转化的细胞，其中所述载体利用重组DNA 技术构建并编码至少一个异源基因。在描述从重组宿主分离蛋白质的方法 时，除非另行清楚规定，否则术语"细胞，，和"细胞培养物"可以互换使用以指 蛋白质的来源。换言之，从"细胞"回收蛋白质可以指从离心沉淀的完整细月包，或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养基回收。本文中，"肺瘤相关抗原"指一般地与肿瘤细胞相关(即，与正常细胞相 比，以相同或更大程度存在)的任何抗原。该抗原可以是相对地肿瘤特异 性的，其表达限制于恶性细胞表面，但是该抗原也可以存在于非恶性细胞 上。 一个实施方案中，本发明的改变的多肽与肿瘤相关抗原结合。因此， 本发明起始多肽可以来源于、产生自或创造自与肿瘤相关分子反应的任何 一种抗体。本文中，术语"恶性"指非良性的肿瘤或癌。本文中，"癌"包括以去调节 的或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌包括癌瘤、肉瘤、白 血病和淋巴瘤。术语"癌"包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞尚未向受试者 身体内非原始肿瘤所在地的位点迁移的恶性肿瘤)和继发性恶性肺瘤(例如， 由肿瘤转移——肿瘤细胞向不同于原始肿瘤所在地的第二位点迁移——引 起的恶性肿瘤)。本文中，短语"将得益于多肽的施用的受试者，，包括将从本发明多肽的施 用中获得阳性治疗或预防结果的受试者，例如哺乳动物受试者。本文公开 的多肽的有益用途的例子包括，例如，检测多肽所识别的抗原(例如，用于 诊断方法)或用多肽进行治疗以减少或消除多肽所识别的靶。例如，在一个 实施方案中，受试者可以由可溶分子或颗粒分子(例如毒素或病原体)自循环
或血清中的减少或清除而受益，或者由表达靶的细胞(例如肿瘤细胞)群体的 减少或消除而受益。正如本文中更详细描述的，多肽可以以非缀合形式使 用，或者可以例如与药物、前药、标签或同位素缀合。II.用于修饰的含有Fc的多肽一个实施方案中，本发明起始多肽至少包含Fc区中足以赋予FcRn结 合性质的部分。Fc区中与FcRn结合的部分包含IgGl的大约282位至438 位氨基酸(EU编号)。Fc区中的氨基酸位置在本文中按照EU索引编号系统 编号(见Kabat等，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，U.S. Dept. Health and Human Services, 5th edition, 1991)。 "Kabat中的EU索引，，指人IgGl EU抗体的残基编号。本发明Fc区优选是人类来源的。编码示例性Fc区(人IgGl区)的核苷 酸序列显示在SEQIDNO: 1中，由SEQIDNO: 1的核苷酸序列编码的氨基 酸序列显示在SEQIDNO: 2中。下表1中也给出了 Fc区的氨基酸序列用于 举例说明氨基酸的EU编号。表1:人IgGl CH2和CH3结构域CH2结构域(EU位置231 - 340)231APELLGG238PSVFLFPPKP248KDTLMISRTP258EVTCVVVDVS268HEDPEVKF丽278YVDGVEVHNA288KTKPREEQYN298STYRVVSVLT308VLHQDWLNGK318EYKCKVSNKA328LPAPIEKTIS338KAKCH3结构域(EU位置341-446) 341GQPREPQ348VYTLPPSRDE358LTKNQVSLTC368LVKGFYPSDI378AVEWESNGQP388ENNYKTTPPV398LDSDGSFFLY408SKLTVDKSRW418QQGNVFSCSV428MHEALHNHYT438QKSLSLSPG一个实施方案中，本发明起始多肽至少包含CH2结构域的282-340位 氨基酸。另一实施方案中，本发明起始多肽包含整个CH2结构域(根据EU 编号，抗体Fc区的大约231-340位氨基酸)。另一实施方案中，本发明起始 多肽至少包含CH2结构域以及至少一个铰链区(根据EU编号，抗体Fc区 的大约216-230位氨基酸)和CH3结构域(根据EU编号，抗体Fc区的大约 341-446位氨基酸)。 一个实施方案中，本发明起始多肽包含CH2和CH3结 构域。 一个实施方案中，本发明起始多肽包含铰链、CH2和CH3结构域。 一个实施方案中，本发明起始多肽包含SEQIDNO:2中所示的序列。Fc区 或其FcRji结合部分可以来源于任何同种型(包括IgGl， IgG2， IgG3和IgG4) 的重链。 一个实施方案中，使用人类同种型IgGl。构成起始多肽的Fc区的结构域可以来源于不同免疫球蛋白分子。例如， 多肽可以包含来源于IgGl分子的CH2结构域和来源于IgG3分子的铰链区。 另一实例中，起始多肽可以包含部分来源于IgGl分子且部分来源于IgG3 的铰链区。另一实例中，起始多肽可以包含部分地来源于IgGl分子且部分 地来源于IgG4分子的嵌合铰链。如上述，本领域普通技术人员将理解，可 以修饰起始Fc结构域(例如在该分子的非FcRn结合部分中)从而使得其在氨 基酸序列上不同于天然抗体分子。本发明起始多肽可以包含至少一个Fc区或其FcRn结合部分。优选的 本发明起始多肽还包含至少一个结合结构域，例如抗原结合结构域、受体 结合结构域或配体结合结构域。 一个实施方案中，起始多肽包含至少一个
结合结构域和至少一个Fc部分。 一个实施方案中，起始多肽由两个结合结 构域和两个Fc部分组成。一个实施方案中，本发明起始多肽具有至少一个对介导生物学效应的 靶分子(例如，能够结合细胞表面受体的配体或者能够结合配体的细胞表面 受体)具特异性的结合结构域，该结合结构域与至少一个Fc部分一起将阴性或阳性信号传递给细胞。 一个实施方案中，起始多肽具有至少一个对所要 靶向以减少或消除的抗原(例如，细胞表面抗原或可溶性抗原)具特异性的结 合结构域以及至少一个Fc区或其FcRn结合部分。A.抗体一个实施方案中，本发明起始多肽是抗体。使用本领域已知方案，例 如，优选地通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如，纯化的肺瘤相关抗应答。在含有Fc的多肽是抗体的实施方案中，抗体可以是单克隆抗体或多克 隆抗体。制备单克隆抗体的方法已经已知一段时间(见，例如，Kohler和 Milstein， Nature, 256: 495-497， 1975)，同样也已经已知将编码免疫球蛋白的 DNA稳定地引入骨髓瘤细胞中的技术(见，例如Oi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6351-6355, 1983)。这些技术，包括体外诱变和DNA转染，使得可 以构建重组免疫球蛋白并可以用于制备用于本发明方法中的多肽或由此多 肽产生的多肽(例如，治疗性和诊断性抗体)。以下进一步描述制备方法、载 体和宿主。本发明中所用的起始多肽可以在非人哺乳动物，例如小鼠、豚鼠、灵 长类动物、兔或大鼠中通过用抗原或其片段免疫此动物而产生。见Harlow & Lane,同上引文，为了所有目的并入作为参考。尽管所得抗体可以从动物血 清中收获以提供多克隆抗体制品，但常常期望从脾、淋巴结或外周血中分 离单个淋巴细胞以提供同质的单克隆抗体(MAb)制品。典型地使用兔或豚鼠 制备多克隆抗体。小鼠典型地用于制备单克隆抗体。单克隆抗体可以针对 片段、通过将抗原片段注射入小鼠中、制备"杂交瘤"和筛选杂交瘤获得特异 地结合抗原的抗体以制备。在此熟知的方法(Kohler等(1975), Nature, 256:495)中，将来自注射了抗原的小鼠的相对短寿命的或必死的淋巴细胞与永生 的肺瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此产生永生的且能够产生遗传 编码的B细胞抗体的杂合细胞或"杂交瘤"。通过选择、稀释、和重新培养 含有形成单一抗体的特异基因的各单个细胞抹，将所得杂种分离成各单个 遗传抹。这些遗传林产生针对期望抗原的同质抗体，该抗体由于其纯遗传 血统被称作"单克隆的"。在适宜培养基中接种并培养由此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选 含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域 技术人员明了，可以通过商业途径从多种渠道获得用于形成、选择和培养 杂交瘤的试剂、细胞系和培养基，而且标准化方案已经成熟建立。 一般地， 分析培养杂交瘤细胞的培养基，以检查抗期望抗原的单克隆抗体的产生。 优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外 试验，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。鉴定到 产生具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过 有限稀释方法对这些克隆进行亚克隆并通过标准方法(Goding， Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp59- 103 (Academic Press, 1986))培养。还 可以理解，可以从培养基、腹水或血清中，通过常规纯化方法，例如，蛋 白质A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，分离这些亚克隆 分泌的单克隆抗体。任选地，可以选择与抗原的特定区域或期望片段结合但不与抗原的其 它不相重叠片段结合的抗体。这后一选择可以通过测量抗体与抗原的一 系 列缺失突变体的结合并确定何种缺失突变体与抗体结合来实现。结合可以 通过例如Western印迹或ELISA评价。显示出与抗体特异结合的最小片段 定义为该抗体的表位。或者，可以利用竟争试验确定表位特异性，在竟争 试验中被测抗体和参照抗体竟争与抗原结合。当被测抗体和参照抗体竟争 时，则它们所结合的表位相同，或者充分接近以致一个抗体的结合干扰另 一抗体的结合。另一实施方案中，编码期望单克隆抗体的DNA可以容易地使用常规方 法(例如，通过使用能够特异地结合编码鼠源抗体的重链和轻链的基因的 寡核苷酸探针)分离和测序。所分离的和亚克隆的杂交瘤细胞是该DNA的 优选来源。 一旦分离后，该DNA可以放入表达载体中，然后用表达载体转 染原核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌(E. coli)细胞、猿COS细胞、中国仓 鼠卵巢(CHO)细胞或在此载体转染前不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。更特 别地，可以使用此分离的DNA(如本文中所述，可以是合成的)克隆恒定区 和可变区序列以便按照Newman等于1995年1月25日提交的美国专利号 5,658,570所述制备抗体，该文献并入此处作为参考。基本上，这需要从选 择的细胞中提取RNA、转化成cDNA、并使用Ig特异性引物扩增。适用于 此目的的引物也描述在美国专利号5,658,570中。正如以下更详细地讨论的， 表达期望抗体的转化细胞可以培养至相对大量，从而提供临床和商业免疫 J求蛋白供应。本领域技术人员也将明了 ，编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点) 的DNA也可以来源于抗体噬菌体文库，例如使用pd噬菌体或Fd噬菌粒技 术。示例性方法见例如EP 368 684 Bl;美国专利5,969,108， Hoogenboom， H.R.和Chames. 2000. Immunol. Today 21:371; Nagy等2002. Nat. Med. 8:801; Huie等2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682; Lui等2002. J. Mol. Biol. 315:1063,所有这些文献均并入此处作为参考。几份出版物(例 如，Marks等，Bio/Technology 10: 779-783 (1992))已经描述了通过链改组、 组合感染和体内重组(构建大噬菌体文库的策略)产生高亲和力人抗体。 另一实施方案中，可以使用核糖体展示代替噬菌体作为展示平台(见，例如， Hanes等2000. Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson等2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750;或Irving等2001 J. Immunol. Methods 248:31)。 在再一实施方案中，可以筛选细胞表面文库以获得抗体(Boder等，2000， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 10701; Daugherty等，2000 J. Immunol. Methods 243: 211)。这些方法提供可以代替传统杂交瘤技术用于分离和随后克隆单克隆抗 体的备选技术。本发明其它实施方案包括在不能产生内源性免疫球蛋白的转基因动物 (例如小鼠)中产生人抗体或基本上人抗体(见例如美国专利号6,075,181、 5,939,598、 5,591,669和5,589,369,所有均并入此处作为参考)。例如，已经 描述过，在嵌合的种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区将导致完全抑 制内源性抗体的产生。将人免疫球蛋白基因系列转移至该种系突变小鼠中 将导致在抗原攻击后产生人抗体。使用SCID小鼠产生人抗体的另一优选方 法公开在美国专利5,811,524中，此文献并入此处作为参考。明显地，与这
些人抗体相关的遗传物质也可以按本文中所述进行分离和操作。制备重组抗体的另 一高度有效的方法公开在Newman, Biotechnology, 10:1455-1460(1992)。具体地，该4支术导致产生灵长类动物化抗体，该抗体 含有猴可变区和人恒定区。此参考文献完整地并入此处作为参考。此外， 该技术也描述在共同转让的美国专利号5,658,570、 5,693,780和5,756,096 中，所有这些专利并入此处作为参考。另一实施方案中，可以通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。 例如，可以从免疫的哺乳动物中分离外周血单个核细胞，并体外培养大约7 天。可以筛选培养物以检测符合筛选标准的特异IgG。分离来自阳性孔的细 胞。可以利用FACS或通过在补体介导的溶血蚀斑试验中鉴定B细胞，分 离各单个产生Ig的B细胞。可以通过显微操作将产生IgG的B细胞加入试 管中，并可以使用例如RT-PCR扩增Vh和Vl基因。可以将Vh和Vl基因此外，还可以从多种不同来源获得可用于产生本发明多肽的遗传序列。 例如，如以上大量讨论的，可以以公众可获得的保藏物形式获得各种人类 抗体基因。许多抗体序列和抗体编码基因已经公布，并且可以从这些序列 利用本领域已知的技术化学合成适宜的抗体基因。与本发明此方面相适合 的寡核苷酸合成技术是本领域技术人员熟知的，并且可以使用几种商业自 动合成仪实施。此外，可以通过商业DNA合成商的服务，获得编码本文中 所述的几类重链和轻链的DNA序列。使用前述任何方法获得的遗传物质然 后可以加以改变或合成以提供或获得本发明多肽。可变结构域和恒定结构域可以分开克隆，例如使用聚合酶链式反应和 选择用于扩增目的结构域的引物进行克隆。此外，许多抗体可变结构域和 恒定结构域的序列是已知的，这些结构域可以使用本领域熟知的方法合成。 例如，可以选择具有特定效应子功能(或缺乏特定效应子功能)或具有特定修 饰以降低免疫原性的恒定区结构域。或者，可以从来自所选动物的可变基 因序列文库，获得可变结构域。可以用期望抗原筛选表达随机组合的结构 域(例如，Vh和Vt结构域)的文库，以鉴定具有期望的结合特征的元件。 此类筛选方法是本领域熟知的。例如，可以将所有抗体基因组成成分克隆 至X噬菌体表达栽体(Huse， WD等(1989), Science, 2476:1275)。此外，可以 筛选在表面上表达抗体的细胞(Francisco等(1994), PNAS， 90:10444;
Georgiou等(1997)， Nat. Biotech,, 15:29; Boder和Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553; Boder等(2000)， PNAS， 97:10701; Daugtherty， P.等(2000) J. Immunol. Methods. 243:211)或病毒(例如，Hoogenboom, HR. (1998)， Immunotechnology 4:1; Winter等 (1994). Annu. Rev. Immunol. 12:433; Griffiths, AD. (1998). Curr. Opin. Biotechnol. 9:102)。本领域技术人员也明了 ， 编码抗体结构域的DNA也可以来源于抗体噬菌体文库，例如使用pd噬菌 体或Fd噬菌粒:技术。示例性方法参见例如，EP 368 684 Bl; U.S. Pat. No. 5,969,108; Hoogenboom等(2000) Immunol. Today 21:371; Nagy等(2002) Nat. Med. 8:801; Huie等(2001), PNAS， 98:2682; Lui等(2002)， J. Mol. Biol. 315:1063,所有这些文献均并入此处作为参考。几份出版物(例如，Marks 等，Bio/Technology 10: 779-783 (1992))已经描述了通过链改组、组合感染和 体内重组作为构建大噬菌体文库的一种策略以产生高亲和力人抗体。另一 实施方案中，可以使用核糖体展示代替噬菌体作为展示平台(见，例如，Hanes， 等(1998)， PNAS 95:14130; Hanes和Pluckthun. (1999)， Curr. Top. Microbiol. Immunol. 243:107; He和Taussig. (1997)， Nuc. Acids Res., 25:5132; Hanes等 (2000)， Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson等(2001)， PNAS， 98:3750;或 Irving等(2001) J. Immunol. Methods 248:31)。用于筛选的优选文库是人可变基因文库。也可以使用来自非人来源的 Vt和VH结构域。文库可以是幼稚的、来自于已免疫的受试者的、或半合成 的(Hoogenboom和Winter. (1992). J. Mol, Biol. 227:381; Griffiths等(1995) EMBO J. 13:3245; de Kruif等(1995). J. Mol. Biol. 248:97; Barbas等(1992)， PNAS, 89:4457)。在一个实施方案中，可以突变免疫球蛋白结构域以产生 具有更大异质性的核酸分子文库(Thompson等(1996)， J. Mol. Biol. 256:77; Lammi匪ki等(1999), J. Mol. Biol. 291:589; Caldwell和Joyce. (1992)， PCR Methods Appl. 2:28; Caldwell和Joyce. (1994)， PCR Methods Appl. 3:S136)。 可以使用标准筛选方法选择高亲和力变体。另一实施方案中，可以，例如使用来自晶体结构的信息，利用本领域已知^t支术，改变VH和Vi序列以增加抗体亲合力。或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术，选择和培养产生抗体的 细胞系。这些技术描述在各种实验室手册和主要出版物中。在此方面，如 下述适用于本发明的才支术4^述在Current Protocols in Immunology, Coligan等，Eds.， Green Publishing Associates and Wiley-Interscience， John Wiley and Sons, New York (1991)，此文献完整地(包括附录)并入此处作为参考。此外，明显地，本发明范围还包括抗原结合DNA序列的所有等位基因 变体、变体和突变体。
如熟知的，可以从最初的杂交瘤细胞或从其它转化的细胞中，通过标 准技术，例如异硫氰酸胍提取和沉淀及随后离心或层析，分离RNA。当期 望时，可以从总RNA中通过标准4支术例如在oligo dT纤维素上层析，分离 mRNA。适宜的技术是本领域熟知的。一个实施方案中，可以使用逆转录酶和DNA聚合酶，根据熟知方法， 同时或分开地制备编码抗体轻链和重链的cDNA。可以利用共有恒定区引物 或者利用基于出版的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异引物，启动 PCR。如上讨论的，还可以使用PCR分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。 在此情况下，可以利用共有引物或者更大的同源探针，例如小鼠恒定区探 针，筛选文库。可以使用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，典型地质粒DNA,并 根据标准的熟知技术(详细阐述在例如与重组DNA技术相关的前述参考文 献中)进行限制性作图和测序。当然，可以根据本发明在分离方法或随后 分析的过程中于任何点上合成DNA。许多情况下，文献中已经报道了针对 这些抗原之每一个的免疫反应性抗体。
另一实施方案中，起始多肽与抗体的结合导致抗原自例如组织或自循 环中减少或消除。另一实施方案中，起始多肽具有至少一个对抗原特异的 结合结构域，其可以用于检测靶分子的存在(例如，检测污染物或者诊断疾 病或病症)。在再一实施方案中，本发明起始多肽包含至少一个结合位点， 该结合位点使该分子靶向受试者中的特定位点(例如靶向肿瘤细胞或血凝 块)。一个实施方案中，本发明起始多肽可以与一种或多种抗原相关抗原免 疫反应。例如，为了治疗癌症或瘤形成，多肽的抗原结合结构域优选与选 定的肿瘤相关抗原结合。考虑到与瘤形成有关的已报道的抗原的数目和相 关抗体的数目，本领域技术人员将明了本发明多肽可以来源于多种完整抗 体中的任何一种。更一般地，在本发明中有用的起始抗体可以获自或者来 已报道的那些抗体)。此外，用于产生本发明所公开的多肽的起始抗体或其 片段可以是鼠的、人的、嵌合的、人源化的、非人灵长类动物的或灵长类 动物化的。本发明中所用起始抗体结合的示例性肿瘤相关抗原包括例如，pan B抗原(例如，在恶性和非恶性B细胞(例如非何杰金淋巴瘤中的B细胞) 表面上发现的CD20)和pan T细胞抗原(例如，CD2, CD3， CD5， CD6, CD7)。 其它示例性肿瘤相关抗原包括但不限于MAGE-1， MAGE-3， MUC-1， HPV 16， HPV E6 &E7， TAG-72， CEA， a-Lewisy， L6-抗原，CD19， CD22, CD25， CD30， CD33, CD37， CD44, CD52， CD56, mesothelin， PSMA， HLA-DR， EGF受体， VEGF受体，和HER2受体。以前报道的与肺瘤相关抗原反应的抗体可以按本文中所述改变以提供 本发明的改变的多肽。能够与肺瘤相关抗原反应的示例性靶抗体包括2B8, Lym 1， Lym 2， LL2, Her2， Bl, BR96， MB1， BH3， B4, B72.3， 5E8， B3F6, 5E10， a-CD33, a-CanAg， a-CD56, a-CD44v6， a-Lewis，和a-CD30。更特别地，示例性靶抗体包括但不限于2B8和C2B8 (Zevalir^和恥 一Rituxan ， IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego), Lym 1 和 Lym 2 (Techniclone)， LL2 (Immunomedics Corp., New Jersey), Trastuzumab (Herceptin , Genentech Inc., South San Francisco), Tositumomab (Bexxar , Coulter Pharm.， San Francisco), Alemtzumab (Campath , Millennium Pharmaceuticals, Cambridge), Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg , Wyeth-Ayerst, Philadelphia), Cetuximab (Erbitux ， Imclone Systems, New York): Bevacizumab (Avastin , Genentech Inc., South San Francisco), BR96, BL22, LMB9, LMB2, MBl， BH3， B4， B72.3 (Cytogen Corp,), SSI (NeoPharm)， CC49 (National Cancer Institute), Cantuzumab mertansine (ImmunoGen， Cambridge), MNL 2704 (Milleneum Pharmaceuticals, Cambridge), Bivatuzumab mertansine (Boehringer Ingelheim， Germany), Trastuzumab隱DMl (Genentech, South San Francisco), My9-6-DMl (ImmunoGen, Cabridge), SGN-IO， -15，誦25和-35 (Seattle Genetics, Seattle)和5E10 (University of Iowa)。在优选实施方案中， 本发明起始抗体与紧上面枚举的抗体结合相同的肿瘤相关抗原。在尤其优 选的实施方案中，多肽来源于Y2B8， C2B8， CC49和C5E10或者与Y2B8， C2B8， CC49和C5E10结合相同抗原，甚至更优选地，包含结构域缺失的抗 体(即，ACH2抗体)。
在第 一优选实施方案中，起始抗体与Rituxan⑧结合相同肿瘤相关抗原。 Rituxan (也称作，rituximab， IDEC-C2B8和C2B8)是第一个FDA批准用于治 疗人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(见，美国专利号5,843,439; 5,776,456和 5,736,137，均并入此处作为参考)。Y2B8 (卯Y标记的2B8; Zevalin ; ibritumomab tiuxetan)是C2B8的鼠源起始物。Rituxar^是嵌合的抗CD20单 克隆抗体，其具有生长抑制性并且据报道可以体外敏化某些淋巴瘤细胞系 使其对化疗剂引起的细胞凋亡作用易感。该抗体有效地结合人补体，具有 强的FcR结合，可以通过补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制在体 外有效地杀伤人淋巴细胞(Reff等，Blood 83:435-445 (1994))。本领域技术人 员明了 ，根据本公开合成的C2B8或2B8 二聚体变体(同二聚体或异二聚体) 可以根据本发明方法与效应子部分缀合，以提供在治疗表现CD20 +恶性肿 瘤的患者时具有甚至更大效果的修饰抗体。在本发明其它优选实施方案中，本发明起始多肽来源于CC49或者与 CC49结合相同肿瘤相关抗原。CC49结合人肿瘤相关抗原TAG-72,该抗原 与人类来源的某些肿瘤细胞(尤其是LS174T肿瘤细胞系)表面结合。 LS174T[美国典型培养物保藏中心(本文中ATCC)编号CL188]是 LS180(ATCC No. CL187)结肠腺癌系的变体。此外，还明了，已经开发了许多对TAG-72具有结合特异性的鼠源单克 隆抗体。其中一种单克隆抗体称作B72.3，其是由杂交瘤B72.3 (ATCC No. HB-8108)产生的鼠源IgGl。 B72.3是使用人乳腺癌提取物作为免疫原开发 的第一代单克隆抗体(见Colcher等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)， 78: 3199-3203 (1981);和美国专利号4,522,918和4,612,282,所有文献均并入 此处作为参考)。其它抗TAG-72的单克隆抗体称作"CC，，(针对结肠癌)。如 Schlom等(美国专利号5,512,443，并入此处作为参考)所述，CC单克隆是使 用借助于B72.3纯化的TAG-72制备的第二代鼠源单克隆家族。由于它们对 TAG-72相对良好的结合亲和力，在ATCC保藏了以下CC抗体，这些抗体 可以在要求下有限制地获得CC49 (ATCC No. HB 9459); CC 83 (ATCC No,HB 9453); CC46 (ATCC No. HB 9458); CC92 (ATTCC No. HB 9454); CC30 (ATCC No. HB 9457); CC11 (ATCC No. 9455);和CC15 (ATCC No. HB 9460)。 U.S.P.N. 5,512,443还教导，可以通过本领域已知的重组DNA技术用 例如人恒定区(Fc)结构域替换鼠恒定区，将这些公开的抗体改变成嵌合形
式。除了爿〉开了鼠的和嵌合的抗TAG-72抗体外，Schlom等还制备了人源 化CC49抗体变体(公开在PCT/US00/25552中)和单链构建体(公开在美国专 利号5， 892,019中)，所有这些文献也并入此处作为参考。本领域技术人员 将明了，所有前述抗体、构建体或重组体及其变体均可以是合成的并用于 提供根据本发明的多肽。除了以上讨论的抗TAG-72抗体，不同团体还报道了对缺失结构域的 CC49和B72.3抗体的构建和部分表征(例如，Calvo等Cancer Biotherapy, 8(1 ):95-109 (1993)， Slavin画Chiorini等Int. J, Cancer 53:97-103 (1993)和 Slavin-Chiorini等Cancer. Res. 55:5957-5967 (1995)。一个实施方案中，本发明起始多肽与CD23(美国专利6,011，138)结合。 在一个优选实施方案中，本发明起始多肽与5E8抗体结合相同表位。另一 实施方案中，本发明起始多肽包含至少一个来自抗CD23抗体(例如5E8抗 体)的CDR。在一个优选实施方案中，本发明起始抗体与CRIPTO-I抗原(WO 02/088170A2或WO03/083041A2)结合。在一个更优选的实施方案中，本发 明多肽与B3F6抗体结合相同表位。在再一实施方案中，本发明多肽包含至 少一个来自抗CRIPTO-I抗体，例如B3F6抗体的CDR。本发明的其它实施方案包括来源于C5E10或与C5E10结合相同肿瘤相 关抗原的修饰抗体。如在共同待决申请09/104，717中亂iiii^C5E 10是识 别大约115 kDa糖蛋白决定簇的抗体，该糖蛋白决定簇似乎是前列腺肿瘤细 胞系(例如，DU145, PC3或ND1)所特异的。因此，与本发明联合，特异地 与C5E10抗体结合相同肿瘤相关抗原的多肽可以单独地使用或者通过本发 明方法与效应子部分缀合，由此提供可用于改善瘤形成性疾病的治疗的修 饰多肽。在尤其优选的实施方案中，起始多肽来源于具有ATCC保藏号 PTA-865的杂交瘤细胞系所分泌的C5E10抗体或者包含该C5E10抗体的所 有或部分抗原结合区。所得多肽然后可以根据本文中的方法与治疗性效应 子部分(见下述)缀合并施用给患有前列腺癌的患者。B.抗体变体除了天然抗体外，本发明起始抗体还可以包括非天然的免疫反应性片 段或部分。另一实施方案中，本发明靶抗体的抗原结合结构域的重链可变部分和
轻链可变部分存在于同一多肽中，例如存在于单链抗体(ScFv)或孩i型抗体 (minibody)(见例如US专利号5,837,821或WO 94/09817Al)中。微型抗体是 由两条多肽链组成的二聚体分子，每条多肽链各含有一个ScFv分子(包含一 个或多个抗原结合位点的单一多肽，例如，通过柔性接头与利用连接肽和 CH3结构域融合的VH结构域连接的Vt结构域)。ScFv分子可以以Vfr接头 -Vl方向或Vr接头-VH方向构建。连接构成抗原结合位点的Vl和Vh結枸 域的柔性铰链优选包含大约10至大约50个氨基酸残基。用于此目的的示 例性连接肽是(Gly4Ser)3 (Huston等(1988)， PNAS, 85:5879)。其它连接肽是 本领域熟知的。制备单链抗体的方法是本领域熟知的，例如Ho等(1989)， Gene， 77: 51; Bird等(1988), Science 242: 423; Pantoliano等(1991)' Biochemistry 30: 10117; Milenic等(1991), Cancer Research, 51: 6363; Takkinen等(1991), Protein Engineering 4: 837。微型抗体可以通过使用本领域描述的方法(见，例如美 国专利5,837,821或WO94/09817Al)构建ScFv成分并连接肽-013成分而制 备。这些成分可以以限制性片段的形式分离自不同质粒，然后连接并重新 克隆至适宜载体中。可以利用限制性消化和DNA序列分析验证正确的装配。 一个实施方案中，本发明的微型抗体包含连接肽。 一个实施方案中，该连 接肽包含Gly/Ser接头，例如，GGGSSGGGSGG。另一实施方案中，可以构建四价微型抗体。除了使用柔性接头(例如， 具有氨基酸序列(G4S)4G3AS)连接两个ScFv分子外，四价微型抗体可以按 与微型抗体相同的方式构建。另一实施方案中，本发明起始抗体包含双链抗体(diabody)。双链抗体与 scFv分子相似，但通常具有短的(少于10个，优选地1-5个)氨基酸残基接 头连接两个可变结构域，以便在同一多肽链上的Vl和VH结构域不能发生 相互作用。相反地， 一条多肽链的Vl和VH结构域与第二多肽链上的Vh和 VL结构域(分别地)相互作用(WO 02/02781)。另一实施方案中，本发明起始抗体包含可操作地与FcR结合部分连接 的免疫反应性片段或其部分(例如，scFv分子、微型抗体、四价微型抗体或 双链抗体)。在一个示例性实施方案中，FcR结合部分是整个Fc区。另一实施方案中，起始抗体的至少一个抗原结合结构域具催化性 (Shokat和Schultz. (1990). Annu. Rev. Immunol. 8: 335)。具有催化性结合特异
性的抗原结合结构域可以使用本领域已知技术制备(见例如，美国专利号6，590，080,美国专利号5,658,753)。催化性结合特异性可以通过许多与针对 酶而鉴定的用于稳定过渡态由此降低活化自由能的那些机制相似的基本机 制起作用。例如，可以最佳地放置一般的酸性和碱性残基以便参与催化活 性位点中的催化反应；可以形成共价的酶-底物中间体；催化抗体也可以具 有对反应合适的定向并增加反应物有效浓度至少7个数量级(Fersht等 (1968)， J.Am. Chem. Soc. 90:5833)并由此极大地降低化学反应的熵。最后， 催化抗体可以转化底物结合时获得的能量以使反应物向类似于过渡态的结 构扭曲。可以通过使用带互补电荷的分子作为免疫原，以将酸性或碱性残基引 入抗原结合位点中。该技术已经被证实可以成功地利用含有带正电荷的铵 离子的半抗原引发抗体(Shokat等，(1988)， Chem. Int. Ed. Engl. 27: 269-271)。 在另一方法中，可以引发抗体以稳定类似于期望反应的过渡态的尺寸、形 状和电荷的化合物(即，过渡态类似物)。见美国专利号4,792,446和美国专 利号4,963,355,这两份专利描述了应用过渡态类似物免疫动物和产生催化 抗体。这两份专利特此并入作为参考。这些分子可以作为免疫缀合物的一 部分，例如和免疫原性栽体分子，例如KLH—起，施用。一个实施方案中，本发明起始抗体是双特异的。双特异分子可以与两 个不同耙位点，例如相同靶分子上的或不同把分子上的靶位点结合。例如， 在抗体的情况下，双特异分子可以与例如相同抗原或两个不同抗原上的两 个不同表位结合。双特异分子可以用于例如诊断和治疗应用。例如，它们可以用固定酶以在免疫测定中使用。它们还可以，例如通过与肿瘤相关分 子和可检测标记(例如紧密地结合放射性核素的螯合剂)结合，用于诊断和治疗癌症。双特异分子还可以，例如通过^f吏细胞毒性指向特异靶标(例如通过 与病原体或肿瘤细胞和细胞毒性触发分子，例如T细胞受体结合)，用于人 类治疗。双特异分子还可以用作例如纤维蛋白溶解剂或疫苗佐剂。双特异结合分子的例子包括具有至少两个针对肿瘤细胞抗原的臂的双 特异结合分子；具有至少一个针对肿瘤细胞抗原的臂和至少一个针对细胞 毒性触发分子的臂的双特异结合分子(例如抗CD3/抗恶性B细胞(IDIO)、抗 CD3/抗pl85.sup.HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗 0VCAR-3、抗CD3/L-D1 (抗结肠癌)、抗CD3/抗促黑激素类似物、抗EGF
受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗 神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛 癌相关抗原(anti-pan carcinoma associated antigen) (AMOC-31)/抗CD3);具有 至少一个特异地与肿瘤抗原结合的臂和至少一个与毒素结合的臂的双特异 结合分子(例如，抗皂草素/抗Id-l，抗CD22/抗急草素，抗CD7/抗急草素，抗 CD38/抗皂草素，抗CEA/抗篦麻毒素A链，抗干扰素a(IFN-a)/抗杂交瘤独 特型，抗CEA/抗长春花生物碱)；用于转化酶激活的前药的双特异结合分子 (例如，抗CD30/抗碱性磷酸酶(该酶催化丝裂霉素磷酸酯前药转化成丝裂霉 素醇))；可以用作纤维蛋白溶解剂的双特异结合分子(例如，抗纤维蛋白/抗 组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)); 使免疫复合物定向于细胞表面受体的双特异结合分子(例如抗低密度脂蛋白 (LDL));用于治疗感染性疾病的双特异结合分子(例如，抗CD3/抗单纯疱渗 病毒(HSV)、抗T细胞受体:CD3复合物/抗流感病毒、抗FcyR/抗HIV);用 于体外或体内检测肿瘤的双特异结合分子(例如抗CEA/抗EOTUBE、抗 CEA/抗DPTA、抗pl85HER2/抗半抗原)；作为疫苗佐剂的双特异结合分子(见 Fanger等，同上引文)；和作为诊断工具的双特异结合分子(例如抗兔IgG/抗 铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗P物质、 抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗p半乳糖香酶(见Nolan等，同上引文))。三特 异抗体的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37,抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗 CD3/抗CD8/抗CD37。一个优选实施方案中，本发明双特异分子与CRIPTO-l结合。 双特异分子可以对每种特异性而言是单价的，或者可以对每种特异性 而言是多价的。例如，抗体分子或融合蛋白可以包含一个与第一靶分子反 应的结合位点和一个与第二靶分子反应的结合位点，或者其可以包含两个 与第 一靶分子反应的结合位点和二个与第二靶分子反应的结合位点。制备 双特异分子的方法是本领域熟知的。例如，可以使用重组技术产生双特异 分子。用于产生双特异分子的示例性技术是本领域已知的(例如，Kontermann 等，Methods in Molecular Biology Vol. 248:抗体工程:方法和方案(Antibody Engineering: Methods and Protocols). Pp 227-242 US 2003/0207346 Al以及其中引用的参考文献)。 一个实施方案中，使用诸如在US 2003/0207346A1 和US专利5,821,333和US2004/0058400中描述的方法，制备多聚体双特异分子。本文中短语"多特异融合蛋白"指具有至少两个结合特异性(即，组合了 两个或两个以上的配体或受体的结合结构域)的融合蛋白(见以上定义)。多 特异融合蛋白可以组装成异二聚体、异三聚体或异四聚体，基本上可以参见WO89/02922(1989年4月6日公开)、EP 314,317 (1989年5月3日公布)、 美国专利号5,116,964 (1992年5月2日授予)中的公开。优选多特异融合蛋 白是双特异的。双特异融合蛋白的例子包括CD4-IgG/TNF受体-IgG和 CD4-IgG/L-选择蛋白-IgG。最后提及的分子联合了淋巴细胞归巢受体(LHR， L-选择蛋白)的淋巴结结合功能和CD4的HIV结合功能，可以潜在地用于预 防或治疗HIV感染、相关病症或用作诊断剂。本发明多特异结合分子的靶结合位点可以容易地由本领域普通技术人 员选择。不以任何方式进行限制，示例性结合位点包括肿瘤抗原的一种或 多种表位。其它示例性靶分子包括例如疏酸肝素、生长因子或其受体(例如 表皮生长因子受体、胰岛素样生长因子受体、肝细胞生长因子(HGF/SF)受 体)的一种或多种表位(见，例如，Cao等Proc. Natl. Acad. Sci 2001. 98:7443; Lu等2004. J. Biol. Chem. 279:2856)。另一实施方案中，起始抗体的抗原结合结构域由无Vt链存在下稳定的 VH结构域，例如来源于camelids的VH结构域组成(Hamers-Casterman等 (1993). Nature, 363:446; Desmyter等(1996). Nat. Struct. Biol. 3: 803; Decanniere等(1999). Structure, 7:361; Davies等(1996), Protein Eng., 9:531; Kortt等(1995). J. Protein Chem.， 14:167)。可以使用本领域已知的技术，改变非人起始抗体或其片段或结构域， 以降低其免疫原性。人源化的起始多肽是来源于非人蛋白质的起始多肽， 该多肽保留了或基本上保留了起始抗体的性质，但是在人体中具有较低的 免疫原性。对于人源化起始抗体，可以通过各种方法实现，包括(a)将完整 非人可变结构域嫁接在人恒定区上以产生嵌合靶抗体；(b)将一个或多个非 人互补决定区(CDR)的至少一部分嫁接在人构架区和恒定区上并保留和不 保留关键的框架残基；(c)移植完整的非人可变结构域，但是通过置换表面 残基用人样部分对其进行"掩饰"。这些方法公开在Morrison等(1984)， PNAS. 81: 6851-5; Morrison等，(1988)， Adv. Immunol. 44: 65-92; Verhoeyen等 (1988)， Science 239: 1534-1536; Padlan， (1991)， Molec. Immun. 28: 489-498;Padlan， (1994)， Molec. Immun. 31: 169-217;和U.S. Pat. Nos. 5,585,089、 5,693,761和5,693,762，所有这些文献均特此完整地并入作为参考。
也可以使用去免疫化来减少起始抗体的免疫原性。本文中，术语"去免 疫化，，包括改变抗体以修饰T细胞表位(见，例如W09852976A1， WO0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的Vh和Vl序列，从每个V区"作 图，，人T细胞表位，从而显示表位在该序列中相对于互补决定区(CDR)及其 它关键残基的位置。分析T细胞表位图中的各单个T细胞表位以鉴定最低 风险导致抗体活性改变的可选氨基酸替代。设计一系列可选的Vh和Vl序 列以包含氨基酸替代组合，随后将这些序列掺入一系列本发明多肽中，以 进行功能检查。通常，制备和检测12-24个变体抗体。之后，将包含修饰 的V和人C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体中，将所得质粒引入 细胞系以产生完整抗体。然后在适当的生物化学和生物学试验中比较这些 抗体，鉴定最佳的变体。
一个实施方案中，起始多肽包含嵌合抗体。在本申请上下文中，术语"嵌 合抗体，，指免疫反应性区域或位点获自或来自第 一物种而恒定区(可以是完 整的、部分的或根据本发明修饰的)获自第二物种的任何抗体。在优选实施 方案中，靶结合区域或位点来自非人来源(例如小鼠)，恒定区是人的。优选 地，通过至少部分地置换一个或多个CDR并在必要时通过部分地置换框架 区和改变序列，改变靶抗体的重链和轻链中的可变结构域。尽管CDR所来 源的抗体可以和构架区所来源的靶抗体是相同类型或甚至是相同亚类，但 可以想到CDR来自不同类型的抗体，并优选地来自不同物种的抗体。为了 将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一可变结构域，将所有的CDR 置换成来自供体可变区的全部CDR可能是不必的。相反地，可能仅需要转移对于维持结合结构域的活性所必需的那些残基。考虑到美国专利号 5,585,089、 5,693,761和5,693,762中阐述的解释，通过实施常规试验或通过尝试试验获得具有降低的免疫原性的功能性抗体，完全在本领域技术人员的能力范围内。
在优选实施方案中，本发明起始多肽在人体中不引起有害免疫应答。 本领域技术人员将明了，也可以制备嵌合起始多肽。在本申请中，术语"嵌 合起始抗体"指免疫反应性区域或位点获自或来自第一物种而恒定区(可以 是完整的、部分的或根据本发明修饰的)获自第二物种的任何起始抗体。在
优选实施方案中，靶结合区域或位点来自非人来源(例如小鼠)，恒定区是人 的。尽管可变区的免疫原特异性通常不受其来源的影响，但人恒定区比来 自非人来源的恒定区具有较小的在人受试者中引起免疫应答的可能性。c.融合蛋白本发明起始多肽也可以是至少包含Fc区的FcRn结合部分的融合蛋白。 优选地，本发明融合蛋白包含结合结构域(包含至少一个结合位点)。本发明 融合蛋白可以是双特异的(具有针对第一靶标的一个结合位点和针对第二靶 标的第二结合位点)，或者可以是多价的(针对同一靶标具有两个结合位点)。文献中报道的融合蛋白的例子包括T细胞受体(Gascoigne等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987》;CD4 (Capon等,Nature 337:525-531 (1989); Traunecker等，Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl等，DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990);和Byrn等，Nature 344:667-670 (1990》;L-选择蛋白 (归巢受体)(Watson等，J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990);和Watson等， Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo等，Cell 61:1303-1313 (1990》； CD28和B7 (Linsley等，J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley等， J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic等,Cell 66:1133-1144 (1991)); TNF受体(Ashkenazi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer等，Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991);和Peppel等，J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991 ));和IgE受体(Ridgway和Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115， Abstract No. 1448 (1991))的融合物。通常，结合结构域的C端与Fc区的N端融合，并替代细胞锚定区。例 如，优选地在融合前失活或缺失与受体结合的配体的任何跨膜区或脂质或 磷脂锚识别序列。编码配体或配体结合部分的DNA利用限制性酶在编码期 望ORF区段的DNA的5，和3'末端或靠近该5，和3，末端的位置切割。所得 DNA片段然后可以容易地插入编码重链恒定区的DNA中。进行融合的精 确位置可以凭经验选择以便优化可溶性融合蛋白质的分泌或结合特征。然 后，将编码融合蛋白的DNA转染至宿主细胞中用于表达。一个实施方案中，融合蛋白包含配体或受体的结合结构域(例如，受体 的胞外域(ECD))和至少一个Fc部分以及任选地合成的连接肽。 一个实施方 案中，在制备本发明融合蛋白质时，将编码配体或受体结合结构域的核酸 以C端和编码Fc区N端的核酸融合。N端融合也是可以的。还可以实施与 恒定区Fc部分的C端的融合或在重链CH1或轻链相应区域的紧靠N端的 融合。一个实施方案中，融合蛋白的Fc区包括基本上完整的抗体Fc区，起 始于化学上定义IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点恰好上游的铰链区(大约216 位EU编号残基，采取重链恒定区的第一个残基为114)并终止于其C端。 进行融合的精确位置不是关键的；具体位点是熟知的，并可以经选择以优 化分子的生物学活性、分泌或结合特征。制备融合蛋白的方法是本领域已 知的。对于双特异融合蛋白，可以将融合蛋白装配成多聚体，尤其是异二聚 体或异四聚体。 一般地，这些组装的免疫球蛋白具有已知的单元结构。基 本的四链结构单元是IgG、 IgD和IgE的存在形式。在更高分子量的免疫球 蛋白中四链单元发生重复；IgM —般地以通过二硫键连接在一起的四个基 本单元的五聚体形式存在。IgA球蛋白以及偶尔地IgG球蛋白也可以在血清 中以多聚体形式存在。对于多聚体的情况，四个单元的每一个均可以是相 同的和不同的。可以包括在本发明融合蛋白中的其它示例性配体和其受体包括下列i) 细胞因子和细胞因子受体细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能活化具有多效性作用。各种 细胞因子或其受体结合部分均可以用于本发明融合蛋白中。示例性细胞因 子包括白介素(例如，IL-l， IL-2， IL-3, IL-4, IL-5， IL-6， IL-7， IL-8， IL-IO， IL-11, IL-12, IL-13,和IL-18),集落刺激因子(CSFs)(例如，粒细胞CSF (G陽CSF)， 粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)，和单核细胞巨噬细胞CSF (M-CSF))，肿 瘤坏死因子(TNF)a和p,及干扰素如干扰素-a, (3，或Y(美国专利号4，925，793 和4,929,554)。细胞因子受体典型地由配体特异的a链和共同的p链组成。细胞因子 受体的例子包括GM-CSF, IL-3 (美国专利号5,639,605)， IL-4 (美国专利号 5,599,905), IL-5(美国专利号5,453,491)， IFNy (EP0240975)的受体，和TNF 受体家族(例如，TNFR-1 (EP417, 563), TNFR-2 (EP 417,014)淋巴毒素卩受 体)。ii) 粘附蛋白 粘附分子是允许细胞彼此相互作用的膜结合蛋白。各种粘附蛋白，包 括白细胞归巢受体和细胞粘附分子，或其受体结合部分，均可以掺入本发 明融合蛋白中。白细胞归巢受体在炎症期间表达在白细胞表面上，包括介导与细胞外基质成分结合的p-l整联蛋白(例如，VLA-1， 2， 3, 4， 5和6)、和 与血管内皮上的细胞粘附分子(CAM)结合的卩2整联蛋白(例如，LFA-1， LPAM-l, CR3和CR4)。 CAM的例子包括ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1和 MAdCAM-l。其它CAM包括选择蛋白家族的那些，包括E-选择蛋白、L-选择蛋白和P-选择蛋白。iii) 趋化因子趋化因子——刺激白细胞向感染位点迁移的趋化蛋白——也可以掺入 本发明融合蛋白中。趋化因子的例子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-l-a和 MIP-1-P)、嗜中性粒细胞趋化因子和RANTES(受活化调节的、正常由T细 胞表达分泌的)。iv) 生长因子和生长因子受体生长因子或其受体(或其受体结合部分或配体结合部分)可以掺入本发 明融合蛋白中。生长因子的例子包括血管内皮生长因子(VEGF)和其同种型 (美国专利号5,194,596);成纤维细胞生长因子(FGF),包括aFGF和bFGF; 心房钠尿肽(ANF);肝生长因子(HGFs;美国专利号5,227,158和6,099,841): 神经营养因子例如骨衍生的神经营养因子(BDNF),神经营养蛋白-3, -4， -5, 或-6 (NT-3， NT-4， NT-5，或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-B，血小板衍生 生长因子(PDGF) (U.S. Pat Nos. 4,889,919, 4,845,075, 5,910,574,和 5,877,016);转化生长因子(TGF)例如TGF-a和TGF-卩(WO 90/14359)，骨 诱导因子包括骨形成蛋白(BMP);胰岛素样生长因子-1和-II (IGF-I和 IGF-II;美国专利号6,403,764和6,506,874);促红细胞生成素(EPO);干细 胞因子(SCF)，血小板生成素(c-Mpl配体)，和Wnt多肽(美国专利号 6,159,462)。可以用作本发明靶向受体结构域的生长因子受体的例子包括EGF受 体；VEGF受体(例如，Fltl或Flkl/KDR), PDGF受体(WO 90/14425); HGF 受体(美国专利号5,648,273和5,686,292),和神经营养受体包括结合NGF、 BNDF和NT-3的低亲和受体(LNGFR),也称作p75^R或p75,以及作为受体 酪氨酸激酶trk家族成员的高亲和受体(e.g. trkA， trkB (EP 455,460)， trkC (EP 522,530》。v) 激素用作本发明融合蛋白中靶向剂的生长激素的例子包括肾素、人生长激 素(HGH;美国专利号5,834,598)、 N-甲硫氨酰基人生长激素；牛生长激素； 生长激素释放因子；曱状旁腺激素(PTH);曱状腺刺激激素(TSH);甲状腺 素；胰岛素原和胰岛素(美国专利号5,157,021和6,576,608);滤泡刺激激素 (FSH)、降钙素、黄体生成素(LH)、 leptin、胰高血糖素；铃蟾肽(bombesin); 促生长素；Mullerian抑制物；松弛素和松弛素原；促性腺激素相关肽；催 乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白；和mullerian抑制物。vi) 凝血因子在本发明融合蛋白中用作靶向剂的示例性血液凝结因子包括凝血因子 (例如因子V， VII， VIII， X， IX， XI， XII和XIII， von Wilebrand因子)；组织因子 (美国专利号5,346,991、 5,349,991、 5,726,147);凝血酶和凝血酶原；纤维蛋 白和纤维蛋白原；纤溶酶和纤溶酶原；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿 或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。其它示例性融合蛋白在例如WO0069913A1和WO0040615A2中教导。 可以包括在本发明融合蛋白中的另 一示例性分子是IGSF9。可以使用本领域 熟知的技术(见例如美国专利号5,116,964和5,225，538)制备融合蛋白。III.鉴定用于修饰的候选氨基酸的方法本发明提供鉴定含有Fc的起始多肽的Fc区(或其FcRn结合部分)中特 定氨基酸残基的方法，其中所述氨基酸残基通过突变(例如氨基酸替代)而改 变后预期将导致对FcRn结合亲和力的调节和对所述多肽在血清中的半衰期 的调节。所述方法包括分子或计算机模建，该模建可以用于预测Fc区中调节(例 如增强或降低)FcRn结合的氨基酸改变。 一般地，这些方法起始于"第一"或 "起始"多肽或含有其的复合物(例如晶体结构或同源模型)，并导致由于FcRn 结合亲和力被调节而与第一多肽不同的"第二"或"改变的"或"修饰的"多肽， 该修饰的多肽在特定治疗或诊断应用中具有更好的性能。所述模建可以在 计算机上进行。这些方法可以包括一个或多个步骤。例如，所述方法可以包括提供乾Fc多肽和FcRn的复合物的结构或相应数据。在另一或随后步骤中，该方法 可以包括在起始多肽的Fc区中鉴定可以被修饰(例如突变)并被预测能影响 多肽对FcRn的结合亲和力的一个确定的残基或一组残基(即，候选氨基酸)。在起始多肽Fc区中引入的优选突变包括改变起始多肽的抗原非依赖性 效应子功能(例如半衰期)的那些突变。 一个实施方案中，突变不损害起始多 肽的任何其它现有效应子功能(例如，抗原、配体、或受体结合或者Fc介导 的效应子功能(非结合FcRn的效应子功能))或在其预期用途中对其造成削 弱。因此，引入的突变优选维持Fc区提供的其它优点中的许多优点。例如， 含有Fc的多肽常常具有ADCC功能。这一重要的细胞杀伤活性在具有截短 的Fc区的抗体构建物中将部分地或完全地丧失。保持Fc依赖性ADCC功 能，可能在某些应用中是重要的，因为其可以引起细胞杀伤效应，从而增 强通过ADCC依赖性耗竭机制起作用的抗癌药或其它药物的效力。在优选实施方案中，本发明的改变的多肽含有不废除或更优选地不调 节起始多肽的其它期望免疫效应子功能或受体结合功能的突变。在尤其优 选的实施方案中，改变的多肽含有不改变该改变的多肽与如下Fc结合蛋白 质的结合的突变，其中所述Fc结合蛋白为能够利于该改变的多肽的纯化的 Fc结合蛋白，尤其是葡萄球菌蛋白质A或G。 Fc上负责与蛋白质A结合的 位点是本领域已知的(Deisenhofer J. 1981， Biochemistry, 4月28日；20(9): 2361-70)。A.基于序列的分析一个实施方案中，基于起始多肽的Fc区与具有不同FcRn结合亲和力 的哺乳动物Fc区的序列比较，预测潜在改变位点。比对Fc区的序列，将 来自具有不同结合性质的序列的一个或多个相应氨基酸替代入起始多肽的 Fc区中。一个实施方案中，当期望较短半衰期时，从无关哺乳动物物种的免疫 球蛋白中选择相应氨基酸，其中所述免疫球蛋白表现出较低的FcRn受体亲 和力。在另一实施方案中，当期望较长半衰期时，从无关哺乳动物物种的 免疫球蛋白中选择同源氨基酸，其中所述免疫球蛋白表现出较高的FcRn受 体亲和力。例如，兔Fc区表现出与人Fc区(尤其是在接触hFcRn的区域中)的 高水平同源性。此外，兔IgG比人IgG更紧地结合hFcRn (Ober等，Int. Immunol. 13: 1551-1559,2001)。因此，在一个示例性实施方案中，潜在的改 变位点被鉴定为在待修饰的多肽Fc区中(例如在人Fc区中)与具有期望生 物学性质的多肽(例如兔Fc区)不同的那些残基，并将人IgGl Fc区中的这些 氨基酸残基中的一个或多个替代为来自兔IgGl Fc区的一个或多个相应氨 基酸残基。例如，嵌合蛋白质将表现出在人Fc中已经被兔Fc氨基酸替代的特定 氨基酸或氨基酸组合。从人Fc和新生儿Fc受体(hFcRn)的接触面(显示在 自ratlgG2a ratFcRn晶体结构开发的同源模型中)，确定这些兔Fc氨基酸。 然后可以将确定为存在于人Fc:人FcRn接触结构域中的特定氨基酸从人序 列改变成兔序列。或者，可以将人Fc的这些残基中的一个和多个替代为来 自豚鼠相同类型的免疫球蛋白的相应氨基酸残基。示例性改变位点包括EU位置280， 281， 282， 283, 284， 285， 288, 289， 290, 305, 307, 308， 309， 315， 340, 344,和378。更特别地，本发明多肽可以含有至少一个选自下组的氨基酸突变根 据EU编号系统，Asp280Asn (其中，D指示在所述EU位置(278)待突变(通 过替代)的氨基酸位置，N指示待替代入该位置以形成改变的多肽的氨基酸), Gly281Glu， Val282Glu, Glu283Gln， His285Arg， Asn286Thr， Lys288Arg, Thr289Pro， Lys290Pro， Val305Thr, Thr307Pro， Val308Ile， Leu309Thr, Asn315Arg， Lys340Arg， Arg344Leu， Ala378Ser， Ser383Lys， Glu386Lys， Pro387Ala，和Asn389Asp。B.构象分析另一实施方案中，鉴定靶氨基酸的方法包括分析(例如，视觉观察或计 算分析)起始多肽(例如，含有Fc的多肽)和/或与Fc受体(例如FcRn)结合的 起始多肽。蛋白质的三维结构影响其生物活性和稳定性，并且该结构可以以多种 方法进行确定或预测。 一般地，经验性方法使用物理生物化学分析。或者， 可以通过一个或多个具有已知三维结构的同源蛋白质(或蛋白质复合物)的 三维结构模型建立，预测三级结构。X射线晶体学可能是人最熟悉的确定 蛋白质结构的方法(因此，术语"晶体结构"可以用于替代术语"结构")(例如， 人IgGl Fc区的晶体结构已经确定(Disenhofer等，Biochemistry (1981)， 20: 2361-70))，但是也可以使用园二色性、光散射，或者通过测量辐射能的吸 收和释放进行估计。其它有用的技术包括中子衍射、核磁共振(NMR)和同源 模建。所有这些方法均是本领域技术人员已知的，它们已经充分地描述在 标准教科书(见，例如Physical Chemistry, 4th Ed" W丄Moore, Prentiss-Hall, N, 丄，1972，或Physical Biochemistry, K.E. Van Holde, Prentiss-Hall, N丄1971))和 许多出版物中。可以使用这些技术中的任一种确定Fc区、含有Fc区(或其 FcRn结合部分)的多肽、或该多肽和FcRn的复合物的结构(然后可以分析 该结构以预测进行替代的氨基酸)和/或可以使用所述技术以提供有关方法 的一个或多个步骤(例如，下文描述的那些)的信息。形成抗体、抗体片段、或scFv-抗原复合物的晶体的方法已有报道，例 如van den Elsen等的报道(Proc. Natl. Acad. Sd. USA 96:13679-13684， 1999， 特此并入此处作为参考)。可以利用这些本领域已知的技术确定含有FcRn 和含Fc多肽的复合物的结构，以^i艮据本发明方法进行分析。或者，可以 容易地从商业或公众数据库，例如蛋白质数据库，获得出版的复合物结构 或相应数据。此外，近来还获得了大鼠FcRn和含有单个FcRn结合位点的 异二聚体大鼠Fc的共晶结构(2.8A)(例如，Martin等，Molecular Cell, (2001)， 7: 867-77)。当复合物的结构(例如X射线结构)或其相应数据未知或无法获 得时，可以利用采用相关复合物(例如来自另 一物种或同源性配体/受体复合 物)的同源模型。例如，可以使用大鼠Fc-FcRn复合物的晶体结构模建人Fc 与FcRn的相互作用。可以评价相应于Fc/FcRn复合物的数据，以确定潜在的改变位点。另一 实施方案中，本发明方法包括分析(例如，结构分析或计算分析)游离的(即， 未结合的)含Fc多肽和与FcRn结合的含Fc多肽之间的构象差异。C.静电优化用于实施本发明方法的基本计算公式提供在例如美国专利号6,230， 102 (其内容特此完整地并入本申请中作为参考)中。 一个实施方案中，根据计算分析多肽和FcRn间的静电力而得到的结果，优选地依据本文中描述的本发 明分立标准(discretecriteria)或规则，改变(或"修饰，，)多肽。该计算分析允 许预测多肽受体复合物中的最佳电荷分布，在计算机系统中表示电荷分布
的一种方式是以一组多极(multipole)来表示。或者，可以通过位于多肽原子 位置的一组点电荷，表示电荷分布。 一旦确定了电荷分布(优选地，最佳电 荷分布)后，可以修饰多肽以匹配，或更好地匹配，该电荷分布。可以通过实施美国专利号6,230,102中所述计算(或如TidorandLee，丄 Chem. Phys. 106:8681， 1997; Kangas和Tidor， J. Chem . Phys. 109:7522， 1998 中所述计算)的计算机执行方法，介导所述计算性分析。可以对此计算机 程序进行适应性修改以考虑多肽-FcRn结合的真实情况(并且与其它方法不 同，本发明方法考虑例如多肽和FcRn在溶剂(例如，水性溶剂如水、磷酸 盐緩冲的盐水(PBS)、血浆或血液)中结合时的溶剂、远程静电作用、和介电 效应)。该计算机执行方法可以用于鉴定对该多肽结构的如下修饰，所述修 饰将在修饰的多肽上导致使静电作用对修饰多肽和FcRn的结合自由能的贡 献最小化(相对于未修饰("起始")多肽而言)的电荷分布。典型地，实施此处 所述操作(更详细地见美国专利号6，230,102)的计算机系统(或装置)将包括 向用户显示信息的输出装置(例如，CRT显示器、LCD、打印机、通讯装置 如调制解调器、音频输出等)。此外，可以将执行本发明方法的指令部分地 或完全地赋予适宜在电子装置中使用的介质，以便执行该指令。因此，本 发明方法可以修改为包含软件(例如，计算机可读指令)和硬件(例如，计算 机、机器人和芯片)的高通量方法。此计算机执行方法不限于特定计算机平 台、特定处理器、或特定高级编程语言。有用的方法见美国专利号6,230,102， 更详细的说明见Lee和Tidor (J. Chem. Phys. 106: 8681-8690， 1997)，所有文 献特此并入此处作为参考。可以按如下应用本发明的规则。为了调节多肽的FcRn结合亲和力，例 如，以降低、改善或重建此结合，首先获取基本序列和/或结构数据。一个实施方案中，候选氨基酸残基可以选自经确定具有次最佳或最佳 的结合亲和力的那些残基。备选地或者另外地，可以自Fc区中邻近具有最 佳或次最佳结合亲和力的残基的那些残基选择靶氨基酸残基。典型地，首 先使用静电荷优化以确定Fc区中对于结合而言次最佳的位置(Lee和Tidor，J. Chem. Phys， 106: 8681-8690， 1997; Kangas和Tidor， J. Chem. Phys. 109: 7522-7545, 1998)。然后，进一步计算性分析一个或多个突变(即，修饰)。基于这些计算， 然后对具有一个或多个根据本发明规则的修饰的修饰多肽子集，确定结合
亲和力。使用连续体静电学才莫型(continuum electrostatics model),可以在多肽Fc 中的氨基酸的每个侧链上实施静电荷优化。电荷优化给予原子中心的电荷， 但并不总是产生实际突变。因此，可以进行一轮电荷优化，其间施加各种 约束条件以代表目的位置的天然侧链特征。例如，可以针对-1、 0和+l的净 侧链电荷，实施优化，其间附加没有原子的电荷超过特定值(例如0.85电子 电荷单位)的约束条件。然后基于优化中观察到的静电结合自由能的潜在增 加，确定候选氨基酸侧链位置以及在这些位置的残基修饰。可以计算从天然残基转向完全不带电荷的侧链电子等排物(即，具有相 同形状但原子上无电荷或具有部分电荷的残基)的结合自由能差(单位 kcal/mo1)。负数指示预测的结合亲和力增加。当结合自由能差是有利的(MK-0.3 kcal/mol)且与自天然残基向完全不 带电荷的侧链电子等排物(即，具有相同形状但原子上无电荷或具有部分电 荷的残基)的转变相关时，从具有非极性側链的氨基酸的集合(例如A，C，I, L，M，F，P，V)中选择修饰。当使用侧链中的最佳电荷分布和-1的净侧链电荷可以获得的结合自由 能差是有利的(AG《0.3 kcal/mol)时，从具有带负电荷的侧链的氨基酸的集合 (例如D,E)中选择f务饰。类似地，当使用侧链中的最佳电荷分布和+1的净侧链电荷可以获得的 结合自由能差是有利的(AG〈-0.3 kcal/mol)时，从具有带正电荷的側链的氨基 酸的集合(例如R,H,K)中选择修饰。最后，当使用侧链中的最佳电荷分布和0的净侧链电荷可以获得的结 合自由能差是有利的(AG〈-0.3 kcal/mol)时，从添加C, Q M和F的具有不带 电荷极性側链的氨基酸的集合(例如N， C， Q， G H， M， F， S， T， W， Y)中选择 修饰。如本文中所述，可以在计算机上建造所设计的修饰多肽，并重新计算 结合能。可以使用60度的二面角增长量，通过在CHARMM中实施旋转异 构体二面角扫描，构建修饰的侧链，以确定每个侧链最希望的位置。然后 针对野生型(起始的)和突变(修饰的)复合物，使用Poisson-Boltzmann静电能 和用于范德瓦尔氏能量和隐蔽表面面积的额外项，计算结合能。然后，对于通过计算这些计算性修饰所得到的结果，可以按需要，例
如在随后重复该方法后，在计算机上重新评价，或者由额外的实验结构/功能数据提供信息。可以划分成以下几类的规则允许进行几项预测1) 在多肽上在结合FcRn时被部分隐蔽的相互作用界面残基处进行修 饰(通过形成iU定改善相互作用)；2) 修饰多肽上的如下极性残基，所述极性残基在结合时被隐蔽并由此 为去溶剂化而付出代价但不与受体形成任何直接静电相互作用(通常通过修 饰成与野生型残基具有相似形状的疏水性残基或者通过添加能够造成有利 的静电相互作用的残基，以获得改善)；和3) 修饰多肽上的如下表面残基，所述表面残基存在于非互补电势 (uncomplementary potential)的区域。这些修饰被认为可以改善多肽和FcRn 间的远程静电相互作用而不扰乱结合界面的堆积相互作用。如此实施，本发明规则允许成功地预测亲和力的改变(例如降低和增 加)、侧链修饰。可以将这些发现分成三大类修饰。第一类修饰涉及位于抗 原上自带电荷基团跨越的能够形成氩键的界面残基；第二类涉及在结合时 支付去溶剂化处罚但不造成反静电相互作用(back elctrostatic interaction)的 隐蔽极性残基；和第三类涉及远程静电相互作用。第一类修饰通过检查基本的物理/化学因素来确定，因为这些残基实质 上与抗原的不饱和氢配偶体形成氢键。与其它方法不同，本发明规则允许 进行不可思议的残基修饰，其中去溶剂化的代价被允许重于有益的相互作 用能量。第二类修饰代表另 一组修饰，因为增加的能量主要由消除不利的去溶 剂化作用并维持非极性相互作用而导致。第三类修饰涉及远距离相互作用，这些相互作用表现出显著增加亲和 力的潜力。这些类型的修饰是尤其有意义的，因为它们不与抗原直接接触 并因此较少地扰乱多肽-FcRn界面的精细相互作用。因此，当根据这些规则针对候选氨基酸位置确定期望的侧链化学后， 可以例如通过替代、插入或缺失(见本文中的进一步描述)，修饰或改变此 (这些)残基位置。除了以上用于多肽修饰的规则外，注意还可以在最佳电荷分布的最初 (及后续)计算中加入某些决定因素，例如溶剂效应。一个实施方案中，基于电荷优化数据，选择改变靶抗体的效应子功能 的优选突变(例如氨基酸替代)，并且可以通过预测Fc区中可以在不同pH 水平——例如，大约7.2-7.4的中性pH;大约3.0-5.0(如4.0)的酸性pH;或 大约8.0-10.9 (例如9.0)的碱性pH——改变(例如增强或降低)与Fc受体的结 合的氨基酸变化(例如替代)来鉴定所述突变。电荷优化在原子中心导致一组最佳电荷，但不产生实际突变提示。一 旦使用以上方法确定电荷优化后，可以基于电荷优化的结果改变(例如突变) 多肽中的一个或多个靶氨基酸残基或任何相邻氨基酸残基(例如位于CH2 结构域或Fc区的FcRn结合环中或周围的残基)。在此过程中，分析最佳电 荷分布，并选择比目前残基更接近于最佳情况的突变。例如，可以选择与 目前残基相比而言匹配、更好地匹配或更接近于最佳情况的氨基酸替代。 可以选择一个或一个以上的突变，以便获得最佳电荷分布。可以通过对数 据进行观察或通过计算分析数据，选出优选的突变。目前，用于检查静电力的软件可以模建最佳电荷分布，之后用户可以 确定何种氨基酸替代或改变将改善此分布。因此，这些步骤(例如，检查模 建的最佳电荷分布和确定用于改善抗原结合的序列修饰)是，或者可以是， 目前所要求保护的方法的一部分。然而，由于在将来可以容易地修饰该软 件使程序包括对氨基酸替代(或改变)的选择，故可能仅需要检查输出结果和 执行所提示的改变(或，如果期望的，它的某种变化)。一个实施方案中，可以通过预测Fc区中能够在不同pH水平(例如，大 约7.2-7.4的中性pH;大约3.0-5.0(如4.0)的酸性pH;或大约8.0-10.9 (例如 9.0)的碱性pH)改变(例如增强或降低)与Fc受体的结合的氨基酸变化(例如， 替代)，鉴定用于替代的氨基酸。一个实施方案中，本发明涉及调节包含Fc区的FcRn结合部分的多肽 在两个不同pH水平与FcRn的结合亲和力的方法，所述方法包括确定多 肽与FcRn在溶剂中于第一 pH水平结合时多肽氨基酸的最佳电荷分布的空 间表现以及相关的结合自由能变化；确定多肽与FcRn在溶剂中于第二 pH 水平结合时多肽氨基酸的最佳电荷分布的空间表现以及相关的结合自由能 变化；基于比较这些电荷分布，鉴定在第一和第二pH水平显示不同电荷分 布的残基、多肽中待修饰以改变多肽结合FcRn时的结合自由能的至少 一 个 候选氨基酸残基位置；和选择选定的氨基酸残基用于在所述氨基酸位置进 行替代，以便替代此当选氨基酸残基后多肽对FcRn的亲和力受到调节。
一个实施方案中，第一pH是大约7.4。 一个实施方案中，第二pH是大 约6.0。一个实施方案中，用带电荷的氨基酸替代起始多肽的不带电荷氨基酸。 另一实施方案中，起始多肽的不带电荷氨基酸用另一不带电荷氨基酸替代。 另一实施方案中，起始多肽的氨基酸(例如不带电荷的或带负电荷的氨基酸) 用带正电荷的氨基酸替代。带正电荷的氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、天冬 酰胺。另一实施方案中，起始多肽的氨基酸(例如不带电荷的或带正电荷的 氨基酸)用带负电荷的氨基酸替代。带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸盐(天冬 氨酸)和谷氨酸盐(谷氨酸)。另一实施方案中，起始多肽的氨基酸(例如，带 负电荷的或带正电荷的氨基酸)用不带电荷的氨基酸替代。另一实施方案中， 起始多肽的氨基酸(例如，不带电荷的氨基酸)用具有不同电荷分布的不带电 荷氨基酸替代。在某些实施方案中，当在改变的多肽中引入氨基酸后，该替代的氨基 酸改变多肽的电荷，以致该改变的多肽具有和起始多肽不同的净电荷。在 其它一些实施方案中，当氨基酸被引入改变的多肽中后，该替代的氨基酸 不改变多肽的电荷，以致该改变的多肽与起始多肽具有相同的净电荷但具 有不同的电荷分布。另一实施方案中，氨基酸分成以下三组(1)具有不带电荷的侧链的非 极性氨基酸(例如，A， L， I， V， G P)。这些氨基酸通常参与疏水性相互作用； (2)具有零净电荷但侧链的不同部分具有非零部分电荷的极性氨基酸(例 如，M， F, W， S， Y， N， Q， C)。这些氨基酸可以参与疏水性相互作用和静电相 互作用。(3)可以在侧链上具有非零净电荷的带电荷氨基酸(例如R， K， H， E， D)。这些氨基酸可以参与疏水性相互作用和静电相互作用。一个实施方案中，改变多肽-Fc相互作用的亲和力的至少一个突变是来 自以下三个类型之一的突变(1)改变相互作用界面或FcRn和远离该界面的多肽之间的非互补静电 势区域中的电荷分布的突变。这些改变可以包括在极性、非极性和带电 荷氨基酸上进行组间替代(这将总是改变部分电荷的位置)；以及在极性氨基 酸组内和带电荷氨基酸组内替代，条件是它们改变电荷分布(例如，C在SG 原子上具有部分负电荷并在HG原子上具有部分正电荷。而N在SG和HD 原子上具有部分正电荷，并在ND和OD原子上具有部分负电荷；则，用C 替代N将改变电荷分布)。例如， 一个实施方案中，用才及性氨基酸(具有零净 电荷但在侧链中的原子上具有部分电荷)替代非极性氨基酸(侧链中所有原 子上具有零电荷)或者反之亦然；(2) 突变抗体上在结合时被隐蔽并由此支付去溶剂化处罚(pay desolvationpenalty)(结合时除去溶剂的能量代价)但不与FcRn形成任何有利 的静电相互作用的极性或带电荷残基。在此情况下，通过突变成不与溶剂 相互作用并由此在结合时不支付去溶剂化处罚的非极性氨基酸，而获得改善。(3) 突变改变分子形状并由此影响位于多肽和FcRn之间的介质的介电 性质的表面残基。由于溶剂比蛋白质具有更高的屏蔽能力(介电常数)，故电 荷通过蛋白质比通过溶剂能产生更强的相互作用。因此，用蛋白质侧链填 充(或清除)位于多肽和FcRn上的电荷之间的空间将调节这些电荷的相互作 用。这些突变包括用具有与原始氨基酸不同形状的側链的替代者进行的氨 基酸替代(除了电子等排物之间的变化外的所有变化V至T、 D至N、 N 至D、 L至D、 L至N、 D至L、 N至L、 Q至E和E至Q)。对于非 极性氨基酸上的该组替代，该现象将是对多肽和FcRn之间静电相互作用的 唯一影响。在一个特定实施方案中，改变的多肽包含在相应于选自下组的EU位置 的氨基酸位置的替代248， 249， 250， 251， 252， 254, 256, 255， 260， 257， 277， 281， 282， 287, 284， 285， 286, 288, 290;304， 305， 306, 307, 309， 310， 312， 313， 315， 343， 374, 426， 428， 430， 431， 432， 434，或438。在一个更特别的实施方案中，改变的多肽可以包括以下突变之任一或 任何组合(以及直到所有)在EU位置248位替代为天冬氨酸;在EU位置249 位替代为精氨酸或赖氨酸;在EU位置250位替代为精氨酸或赖氨酸;在EU 位置251位替代为精氨酸、赖氨酸或天冬酰胺;在EU位置252位替代为丝 氨酸或苏氨酸;在EU位置254位替代为丝氨酸或苏氨酸;在EU位置256位 替代为精氨酸、谷氨酸或赖氨酸;在EU位置255位替代为亮氨酸、天冬氨 酸或曱硫氨酸;在EU位置260位替代为赖氨酸;在EU位置257替代为精氨 酸、天冬氨酸、谷氨酸或赖氨酸;在EU位置277位替代为精氨酸、天冬氨 酸、谷氨酰胺、或赖氨酸;在EU位置279位替代为谷氨酸;在EU位置281 位替代为谷氨酰胺;在EU位置282位替代为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、
或赖氨酸;在EU位置287位替代为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸或 苏氨酸;在EU位置284位替代为天冬氨酸或谷氨酸;在EU位置285位替代 为天冬氨酸，谷氨酸或苯丙氨酸;在EU位置286位替代为天冬氨酸、谷氨酸 或曱硫氨酸;在EU位置288位替代为天冬氨酸或谷氨酸;在EU位置290位 替代为天冬氨酸或谷氨酸;在EU位置304位替代为天冬氨酸或谷氨酸;在EU 位置305位替代为精氨酸;在EU位置306位替代为精氨酸、天冬氨酸、谷 氨酸、或赖氨酸;在EU位置307位替代为精氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸；在 309位替代为精氨酸、天冬氨酸，赖氨酸或谷氨酸;在EU位置310位替代为 精氨酸、亮氨酸、赖氨酸或天冬酰胺;在EU位置312位替代为精氨酸、天 冬酰胺、或赖氨酸;在EU位置313位替代为天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸;在 EU位置315位替代为天冬氨酸或谷氨酸;在EU位置343位替代为谷氨酰胺 或赖氨酸;在EU位置345位替代为精氨酸或谷氨酰胺;在EU位置374位替 代为精氨酸、赖氨酸或亮氨酸;在EU位置376位替代为天冬酰胺;在EU位 置426位替代为精氨酸、天冬氨酸、或谷氨酸;在EU位置428位替代为精 氨酸、谷氨酰胺、或赖氨酸;在EU位置430位替代为赖氨酸;在EU位置431 位替代为脯氨酸;在EU位置432位替代为精氨酸;在EU位置434位替代为 亮氨酸或赖氨酸;或在EU位置438位替代为谷氨酸。在一个更特别的实施方案中，在IgGl的Fc区中引入替代，该替代选 自以下突变之一K248D， D249R, D249K， T250R， T250K， L251R， L251K， L251N， M252S， M252T， M254S, M254T， T256R， T256E, T256K， R255D, R255L， R255M， T260K, T260R， T260K， T260Q， P257R， P257D, P257E， P257K: W277R， W277D, W277Q， W277K， V279E， G281Q, V282R， V282D， V282E， V282K, V282E， H287D， A287E, A287K， A287P, A287T， V284D， V284E, A287E， H287D， H285E， H285F， N286D，腦6E， N286M， K288D， K288E, K290D， K290E, S304D, S304E， V305R， V306E， L306R, L306D, L306E， L306K: V307E， T307R， T307D， L309R， L309D， L309E， L309K， H310R， H310N, H310L， H310K， L312K， D312R， D312N， D312K， N313R， W313D, N313K， W313K， N315D， N315E， P343Q, P343K， E345R， P374R， P374L， P374K， D376N， S426R， S426D， S426E, E430K， A431P， L432R, N434K， N434L,或 Q438E。D. 侧链重堆积在另一实施方案中，选择优选的氨基酸替代的方法包括在含有FcRn和 含Fc多肽的复合物的结构(例如，晶体结构或模型)上应用侧链重堆积技术 (sidechainrepacking)。在侧链重堆积计算中，可以在计算上修饰靶残基，并 计算评价所得Fc多肽突变体在与FcRn结合的构象中的稳定性。侧链重堆 积计算产生按等级排列的一列具有改变的稳定性(即，改变的分子内能量) 的变体。另 一 实施方案中，选择优选氨基酸替代的方法包括在含有两个多肽(例 如，含Fc的多肽和FcRn)的复合物的结构(例如，晶体结构或模型)上应用侧 链重堆积技术。然后，可以选择导致期望的受体结合亲和力改变(例如，增 加或降低)的突变用于实验表达。计算评价的蛋白质突变体的数量可以十分巨大，因为每一个可变氨基 酸位置可以突变成所有20种标准氨基酸。用于对计算分析结果进行分级的 示例性计算算法包括终端消除(dead-end elimination)和树形检索算法(见例 如，Lasters等(Protein Eng. 8:815-822， 1995)， Looger和Hellinga (J. Mol. Biol. 307:429-445， 2001)，和Dahiyat和Mayo (Protein Sci. 5:895-903, 1996))。E. 3-D显示一个实施方案中，可以目视分析多肽-FcRn复合物的三维结构和/或模 型(例如使用3-D分子显像器)，以预测有利于或不利于特定分子构象的突变。一个实施方案中，突变通过在突变的含Fc多肽和FcRn的氨基酸残基 之间引入额外的接触，导致含有Fc的多肽与Fc受体的亲和力增加。这可 以通过例如将含有Fc的多肽的较小氨基酸侧链(例如，丙氨酸、甘氨酸、丝 氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、半胱氨酸)替代为较大氨基酸侧链(例 如，曱硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、 精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸)来实现。另一实施 方案中，突变通过改变含有Fc的多肽中与FcRn接触的氨基酸，导致含有 Fc的多肽对Fc受体的亲和力降低。这可以例如通过将含有Fc的多肽的较 大氨基酸側链(例如，甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸)
替代为较小氨基酸侧链(例如，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬 酰胺、缬氨酸、半胱氨酸)来获得。一个实施方案中，在FcRn结合环区中进行一个或多个突变。FcRn结 合环包含氨基酸残基280， 281， 282, 283, 284， 285， 286， 287， 288， 289, 290， 291， 292， 293， 294, 295， 296,297,298和2990艮据EU编号)。图l中显示了该 环。 一个实施方案中，在选自下组的氨基酸中实施一个或多个突变280, 281， 282， 283， 284， 285， 286， 287， 288， 289, 291， 292， 293， 294， 295, 296, 297， 298 和299 (根据EU编号)。 一个实施方案中，对FcRn结合环中的一个或多个 氨基酸的突变导致与FcRn的结合亲和力降低。优选地，对FcRn结合环中 的一个或多个氨基酸的突变导致FcRn结合亲和力增加。 一个实施方案中， 本发明涉及增加本发明多肽的半衰期的方法，包括突变FcRn结合环中的至 少一个氨基酸残基。另一实施方案中，本发明涉及用于治疗患者的組合物， 其中所述患者将得益于用本发明的具有增加的半衰期的改变的多肽进行的 治疗。另一实施方案中，在15AFcRn接触区中，例如在以下位置(也列出了用 于这些位置的示例性氨基酸)之一或多个，进行一个或多个突变243 F; 244 P; 245 P; 246 K; 247 P; 248 K; 249 D; 250 T; 251 L; 252 M; 253 I; 254 S; 255 R; 256 T; 257 P; 258 E; 259 V; 260 T; 261 C; 275 F; 276 N; 277 W; 278 Y; 279 V; 280 D; 282 V; 283 E; 284 V; 285 H; 286 N; 287 A; 288 K; 289 T; 290 K; 291 P; 292 R; 293 E; 302 V; 303 V; 304 S; 305 V; 306 L; 307 T; 308 V; 309 L; 310 H; 311 Q; 312 D; 313 W; 314 L; 315 N; 316 G; 317 K; 318 E; 319 Y; 336 I; 337 S; 338 K; 339 A; 340 K; 341 G; 342 Q; 343 P; 344 R; 345 E; 346 P; 347 Q; 348 V; 367 C; 369 V; 372 F; 373 Y; 374 P; 375 S; 376 D; 377 I; 378 A; 379 V; 380 E; 381 W; 382 E; 383 S; 384 N; 385 G; 386 Q; 387 P; 388 E; 389 N; 391 Y; 393 T; 408 S; 424 S; 425 C; 426 S; 427 V; 428 M; 429 H; 430 E; 431 A; 432 L; 433 H; 434 N; 435 H; 436 Y; 437 T; 438 Q; 439 K;和440 S (才艮据EU编号)。F.淘选FcR突变体文库另一实施方案中，可以使用本发明多聚体FcRn受体(即，本文中进一 步详细描述的FcRn-Fc融合蛋白)，分析任何可获得的Fc多肽文库的成员的 效应子功能改变。例如，可以使用本发明多聚体Fc受体筛选或"淘选，，突变
的含有Fc的多肽的噬菌体文库。噬菌体展示文库典型地包含噬菌体颗粒， 该噬菌体颗粒表达该突变的含有Fc的多肽、或Fc区、或它们的含有插在 该噬菌体基因组中的多核苷酸序列的突变的区域或部分。因此，噬菌体文 库可以在其中包括如下噬菌体颗粒，该噬菌体颗粒表达突变的Fc-多肽的所 有组成成分或组合文库的每一成员。在这些方法中使用的噬菌体典型地是 丝状噬菌体，包括fd和M13。突变的Fc部分典型地作为与病毒外壳蛋白(例 如，噬菌体基因III或VIII蛋白质)的融合物表达在噬菌体表面。制备噬菌 体文库的方法是本领域已知的(见，Brinkman等，J. Immunol. Methods, (1995): 182: 41-50; Ames等，J. Immunol. Methods, (1995)， 184: 177-86; Kettleborough 等，(1994), 24: 952-8; Persic等，Gene, (1997)， 187: 9-18; Burton等，Advances in Immunol., (1994)， 57: 191-280。或者，可以筛选已有噬菌体展示文库。可 获得的文库包括WO 02/060919中描述的改变的Fc多肽的文库。可以，例如使用标记的多聚体FcRn(结合于或固定于固相表面例如珠 上)，选择或鉴定表达如下Fc区的噬菌体，所述Fc区与本发明多聚体Fc 受体以高于或低于起始多肽的亲和力发生结合。也可以在FACS分拣中使用 该噬菌体，以选择表达更高亲和形式的Fc区的细胞。使用这些方法，可以检测改变形式的Fc分子在FcRn结合亲和力上的 变化，并选择具有期望的结合亲和力增加或降低的那些分子。G.进一步优化FcRn结合亲和力可以重建本发明方法产生的改变的多肽，并对其作进一步改变以进一 步调节FcR结合(例如，以进一步增加或进一步降低结合)。因此，可以在上 述步骤之后实施额外的步骤，包括，例如(a)获得相应于改变的或"第二" 多肽和受体的复合物的结构的数据；(b)使用该数据(我们可以将其称作"额 外数据"以使之与在第 一"轮"中获得的和使用的数据区分开来)，确定第二多 肽恒定区的如下额外电荷分布的表现，其中所述额外电荷分布使得静电作 用在第二多肽和受体的结合自由能中贡献最小；和(c)表达与受体结合的第 三多肽，该第三多肽具有在至少一个氨基酸残基上不同于第二多肽的序列。 此外，可以使用经验性的结合数据为进一步优化提供信息。可以再进行额 外的多轮优化。
IV. 文变多肽的方法获得起始多肽中待进行的期望突变后，可以使用多种可用方法中的任 一种产生包含该突变的改变的多肽。例如，可以通过重组方法制备该多核 苷酸。而且，由于遗传密码的简并性，可以使用多种核酸序列编码每一个 期望多肽。对于制备编码起始多肽的氨基酸序列变体的核酸分子，示例性的本领域已知方法包括，但不限于，通过对编码该多肽的较早制备的DNA进行定 点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变、和盒式诱变来制备。定点诱变是制备替代变体的优选方法。该技术是本领域熟知的(见例如， Carter等Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985)和Kunkel等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1987))。简言之，对DNA实施定点诱变时，通过如 下方式改变亲本DNA:首先使编码期望突变的寡核苷酸与亲本DNA的一 条单链杂交。杂交后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用亲本DNA的 该条单链作为模板，利用DNA聚合酶合成完整的第二链。这样，编码期望 突变的寡核苦酸被并入所得的双链DNA中。PCR诱变也适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。见，Higuchi,《PCR Protocols》，pp.177-183 (Academic Press, 1990);和Vallette等，Nuc. Acids Res. 17:723-733 (1989)。简言之，当在PCR中使用小量模板DNA作为起始材料 时，可以使用与模板DNA中的相应区域在序列上稍有差异的引物，产生相 对大量的特异DNA片段，该DNA片段将与模板序列仅在引物区别于模板 的位置上存在差异。制备变体的另 一方法，盒式诱变，基于Wells等，Gene 34: 315-323 (1985) 描述的技术。起始材料是包含待突变的起始多核苷酸DNA的质粒(或其它 载体)。鉴定待突变的亲本DNA中的密码子。在所鉴定的突变位点的每一 側必须存在单一限制性内切酶位点。如果没有此类限制性位点存在，则可 以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法，通过将它们引入起始多肽DNA的适 当位置而产生此位点。在这些位点切割质粒DNA以将之线性化。使用标准 方法，合成编码限制性位点之间的DNA序列但含有期望突变的双链寡核苷 酸，其中使用标准技术分开地合成寡核苷酸的两条链，然后再将它们杂交 在一起。该双链寡核苷酸称作盒子。该盒子设计有与线性化质粒的末端相 容的5，和3，端，这样该盒子可以直接与质粒连接。该质粒由此含有突变的
DNA序列。
备选地，或者另外地，可以确定编码多肽变体的期望氨基酸序列，并 可以通过合成方法制备编码此氨基酸序列变体的核酸序列。本领域普通技术人员明了 ，本发明具有改变的FcRn结合的多肽可以进 一步加以修饰，从而改变它们的氨基酸序列但不改变期望活性。例如，可 以在蛋白质进行其它核苷酸替代，以在"非必需"氨基酸残基位置导致氨基酸 替代。例如，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基可以用来自相同侧链 家族的其它氨基酸残基替代。另一实施方案中，可以将一段氨基酸链用结 构上相似的链(区别在于侧链家族成员的种类和/或组成)置换，即，可以进 行保守替代，其中一个氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换。
具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义，包括碱性側 链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性側链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、 不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨 酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性側链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异 亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、(3分支的侧链(例如，苏 氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 组氨酸)。
除了氨基酸替代外，本发明还考虑对起始Fc区氨基酸序列的其它修饰 以产生具有改变的效应子功能的Fc区变体。例如，可以缺失Fc区的一个 或多个氨基酸残基，以降低或增强与FcR的结合。 一个实施方案中，可以 修饰Fc区的一个或多个残基以产生该Fc区变体。 一般地，根据本发明此 实施方案，缺失不超过1个至大约10个Fc区残基。此处包含一个或多个 氨基酸缺失的Fc区优选保持具有人Fc区天然序列的起始Fc区的至少大约 80%、优选地至少大约90%、最优选地至少大约95%。
也可以制备具有改变的效应子功能的氨基酸插入Fc区变体。例如，可 以将至少一个氨基酸残基(例如， 一个至两个氨基酸残基， 一般地不超过IO 个残基)引入一个或多个本文中鉴定为影响FcR结合的Fc区位置的邻近位 置。"邻近，，指距离本文中鉴定的Fc区残基一个至两个氨基酸残基的范围内。 该Fc区变体可以显示出增强的或减弱的FcRn结合。
该Fc区变体一般地在Fc区中包含至少一个氨基酸修饰。 一个实施方 案中，氨基酸修饰可以组合。例如，变体Fc区可以在其中包括对例如本文 中鉴定的特定Fc区位置的两个、三个、四个、五个等替代。另一实施方案 中，改变的多肽可以具有改变的与FcRn以及与另一 Fc受体的结合。Fc区由两个相同蛋白质链组成。因此， 一个实施方案中，突变发生在 两条蛋白质链上。另一实施方案中，突变仅发生在一条蛋白质链中。V.优选的改变本发明的改变的多肽在其Fc区中含有至少一个突变(例如，氨基酸替 代)。 一个实施方案中，替代的氨基酸位于Fc区的CH2结构域中。另一实 施方案中，替代的氨基酸位于Fc区的CH3结构域中。另一实施方案中，替 代的氨基酸位于Fc区的CH2和CH3两个结构域中。一个实施方案中，本发明的改变的多肽在Fc区中包含至少一个氨基酸 突变，该突变的作用在于增强分子在血液中的半衰期。具有增加的半衰期 的分子具有同时减少药物的周期性给药或可选地降低药物剂量的优点，并 维持相同的药代动力学谱。另一实施方案中，本发明的改变的多肽在Fc区中包含至少一个氨基酸 突变，该突变的作用在于减少该抗体在血液中的半衰期。具有降低的半衰 期的分子具有减少的患者暴露时间和剂量的优点。当改变的抗体缀合毒性 或放射性药物(例如抗癌治疗剂)诊断标记时，由于必须平衡抗体的非特异性 结合和特异性结合，故减少的半衰期是尤其重要的。半衰期或其它抗原非依赖性效应子功能的改变可以从起始抗体和改变 的抗体在FcRn结合亲和力上的差异来进行预测。另一示例性实施方案中，通过调节FcRn结合亲和力，调节多肽的组织 分布或生物利用度。 一个实施方案中，本发明改变的多肽在Fc区中包含至 少一个导致多肽向特定把组织(例如粘膜表面或疾病位点，例如肿瘤或其它 以病理学为特征的特殊疾病)的定位增加的氨基酸突变。另一实施方案中，本发明改变的多肽在Fc区包含至少一个导致所述改 变的多肽在如下组织中的定位减少的氨基酸突变，其中所述组织对未改变 的起始多肽的作用敏感。 一个示例性实施方案中，改变的多肽显示出自母 体循环系统向胎儿的胎盘转移减少。可能得益于减少的(或增加的)定位的其 它敏感组织包括脑、肾、和肝。 一个示例性实施方案中，本发明的改变的 多肽显示出自脉管系统跨肾小球上皮的转运减少。另一实施方案中，本发
明改变的多肽显示出自脑跨血脑屏障(BBB)的转运减少。
另一实施方案中，本发明的改变的多肽在Fc区中包含至少一个氨基酸 突变，该氨基酸突变导致由FcRn所介导的聚积的IgG与肾小球上皮细胞的 结合减少，并导致与缺乏该突变的起始多肽相比较少的膜性肾病。 (Haymann等2004. Nephron Exp. Nephrol. 90:el3-e21)
Fc (或含有Fc的多肽)的组织定位的增加或减少可以分别由该Fc区对 FcRn (新生儿Fc受体)的亲和力的增加或减少来反映。类似地，Fc多肽的 FcRn结合亲和力与Fc多肽的组织分布或生物利用度的相关性也符合FcRn 促进抗体通过胞吞转运作用跨上皮屏障转运的生物学作用。
一些实施方案中，本发明的改变的多肽显示出改变的抗原非依赖性效 应子功能但不改变抗原依赖性效应子功能(例如ADCC或CDC)。其它实施 方案中，本发明的改变的多肽具有改变的抗原非依赖性效应子功能和改变 的抗原依赖性效应子功能。 一个实施方案中，本文所公开的一个或多个突 变可以赋予增加的抗原依赖性效应子功能和降低的半衰期。
另一实施方案中，本文所公开的一个或多个突变可以赋予增加的抗原 依赖性效应子功能和增加的半衰期。另一实施方案中，本文所公开的一个 或多个突变可以赋予降低的抗原依赖性效应子功能和降低的半衰期。另一 实施方案中，本文所公开的一个或多个突变可以赋予降低的抗原依赖性效 应子功能和增加的半衰期。
在特定实施方案中，本发明的改变的多肽包含在相应于选自以下的EU 氨基酸位置的氨基酸位置的替代248， 249， 250， 251， 252， 255, 256， 257, 258, 260, 277,279， 280, 281， 282, 283, 284， 285, 286, 287， 288, 289， 290， 304， 305， 306， 307， 309， 310, 311,312, 313,314, 315， 316,317,340,343， 344，345,374，376，378,383，386，387，389， 426， 428, 430， 431， 432, 434,436，或 438。
在一个示例性实施方案中，所述改变的多肽在15AFcRn接触区或"带" 的氨基酸(例如，从EU位置243至261，从EU位置275至EU位置280，从 EU位置282至EU位置293，从EU位置302至EU位置319,从EU位置 336至EU位置348， EU位置367， EU位置369，从EU位置372至EU位置 389， EU位置391， EU位置393， EU位置408，和从EU位置424至EU位置 440)中包含替代。
另一示例性实施方案中，改变的多肽在包含EU氨基酸位置280， 281， 282， 283， 284， 285， 286， 287， 288, 289， 290,291， 292， 293， 294， 295, 296, 297， 298，和299的FcRn接触环中包含替代。
用于突变的示例性Fc区(或其FcRn结合部分)位点包括EU位置280， 281， 282， 283, 285， 286, 288， 289， 2卯，305, 307， 308, 309， 315， 340， 344,和 378。
另 一实施方案中，改变的多肽可以包括以下突变之任一或任何组合(直 到所有)将EU位置248替代为天冬氨酸；将EU位置249替代为精氨酸或 赖氨酸；将EU位置250替代为精氨酸或赖氨酸；将EU位置251替代为精 氨酸，赖氨酸,或天冬酰胺；将EU位置252替代为谷氨酰胺，天冬酰胺，丝 氨酸或苏氨酸；将EU位置255替代为曱硫氨酸，天冬氨酸，或亮氨酸；将EU 位置256替代为精氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置257替代为精氨酸， 天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置258替代为精氨酸，谷氨酰胺,或赖 氨酸；将EU位置260替代为赖氨酸；将EU位置277替代为精氨酸，天冬氨 酸，谷氨酰胺，或赖氨酸；将EU位置279替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸， 或赖氨酸；将EU位置280替代为天冬酰胺；将EU位置281替代为天冬氨 酸，谷氨酸，或谷氨酰胺；将EU位置282替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨 酸,或赖氨酸；将EU位置283替代为谷氨酰胺；将EU位置284替代为精氨 酸，赖氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置285替代为精氨酸，天冬氨酸， 谷氨酸，赖氨酸，脯氨酸，苏氨酸，或苯丙氨酸；将EU位置286替代为天冬 氨酸，谷氨酸，苏氨酸，或曱硫氨酸；将EU位置287替代为天冬氨酸，谷氨 酸，赖氨酸，脯氨酸，或苏氨酸；将EU位置288替代为曱硫氨酸，精氨酸，天 冬氨酸或谷氨酸；将EU位置289替代为脯氨酸；将EU位置290替代为脯 氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置304替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU 位置305替代为精氨酸或苏氨酸；将EU位置306替代为精氨酸，天冬氨酸， 谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置307替代为精氨酸，脯氨酸，天冬氨酸，或谷氨 酸；将EU位置308替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，或异亮氨酸; 将位置309替代为苏氨酸，精氨酸，天冬氨酸，赖氨酸或谷氨酸；将EU位置 310替代为精氨酸，亮氨S吏，赖氨酸或天冬酰胺；将EU位置311替代为精氨 酸或赖氨酸；将EU位置312替代为精氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，或赖氨酸; 将EU位置313替代为天冬氨酸，精氨酸，或赖氨酸；将EU位置314替代为
精氨酸，赖氨酸,或天冬酰胺；将EU位置315替代为精氨酸，天冬氨酸或谷 氨酸；将EU位置316替代为天冬氨酸或赖氨酸；将EU位置317替代为天 冬氨酸或谷氨酸；将EU位置340替代为精氨酸；将EU位置343替代为谷 氨酰胺或赖氨酸；将EU位置344替代为亮氨酸；将EU位置345替代为精 氨酸，赖氨酸,或谷氨酰胺；将EU位置374替代为精氨酸，赖氨酸,或亮氨酸; 将EU位置376替代为天冬酰胺，精氨酸，亮氨酸，或赖氨酸;将EU位置378 替代为丝氨酸；将EU位置383替代为赖氨酸;在EU位置385将甘氨酸替代 为赖氨酸；在EU位置386将谷氨酰胺替代为丙氨酸或赖氨酸；将EU位置 387替代为丙氨酸；将EU位置389替代为天冬氨酸；将EU位置426替代为 精氨酸，天冬氨酸,或谷氨酸；将EU位置428替代为天冬氨酸，谷氨酸，精 氨酸，谷氨酰胺,或赖氨酸；将EU位置430替代为精氨酸，谷氨酰胺，甲硫 氨酸,或赖氨酸；将EU位置431替代为赖氨酸或脯氨酸；将EU位置432替 代为精氨酸和苯丙氨酸；将EU位置434替代为亮氨酸，精氨酸，或赖氨酸; 将EU位置436替代为精氨酸或谷氨酸;或将EU位置438替代为谷氨酸。
更特别地，改变的多肽可包括以下突变之任一或任何联合(直到所有) 将赖氨酸在EU位置248替代为天冬氨酸；将天冬氨酸在EU位置249替代 为精氨酸或赖氨酸；将苏氨酸在EU位置250替代为精氨酸或赖氨酸；将亮 氨酸在EU位置251替代为精氨酸，赖氨酸,或天冬酰胺；将曱硫氨酸在EU 位置252替代为谷氨酰胺，天冬酰胺，丝氨酸或苏氨酸；将精氨酸在EU位 置255替代为曱硫氨酸，天冬氨酸，或亮氨酸；将苏氨酸在EU位置256替代 为精氨酸，谷氨酸,或赖氨酸；将脯氨酸在EU位置257替代为精氨酸，天冬 氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将谷氨酸在EU位置258替代为精氨酸，谷氨酰胺， 或赖氨酸；将苏氨酸在EU位置260替代为赖氨酸；将色氨酸在EU位置277 替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，或赖氨酸；将缬氨酸在EU位 置279替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸,或赖氨酸；将天冬氨酸在EU位置 280替代为天冬酰胺；将甘氨酸在EU位置281替代为天冬氨酸，谷氨酸，或 谷氨酰胺；将缬氨酸在EU位置282替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖 氨酸；将谷氨酸在EU位置283替代为谷氨酰胺；将缬氨酸在EU位置284 替代为精氨酸，赖氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；将组氨酸或丙氨酸在EU位置 285替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯氨酸，苏氨酸，或苯丙氨 酸；将天冬酰胺或赖氨酸在EU位置286替代为天冬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，
或甲硫氨酸；将丙氨酸在EU位置287替代为天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯 氨酸，或苏氨酸；将赖氨酸在EU位置288替代为曱硫氨酸，精氨酸，天冬氨 酸或谷氨酸；将苏氨酸在EU位置289替代为脯氨酸；将赖氨酸在EU位置 290替代为脯氨酸，天冬氨酸或谷氨酸；将丝氨酸在EU位置304替代为天 冬氨酸或谷氨酸；将缬氨酸在EU位置305替代为精氨酸或苏氨酸；将亮氨 酸或缬氨酸在EU位置306替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸,或赖氨酸；将 苏氨酸或缬氨酸在EU位置307替代为精氨酸，脯氨酸，天冬氨酸,或谷氨酸; 将缬氨酸在EU位置308替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，或异亮 氨酸；将亮氨酸在EU位置309替代为苏氨酸，精氨酸，天冬氨酸，赖氨酸或 谷氨酸；将组氨酸在EU位置310替代为精氨酸，亮氨酸，赖氨酸或天冬酰 胺；将谷氨酰胺在EU位置311替代为精氨酸或赖氨酸；将天冬氨酸或亮氨 酸在EU位置312替代为精氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，或赖氨酸；将天冬酰胺 在EU位置313替代为天冬氨酸，精氨酸，或赖氨酸；将亮氨酸在EU位置314 替代为精氨酸，赖氨酸，或天冬酰胺；将天冬酰胺在EU位置315替代为精氨 酸，天冬氨酸或谷氨酸；将天冬酰胺或甘氨酸在EU位置316替代为天冬氨 酸或赖氨酸；将赖氨酸在EU位置317替代为天冬氨酸或谷氨酸；将赖氨酸 在EU位置340替代为精氨酸；将脯氨酸在EU位置343替代为谷氨酰胺或 赖氨酸；将精氨酸在EU位置344替代为亮氨酸；将谷氨酸在EU位置345 替代为精氨酸，赖氨酸，或谷氨酰胺；将脯氨酸在EU位置374替代为精氨酸, 赖氨酸，或亮氨酸；将天冬氨酸在EU位置376替代为天冬酰胺，精氨酸，亮 氨酸,或赖氨酸；将丙氨酸在EU位置378替代为丝氨酸；将丝氨酸在EU位 置383替代为赖氨酸；将甘氨酸在EU位置385替代为赖氨酸;将谷氨酰胺在 EU位置386替代为丙氨酸或赖氨酸；将脯氨酸在EU位置387替代为丙氨 酸；将天冬酰胺在EU位置389替代为天冬氨酸；将丝氨酸在EU位置426 替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸；将曱疏氨酸在EU位置428替代为天冬 氨酸，谷氨酸，精氨酸，谷氨酰胺,或赖氨酸；将谷氨酸在EU位置430替代 为精氨酸，谷氨酰胺，曱硫氨酸，或赖氨酸；将亮氨酸在EU位置431替代为 赖氨酸或脯氨酸；将组氨酸在EU位置432替代为精氨酸替代为苯丙氨酸; 将天冬酰胺在EU位置434替代为亮氨酸，精氨酸,或赖氨酸；将酪氨酸在 EU位置436替代为精氨酸或谷氨酸;或将谷氨酰胺在EU位置438替代为谷 氨酸。
另 一实施方案中，本发明多肽可以含有至少一个选自下组的氨基酸突
变根据EU编号系统，将EU位置281替代为E，将EU位置282替代为 E,将EU位置283替代为Q，将EU位置285替代为R,将EU位置286替 代为T，将EU位置288替代为R，将EU位置289替代为P,将EU位置290 替代为P,将EU位置305替代为T，将EU位置307替代为P,将EU位置 308替代为I,将EU位置309替代为T，将EU位置315替代为R，将EU位 置340替代为R，将EU位置344替代为L，将EU位置378替代为S，将EU 位置383替代为K，将EU位置385替代为K，将EU位置386替代为A，和 将EU位置389替代为D。
更特别地，本发明多肽可以含有至少一个选自下组的氨基酸突变根 据EU编号系统，Asp280Asn(其中D指示在所述EU位置(280)待突变的氨 基酸位置，而N指示为了达到所述改变的多肽在该位置待替代的氨基酸)， Gly281Glu， Val282Glu, Glu283Gln, His285Arg， Asn286Thr， Lys288Arg, Thr289Pro， Lys290Pro， Val305Thr， Thr307Pro， Val308Ile， Leu309Thr， Asn315Arg， Lys340Arg, Arg344Leu， Ala378Ser， Ser383Lys, Glu386Lys， Pro387Ala，和Asn389Asp。
在一个特定实施方案中，改变的多肽在相应于选自下组的EU位置的氨 基酸位置包含替代248， 249， 250， 251， 252， ， 256, 255， 260， 257， 277， 281, 282， 287， 284， 285, 286, 288， 290;304， 305， 306, 307, 309， 310， 312， 313， 315， 343， 374， 426, 428， 430， 431, 432， 434，或438。
另 一实施方案中，改变的多肽可以包括以下突变之任一或任何组合(直 到所有)将EU位置248替代为天冬氨酸；将EU位置249替代为精氨酸或 赖氨酸；将EU位置250替代为精氨酸或赖氨酸；将EU位置251替代为精 氨酸，赖氨酸，或天冬酰胺；将EU位置252替代为丝氨酸或苏氨酸；将EU 位置256替代为精氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置255替代为亮氨酸, 天冬氨酸或曱硫氨酸；将EU位置260替代为赖氨酸；将EU位置257精氨 酸，天冬氨酸，谷氨酸,或赖氨酸；将EU位置277替代为精氨酸，天冬氨酸, 谷氨酰胺，或赖氨酸；将EU位置279替代为谷氨酸；将EU位置281替代为 谷氨酰胺；将EU位置282替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将 EU位置287替代为天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯氨酸，或苏氨酸；将EU位 置284替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置285替代为天冬氨酸，谷氨酸
或苯丙氨酸；将EU位置286替代为天冬氨酸，谷氨酸，或曱硫氨酸；将EU 位置288替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置290替代为天冬氨酸或谷氨 酸；将EU位置304替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置305替代为精氨 酸；将EU位置306替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置 307替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸；将309位置替代为精氨酸，天冬氨 酸，赖氨酸或谷氨酸；将EU位置310替代为精氨酸，亮氨酸，赖氨酸或天冬 酰胺；将EU位置312替代为精氨酸，天冬酰胺，或赖氨酸；将EU位置313 替代为天冬氨酸，精氨酸,或赖氨酸；将EU位置315替代为天冬氨酸或谷氨 酸；将EU位置343替代为谷氨酰胺或赖氨酸；将EU位置345替代为精氨 酸或谷氨酰胺；将EU位置374替代为精氨酸，赖氨酸,或亮氨酸；将EU位 置376替代为天冬酰胺；将EU位置426替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸; 将EU位置428替代为精氨酸，谷氨酰胺，或赖氨酸；将EU位置430替代为 赖氨酸；将EU位置431替代为脯氨酸；将EU位置432替代为精氨酸；将 EU位置434替代为亮氨酸或赖氨酸;或将EU位置438替代为谷氨酸。
另一实施方案中，在IgGl的Fc区中引入替代，所述替代选自K248D， D249R, D249K, T250R, T250K， L251R, L251K, L251N， M252S, M252T， M252Q， M252N， R255D， R255L， R255M， T256R, T256E， T256K， P257R, P257D， P257E, P257K， E258R. E258Q. E258K， T260K, T260R， T260K， T260Q， W277R， W277D, W277Q， W277E, W277K， V279R， V279D， V279E， V279K， D280N， G281D， G281E， G281Q, V282R, V282D， V282E, V282K， E283Q, V284R， V284D, V284E, V284K，腦5R， H285D， H285E， H285K, H285P， H285T， H285F， A285D， A285E,腦6D， N286E， N286T， N286M, A286M， A286E, A286D， A287D, A287E, A287K, A287P， A287T， K288D， K288E, K288M， K288R， T289P, K290D， K290E， K290P， S304D， S304E， V305T，V305R， V306D，V306E, L306R， L306D， L306E, L306K, V307E， T307R， T307D， T307P, V308R， V308D, V308E， V308K， V308I, L309R, L309D， L309E， L309K， L309T, H310R， H310N, H310L, H310K, L312K， Q311R， Q311K， D312R， D312N， D312L， D312K， L312K， N313R， N313K, W313D， N313K， W313K, L314R， L314N, L314K， N315R， N315D， N315E， N316D， N316K， K317D， K317E， K340R， P343Q， P343K, R344L, E345R， E345Q， E345R， P374R， P374L， P374K， D376R， D376L， D376K， D376N， A378S， S383K， G385K, Q386A， Q386A，
P387A, N389D， S426R， S426D， S426E， M428R, M428D, M428E， E430R， E430Q， E430K， E430M, A431P， L431K, H432F， L432R, N434R， N434K， N434L， Y436R，Y436E或Q438E。
如上所述，可以明了，本发明组合物可以包含一个或多个本文所述突 变。 一个实施方案中，本发明的改变的多肽包含仅一个本文所列突变。一 个实施方案中，本发明的改变的多肽包含仅两个本文所列突变。 一个实施 方案中，本发明的改变的多肽包含仅三个本文所列的突变。 一个实施方案 中，本发明的改变的多肽包含仅四个本文所列的突变。
A.具有增强的FcRn结合亲和力的改变的多肽
一个实施方案中，本发明提供与相应起始多肽相比具有增强的新生儿 Fc受体亲和力的改变的多肽。优选地，该改变的多肽显示出比不含突变的 相应多肽较长的循环半衰期。
一个实施方案中，具有增强的FcRn结合亲和力的改变的多肽可以在以 下EU位置之一包含至少一个氨基酸替代284， 285， 286， 288, 290,和304。
另一实施方案中，具有增强的FcRn结合亲和力的改变的多肽可以包含 至少一个以下氨基酸替代将EU位置284替代为谷氨酸；将EU位置285 替代为谷氨酸；将EU位置286替代为天冬氨酸；将EU位置288替代为谷 氨酸；将EU位置290替代为谷氨酸。
在一个示例性实施方案中，所述改变的多肽包含IgGl分子的Fc区。 优选地，该分子含有至少一个以下突变V282E， V284E， H285E， N286D， N286E， K288E， K290E,和S304D。
在本发明的一个优选实施方案中，与起始多肽相比，修饰多肽的FcRn 结合亲和力增加至少大约30%， 50%， 80%， 2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，15倍， 20倍，25倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，或100倍。
当施用给患者时，本发明的改变的多肽可以在患者体内具有超过1小 时、2小时、3小时、4小时、5小时、IO小时、12小时、24小时、2天、 3天、4天、5天、10天、12天、2周、3周、或l个月的循环半衰期。在 一个示例性实施方案中，本发明的改变的多肽在患者体内具有超过21天的 循环半衰期。
一个实施方案中，所述改变的结合分子可以在特定靶组织，例如患病 组织中具有增加的定位或生物利用度。示例性患病组织包括瘤形成组织或
肿瘤或以本文所述4壬4可病症的病理为特征的其它纟且织或器官，包4舌脑或
CNS、肺、心、胰、肝、肾、膀胱、胃、大肠或小肠、呼吸道、淋巴结、肌 肉、表皮、骨、软骨、关节、血管、骨髓、前列腺、卵巢或子宫。
B.具有降低的FcRn结合亲和力的改变的多肽
在另一实施方案中，本发明提供对新生儿Fc受体相比于相应的起始多 肽具有降低的亲和力的改变的多肽。优选地，所述改变的多肽表现出与不 含突变的相应多肽相比较短的循环半衰期。
具有降低的FcRn结合亲和力的改变的多肽可以在EU位置包含至少一 个氨基酸替代，其中所述EU位置选自以下区域之一a)从248位至260位； b)从277位至315位；c)从343位至374位；和d)从426位至438位。
一个实施方案中，具有降低的FcRn结合亲和力的改变的多肽可以包含 至少一个位于如下EU位置之一的氨基酸替代248, 249， 250， 251, 252， 256， 255, 260， 257， 277， 281， 282， 287, 284， 285， 286， 288, 290;304, 305， 306， 307， 309， 310, 312， 313， 315, 343， 374, 426, 428， 430, 431， 432， 434，或438。
在另一实施方案中，具有降低的FcRn结合亲和力的改变的Fc多肽可 以包含至少一个如下氨基酸替代将EU位置248替代为天冬氨酸；将EU 位置249替代为精氨酸或赖氨酸；将EU位置250替代为精氨酸或赖氨酸; 将EU位置251替代为精氨酸，赖氨酸,或天冬酰胺；将EU位置252替代为 丝氨酸或苏氨酸；将EU位置256替代为精氨酸，谷氨酸,或赖氨酸；将EU 位置255替代为亮氨酸，天冬氨酸或曱硫氨酸；将EU位置260替代为赖氨 酸；将EU位置257替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置 277替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，或赖氨酸；将EU位置279替代为 谷氨酸；将EU位置281替代为谷氨酰胺；将EU位置282替代为精氨酸，天 冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置287替代为天冬氨酸，谷氨酸，赖氨 酸，脯氨酸，或苏氨酸；将EU位置284替代为天冬氨酸；将EU位置285替 代为天冬氨酸或苯丙氨酸；将EU位置286替代为谷氨酸或甲硫氨酸；将EU 位置288替代为天冬氨酸；将EU位置290替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU 位置304替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU位置305替代为精氨酸；将EU 位置306替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU位置307替代 为精氨酸，天冬氨酸,或谷氨酸；将位置309替代为精氨酸，天冬氨酸，赖氨
酸或谷氨酸；将EU位置310替代为精氨酸，亮氨酸，赖氨酸或天冬酰胺；将 EU位置312替代为精氨酸，天冬酰胺,或赖氨酸；将EU位置313替代为天 冬氨酸，精氨酸，或赖氨酸；将EU位置315替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU 位置343替代为谷氨酰胺或赖氨酸；将EU位置345替代为精氨酸或谷氨酰 胺；将EU位置374替代为精氨酸，赖氨酸,或亮氨酸；将EU位置376替代 为天冬酰胺；将EU位置426替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸；将EU位 置428替代为精氨酸，谷氨酰胺,或赖氨酸；将EU位置430替代为赖氨酸; 将EU位置431替代为脯氨酸；将EU位置432替代为精氨酸；将EU位置 434替代为亮氨酸(亮氨酸)或赖氨酸;或将EU位置438替代为谷氨酸。另 一实施方案中，改变的多肽可以包括以下突变之任一或任何组合(直 到所有)K248D， D249R， D249K, T250R, T250K， L251R， L251K， L251N， M255S， M255T, T256R， T256E, T256K, R255D， R255L， R255M, T260K， T260R， T260K， T260Q， P257R, P257D， P257E， P257K， W277R， W277D， W277Q， W277K， V279E, G281Q， V282R， V282D, V282E， V282K， V282E, A287D, A285E， A287K, A287P, A287T, V284D, ， H285D， H285F， N286E， N286M, K288D， K290D， K290E, S304D， S304E， V305R， V306E， L306R， L306D， L306E， L306K， V307E， T307R， T307D, L309R， L309D， L309E， L309K， H310R, H3丽，H310L， H310K， L312K, D312R, D312N， D312K， N313R， W313D， N313K， W313K, N315D， N315E， P343Q， P343K, E345R， P374R， P374L, P374K, D376N, S426R, S426D， S426E， E430K, A431P, L432R, N434K, N434L，或Q438E。在某些优选实施方案中，具有降低的FcRn结合亲和力的改变的Fc可 以包含至少一个突变M252S， M252T， V282E, K288E;V308E， V308D， L314K, N434L,或Q438E。在更优选的实施方案中，具有降低的FcRn结合亲和力的 改变的多肽可以包含至少一个突变M252S、 M252T、 N434L或Q438E。 在再更优选的实施方案中，具有降低的FcRri结合的改变的Fc多肽包含突 变N434L或Q438。另一实施方案中，具有降低的FcRn结合亲和力的改变 的多肽可以包含至少一个如下氨基酸替代将EU位置252替代为苏氨酸; 将EU位置255替代为天冬氨酸；将EU位置282替代为精氨酸，天冬氨酸， 谷氨酸或赖氨酸；将位置309替代为精氨酸，天冬氨酸，赖氨酸或谷氨酸；和 将位置434替代为亮氨酸。.
在一个示例性实施方案中，所述改变的多肽包含IgGl分子的Fc区。 优选地，该分子包含至少一个如下突变M252T， R255D, V282R， V282D， V282E, V282K, L309R， L309D, L309K， L309E，或N434L。在一个本发明优选实施方案中，与起始多肽相比，修饰多肽对FcRn的 结合亲和力减少至少大约30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%， 85%, 90%, 95%， 97%, 98%，或99%。当施用给患者时，本发明的改变的多肽可以在患者体内具有少于1小 时、2小时、3小时、4小时、5小时、IO小时、12小时、24小时、2天、 3天、4天、5天、10天、12天、2周、3周或1个月的循环半衰期。在一 个示例性实施方案中，本发明的改变的多肽在患者体内具有少于大约21天 的循环半衰期。一个实施方案中，改变的多肽可以在特定组织，例如易受到未改变的 结合分子的毒性伤害的组织中具有降低的定位或生物利用度。典型地易受 到治疗剂的毒性作用伤害的示例性组织包括脑或CNS、心脏、肝和肾。另 一实施方案中，改变的多肽可以具有降低的前往胎儿的定位或胎盘转移。 另一实施方案中，改变的多肽，当通过奶或初乳摄取时，可以具有降低的 新生儿循环系统定位。V.改变的多肽的表达本发明多肽，例如起始多肽和修饰多肽可以通过重组方法制备。 例如，编码多肽的多核苷酸可以插入适宜表达载体中用于重组表达。 当多肽是抗体时，编码额外的轻链和重链可变区(任选地与恒定区连接)的多 核*酸可以插入同 一或不同表达载体中。亲和标签序列(例如His(6)标签)可 以任选地附着于起始多肽序列或包括在起始多肽序列中以利于下游纯化。 编码免疫球蛋白链的DNA片段与表达栽体中确保免疫球蛋白多肽的表达的 控制序列可操作地连接。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然结 合的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。优选地， 表达控制序列在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中是真核启动子系 统。 一旦将载体掺入适当宿主中后，在适于该核苷酸序列高水平表达以及 多肽收集和纯化的条件下维持宿主。这些表达载体典型地作为附加体或作为宿主染色体DNA的一个组成部
分可以在宿主生物体中复制。 一般地，表达栽体含有选择标记(例如，氨节 青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测被期望的DNA序列转化的那些细胞(见例如，美国专利号4,703,362)。大肠杆菌(E. coli)是一种尤其有用的克隆本发明多核苷酸(例如DNA序 列)的原核宿主。适用的其它微生物宿主包括芽孢杆菌(bacilli),例如枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilus)和其它肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌 (Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种々支单胞菌属(Pseudomonas)物种。其它微生物例如酵母也可以用于表达。酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵 母属(Pichia)是示例性酵母宿主，适宜的载体具有表达控制序列(例如启动 子)、复制起点、终止序列及按照期望的序列等等序列。典型的启动子包括 3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶启动子。诱导型酵母启动子包括例如来自 醛脱氢酶、isocytochrome C和负责曱醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动 子。除了微生物，也可以使用哺乳动物组织培养物表达和产生本发明多肽 (例如编码免疫JE求蛋白或其片段的多核苷酸)。见Winnacker， From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y.， N.Y. (1987)。真核细月包实际上是优选的，因为 本领域已经开发出大量能够分泌异源蛋白质(例如完整免疫球蛋白)的适宜 宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、293细胞、 骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。用于这些细胞的表达载体包括表 达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(Queen等，Immunol. Rev. 89: 49(1986)),和必需的加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、 多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是来源于免疫球 蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒。巨细胞病毒等的启动子。见Co 等，J. Immunol. 148: 1149 (1992)。含有目的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的 载体可以通过熟知方法转移至宿主细胞中，所述方法可以依据细胞宿主的 类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿 孔、脂转染、生物轰击或基于病毒的转染可以用于其它细胞宿主。(一般见 Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press),第二版，1989)。用于转化哺乳动物细胞的其它方法包括使用 Polybrene、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(一般见，Sambrook等，同上引文)。对于转基因动物的制备，可以将转基因显微注射至受精的 卵母细胞中，或者可以将其掺入胚胎干细胞的基因组，并将该细胞的细胞 核转移至去核卵母细胞中。也可以将本发明多肽掺入转基因中用于导入转基因动物的基因组和随后表达，例如，在转基因动物的奶中表达(见例如，Deboer等，5,741,957; Rosen 5,304,489;和Meade 5，849，992)。适宜的转基因包括可操作地与来自乳腺特 异基因如酪蛋白或p乳球蛋白的启动子和增强子连接的轻链和/或重链的编 码序列。改变的多肽(例如多肽)可以使用单个载体或两个载体表达。例如，可以 将抗体重链和轻链克隆在不同表达载体上，并共转染至细胞中。一个实施方案中，可以使用信号序列以利于本发明多肽的表达。 一旦表达后，多肽可以根据本领标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和柱(例 如，蛋白A或蛋白G)、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等纯化(一般见Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y" (1982))。 一个优选实施方案中，纯 化方法可以使用下述本发明多聚体Fc受体。VI.分析结合亲和力可以以多种方式测量结合亲和力。 一般地，且无论用于确定或测量亲 和力的确切方式如何，本发明方法调节与FcRn的结合亲和力，而当本发明 方法产生多肽时，该多肽在其临床应用的任何方面优于其所来自的起始多 肽(例如，当修饰的多肽可以以更低剂量或更低频率或以更方便的施用途 径施用时或者当修饰的多肽具有降低的副作用或改变的生物分布时，本发 明方法被认为是有效的或成功的)。改变的多肽在效应子功能上的改变可以通过测定其对特定Fc受体的结 合亲和力来确定。 一个实施方案中，可以通过测量改变的多肽对FcY受体的 结合亲和力，确定抗原依赖性效应子功能的改变。另一实施方案中，可以 通过测量对其它Fc受体，尤其是新生儿Fc受体(例如人FcRn)的结合亲和 力，确定抗原非依赖性效应子功能(例如，半衰期或生物分布)。本发明改变的多肽在结合亲和力上的改变可以通过比较改变的多肽与 适宜的对照多肽(例如相应起始多肽)的结合亲和力来确定。 一个实施方案 中，可以通过比较改变的多肽在第一试验中的结合亲和力和对照多肽在第
二结合试验中的结合亲和力，确定结合亲和力的改变。在备选实施方案中， 可以通过比较改变的多肽和对照多肽在相同试验中的结合亲和力，确定结 合亲和力的变化。例如，所述试验可以是竟争性结合试验，其中使用递增 浓度的对照多肽，评价所述改变的多肽的结合亲和力。在一个特定实施方案中，可以在第一pH (例如酸性pH)和第二pH (例如碱性pH)下测定对Fc 受体(例如FcRn)的结合亲和力。更特别地，可以通过各种试验，包括例如表面等离子体共振(例如 BiaCore试验)、分析性超离心、凝胶过滤、FRET、和ELISAL或KinExA 3000试验(可从Sapidyne Instruments (Boise, ID)获得)，测量多肽和其所结合 的受体之间的亲和力。示例性试验在以下详述。i) 无细胞试验本领域已经描述几种用于检查效应子功能(例如FcR结合亲和力)的体 外无细胞试验。优选地，基于细胞的试验能够评价改变的抗体与可溶性Fc 受体形式，例如单体Fc受体或本发明的多聚体Fc受体的结合。自动HTS 技术可以用于此筛选程序。筛选可以使用允许实施检测的标记物(例如同位 素标记物、生色团、荧光团、发光团(lumiphore)或表位)。标记物可以与待 分析的多聚体Fc受体或含Fc的多肽附着。示例性无细胞试验包括但不限于FRET(焚光共振能量传递)、BRET(生 物发光共振能量传递)、基于Alphascreen (Amplied Luminescent Proximity Homogeneous)的试-睑、闪烁接近才企测法(scintillation proximity assays)、 ELISA (酶联免疫吸附试验)、SPR(表面等离子体共振，例如BIACORE⑧)、恒温滴 定量热法、示差扫描量热法、凝胶电泳、分析性超离心、和层析，包括凝 胶过滤层析。ii) 基于细胞的试验本领域已经描述了几种用于检查改变的多肽的效应子功能(例如，FcR 结合亲和力)的基于细胞的体外试验。优选地，基于细胞的试验能够评价改 变的抗体与表面形式的Fc受体的结合。示例性基于细胞的试验包括桥接试 验(bridging assay)和流式细胞术。在一个示例性实施方案中，可以使用FcR桥接试验，测量改变的多肽 的FcR结合亲和力。可以用基于抗体在抗原和携带FcR的细胞之间形成"桥" 的能力的试验，测量FcR (例如，FcRn或FcyR)结合亲和力。ii)模型动物试验为了兽医学目的或作为人类疾病(例如上述免疫疾病或病症)的动物模 型，也可以将本发明改变的多肽施用给模型动物，以便通过例如检查抗体 的半衰期或生物分布，检查本发明改变的多肽用于治疗的潜力。关于后者， 该动物模型可以用于评价本发明抗体的疗效(例如检查效应子功能、剂量和 施用时程)。一个实施方案中，可以检查本发明改变的多肽在循环半衰期方面的改 善。具有增强的半衰期的改变的多肽当施用给模型动物时可以或预期将比 不含突变的相应多肽(例如，在改变的多肽包含突变的位置上不含突变的相 同类型抗体(例如IgG如IgGl))更长地保留在循环中。例如，由于21天是人 类抗体的典型(3相半衰期，本发明改变的抗体可以是循环时间长于21天的 那些抗体。另一实施方案中，改变的多肽相对于靶抗体具有降低的半衰期。 例如，可以选择相对于耙抗体具有降低的半衰期(例如，少于21天)的改变 的抗体。可以用于评价本发明改变的多肽预防或治疗肿瘤形成的疗效的动物模 型例子包括肿瘤异种移植模型。可以用于评价本发明改变的多肽预防或治疗类风湿性关节炎(RA)的疗 效的动物模型例子包括佐剂诱导的RA、胶原诱导的RA和胶原mAb诱导 的RA (Holmdahl等，Immunol. Rev. 184:184, 2001; Holmdahl等，Ageing Res. Rev. 1:135， 2002; Van den Berg， Curr. Rheumatol. Rep. 4:232， 2002)。可以用于评价本发明改变的多肽预防或治疗炎性肠病(IBD)的疗效的动 物模型例子包括TNBS诱导的IBD、 DSS诱导的IBD (Padol等，Eur. J. Gastrolenterol. Hepatol. 12:257， 2000; Murthy等，Dig. Dis. Sci. 38:1722， 1993)。可以用于评价本发明改变的多肽预防或治疗肾小球肾炎的疗效的动物 模型例子包括抗GBM诱导的肾小球肾炎(Wada等，Kidney Int. 49:761-767， 1996)和抗thyl诱导的肾小球肾炎(Schneider等，Kidney Int. 56:135-144， 1999)。效的动物模型例子包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE) (Link和Xiao, Immunol. Rev. 184:117-128， 2001)。 VII. FcRn融合蛋白另一方面，本发明提供新试剂，例如用于纯化、用于确定本发明改变 的含Fc的多肽的结合亲和力、和用于淘选影响与FcRn结合的其它Fc突变。本发明试剂可以是含有第一多肽和至少一个其它多肽的多聚体Fc结合 蛋白质，其中所述第一和其它多肽各含有至少一个可操作地与至少一个单 体Fc结合域连接的Fc区或其部分。一个实施方案中，各多肽的Fc区或其部分和Fc结合域或其部分分别 使用本领域易于获得的技术通过遗传方式融合在一起。在某些实施方案中， 多聚体通过所述第一和其它多肽的非共价结合而形成。另一实施方案中， 多聚体通过所述第一和其它多肽之间的共价结合(例如，二硫键结合)而形 成。优选地，第一和第二多肽在其相应的Fc区共价键合(例如通过二疏键) 以形成"二聚的"(或bidendate)Fc结合域。 一个实施方案中，Fc区可以;故改 变(例如突变)以便其效应子功能(尤其是与Fc受体的结合)被废除或失活。所 述Fc区和Fc结合域可以来源于表达相应结构域的任何生物体。优选的物 种包括人、猴、小鼠、大鼠和兔。多聚体Fc受体可以是嵌合的，例如Fc 区可以来源于啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)，而Fc结合域来源于灵长类动 物(例如，人或猴)。在某些优选实施方案中，本发明试剂可以包含来源于Fc受体(例如Fc 新生儿受体)或其细胞外部分的Fc结合域。一个实施方案中，本发明FcRn:Fc 分子是二聚体分子；构成二聚体的各单体分别包含含有新生儿受体a链胞 外域(例如，该受体的al和a2域)和Fc区或其部分的第一多肽和第二卩微 球蛋白(p2m)多肽。在一个实施方案中，Fc区来源于IgGl 。优选的人FcRn a-Fc 融合物的DNA序列显示在SEQ ID NO: 9中，预测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 10中。Fc区优选含有至少一个降低其与单体或多聚体Fc受体的结 合的突变。例如，可以在氨基酸位置310、 311、 433和434(EU编号)进行突 变，例如实施例4中描述的。令人惊奇的是，多聚体Fc受体可以比单体Fc受体高得多的水平表达。 例如，在用编码FcRn:Fc融合蛋白和|32m ( —起在同一载体上或在不同载体 上)的表达载体稳定转染哺乳动物细胞系(例如CHO)后，可以获得多达 100mg/L的产率。
本发明试剂提供了许多优于现有试剂的优点。本发明人令人惊奇地意外发现，本发明多聚体Fc受体与含有Fc的多肽具有极大地增强的结合相 互作用。通过Biacore测量hFcRnFc对固定化hlgG的结合亲和力，显示出 25纳摩尔结合亲和力，相对地单体hFcRn的结合亲和力为2,000纳摩尔。 例如，本发明试剂能够结合含有Fc的多肽(例如抗体Fc区)上的至少两个分 开的FcR结合位点。尤其是，本发明试剂能够结合Fc多肽(例如抗体)Fc区 的两条重链上的FcR结合位点。这些性质使得与含有Fc的多肽具有增强的 结合相互作用。尤其是，本发明试剂能够以增强的稳定性和/或亲合力结合 含有Fc的多肽。现有试剂典型地包含单体可溶性Fc受体或其片段，其有 着多种缺陷。例如，单体Fc受体，尤其是人单体FcRn,由于在被包被、标 记或固定在固体(例如塑料)表面上时具有差的亲和力和不稳定性，故不能用 于许多高通量筛选(HTS)试验形式(例如HTSELISA)。而且，Fc-多肽与单体 Fc受体的结合相对较弱，这使得难于测量结合信号。与单体Fc受体相比， 本发明多聚体Fc受体由于具有增强的稳定性和改善的(例如>100倍)针对特 定的含Fc多肽的结合亲和力，故提供了更为有力的试验。因此，本发明多聚体Fc受体可以用于多种筛选方法中以检查任何含有 Fc的多肽的FcR结合亲和力变化。本发明多聚体Fc受体可以用于本领域已 知的能够评价含Fc多肽(例如抗体)与多聚体Fc受体的结合的任何无细胞结 合试验。根据所述试验的要求，可以将本发明多聚体Fc受体固定在固相基 质上或者本发明多聚体Fc受体可以自由地飘浮在溶液中。在本文中描述了 适宜的无细胞结合试验。 一个实施方案中，本发明多聚体Fc受体可以用于 检查本发明改变的多肽在效应子功能上的变化。另 一实施方案中，本发明多聚体Fc受体可以用于纯化含有Fc的多肽。 例如，可以将本发明多聚体Fc受体固定在柱上，以便可以从混合物中基于 含有Fc的多肽与多聚体Fc受体的更大亲和力而纯化出含有Fc的多肽。这 些方法与要求用利于纯化的标签(例如用His或表位标签)标记蛋白质的现有 亲和纯化方法相比提供了某些优点。此类标签可能干扰纯化蛋白的预期用 途(例如作为治疗剂施用)，并且如果除去此类标签的话，除去它们的方法需 要大量的纯化步骤，从而导致产率的大量损失。在一个示例性实施方案中，本发明多聚体新生儿Fc受体可以利于含有 Fc的多肽在第一pH (例如酸性pH)下与柱子结合以及在第二pH (例如中性
pH)下从柱子上洗脱。该纯化方法比现有用于纯化含有Fc的多肽的方法具 有额外的优点。例如，蛋白A亲和柱被普遍地用于纯化抗体和其它含有Fc 的多肽。然而，从柱子上洗脱该多肽要求相对苛刻的处理(例如低pH)，这 些处理可能破坏所述多肽，导致产率的大量损失。相反地，从多聚体新生 儿Fc受体亲和中洗脱含有Fc的多肽仅仅要求从第一 pH (例如pH5.8-6.5) 小幅上升至第二 pH(例如pH 7.0-7.5)。另一实施方案中，本发明多聚体Fc受体(例如，此外，本发明试剂可以 用于检查基于任何含有Fc的蛋白质的治疗，尤其是单克隆抗体治疗的安全 性。例如，当施用给患者时，某些含有Fc的多肽(例如，氧化的含有Fc的 多肽)可以表现出向易受攻击的组织的不期望的胞吞转运(例如，从母体向胎 儿的胎盘转移)。预期该含有Fc的多肽以较低的亲和力与多聚体Fc受体结 合，并将在未被氧化的多肽之前洗脱。甲硫氨酸(例如，EU位置253和429 位)残基尤其易于受到氧化。因此，可以基于与多聚体Fc受体的结合筛选 Fc多肽，并且如果对多聚体Fc受体的结合亲和力处于可接受的阈值，可以 基于治疗应用选择Fc多肽。例如， 一个实施方案中，可以使用与多聚体Fc 受体的结合，在多肽制品之间测定批次的一致性或者实施质量控制检查。本发明多聚体Fc受体可以使用本文所述任何方法产生。VIII.进一 步修饰改变的含有Fc的多肽可以进一步修饰改变的含有Fc的多肽，以提供期望效果。例如，在某 些实施方案中，可以通过与用来改善多肽的期望功能(例如疗效)的额外部 分，即，功能性部分，例如PEG化部分、阻断部分、可检测部分、诊断部 分和/或治疗部分缀合(即，物理连接)，修饰所述的改变的多肽。化学缀合 可以随机地或通过位点特异地修饰所述改变的多肽内的特定残基来实现。 以下首先描述了示例性功能性部分，之后描述了用于连接此功能性部分和 改变的多肽的不同氨基酸侧链化学的有用化学方法和物质。a)功能性部分有用的功能性部分的例子包括但不限于PEG化部分、阻断部分、可检 测部分、-珍断部分和治疗部分。示例性PEG化部分包括聚(亚烷基)二醇部分，例如PEG部分，优选地 PEG-马来酰亚胺部分。优选的PEG化部分(或相关聚合物)可以例如是聚乙
二醇("PEG，，)、聚丙二醇("PPG，，)、聚氧乙基化甘油("POG")和其它聚氧乙基 化多元醇、聚乙烯醇("PVA，，)和其它聚环氧烷、聚氧乙基化山梨糖醇或聚氧 乙基化葡萄糖。聚合物可以是均聚物、随机或嵌段共聚物、基于上述单体 的三元共聚体、直链或支链的、取代的或未取代的，条件是其具有至少一 个活性砜部分。聚合部分可以是任何长度或者分子量，但是这些特征可能 影响生物学性质。对于降低药物应用时的清除速率，尤其有用的聚合物平 均分子量为2,000至35,000道尔顿。此外，如果两个基团与聚合物一头一 个地连接，聚合物的长度可能影响两个基团之间的有效距离和其它空间关物学活性。PEG由于几个原因可以用于生物学应用。PEG典型地是透明的、 无色的、无味的、可溶于水、具有热稳定性、对许多化学试剂具有惰性、 不水解、而且无毒。优选地，PEG化部分与具有增加寿命的本发明改变的含有Fc的多肽附 着。PEG化部分可以通过增加所述改变的多肽分子的表观分子量，用来进 一步增加所述改变的多肽的半衰期。增加的表观分子量可以降低皮下或全 身施用后从身体中清除的速率。在许多情况下，PEG化也可以起到降低抗 原性和免疫原性的作用。此外，PEG化可以增加改变的多肽的可溶性。示例性阻断部分(blocking moiety)包括半胱氨酸加合物、胱氨酸、混和 的二硫化物加合物、或其它具有足够的空间体积和/或电荷以致可以降低抗 原依赖性效应子功能(例如，通过抑制Fc区结合Fc受体或补体蛋白的能力) 的化合物。优选地，所述阻断部分与具有降低的效应子功能的本发明改变 的多肽缀合，以进一步降低效应子功能。可以用于和本发明改变的多肽缀合的示例性可检测部分包括荧光部 分、放射性同位素部分、不透射线的部分等，例如可4企测标记物，如生物 素、荧光团、生色团、自旋共振探针、或放射性标记物。示例性荧光团包 括荧光染料(例如荧光素、罗丹明等)和其它发光分子(例如鲁米那)。荧光团 可以是环境敏感的，这样如果其位置紧靠修饰蛋白中的一个或多个在结合 底物(例如，丹磺酰基探针)时发生结构变化的残基，则其荧光将发生变化。 示例性放射性标记物包括含有具有一个或多个低敏感核的原子(13(3， 15N， 2H， 125I， 1231， "Tc， 43K，52Fe，67Ga，68Ga， mIn等)的小分子。其它有用的部分是本领 域已知的。
可以用于和本发明改变的多肽缀合的诊断部分的例子包括适用于揭示 疾病或病症的存在的可检测部分。典型地，诊断部分允许确定与疾病或病 症相关的分子(例如靶肽、蛋白质或多个蛋白质)的存在、不存在或水平。此 诊断也适用于预后和/或诊断疾病或病症及其进程。
可以用于和本发明改变的多肽缀合的示例性治疗部分包括例如，抗炎 剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗感染剂。该功能性部分也可以具有上述功 能中的一种或多种功能。
示例性治疗剂包括能够引起核DNA多处链断裂并由此适用于诱导细胞 (例如，癌症的)死亡的、具有高能电离辐射的放射性核素。示例性高能放 射性核素包括90Y， 125I, 131I, 1231,111In， 105Rh， 153Sm, 67Cu， 67Ga， 166Ho， 177Lu， 186Re和188Re。这些同位素典型地产生具有短路径长度的高能a或卩粒子。 这些放射性核素杀伤其邻近的细胞，例如该缀合物所附着的或已经进入的 赘生性细胞。它们对非被定位的细胞几乎无或完全无作用，并且基本上是 无免疫原性的。
示例性治疗剂也包括细胞毒性剂，例如细胞抑制剂(例如烷化剂、DNA 合成抑制剂、DNA嵌入剂或交联剂、或DNA-RNA转录调节剂)、酶抑制剂、 基因调节剂、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、抗血 管生成剂等。
示例性治疗剂还包括烷化剂，例如蒽环抗生素(anthracycline)家族的药 物(例如，阿霉素(adriamycin)、 洋红霉素(carminomycin)、 环孑包菌素A (cyclosporin-A)、 氯套(chloroquine)、 曱基蝶呤(methopterin)、 光神霉素 (mithramycin)、 紫菜霉素(porfiromycin)、 streptonigrin、紫菜霉素，、蒽二酮类(anthmcenediones)和氮丙啶类(aziridines))。另一实施方案中，化疗部分是 细胞抑制剂，例如DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂的例子包括但不限 于氨曱蝶p令(methotrexate)和二氯代氨曱蝶p令(dichloromethotrexate) 、 3-氨基 -1 ，2，4-苯并三嗪-1 ，4-二氧化物(3-amino-1 ，2，4-benzotriazine 1 ，4-dioxide)、氨基 蝶呤(aminopterin)、胞嘧啶 β-D-阿4立伯呋喃糖苷(cytosine 卩-D-arabinofuranoside)、 5-氟-5，-脱氧尿苷(5-fluoro-5'-deoxyuridine)、 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、 9-[l，3-二羟-2-丙氧曱基]鸟嘌呤(ganciclovir)、羟基脲 (hydroxyurea)、 放线菌素D (actinomycin-D)和丝裂霉素C(mitomycin C)。示 例性DNA嵌入剂或交联剂包括但不限于博来霉素(bleomycin)、卡铂(carboplatin)、 亚确基脈氮芥(carmustine)、 苯丁酸氮芥(chlorambucil)、 环碌 酰胺(cyclophosphamide)、 顺二氨铀(II) 二氯化物(顺氯氨铂) (cis隱diammineplatinum(II) dichloride (cisplatin))、苯丙氨酸氮芥(melphalan)、 米4乇蒽醌(mitoxantrone)和奥沙利柏(oxaliplatin)。示例性治疗剂还包括转录调节剂，例如放线菌素D、道诺红霉素 (daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、高三尖杉酉旨械(homoharringtonine)和依 达比星(idarubicin)。与本发明相容的其它示例性细胞抑制剂包括安莎霉素 (Ansamycin)、笨3昆类(benzoquinones)、自昆型书亍生物(例i口, "l^若酮(quinolones)、 染料木黄铜(genistein) 、 bactacyclin)、白消安(busulfan)、 异环磷酰胺 (Ifosfamide)、 氛芥(mechlorethamine)、 三亚胺酉毘 (Triaziquone) 、 i也。丫 S昆 (Diaziquone)、卡巴酉昆(carbazilquinone)、 indoloquinone E09、 二吖丙"定基-苯 醌曱基DZQ(diaziridinyl-benzoquinone methyl DZQ)、三亚乙基磷跣胺 (triethylenephosphoramide)、和亚贿基脲化合物(例如，卡氮芥(carmustine)、 环己亚硝脲(lomustine)、甲环己氯乙亚硝脲(semustine))。示例性治疗剂还包括细胞毒性核苷，例如腺苷阿拉伯糖苷、阿糖胞苷 (cytarabine )、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧。定、氟达拉滨(fludarabine)、 5-氟脱氯尿苷(floxuridine )、呋氟尿嘧啶(ftoraflir)和6-巯基噤呤；微管蛋白结 合剂例如紫杉类药物(Taxoids)(例如，太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、多烯紫 衫醇(Docetaxel) 、 taxane)、诺考达哇(nocodazole )、利索新(Rhizoxin )、 dolastatin类(例如，dolastatin-10， -11或-15)、秋水仙素(colchicine)和类秋水 寸山素(colchicinoid)(侈'J:i口 ZD6126)、 combretastatin类(伊J长口 combretastatin A-4， AVE-6032)、和长春花生物石烕(vinca alkaloids )(例如，长春花碱(vinblastine )、 长春花新碱(vincristine )、长春地辛(vindesine)和长春瑞宾(Vinorelbine ) (navelbine));抗血管生成化合物，例如制管张素(Angiostatin ) Kl-3、 DL-a-二氟曱基-鸟氨酸、内抑素(endostatin)、烟曲霉素(ftimagillin)、染料木黄铜、 二曱胺四环素(minocycline)、星形孢菌素(staurosporine)和(±)沙立度胺 (Thalidomide)。示例性治疗剂还包括激素和激素拮抗剂，如皮质类固醇(例如强的松 (prednisone))、 孕酉同(侈'J》口 ， #5基孕§同(hydroxyprogesterone)或 medroprogesterone、雌激素(例如，二乙基乙烯雌酚(diethylstilbestrol))、抗雌 激素(例如，三苯氧胺(tamoxifen))、雄激素(例如，睾酮(testosterone))、芳香 酶才中制剂(aromatase inhibition)(例i口，氨鲁米净争(aminogluthetimide)) 、 17-(烯 丙基氨基)-17-脱曱氧基格尔德霉素(Geldanamycin )、 4-氨基-l，8-萘酰亚胺、 芽菜配基(apigenin)、布雷菲尔德菌素A(brefeldin A)、曱腈咪胍(cimetidine)、 二氯亚甲基-二磷酸、亮丙瑞林(Leuprolide)(Leuprorelin)、黄体素释放激素、 pifithrin-a 、雷帕霉素(rapamycin)、性激素结合球蛋白和毒胡萝卜素 (thapsigargin)。示例性治疗剂还包括酶抑制剂，例如S(+)-喜树碱(camptothecin)、姜黄 色素(curcumin)、(-)-鱼藤素(deguelin)、 5，6-二氯苯并-咪唑l-卩-D-呋喃核糖苷、 鬼臼亚乙苷(etoposide)、福美斯坦(Formestane )、磷烯菌素(fostriecin)、 hispidin、 2-亚氨基画l-咪哇烷乙酸(cyclocreatine)、莫维i若4木(Mevinolin )、制 滴菌素A(trichostatin A)、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin) AG34和酪氨酸磷 酸化抑制剂AG879。示例性治疗剂还包括基因调节剂，例如5-氮杂-2，-脱氧胞苷、5-氮杂胞 苷、胆钙化醇(cholecalciferol)(维生素D3) 、 4-羟基三苯氧胺 (4-hydroxytamoxifen)、 #_黑素(melatonin)、美服培酮(Mifepristone)、雷洛昔 芬(Raloxifene)、 trans-retinal (维生素A醛)、视黄酸(retinoic acid)、维生素A 酸、9-顺式-视黄酸、13-顺式-视黄酸、视黄醇(维生素A)、三苯氧胺和 troglitazone。示例性治疗剂还包括细胞毒性剂，例如蝶啶家族的药物、diyenes和鬼 臼毒素类(podophyllotoxins)。这些类别中尤其有用的成员包括例如，甲基蝶 呤、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物例如鬼臼亚乙苷或磷酸鬼 臼亚乙香、异长春碱(leurosidine)、长春地辛、环氧长春碱(leurosine)等。与本文的教导相容的再其它细胞毒素包括auristatin(例如auristatin E和 monomethylauristan E)、力口利车霍素(calicheamicin)、 4豆4干菌狀(gramicidin) D、 美登木树生物碱(maytansanoids)(例如美登素(maytansine))、新制癌菌素 (neocarzinostatin)、拓朴替康(topotecan )、 taxanes、纟田月包松弛素B、溴化乙 口定、吐才艮械(emetine)、 tenoposide、 4火水仙素、dihydroxy anthracindione、 米 托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、 普萘洛尔(Propranolol)、噪呤霉素(puromycin)和它们的类似物或同系物。其它类型的功能性部分是本领域已知的，可以根据本文的教导容易地 用于本发明方法和组合物中。
b)用于连接功能性部分和氨基酸侧链的化学用于连接前述功能性部分(它们可以是小分子、核酸、聚合物、肽、蛋 白质、化疗剂或其它类型的分子)与特定氨基酸侧链的化学是本领域已知的 (对于特定接头的详细综述，见例如，Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996》。本领域已知的用于巯基部分(例如半胱氨酸、或硫基側链化学)的连接基 团的例子包括但不限于，活化的酰基基团(例如，a-卣代乙酸酯、氯乙酸或 氯乙酰胺)、活化的烷基基团、Michael受体如马来酰亚胺或丙烯酸基团、通 过氧化还原反应与巯基部分反应的基团、和活化的二硫化物基团。巯基部 分也可以通过与溴三氟丙酮、a-溴-p-(5-咪唑基(imidozoyl))-丙酸、氯乙酰基 磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、曱基-2-吡啶基二 硫化物、对氯汞苯曱酸酯、2-氯汞-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2-恶-1,3-二口坐。在一个优选实施方案中，半胱氨酸或具有疏基侧链化学的其它氨基酸 在含有Fc的多肽的制备过程中或在之后连接。例如，在使用细胞培养物制 备修饰的含Fc的多肽时，提供条件以便溶液中的游离半胱氨酸能够与含有 Fc的多肽的巯基侧链形成半胱氨酸加合物。由此形成的加合物可以用于抑 制糖基化和/或效应子功能，或者，随后置于还原条件下以除去加合物并由 此允许使用上述巯基化学物质之一。本领域已知的用于羟基部分(例如，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸侧链化学) 的连接基团的例子包括以上针对巯基部分所描述的那些，包括活化的酰基 基团、活化的烷基基团和Michael受体。本领域已知的用于氨基部分(例如，天冬酰胺或精氨酸侧链化学)的连接 基团的例子包括但不限于N-琥珀酰亚氨基、N-磺基琥珀酰亚氨基、N-邻苯 二曱酰亚氨基(phthalimidyl)、 N-磺基邻苯二曱酰亚氨基、2-硝基苯基、4-硝 基苯基、2,4-二硝基苯基、3-磺酰基-4-硝基苯基、3-羧基-4-硝基苯基、亚氨 酸酯(例如，吡啶甲酰亚氨酸曱基酯)、磷酸吡嗜醛、吡,醛、氯氬硼化物 (chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-曱基异脲和2，4-戊二酮。本领域已知的用于酸性部分(例如，天冬氨酸或谷氨酸侧链化学)的连接 基团的例子包括活化的酯和活化的羰基。酸性部分也可以选择性地通过与 碳二亚胺(R，N-C-N-R，)例如l-环己基-3-[2-吗啉基-(4-乙基)]碳二亚胺或1-乙
基-3-(4-氮嗡杂-4,4-二曱基戊基)碳二亚胺。当期望的功能性部分是PEG化部分时，可以使用本领域熟知的PEG化 反应。例如， 一个方法中，通过与反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水 溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应，实现PEG化。用于PEG化本发明 抗体和抗体片段的水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)。另一实施方案中，用于 PEG化的聚合物是聚乙二醇-马来酰亚胺(即，PEG-马来酰亚胺)。制备本发明的PEG化的抗体或抗体片段的方法一般包括步骤a)使抗 体或抗体片段与聚乙二醇，例如PEG的反应性酯或醛衍生物，在可以造成 抗体或抗体片段结合一个或多个PEG基团的条件下反应，和b)获得反应产 物。本领域技术人员将明了如何基于已知参数和期望结果选择最佳反应条 件或酰化反应。 一个实施方案中，可以靶向特定氨基酸残基，例如改变第 一氨基酸残基以便抑制第二氨基酸残基的糖基化(优选在第一氨基酸是半 胱氨酸和具有巯基化学的情况下)。IX.预防、i貪断和治疗方法当本发明改变的多肽(例如抗体或融合蛋白)与细胞表面抗原结合并且 该结合激起必需的效应子应答时，本发明具有通常的用途。效应子介导的 应答的一个例子是降低病症的根本原因(例如，消除肿瘤细胞或参与免疫或 炎症反应的抗原携带细胞)。另一实施方案中，可以减少病症的一个或多个 症状。另一实施方案中，本文所述组合物可以用于诊断试剂(例如，用于肿 瘤成像的抗体)中以改变效应子介导的应答。本文所述的方法可以用于有发 生疾病的危险的受试者或者目前表现出疾病病症的受试者。A.抗肿瘤治疗因此，某些实施方案中，本发明改变的多肽可用于预防或治疗癌症。 一个实施方案中，改变的多肽阻断自分泌或旁分泌生长(例如，通过和受体 结合而不转导信号，或通过和生长因子结合)。在优选实施方案中，改变的 多肽能够与肿瘤相关抗原结合。一个实施方案中，改变的多肽可以减小肿瘤体积、抑制胂瘤生长和/或 延长携带肿瘤的动物的存活时间。 一般地，本发明可以用于预防或治疗任 何包含如下抗原标志的赘生物，所述抗原标志允许修饰的抗体靶向癌细胞。 可以预防或治疗的示例性癌症或瘤形成包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、头
颈癌、前列腺癌、结肠-直肠癌、黑素瘤或皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈 癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌(例如小细胞和非鳞状细胞癌)、胰腺癌和多发性骨髓瘤。
更特别地，本发明修饰的抗体可以用于治疗Kaposi肉瘤、CNS 瘤形成(毛细血管性成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移癌)、黑素瘤、胃肠道的 和肾的肉瘤、横紋肌肉瘤、成神经胶质细胞瘤(优选地多形性成神经胶质细 胞瘤)、平滑肌肉瘤、成视网膜细胞瘤、卵巢的乳头状囊腺癌、Wilm氏肿瘤 或小细胞肺癌。可以理解，鉴于本发明公开，无需过度实验即可以针对与 前述瘤形成有关的肺瘤相关抗原，衍生出适当的起始多肽。适于使用本发明治疗的血液癌症的例子包括何杰金氏和非何杰金氏淋 巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病(Burkitt，s type leukemia))、 慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和单核细胞性白血病。可以理解，本发明改变 的多肽和方法尤其可以有效地治疗各种B细胞淋巴瘤，包括低级/滤泡性非 何杰金氏淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、扩散性 大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)型NHL、中级/滤泡性NHL、中级扩 散性NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无裂细胞 性NHL 、巨大肿块(bulky disease) NHL和Waldenstrom氏巨球蛋白血症。本 领域技术人员应当明了，这些淋巴瘤由于正在变化的分类系统而常常具有 不同的名称，而且，患有分类于不同名称下的淋巴瘤的患者也可以得益于 本发明的联合治疗方案。除了上述瘤形成病症，可以理解本发明还可以有 利地用于治疗带有相容的肿瘤相关抗原的其它恶性肿瘤。
B.免疫疾病治疗除了肿瘤病症外，本发明改变的多肽在治疗自身免疫病或异常免疫应 答方面也尤其有效。在此方面，可以明了，本发明改变的多肽可以用于控 制、阻抑、调节或消除对外部抗原和自身抗原的不期望的免疫应答。例如， 一个实施方案中，抗原是自身抗原。另一实施方案中，抗原是变应原。在 其它实施方案中，抗原是同种抗原或异种抗原。本发明公开的修饰多肽在例如以抑制移植受体对供体移植物例如组织或器官移植物或骨髓移植物的 排斥。此外，抑制或消除骨髓移植物中的供体T细胞也可以用于抑制移植 物4元宿主疾病。 在其它实施方案中，本发明改变的多肽可以用于治疗免疫病症，包括但不限于，变应性支气管肺曲霉病；变应性鼻炎；自身免疫性溶血性贫血； 棘皮症；过敏性接触性皮炎；Addison氏病；特应性皮炎；斑壳(alopecia areata); 普壳(alopecia universalis );;定4分4犬蛋白病(amyloidosis); 过敏'l"生紫 癜(anaphylactoid purpura);类过敏反应(Anaphylactoid reaction);再生P章碍'l"生 贫血(aplastic anemia);遗传性血管性水肿(angioedema);特发性血管性水肿； 强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis );颅动乐h炎(cranial arteritis ); 巨细 胞性动脉炎(giant cell arteritis); Takyayasu氏动脉炎；颞动脉炎(temporal arteritis);哮喘；毛细血管扩张-运动共济失调症(ataxia-telangiectasia);自身 免疫性卯巢炎(autoimmune oophoritis); 自身免疫性睾丸炎(autoimmune orchitis); 自身免疫性多内分泌衰竭(autoimmune polyendocrine failure); Behcet氏病；Berger氏病；Buerger氏病；支气管炎；大疱性天疱痴(bullous pemphigus);慢性皮肤粘膜念珠菌病(chronic mucocutaneous candidiasis ); Caplan氏综合症；心肌梗塞后综合征(post-myocardial infarction syndrome); 心包切开术后综合征(post-pericardiotomy syndrome); 心脏炎(carditis); 口炎 性腹泻(celiac sprue); Chagas氏病；Chediak-Higashi综合4正；Churg-Strauss 病；肝硬变(Cirrhosis); Cogan氏综合征；冷凝集素病(cold agglutinin disease); CREST综合征；Crohn氏病；冷球蛋白血症(cryoglobulinemia);隐源性致纤 维化肺泡炎(Cryptogenic Fibrosing Alveolitis), 疱渗样皮炎(dermatitis herpetifomis); 皮肌炎(dermatomyositis); 糖尿病；Diamond- Blackfan综合 征；DiGeorge综合征；盘状红斑狼掩(discoid lupus eryt hematosus);嗜酸性 筋膜炎(eosinophilic fasciitis);巩膜外层炎(episcleritis);持久隆起性红斑 (Drythema elevatum diutinum);边缘性红斑(erythema marginatum); 多形红斑 (erythema multiforme); 结节性红斑(erythema nodosum); 家族性地中海热 (Familial Mediterranean fever ); Felty 氏综合征；肺纤维化(fibrosis pulmonary); 过敏样肾'J 、球性肾炎(glomerulonephritis， anaphylactoid); 自身 免疫性肾小球肾炎；链球菌感染后肾小球肾炎(post-streptococcal glomerulonephritis);移植后肾、球肾炎；膜性肾小球病(glomerulopathy, membranous); Goodpasture氏综合征；免疫介导的粒性白细月包减少症 (granulocytopenia, immune-mediated);环状肉芽月中(granuloma annulare);变应 性肉芽月中病(granulomatosis, allergic);肉芽月中性肌炎(granulomatous myositis); Grave氏病；桥本曱状腺炎(Hashimoto's Thyroiditis);新生儿溶血病；特发性 血色病(hemochromatosis， idiopathic); Henoch-Schoenlein紫癜；慢性活动性 和慢性进行性肝炎；组织细胞增生症X(histiocytosisX);嗜酸细胞增多综合 征(hypereosinophilic syndrome); 特发性血小板减少性紫疯(idiopathic thrombocytopenic purpura); Job 氏综合征；幼年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis); 幼年型类风湿关节炎(juvenile rheumatoid arthritis)(幼年型 慢性关节炎)；Kawasaki氏病；角膜炎(keratitis);干燥性角膜结膜炎 (keratoconjunctivitis sicca); Landry-Guilain-Barre-Strohl纟宗合征；瘤型麻风 (Leprosy, lepromatous); Loeffler氏综合征；狼掩；狼痴肾炎(lupus nephritis); Lyell氏综合征；Lyme氏疏螺旋体病(Lyme disease);淋巴瘤样肉芽肿病 (lymphomatoid granulomatosis); 全身性月巴大细月包增生症(mastocytosis, systemic);混合性结締组织病(mixed connective tissue disease ); 多发性单 一神经炎(Mononeuritis multiplex); Muckle-Wells综合征；粘膜皮肤淋巴结 综合征(mucocutaneous lymph node syndrome); 粘膜皮狭淋巴结综合征；多 中心性网状组织细胞增生症(multicentric reticulohistiocytosis );多发性硬化 (Multiple sclerosis); 重症肌无力(myasthenia gravis); 覃样肉芽肿病(mycosis fungoides); 全身性坏死性血管炎(necrotizing vasculitis, systemic); 肾病综合 征(nephrotic syndrome);重叠综合征(overlap syndrome);脂膜炎(panniculitis); 阵发性寒冷性血红蛋白尿症(paroxysmal cold hemoglobinuria);阵发性睡眠性 血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria);类天疱瘙(pemphigoid); 天疱齊(pemphigus);红斑性天疱齊(pemphigus erythematosus); 落叶'f生天疱 痴(pemphigus foliaceus);寻常性天疱痴(pemphigus vulgaris);饲鴒者病(pigeon breeder's disease); 过敏性肺炎(Hypersensitivity Pneumonitis); 结节性多动脉 炎(polyarteritis nodosa); 风湿性多肌痛(Polymyalgia rheumatica); 多肌炎 (polymyositis);特发性多发性神经炎(polyneuritis， idiopathic);葡萄牙型家族 性多发性神经病(Portuguese familial polyneuropathy); 先兆子痫/子痫 (pre-eclampsia/eclampsia); 原发性胆汁性肝石更变(Primary biliary cirrhosis ); 进行性全身性硬化(硬皮病)；银屑病；银屑病性关节炎；肺泡蛋白沉着症 (pulmonary alveolar proteinosis); 肺纤维化(pulmonary fibrosis), Raynaud氏 现象/综合征；Reidel氏曱状腺炎；Reiter氏综合征，复发性多软骨炎(relapsing polychrondritis); 风湿热(rheumatic fever); 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis); 结节病(Sarcoidosis); -凡膜炎(scleritis);石更4匕'f生胆管炎(sclerosing cholangitis); 硬皮病(scleroderma),血清病(serum sickness); Sezary综合征； Sjogren氏综合征；Stevens-Johnson综合征；Still氏病；亚急性硬化性全脑 炎(subacute sclerosing panencephalitis); 交感性目艮炎(sympathetic ophthalmia); 全身性红斑狼疮；移植排斥；溃疡性结肠炎(ulcerative colitis);未分化结締 纟且织病(undifferentiated connective tissue disease);十曼'f生荨麻症(urticaria, chronic); 冷激性荨麻渗(urticaria， cold);目艮色素层炎(uveitise);白癜风 (vitiligo); Weber-Christian病；Wegener氏肉芽月中；和Wiskott-Aldrich综合 征。
C抗炎治疗
在再其它实施方案中，本发明的改变的多肽可以用于治疗因炎症而引 起的(至少部分地)或恶化的炎性病症，例如增加的血流、水肿、免疫细胞的 活化(例如增生、细胞因子产生或增强的吞噬作用)。示例性炎性病症包括其 中涉及炎性因子(例如，基质金属蛋白酶(MMP)、 一氧化氮(NO)、 TNF、白 介素、血浆蛋白；细胞防御系统、细胞因子、脂质代谢物、蛋白酶、毒性 自由基、线粒体、细胞凋亡、粘附分子等)或炎性因子以异常数量(例如， 可以有利地改变例如有益于受试者的量)存在于给定区域或组织中的那些 病症。发炎过程是活组织对损伤的应答。炎症的原因可以是由于物理损伤、 化学物质、微生物、组织坏死、癌症或其它因素。急性炎症持续时间短， 仅仅持续数天。然而，如果其持续较长时间，则可以称作慢性炎症。
炎性病症包括急性炎性病症、慢性炎性病症、和复发性炎性病症。急性炎性病症一般具有相对短的持续期，并且持续大约数分钟至大约1到2天，但它们也可以持续几周。急性炎性病症的主要特征包括增加的血流、体液和血浆蛋白渗出(水肺)以及白细胞如嗜中性粒细胞渗出。慢性炎性病症一般有较长的持续期，例如数周至数月至数年或甚至更长，并且在组织学 上其与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结締组织的增生有关。复发性炎性病症包括在一段时间后复发的或周期性发作的病症。复发性炎性病 症的例子包括哞喘和多发性硬化。 一些病症可以落入一种或多种分类中。
炎性病症一般的特征在于发热、潮红、肿大、疼痛和丧失功能。炎性 病症的示例性原因包括但不限于微生物感染(例如细菌、病毒和真菌感染)、
物理因素(例如，烧伤、辐射和创伤)、化学因素(例如，毒素和腐蚀性物质)、 组织坏死和各种类型的免疫反应。炎性病症的例子包括但不限于阿尔茨海默氏病；严重译喘，动脉粥样硬化，恶液质，CHF-缺血和冠脉再狭窄；骨 关节炎，类风湿性关节炎，纤维化/辐射诱导的或幼年型关节炎；急性和慢 性感染(细菌、病毒和真菌)；急性和慢性支气管炎，鼻窦炎(sinusitis)和其它 呼吸感染，包括感冒；急性和慢性肠胃炎和结肠炎及Crohn氏病；急性和 慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征；嚢性纤维化；急性和慢性皮 炎；银屑病；急性和慢性结膜炎；急性和慢性浆膜炎(心包炎、腹膜炎、滑 膜炎、胸膜炎和腱炎(tendinitis));尿毒症性心包炎；急性和慢性胆嚢炎；急 性和慢性阴道炎(vaginitis);中风，由创伤引起的脑或中枢神经系统的炎症， 和溃疡性结肠炎；急性和慢性眼色素层炎；药物反应；糖尿病性肾病，和 烧伤(热的、化学的和电的)。可以用本发明抗体或抗原结合片段治疗的其它 炎性病症或状况包括由于角膜移植、慢性阻塞性肺病、丙型肝炎、淋巴瘤、 多发性骨髓瘤和骨关节炎引起的炎症。
另一实施方案中，本发明多肽可以用于预防或治疗神经变性病，包括 但不限于，阿尔茨海默氏病、中风和创伤性脑或中枢神经系统损伤。其它 的神经变性病包括ALS/运动神经元病、糖尿病性外周神经病、糖尿病性视 网膜病、亨廷顿舞蹈病、黄斑变性和帕金森病。优选实施方案中，对FcRn 具有降低的结合亲和力的改变的多肽用于治疗神经系统疾病，因为它们不 能如同具有更高FcRn结合亲和力的多肽一样有效地跨过血脑屏障。例如， 一个实施方案中，将本发明改变的多肽注射入脑脊液中以治疗神经变性疾 病。
在预防性应用中，将包含本发明多肽的药物组合物或药物施用给有疾 病危险(或患有疾病但仍未显示出症状)的受试者，其中所述疾病是可以用具 有Fc区的多肽治疗的疾病，例如免疫系统病症，其中所述施用采用的量将 足以消除或减少所述危险、降低疾病的严重性、或延迟疾病的开始时间(其 中所述疾病包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及在 疾病发展过程中出现的中间病理表型)。
在治疗性应用中，将组合物或药物施用给已经患有此类疾病的受试者， 其中所述施用采用的量将足以治疗或至少部分地阻止疾病的症状(生物化学 的、组织学的和/或行为的)，包括其并发症以及在疾病发展过程中出现的中
间病理表型。本发明多肽尤其可用于调节存在于血液中的细胞表面抗原的或低生物学活性引起。'。 、一些方法中，施用药剂可以降低或消除免疫病症例如炎症。足以完成治疗或预防的量被定义为治疗或预防有效的剂量。在预防和治疗方案两者中，通常药剂分几个剂量施用直到实现足够的免疫应答。可以理解，基于对与本发明修饰多肽结合的靶分子的选择，本发明多肽可以用于治疗本文中未明确提及的许多病症。还可以意识到，任何本领域已知的抗体或融合蛋白均可以根据本发明方法加以修饰并用于治疗其适用的病症。D.施用方法本发明改变的多肽可以通过startingeral、局部、静脉内、口服、动脉内、 颅内、腹膜内或鼻内方式用于预防和/或治疗。术语startingeral在本文中用 于包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。最典型 的蛋白质药物施用途径是血管内、皮下或肌内，但其它途径也可能是有效 的。在一些方法中，将药剂直接注射入已经积累了沉积物的特定组织中， 例如颅内注射。 一些方法中，抗体以緩释组合物或装置(例如MedipadTM装 置)的形式施用。此蛋白质药物也可以通过呼吸道，例如使用干粉吸入装置 来施用。对于上述病症的治疗，本发明组合物的有效剂量随着许多不同因素而 变化，所述因素包括施用方式、靶位点、受试者的生理学状况、受试者是 人还是动物、施用的其它药物、和治疗是预防性的还是治疗性的。通常， 受试者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。对于用抗体进行被动免疫，剂量范围从大约0.0001至100mg/kg、更通 常是O.Ol至20mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是lmg/kg体重或10mg/kg 体重或在l-10mg/kg的范围内，优选地至少lmg/kg。可以每日、隔日、每 周、或根据任何其它通过经验性分析确定的方案，向受试者施用此剂量。 一个示例性疗法需要长期，例如至少6个月，多剂量施用。其它示例性治 疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用1次。示 例性剂量方案包括连续每日l-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种多肽同时施用，在此 情况下各多肽的施用剂量分别在所指明的范围内。通常多次施用多肽。两个单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。 一些方法中，调整剂量以达到l-1000|ig/ml的血浆抗体浓度，而一些方法中 调制以达到25-300吗/ml的血浆抗体浓度。或者，可以以緩释制剂的形式施 用抗体，在此情况下需要较低的施用频率。剂量和频率随着多肽在受试者 中的半衰期而变化。 一般地，人抗体显示出最长的半衰期，之后是人源化 抗体、嵌合抗体和非人抗体。如本文讨论的，半衰期也取决于改变的多肽 中存在的具体突变。施用剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预 防性应用中，含有本发明抗体或其鸡尾酒式混合物的组合物被施用给尚未 处于疾病状态的受试者以便增强受试者的抵抗力。该量被定义为"预防有效 剂量"。在此应用中，准确的剂量又取决于受试者的健康状况和一般免疫状 况，但是通常为0.1至25mg/剂，尤其是0.5至2.5mg/剂。可以以相对稀的 间隔长期施用相对低的剂量。 一些受试者可以在其剩余生命期中持续接受 治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例如， 大约1至200mg抗体/剂，更通常使用5-25mg剂量)，直到减緩或终止疾病 进程，优选地直到受试者显示出部分或完全的疾病症状改善。之后，患者 可以接受预防性施用方案。编码抗体的核酸的剂量范围是每个受试者大约10ng至lg、 100ng至 100mg、 l吗至10mg、或30-300吗DNA。感染性病毒载体的剂量变化范围 是10至100,或更多病毒体/剂。本领域技术人员能够通过常规实验确定改变的多肽用于治疗疾病目的 的有效无毒量。例如，修饰多肽的治疗有效量可以根据因素例如受试者的 疾病阶段(例如I期对IV期肿瘤)、年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑 制状况或疾病)和体重而变化。可以调制剂量方案以提供最佳的治疗反应。 例如，可以每日分几次施用，或者可以随着治疗情况的紧急性而按比例减 少剂量。E.对治疗的监测
可以 <吏用标准方法监测对患有疾病或病症的受试者的治疗。 一 些方法 需要在施用药剂剂量前测定基线值，例如受试者中抗体水平或抗体镨的基 线值，并将此与治疗后的镨或水平进行比较。该水平值或镨值的显著性增 加(即，高于重复测量相同样品的典型实验误差范围(表示为偏离这些测量的 平均值的一个标准差)表示阳性治疗结果(即，药剂的施用已经实现了期望的 反应)。如果针对免疫应答的值不发生显著性变化或减少，则指示阴性治疗 结果。在其它方法中，针对对照群体，确定对照水平值或镨值(即，平均值加 标准差)。典型地，对照群体中的个体未接受过在先治疗。然后比较施用治 疗剂后受试者的水平或镨的平均值和对照值。相对于对照值的显著性增加 (例如，高于偏离平均值的一个标准差)表明阳性或充分的治疗结果。缺乏显 著性增加或出现降低表明阴性或不充分的治疗结果。在所述水平相对于对 照值正在增加时， 一般持续药剂的施用。如前，相对于对照值，平台期的 到达指示可以停止治疗施用或减少治疗施用的剂量和/或频率。达到平台的个体组成的对照群体，确定对照水平值或语值(例如，平均值加 标准差)。将在受试者中测量到的水平值或谱值与该对照值比较。如果受试 者中测量到的值与对照值没有显著差异(例如大于1个标准差)，则可以停止 治疗。如果受试者的水平显著地低于对照值，则为药剂的继续施用提供了 正当理由。如果受试者的水平持续低于对照水平，则可能需要变化疗法。其它方法中，监测目前没有接受治疗但已经有过在先疗程的受试者的 多肽水平或语，以确定是否需要重新开始治疗。可以将在受试者中测量到 的水平或谱与受试者先前在在先疗程后达到的值进行比较。相对于先前测 量值的显著减少(即，高于重复测量相同样品的典型误差范围)指示可以恢复 治疗。或者，可以将受试者中测量到的值与如下对照值(平均值加标准差) 比较，所述对照值在由经历过疗程的受试者组成的群体中确定。或者，可 以将在受试者中测量到的值与在由经过预防性治疗的受试者(保持无疾病症 状)组成的群体或由经过治疗性治疗的受试者(表现出疾病特征的改善)组成 的群体中确定的对照值进行比较。在所有这些情况下，相对于对照值的显 著性减少(即，大于标准差)指示该受试者应当重新开始治疗。施用后的多肽谱典型地表现出立即的抗体浓度峰和之后的指数式衰 减。不再给药的情况下，取决于所用抗体的半衰期，衰减将在数日至数月内趋近治疗前水平。例如， 一些人抗体的半衰期是大约20天。一些方法中，在施用前在受试者中针对给定抗原对多肽进行基线测量， 施用后很快进行第二测量以确定多肽峰水平，并定期地再进行一次或多次 测量以监测多肽水平的衰减。当多肽水平下降到基线或扣除基线后峰的预 定的百分数(例如，50%、 25%或10%)时，给予多肽的再一剂量。 一些方法 中，将扣除背景后的峰或随后测量水平与参考水平进行比较，所述参考水 平在先在其它受试者中确定以形成有益的预防或治疗方案。如果所测量到 的多肽水平显著低于参考水平(例如，低于得益于治疗的受试者群体中的参 考值的平均值减去一个标准差)，则说明需要再一剂量的多肽施用。其它方法包括在疗程中监测任何本领域认可的、被研究者或医师常规 用于诊断或监测疾病的生理学症状(例如，身体的或精神的症状)。F.联合治疗本发明改变的多肽可以任选地与已知或被确定可以有效地治疗需要治 疗(例如预防性或治疗性)的病症或疾病的其它药齐'J(包括以上VIII部分的任 何药剂)联合施用。此外，本发明多肽还可以和向多肽添加功能的部分(例如 PEG、标签、药物或标记物)缀合。还可以理解，本发明改变的多肽可以和任何能够体内消化、减少、抑 制或控制瘤形成细胞生长的化疗剂(一种或多种)组合或联合使用(例如，以 提供联合治疗方案)。与本发明相容的示例性化疗剂包括烷化剂、长春花生 物碱(例如，长春花新碱、长春花碱)、曱基千肼(procarbazine)、氨基蝶呤和 强的松。四药物联合MOPP(mechlethamine(氮芥)、长春花新碱(Oncovin )、 甲基苄肼和强的松)可以非常有效地治疗各种类型的淋巴瘤，并包含本发明 的优选实施方案。在MOPP的耐药性患者中，可以使用ABVD(例如，阿霉 素、博来霉素、长春花新碱和达卡巴嗪(Dacarbazine))、 ChlVPP(苯丁酸氮芥、 长春花新碱、曱基卡肼和强的松)、CABS (环己亚硝脲、阿霉素(doxorubicin)、 博来霉素和链脲霉素(Streptozotocin ))、 MOPP加ABVD、 MOPP加ABV (阿 霉素、博来霉素和长春花新碱)或BCVPP (亚硝基脲氮芥、环磷酰胺、长春 花新碱、甲基千肼和强的松)联合。对于标准给药剂量和进度，可参见Arnold S, Freedman和Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas,《Harrison's Principles of
Internal Medicine》1774-1788 (Kurt J. Isselbacher等，eds.， 13th ed. 1994)以及 V. T. DeVita等，(1997)和其中引用的参考文献。这些疗法可以不经变化或根 据具体患者按照需要经过变化后与本文所述一种或多种本发明修饰多肽联 合使用。可用于本发明的其它治疗方案包括使用单独烷化剂例如环磷酰胺或苯 丁酸氮芥、或药物联合如CVP (环磷酰胺、长春花新碱和强的松)、CHOP (CVP和阿霉素)、C-MOPP(环磷酰胺、长春花新碱、强的松和曱基卡肼)、 CAP-BOP (CHOP加曱基千肼和博来霉素)、m-BACOD (CHOP加氨曱蝶呤、 博来霉素和曱酰四氢叶酸(leucovorin ) )、 ProMACE-MOPP (强的松、氨曱 蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、鬼臼亚乙苷和曱酰四氢叶酸加标准MOPP)、 ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、鬼臼亚乙苦、阿糖胞苷、 博来霉素、长春花新碱、氨曱蝶呤和曱酰四氬叶酸)以及MACOP-B(氨曱蝶 呤、阿霉素、环磷酰胺、长春花新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和曱 酰四氢叶酸)。本领域技术人员能够容易地确定用于这些方案之每一个的标 准剂量和进度。CHOP也已经与博来霉素、氨曱蝶呤、曱基卡肼、氮芥、胞 嘧啶阿拉伯糖苷和鬼臼亚乙苷联合。其它相容的化疗剂包括但不限于2-氯 脱氧腺苷(2-CDA)、 2，-脱氧助间型霉素(Deoxycoformycin )和氟达拉滨。对于不能实现疾病缓解或复发的中级和高级NHL患者，使用救援治疗 (salvage treatment )。救援治疗使用药物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡铂、 顺铂、鬼臼亚乙苷和异环磷酰胺(单独地或联合地给予)。在复发的或侵袭 性的某些肿瘤病症中，常常使用以下方案IMVP-16(异环磷酰胺、氨曱蝶 呤和鬼臼亚乙苷)、MIME(曱基-gag、异环磷酰胺、氨曱蝶呤和鬼臼亚乙苷)、 DHAP (地塞米松(dexamethasone)、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP (鬼臼 亚乙苷、曱基强的松龙(methylpredisolone)、 HD阿糖胞苷、顺粕)、CEPP(B) (环磷酰胺、鬼臼亚乙苷、曱基千肼、强的松和博来霉素)和CAMP (环己亚 硝脲、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)(每个均有熟知的给药速率和进度)。可以与本发明修饰多肽联合使用的化疗剂的量可以随着受试者而变 化，或者可以根据本领域熟知的方法施用。见例如，Bruce A Chabner等， Antineoplastic Agents, 《Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Thempeutics》1233-1287 ((Joel G, Hardman等，eds.， 9th ed. 1996)。尽管可以如本文所述施用修饰的多肽，但必需强调的是，在其它实施
方案中，可以将修饰的多肽施用于健康患者作为一线治疗。在此实施方案 中，可以向具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或向已经没有、现有没有 或正在没有正常或平均红骨髓储备的患者，施用本发明修饰多肽。如本文中所用，修饰多肽与辅助疗法的联合或组合施用意味着相继的(sequential)、 同时的(simutaneous)、 延及同时间的(coextensive)、 同时存在的(concurrent)、 伴随的(concomitant)、或同一时期的(contemporaneous)施用或应用所述疗法 和本发明公开的抗体。本领域技术人员明了，可以安排联合治疗方案中各 成分的施用或应用时间以增强治疗的整体效力。例如，可以按标准的熟知 疗程施用化疗剂，之后在数周内施用本发明的放射免疫缀合物。反过来， 可以静脉内施用与修饰多肽结合的细胞毒素，之后进行定位于肿瘤的外部 成束辐射。在再其它实施方案中，修饰多肽可以与一种或多种选定的治疗 剂在一次门诊中同时施用。本领域技术人员(例如有经验的肿瘤学者)基于选 定的辅助治疗和本说明的教导，无需过度实验能够容易地鉴别有效的联合 治疗方案。在此方面，可以理解，修饰多肽和化疗剂的联合可以以任何顺序并在 向患者提供治疗益处的任何时间框架内施用。即，化疗剂和修饰多肽可以 以任何顺序或同时施用。在选定的实施方案中，本发明修饰多肽向之前已 经进行过化疗的患者施用。在其它实施方案中，修饰多肽和化疗基本上同 时或并行地施用。例如，可以给予正在经历化疗疗程的患者修饰抗体。在 优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的1年内施用修饰抗体。在其它优 选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的10、 8、 6、 4或2个月内施用修饰 多肽。在再其它优选实施方案中，在任何化疗剂或治疗的4、 3、 2、或l周 内施用修饰多肽。在再其它优选实施方案中，在选定的化疗剂或治疗的5、 4、 3、 2或1天内施用修饰多肽。还可以理解，两种药剂或治疗可以在大约 数小时或数分钟内(即，基本上同时地)施用。IX.药物组合物本发明药物组合物在可药用载体中包括至少一种通过本文所述方法制 备的含有Fc的修饰多肽。"可药用载体，，指正常用于活性成分给药的药物制 品中的至少一种成分。同样地，载体可以含有本领域使用的任何药物赋形 剂和任何形式的用于给药的赋形药。组合物可以例如是注射溶液、水性悬 浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、固体和液体口力良制剂、油膏剂(salve)、 凝月交、软膏(ointment)、透皮贴剂(intradermal patch)、霜剂、洗剂、片剂、月交 嚢、緩释制剂等。其它赋形剂可以包括例如着色剂、味道掩蔽剂、溶解助 剂、悬浮剂、压缩剂(compressing agent)、肠衣、緩释助剂等。本发明药剂常常以包含活性治疗剂和各种其它可药用成分的药物组合 物形式施用。见Remington's Pharmaceutical Science (15th ed.， Mack Publishing Company, Eastern, Pennsylvania (1980))。优选的形式取决于期望的施用和治 疗应用的方式。组合物还可以根据期望的制剂，包括可药用的无毒栽体或 稀释剂(被定义为通常用于配制向动物或人类给药的药物组合物的赋形 药)。可以选择稀释剂以不影响该组合的生物学活性。此类稀释剂的例子是 蒸馏水、生理磷酸緩冲盐水、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液、和Hank氏溶液。 此外，药物组合物或制剂还可以包括其它载体、辅药、或无毒性非治疗性 无免疫原性稳定剂等。可以以储库型注射(depost injection)或植入制剂的形式施用多肽，所述 制剂可以按允许緩释活性成分的方式配制。 一个示例性组合物包含配制在 水性緩沖液(由50mML-组氨酸、150mMNaCl组成，用HCl调节至pH6.0) 中的5mg/mL多肽。 一个示例性通用制剂緩冲液是20mM柠檬酸钠，pH 6.0、 10 %蔗糖、0.1 % Tween 80。典型地，将组合物制备成液体溶液或悬浮液形式的注射剂；也可以制 备适用于在注射前溶解或悬浮在液体赋形药中的固体形式。制剂也可以乳 化或包封在脂质体或微粒如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中用于增强的 佐剂效果(见以上讨论)(见Langer, Science 249:1527， 1990和Hanes， Advanced Drug Delivery Reviews 28:97， 1997)。本发明进一步通过一些实施例举例说明，这些实施例不应理解为限制 性的。在整个本申请以及附图和序列表中应用的所有参考文献、专利和出 版的专利申请的内容均特此并入作为参考。实施例实施例I -制备具有嵌合Fc区的改变抗体为了评价人兔IgG嵌合构建体的结合，首先将可能影响结合的氨基酸 确定为在这两个相互作用的蛋白质之间的相互作用界面的IOA以内。基于
大鼠IgG2a和大鼠FcRn的晶体结构，确定大鼠IgG2aFc上位于这两个分子 的界面的IOA之内的氨基酸。然后兔IgGl Fc和大鼠IgGl Fc区的同源性比 对允许确定兔Fc区上哪些氨基酸可能在相互作用界面的IOA之内。然后确 定大鼠和人Fc区的对应物。然后构建嵌合分子，包括在10A界面内的所有 突变体。然后将各单个氨基酸单独替代入hFc中，分析以确定所述各单个 成分氨基酸对结合的贡献。然后利用显示出增强的hFcRn结合的分子，构 建氨基酸突变体的组合。以此方式，仅鉴定结合的阳性贡献者。使用Biacore，分析各突变体的亲和力，将显示出25%或更佳的亲和力 增加的分子评定为阳性结果。试验在pH6进行。通过本领域普通技术人员已知的标准技术，在293细胞中瞬时表达突 变抗体。所表达的蛋白质含有X型人F(ab)，其可以容易地使用蛋白L纯化。 该抗体与动物中不表达的表位具有反应性(pK有待测定)。通过ELISA，使 用与可变区有反应性的抗原，并用抗人H&L HRP (辣根过氧化物酶)二抗检 测，以实现在血液中该mAb的检测。这些试验和动物模型可以由本领域普 通技术人员容易地建立。在Biacore上测量了兔IgGl对可溶性单体hFcRn的Kd。在相同芯片上 将该值与针对人IgGl确定的Kd进行比较。这些实验中，IgG固定在芯片 的不同象限上，并且可以确定Kd值的直接比较结果。购买蛋白质并在使用 之前通过SDS PAGE和分析性凝胶过滤验证蛋白质纯度。完成了兔IgGl和人IgGl的序列比对，并且已经鉴定了从大鼠 IgG2a/rFcRn晶体结构确定的位于人和兔IgG界面IOA内的序列。确定人抗体和IgG融合蛋白的IgG恒定区中增加抗体半衰期的具体氨 基酸替代。本发明突变具体来自于兔IgGl恒定区(rFc)和hlgGl恒定区(hFc) 之间的嵌合蛋白构建体。然后，通过测量hFcRn与突变的hFc区的结合亲和力，确定这些变化 带来的影响，并与天然hFc进行比较，h/rFc嵌合体显示出对hFcRn更大的 亲和力。然后在猴或其它适当模型例如基因楔入(knock-in)或转基因hFcRn 小鼠中，确定这些分子的体内半衰期，以证实嵌合蛋白相对于天然hFc具 有增加的半衰期。结果已经获得了 Biacore数据，其中hFcRn显示出对于兔IgG与hFcRn 的结合比hlgG紧密两倍的Kd值。用于替代的残基的例子包括EU位置
280， 281, 282, 283， 285， 286, 288， 289， 290， 305， 307， 308, 309， 315， 340， 344， 和378。更特别地，本发明多肽可以含有选自下组的至少一个氨基酸突变 Asp280Asn (其中D表示在所述EU位置(278)待被突变(通过替代)的氨基酸 位置，N表示为实现改变的多肽待通过替代进入该位置的氨基酸)， Gly281Glu， Val282Glu， Glu283Gln， His285Arg, Asn286Thr， Lys288Arg， Thr289Pro， Lys290Pro， VaB05Thr, Thr307Pro， Val308Ile， Leu309Thr, Asn3153Arg， Lys340Arg, Arg344Leu, Ala378Ser， Ser383Lys， Glu386Lys， Pro387Ala，和Asn389Asp (根据EU编号系统)。实施例2 -通过静电优化鉴定候选残基在本实施例中，描述用于修饰抗体恒定区对人FcRn的亲和力的方法。 为了获得在酸性pH和中性pH时Fc区对FcRn具有改变的结合亲和力的突 变体，我们将静电电荷优化技术应用于与人FcRii结合的人Fc的同源物模 型。在酸性(6.0) pH和中性(7.4) pH时的人Fc/FcRn复合体的模型使用 MODELLER程序(Accelrys， Inc., San Diego, CA)由大鼠Fc/FcRn复合体的晶 体结构(PDB代码111A)衍生，并在CHARMM (Accelrys， Inc., San Diego, CA) 中进行了能量最小化。在计算性优化过程中，我们使用静电荷优化以确定 可以调节酸性pH和中性pH时Fc和FcRn的结合的Fc残基的位置(Lee和 Tidor, J. Chem. Phys. 106: 8681-8690， 1997; Kangas和Tidor, J. Chem. Phys. 109:7522-7545,1998)。在两个pH值，酸性(6.0) pH和中性(7.4) pH时完成 这些计算，因为已知Fc于酸性pH时在胞々欠液泡中结合FcRn并在中性pH 时在细胞外间隙释放。中性pH时Fc对FcRn的增强结合有可能损害Fc的 半衰期。如果在典型的IgG清除机制中IgG不能自细胞结合的FcRn释放， 则半衰期的减少将是预期的结果。因此，在较高pH对FcRn具有增加的亲 和力的含Fc蛋白将从血液中清除，导致蛋白质具有较短半衰期。可以将这些突变预测分成涉及(1)在结合时变得部分隐蔽的相互作用 界面所涉及的残基处进行的突变(通过跨界面形成氢键，改善相互作用)；(2) 抗体上的如下极性残基的突变，所述极性残基在结合时变得隐蔽并由此为 去溶剂化而付出代价但不与FcRn形成任何直接静电相互作用(通常通过突 变成与野生型残基具有相似形状的疏水性残基或者通过添加能够造成有利 的静电相互作用的残基，以获得改善)；和(3)Fc上的如下表面残基的突变，
所述表面残基存在于非互补电势的区域中。i人为这些突变可以改善Fc和 FcRn间的远程静电相互作用而不扰乱结合界面的堆积相互作用，且包括保 留和改变分子电荷的两种突变。在进行电荷优化时，设置各种限制以代表天然側链特征。例如，对于-1， 0，和+1的净侧链电荷，优化时附加限制条件一没有一个原子的电荷超过 0.85电子电荷单位的绝对值。使用以程序CHARMM (Accelrys, Inc. San Diego，CA)添加氬的标准方案，制备了模型。除了 (32-微球蛋白链的N端外， 将N-乙酰胺和N-甲酰胺补缀物(patch)分别加至N端和C端。分开制备用于 酸性pH和中性pH值的模型，以说明组氨酸残基的不同质子化和旋转异构 状态以及天冬酰胺和谷氨酰胺的旋转异构状态。使用连续静电模型 (continnum electrostatics model),我们对Fc中在酸性pH和中性pH值时位 于FcRn界面的15A内的氨基酸(候选残基)的每个侧链进行了静电电荷优 化。基于电荷优化的结果，确定了用于其它计算分析的突变。在该过程中， 我们目视检查了最佳的电荷分布并设计了比目前残基更接近最佳状况的突 变。电荷优化在原子中心给出电荷，但是不产生真实突变。在加上各种限 制条件以代表天然側链特征的情况下，进行了一轮电荷优化。例如，利用 附加限制条件——无原子的电荷超过0.85电子电荷单位的绝对值，针对-1, 0 和+ l的净侧链电荷，进行了优化。仅仅选择如下位置，在所述理想电荷分 布处的替代可以在中性pH和酸性pH之间产生不少于0.3kcal/摩尔的人 FcRn结合差异。分析现有侧链上的理想电荷分布，并提出了一套来自20 种天然氨基酸的替代。以下实例显示了针对Fc分子的缬氨酸284、组氨酸285、天冬酰胺286 和赖氨酸290(选定残基的实例)得到的优化结果。Mut (突变能量)栏相应于 从天然残基到完全不带电荷的侧链电子等排物(即，具有相同形状但在原子 上没有电荷或有部分电荷的残基)的结合自由能差(kcal/mo1)。负数指示预测 的结合亲和力增加。Opt-l栏相应于以侧链中最佳的电荷分布和-1的净侧链 电荷能够得到的结合自由能差。栏Opt0和Optl分别相应于在净电荷为0 和+1时具有最佳电荷的结合自由能差。对于酸性pH，获得了如下结果 残基 Mut Opt-l Opt0 OptlV284 0.0 -0.9 -0.3 0.5 H285 -0.6-2.0-1.6陽l.l腦6 0.0-1.1-0.21.1K290 -0.7-0.8-0.9-0.8对于中性pH,获得了如下结果残基 MutOpt-lOptOOptlV284 0.0-0.2-0.3-0.3H285 0.1-0.2-0.10.2N286 0.1-0.3-0.3-0.3K290 -0.20.1-0.3-0.3基于这些结果和对模型的目视分析，提出了能够利用这些结合自由能 改善的向谷氨酸的转变。事实上，对于所有位置，通过将野生型氨基酸突人FcRn结合差异。通过在CHARMM中进行旋转异构体二面角扫描，使用30或60度的 二面角角度增量，建立突变侧链，以确定每一个侧链的最理想的位置。然 后使用Poisson-Boltzmann静电能量和用于范德瓦尔氏能量和隐蔽表面面积 的额外项，计算野生型和突变复合体的结合能。使用PARSE或CHARMM的氨基酸电荷设定，在酸性pH和中性pH时 进行计算。使用一致评分方案，意味着使用两种电荷设定获得的结果应具 有相符的预示，以便产生有意义的预测。以下实例说明该方法在Fc分子的缬氨酸284、组氨酸285、天冬酰胺 286和赖氨酸288上的使用残基编号突变G6.0 parseG7.4 parseGg.O charmmG7.4 charmmV284E-1.70.7-1.4-0.3H285E-2.50.4-2.3-1.2N286E-0.41.2-1.5-0.7K290E-0.9-0.4-1.80.7在酸性pH时，人Fc和人FcRn的结合相对于野生型Fc和FcRn的结合, AAG在两种电荷设定下均低于-0.3kcal/mo1，说明相对于野生型人Fc而言亲
和力增加。在中性pH时，在两种电荷设定下AAG具有不同的预示，说明 突变体不可能在中性pH时比野生型人Fc具有更高的人FcRn结合亲和力 (在一致评分方案的内容中)。因此，预计V284E、 H285E、 N286E和K290E的半衰期。'、 、总之，我们执行了上述计算方法以预测可以在中性和酸性pH值下差异 地调节Fc分子的FcRn结合亲和力的突变。我们提出，在人Fc中可以导致 酸性pH时具有增加的FcRn亲和力但不影响或降低中性pH时的相互作用 亲和力的氨基酸替代，将导致具有更长体内半衰期的Fc分子。在中性pH基酸替代将表现出导致体内半i期i少。' ；"' ,实施例4:改变的Fc多肽的构建将通过本发明方法预测的改变引入编码人源化IgGl单克隆抗体 huCBEll重链的起始多肽中。图1A和1B分别显示了该重链的核香酸序列 (SEQ ID NO: 3)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4)。利用标准重组DNA技 术，通过定点诱变，向称作pEAG1787的表达载体上携带的huCBEll重链 中引入突变。抗体可变区是第1-120位残基、人IgGl恒定区是第121-449 位残基。将huIgGl的C端赖氨酸残基遗传除去。供参考在上述序列中N 连接的糖基化位点(EU残基号N297)是第300位残基。图2按照EU编号索 引显示huCBEll的Fc区的氨基酸序列。HuCBEll单克隆抗体是人源化IgGl、 k重组抗体，识别人淋巴毒素p 受体。mAb CBE11的克隆、嵌合化及人源化描述在美国专利申请 2004/0058394中。HuCBEll轻链携带在称作pEAG1754的表达载体中。可 变区为第1-107位残基，人k恒定区为第108-214位残基。图3A和3B分 别显示该轻链的核香酸序列(SEQ ID NO: 5)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。野生型和改变的多肽通过用重链载体(pEAG1787)和轻链载体 (pEAGl "4)瞬时共转染人胚胎肾细胞系(HEK293E)而表达。实施例5: FcRn-Fc融合蛋白剂的构建
通过遗传融合新生儿Fc受体的胞外i或和IgGl抗体的Fc区，构建二聚 Fc结合蛋白。
简言之，通过RT-PCR从人胎盘polyA+ RNA克隆人|32微球蛋白cDNA。 人卩2微球蛋白cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)和预测的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 8)分别显示在图4A和4B中。通过RT-PCR从人胎盘polyA十 RNA中克隆相应于人FcRn的a链的cDNA，并测序。将人FcRn a链的胞 外域(ECD)(第1-297位残基)亚克隆，以便和来源于IgGl抗体的人Fc区融 合。
Fc区(第398-535位残基)来源于先已描述过的人IgGl抗体(见美国专利 号5,928,643)。 IgGl Fc区含有截短的铰链，但是保留了该抗体的CH2和CH3 结构域，遗传除去了 CH3结构域的C端赖氨酸残基。图1A和IB显示了 IgGl抗体重链cDNA的核芬酸序列(SEQ ID NO: 3)和预测的氨基酸序列 (SEQ ID NO: 4)。
为了消除融合蛋白质结合FcRn的可能性，通过定点诱变，将Fc区在4 个位置(在图5B显示的序列中显示为带下划线的残基388， 389, 511和512) 处自其野生型序列进行突变，以产生先前已经证明可以显著地降低与FcRn 的FcRn结合亲和力和血清半衰期(Kim等，1994, Eur. J. Immunol. 24: 542-548 ; 和 Popov 等 1996， Mol. Immunol. 33: 521-530)的 H310A/Q311N/H433A/N434Q(EU编号)突变体的人等价物("huM4Fc")。
使用标准重组DNA技术，使该Fc区与FcRn ECD的C端融合以形成 FcRn-Fc融合蛋白cDNA。将卩2微球蛋白和FcRn-Fc融合蛋白cDNA插入 表达载体(pEAG1761)中，该表达载体在由巨细胞病毒立即早期启动子驱动 的串联转录单位中携带这两种cDNA。用pEAG1761转染CHO细胞以产生 分泌可溶性二聚体(杂四聚FcRn-Fc融合蛋白，由两个卩2-微球蛋白和二个 FcRn a-Fc融合链组成)的稳定细胞系。图5A和5B分别显示pEAG1761编 码的人FcRn a-Fc融合cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)和预测的氨基酸 序列(SEQIDNO: 10)。
使用10,000 MWCO聚醚砜膜，在Amicon搅拌杯单元(stirred cell unit) 中，将含有分泌的FcRn-huM4Fc (a链和p2-微球蛋白)融合蛋白的条件培养 基(来自CHO或293细胞)浓缩大约6倍至150ml。在40倍体积的20mMMES (pH5.8)、 150mMNaCl中透析该浓缩物过夜，之后4°C 2060xg离心IO分钟
以沉淀细月包碎片。将其力口至6ml人IgG-Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences)柱，该柱在20mM MES (pH 5.8)、 150mMNaCl中预先经过平衡。 用单一步骤的緩冲液变化(20mM Tris、 150mM NaCl中pH 8),洗脱结合的 FcRnFc。 hlgG-Sepharose柱成功i也用于捕获大鼠、小鼠和人FcRn-huM4Fc蛋白。通过非还原性SDS-PAG (4% - 20%梯度凝胶)分析洗脱的级分，将含有 FcRn-huM4Fc的级分合并，以通过阴离子交换层析进一步纯化。使用lmg/ml 人或大鼠蛋白质溶液(八280值为1.80)，以及lmg/ml小鼠蛋白质溶液(A280 值为1.84),分光光度法确定蛋白质浓度。从IgG-Sepharose柱上洗脱大约 70mg hFcRn-M4Fc。将此合并物在20mM Tris pH8中透析，之后上5ml DEAE 柱。从DEAE柱上使用最高达0.5MNaCl终浓度的递增盐线性梯度(20倍柱 体积)，洗脱结合的蛋白质。FcRn-huM4Fc蛋白在大约150mM-175mMNaCl (300/。-35% 0.5MNaCl緩冲液)处洗脱。利用同上的SDS-PAGE分析DEAE级 分的纯度，合并含有FcRn-huM4Fc的级分，得到48mg均质的FcRnFc合并 物。浓缩此DEAE合并物，并离心通过Vivaspin浓缩装置(10,000 MWCO) 将緩冲液更换成20mM MES (pH 5.8)、 150mM NaCl緩沖液以便-80。C储存，或者用于大小排阻层析(Superdex200 16/60, Amersham Biosciences)-最后的纯化步骤——以除去小量聚积物。实施例6:分析改变的多肽的FcRn结合亲和力使用各种无细胞试验通过其结合生物素化FcRn的能力来鉴定本发明改 变的人单克隆抗体。a)纯化改变的Fc多肽使用实施例4的FcRn-huM4Fc融合蛋白，纯化含有改变的Fc区的人单 克隆抗体。为了利于纯化，将FcRn-huM4Fc融合蛋白固定在Sepharose 4 Fast Flow Media上。通过大约20mg hFcRn与NHS活化的Sepharose 4 Fast Flow media (Amersham Biosciences)在PBS (pH 2.2)中摇动下4。C过夜偶联，制备 2mlhFcRnFc柱。用PBS洗涤该柱，之后用于纯化。每人FcRnFc柱lmg。将每种改变的人IgGl mAb各lmg在上样緩沖液20mM MES (pH5.8)、 150mMNaCl中施加于该柱上。柱子之后用10倍柱体积的上样緩沖液洗涤，
用升高pH至8.0的pH分步梯度(20mM Tris， 150mM NaCl)洗脱结合的mAb。b) FcRn-huM4Fc的生物素化(bhFcRnFc):生物素XX磺基琥珀酰亚胺基酯(xx-两个氨基己酰基链)用于对FcRn-huM4Fc进行生物素以便用于下述竟争性、基于珠子的、FRET和 AlphaScreen试验。该试剂可以从Molecular Probes的Mini-Biotin-XX蛋白 质标记试剂盒获得。FcRnFc在PBS 150mM Na/K磷酸盐，pH 7.0和150mM NaCl中透析。向0.72mg/ml hFcRnFcIgG (50(^1)加入1/10体积的1M碳酸 氢Na(50pL)碳酸盐(NaHCO3)储液。接着加入10^1生物素-XX试剂(按 Molecular Probes所述临用前溶解在水中)。反应室温孵育1小时，然后4°C 在PBS中彻底透析。当冻存在-80。C时，该生物素化的融合蛋白(bhFcRnFc) 是稳定的。c) 直接结合试验使用ELISA形式，评价未标记的hFcRn-Fc与本发明改变的Fc多肽的 直接结合。除非另外说明，否则所有洗涤和稀释均在pH 6.0 PBS中进行。板子在 4X:用5吗/ml改变的IgG抗体按每孔lOOjil包被过夜。洗涤板子3次，然后 用1。/。BSA包被2小时。然后洗涤板子3次，并与100pL适当的系列稀释 的FcRnFc温育90分钟。再次洗涤板子3次，并加入100pL适当的二级 mAb-HRP或链霉亲和素HRP,温育90分钟，再次洗涤板子，并根据对于 所选二级mAb适当的方法显色，并读取吸光度。使用图10所示结合数据 的四参数拟合，确定表观解离常数(Kd)。d) 竟争性结合试验变体抗体对标记的二聚FcRn构建物(bhFcRnFc)的相对结合亲和力使用 两种接近试验(FRET和AlphaScreen)确定，在所述试验中评价荧光标记的对 照抗体(5C8)与实施例4的改变的多肽间的竟争结合。i) FRET结合试验在黑色半孔ELISA板中以30^L总反应体积进行FRET试验。各反应混 合物在具有lOOmM NaCl和0.005% P20去污剂(Biacore, Tween-20)的pH 5.8 緩沖液中含有a) lnM用铕标记的对照抗体(h5C8); b) 250nM用第二焚光团 (APC)标记的链霉亲和素；c)来自实施例4的适当竟争者mAb (0-5pMolar; 0-0.75 mg/ml);和d) 200nM bhFcRnFc。最后向反应混合物添加bhFcRnFc。
反应在室温温育30分钟，然后在LJL Analyst (Molecular Devices)上4吏 用615激发波长和665荧光发射波长进行读数。LJL Analyst的设置为50ps 时间延迟和400ps读数。APC和Eu的信号比(AF) (665nm/615nm)相对于竟 争者mAb的浓度作图，以确定IC50 (pg/ml)。阴性对照反应缺乏铕标记的 hAb和竟争者IgG，阳性对照不含竟争者IgG。确定每种改变的抗体的相对ICso值(突变体IC50/w丄对照IC50),并作图 (图6)。图6显示，在EU位置285, 286， 290和304含有突变的抗体，尤 其是含有突变H285E， N286D， K290E和S304D的抗体导致对二聚FcRn/Fc融合蛋白增强的相对结合亲和力(相对1(:5()<1)。相反地，许多改变的抗体(即，在EU位置252， 255, 279， 282， 284, 285,287， 288, 290,304, 306， 309， 376， 434， 和438含有突变的那些改变的抗体)对二聚FcRn/Fc融合蛋白显示出表观结 合亲和力降低(相对1(:5()>1)。尤其是，EU位置282(V282E)、 290(K290D)、 438(Q438E)和434(N434L)处的突变显示出对FcRn的结合亲和力显著降低。 例如，突变N434L导致比对照抗体低大约400倍的FcRn结合亲和力。 ii) ALPHA Screen结合试验AlphaScreen是基于珠的试验，其使用分别地与结合配偶体(即，二聚体 Fc结合蛋白和改变的Fc多肽)缀合的供体和受体珠。供体珠用光敏剂包被， 该光敏剂在激光激发(例如，在680nm)后产生单态氧。化学发光包被的受体 珠与此单态氧反应，释放出520-620nm的光。由于单态氧在溶液中非常短 的半衰期，故受体珠的化学发光与供体珠的接近度成比例。因此，供体和 受体珠的结合导致极大地增强的化学发光信号。在384孔白色Costar板(Corning， Acton， MA)中向二倍系列稀释的实施 例4的改变的抗体添加生物素化的Fc/FcRn融合蛋白(bhFcRnFc)。 30分钟 室温温育后，在25pl终反应体积中以20ng/ml (终浓度)加入人IgGl缀合的 受体珠(由PerkinElmer Biosignal Inc., Montreal, Canada缀合)和链霉亲和素缀 合的供体珠(PerkinElmer Biosignal Inc., Montreal, Canada)。此安排导致反应 混合物含有与Fc/FcRn融合蛋白结合的链霉亲和素缀合的供体珠和与改变 的抗体结合的igGl缀合的受体珠。反应混合物室温温育1小时，在Fusion-Aplha读数器(PerkinElmer Biosignal Inc., Montreal, Canada)上读数。使用PBS、0.1。/o牛血清白蛋白和0.01 Tween-20，pH6.0作为试验緩冲液。使用人IgGl作为阳性对照。使用pH7.0 的试验緩冲液作为阴性对照以验证人IgGl与人FcRnFc不结合。使用 GraphPad Prism软件分析结果。针对每种改变的抗体确定的IC5o值(吗/ml)总结在图7中。图7说明， 在EU位置284， 285， 286和288含有突变，尤其是突变V284E， H285E， N286D: K290E的抗体相对于对照抗体导致对二聚FcRn/Fc融合蛋白增强的表观结 合亲和力(ICso〈1)。相反地，许多改变的抗体(即，在EU位置252，255，279, 282,284,285,286， 290,304,306,309,314， 313,345， 376， 434和438含有 突变的那些改变的抗体)相对于对照抗体而言，对二聚FcRn/Fc融合蛋白显 示出降低的表观结合亲和力(IC50〉1)。尤其是，EU位置252 (M252S和 M252T)， 434 (N434L),和438 (Q438E)显示出显著降低的对FcRn的结合亲 和力。例如，突变Q438E导致比对照抗体低大约1500倍的FcRn结合亲和 力。等同方案本领域技术人员将意识到，或者能够仅仅使用常规实验即确定与本文 所述的本发明的具体实施方案等同的许多方案。这些等同方案均旨在包括 在以下权利要求中。
权利要求
1.包含至少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽与起 始多肽相比包含至少一个突变，并且其中所述至少一个突变选自将EU氨基酸位置248替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置249替代为带正电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置251替代为极性氨基酸或赖氨酸；将EU氨基酸位置252替代为极性氨基酸；将EU氨基酸位置255替代为极性氨基酸；将EU氨基酸位置256替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置257替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置258替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸；在EU氨基酸位置277的替代；将EU氨基酸位置279替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置280替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置281替代为带电荷的氨基酸或谷氨酰胺；将EU氨基酸位置282替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置284替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置285替代为带正电荷的氨基酸，极性氨基酸，或天冬 氨酸；将EU氨基酸位置286替代为谷氨酸，苏氨酸，或曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置287替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置288替代为带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置289的替代；将EU氨基酸位置304替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置305替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 在EU氨基酸位置306的替代；将EU氨基酸位置307替代为极性或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置308替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置309替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置310替代为带电荷的氨基酸或极性氨基酸；将EU氨基酸位置311替代为带正电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置312替代为带正电荷的氨基酸或极性氨基酸；将EU氨基酸位置313替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置315替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置316替代为带正电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置317替代为带电荷的氨基酸或极性氨基酸；将EU氨基酸位置340替代为带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置343替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置344替代为亮氨酸；将EU氨基酸位置345替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置376替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置378替代为丝氨酸； 将EU氨基酸位置383替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置385替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置389替代为带负电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置424替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置426替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置430替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置431替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置432替代为极性氨基酸； 将EU氨基酸位置434替代为赖氨酸，精氨酸,或亮氨酸； 将EU氨基酸位置436替代为带负电荷的氨基酸；和 将EU氨基酸位置438替代为带电荷的氨基酸.
2.包含至少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽与起 始多肽相比包含至少 一个突变，并且其中所述至少一个突变选自 将EU氨基酸位置248的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置249的天冬氨酸替代为带正电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置251的亮氨酸替代为极性氨基酸或赖氨酸； 替代EU氨基酸位置252的曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置255的精氨酸替代为极性氨基酸； 将EU氨基酸位置256的苏氨酸替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置257的脯氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置258的谷氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 替代EU氨基酸位置277的色氨酸； 将EU氨基酸位置279的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置280的天冬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置281的甘氨酸替代为带电荷的氨基酸或谷氨酰胺； 将EU氨基酸位置282的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置284的缬氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 将EU氨基酸位置285的組氨酸或丙氨酸替代为带电荷的氨基酸或极 性氨基酸；将EU氨基酸位置285的组氨酸或丙氨酸替代为带正电荷的氨基酸, 极性氨基酸，或天冬氨酸；将EU氨基酸位置286的天冬酰胺或赖氨酸替代为谷氨酸，苏氨酸，或 曱硫氨酸；将EU氨基酸位置287的丙氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 将EU氨基酸位置288的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 替代EU氨基酸位置289的苏氨酸；将EU氨基酸位置304的丝氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 将EU氨基酸位置305的缬氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 替代EU氨基酸位置306的亮氨酸或缬氨酸；将EU氨基酸位置307的苏氨酸或缬氨酸替代为极性或带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置308的缬氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置309的亮氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置310的组氨酸替代为带电荷的氨基酸或极性氨基酸; 将EU氨基酸位置311的谷氨酰胺替代为带正电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置312的天冬氨酸或亮氨酸替代为带正电荷的氨基酸 或极性氨基酸；将EU氨基酸位置313的天冬酰胺替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置315的天冬酰胺替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置316的天冬酰胺替代为带正电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置317的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸或极性氨基酸； 将EU氨基酸位置340的赖氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置343的脯氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 将EU氨基酸位置344的精氨酸替代为亮氨酸；将EU氨基酸位置345的谷氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置376的天冬氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸；将EU氨基酸位置378的丙氨酸替代为丝氨酸； 将EU氨基酸位置383的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置385的甘氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置389的天冬酰胺替代为带负电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置424的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置426的丝氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置430的谷氨酸替代为极性氨基酸或带电荷的氨基酸; 将EU氨基酸位置431的亮氨酸替代为带电荷的氨基酸； 将EU氨基酸位置432的组氨酸替代为极性氨基酸； 将EU氨基酸位置434的天冬酰胺替代为赖氨酸，精氨酸,或亮氨酸； 将EU氨基酸位置436的酪氨酸替代为带负电荷的氨基酸;和 将EU氨基酸位置438的谷氨酰胺替代为带电荷的氨基酸。
3. 权利要求1或2的改变的多肽，其中位于EU氨基酸位置277， 289, 306， 344，或378中的至少一个位置上的氨基酸被带电荷的氨基酸，极性氨基酸， 或非极性氨基酸替代。
4. 权利要求3的改变的多肽，其中所述带电荷的氨基酸是带负电荷的 氨基酸.
5. 权利要求4的改变的多肽，其中所述带负电荷的氨基酸选自天冬氨 酸和谷氨酸.
6. 权利要求3的改变的多肽，其中所述带电荷的氨基酸是带正电荷的 氨基酸.
7. 权利要求6的改变的多肽，其中所述带正电荷的氨基酸选自精氨酸, 组氨酸，和赖氨酸.
8. 权利要求7的改变的多肽，其中所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸.
9. 权利要求3的改变的多肽，其中极性氨基酸选自曱硫氨酸，苯丙氨 酸，色氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和半胱氨酸。
10. 权利要求3的改变的多肽，其中非极性氨基酸选自丙氨酸，亮氨酸， 异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸和脯氨酸。
11. 权利要求l或2的改变的多肽，其中所述改变的多肽是抗体或其片段。
12. 权利要求l或2的改变的多肽，其中所述改变的多肽是融合蛋白。
13. 权利要求l或2的改变的多肽，其中Fc区或其FcRn结合部分来源 于人抗体。
14. 权利要求13的改变的多肽，其包含完整的Fc区。
15. 权利要求14的改变的多肽，其中起始多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。
16. 权利要求11-13任一项的改变的多肽，其中Fc区或其Fc结合部分 是IgG同种型的。
17. 权利要求16的改变的多肽，其中所述IgG同种型是IgGl亚类。
18. 权利要求11-13任一项的改变的多肽，其中所述多肽在V^或Vh的 互补决定区(CDR)包含一个或多个非人氨基酸残基。
19. 权利要求11或13的改变的多肽，其中所述多肽可以结合(a)抗原和 (b) FcR。
20. 权利要求19的改变的多肽，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
21. 权利要求12的改变的多肽，其中所述多肽可以结合(a)配体和(b)FcR。
22. 权利要求19或21的改变的多肽，其中FcR是FcRn.
23. 权利要求19或21的改变的多肽，其中所述多肽与不含所述突变的 起始多肽以不同的结合亲和力结合FcR。
24. 权利要求23的改变的多肽，其中所述改变的多肽的结合亲和力比 起始多肽的高大约1.5倍至大约100倍。
25. 权利要求34的改变的多肽，其中所述改变的多肽的结合亲和力比 起始多肽的低大约1.5倍至大约100倍。
26. 权利要求19或21的改变的多肽，其中所述改变的多肽在第一pH 时对FcR显示出一种结合亲和力，并在第二 pH时对FcR显示出不同的结 合亲和力。
27. 权利要求26的改变的多肽，其中所述改变的多肽的结合亲和力在 第一pH时比在第二pH时高大约1.5倍至大约100倍。
28. 权利要求27的改变的多肽，其中所述改变的多肽的结合亲和力在 第一pH时比在第二pH时低大约1.5倍至大约100倍。
29. 权利要求11-13任一项的改变的多肽，其中所述改变的多肽，当施 用给患者时，显示出与不含突变的起始多肽不同的循环半衰期。
30. 权利要求29的改变的多肽，其中所述改变的多肽的半衰期比不含 突变的起始多肽长大约1小时至大约1周。
31. 权利要求30的改变的多肽，其中所述改变的多肽的半衰期比不含 突变的起始多肽短大约1小时至大约1周。
32. 权利要求l或2的改变的多肽，其中所述改变的多肽可以与蛋白A 或G结合。
33. 包含权利要求l或2的改变的多肽的药物组合物。
34. 包含编码权利要求1或2的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
35. 权利要求34的核酸分子，其是表达载体。
36. 包含权利要求35的表达载体的宿主细胞。
37. 用于治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用包含至 少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自 以下的突变将EU氨基酸位置284替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置285替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置286替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置288替代为谷氨酸或天冬氨酸； 将EU氨基酸位置290替代为谷氨酸；和 将EU氨基酸位置304替代为天冬氨酸，其中所述改变的多肽与不含突变的起始多肽相比显示出更长的循环半衰期。
38. 用于治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用包含至 少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自 以下的突变将EU氨基酸位置284的缬氨酸替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置285的组氨酸替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置286的天冬酰胺替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置288的赖氨酸替代为谷氨酸或天冬氨酸； 将EU氨基酸位置290的赖氨酸替代为谷氨酸；和 将EU氨基酸位置304的丝氨酸替代为天冬氨酸， 其中所述改变的多肽与不含突变的起始多肽相比显示出更长的循环半 衰期。
39.用于治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用包含至 少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自 以下的突变将EU氨基酸位置248替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置249替代为精氨酸或赖氨酸；将EU氨基酸位置250替代为精氨酸或赖氨酸；将EU氨基酸位置251替代为精氨酸，赖氨酸，或天冬酰胺；将EU氨基酸位置252替代为丝氨酸或苏氨酸；将EU氨基酸位置254替代为丝氨酸或苏氨酸；将EU氨基酸位置256替代为精氨酸，谷氨酸，或赖氨酸；将EU氨基酸位置255替代为亮氨酸，天冬氨酸或曱硫氨酸；将EU氨基酸位置260替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置257替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置277替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺,或赖氨酸； 将EU氨基酸位置279替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置281替代为谷氨酰胺；将EU氨基酸位置282替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸,或赖氨酸； 将EU氨基酸位置287替代为天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯氨酸，或苏 氨酸；将EU氨基酸位置284替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置285替代为天冬氨酸或苯丙氨酸； 将EU氨基酸位置286替代为谷氨酸或曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置288替代为天冬氨酸； 将EU氨基酸位置290替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置304替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU氨基酸位置305替代为精氨酸；将EU氨基酸位置306替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置307替代为精氨酸，天冬氨酸,或谷氨酸； 将EU氨基酸位置309替代为精氨酸，天冬氨酸，赖氨酸或谷氨酸； 将EU氨基酸位置310替代为精氨酸，亮氨酸，赖氨酸或天冬酰胺； 将EU氨基酸位置312替代为精氨酸，天冬酰胺,或赖氨酸； 将EU氨基酸位置313替代为天冬氨酸，精氨酸，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置315替代为天冬氨酸或谷氨酸； 将EU氨基酸位置343替代为谷氨酰胺或赖氨酸； 将EU氨基酸位置345替代为精氨酸或谷氨酰胺； 将EU氨基酸位置374替代为精氨酸，赖氨酸，或亮氨酸； 将EU氨基酸位置376替代为天冬酰胺； 将EU氨基酸位置426替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸； 将EU氨基酸位置428替代为精氨酸，谷氨酰胺，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置430替代为赖氨酸； 将EU氨基酸位置431替代为脯氨酸； 将EU氨基酸位置432替代为精氨酸； 将EU氨基酸位置434替代为亮氨酸或赖氨酸；和 将EU氨基酸位置438替代为谷氨酸，其中所述改变的多肽比不含突变的起始多肽显示出较短的循环半衰期。
40.用于治疗患有病症的患者的方法，所述方法包括给患者施用包含至 少Fc区的FcRn结合部分的改变的多肽，所述多肽包含至少一个选自以下 的突变将EU氨基酸位置248的赖氨酸替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置249的天冬氨酸替代为精氨酸或赖氨酸；将EU氨基酸位置250的苏氨酸替代为精氨酸或赖氨酸；将EU氨基酸位置251的亮氨酸替代为精氨酸，赖氨酸，或天冬酰胺；将EU氨基酸位置252的曱硫氨酸替代为丝氨酸或苏氨酸；将EU氨基酸位置254的甲硫氨酸替代为丝氨酸或苏氨酸； 将EU氨基酸位置256的苏氨酸替代为精氨酸，谷氨酸，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置255的精氨酸替代为亮氨酸，天冬氨酸或曱硫氨酸； 将EU氨基酸位置260的苏氨酸替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置257的脯氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或赖 氨酸；将EU氨基酸位置277的色氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，或 赖氨酸；将EU氨基酸位置279的缬氨酸替代为谷氨酸； 将EU氨基酸位置281的甘氨酸替代为谷氨酰胺； 将EU氨基酸位置282的缬氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或 赖氨酸；将EU氨基酸位置287的丙氨酸替代为天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，脯 氨酸,或苏氨酸；将EU氨基酸位置284的缬氨酸替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置285的组氨酸替代为天冬氨酸或苯丙氨酸；将EU氨基酸位置286的天冬酰胺替代为谷氨酸或曱疏氨酸；将EU氨基酸位置288的赖氨酸替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置290的赖氨酸替代为天冬氨酸；将EU氨基酸位置304的丝氨酸替代为天冬氨酸或谷氨酸；将EU氨基酸位置305的缬氨酸替代为精氨酸；将EU氨基酸位置306的亮氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，谷氨酸,或赖 氨酸；将EU氨基酸位置307的苏氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸； 将EU氨基酸位置309的亮氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，赖氨酸或谷 氨酸；将EU氨基酸位置310的组氨酸替代为精氨酸，亮氨酸，赖氨酸或天冬 酰胺^将EU氨基酸位置312的天冬氨酸替代为精氨酸，天冬酰胺，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置313的色氨酸替代为天冬氨酸，精氨酸，或赖氨酸； 将EU氨基酸位置315的天冬酰胺替代为天冬氨酸或谷氨酸； 将EU氨基酸位置343的脯氨酸替代为谷氨酰胺或赖氨酸；将EU氨基酸位置345的谷氨酸替代为精氨酸或谷氨酰胺；将EU氨基酸位置374的脯氨酸替代为精氨酸，赖氨酸，或亮氨酸；将EU氨基酸位置376的天冬氨酸替代为天冬酰胺；将EU氨基酸位置426的丝氨酸替代为精氨酸，天冬氨酸，或谷氨酸；将EU氨基酸位置428的曱硫氨酸替代为精氨酸，谷氨酰胺,或赖氨酸；将EU氨基酸位置430的谷氨酸替代为赖氨酸；将EU氨基酸位置431的丙氨酸替代为脯氨酸；将EU氨基酸位置432的亮氨酸替代为精氨酸；将EU氨基酸位置434的天冬酰胺替代为亮氨酸或赖氨酸；和将EU氨基酸位置438的谷氨酰胺替代为谷氨酸，其中所述改变的多肽比不含突变的起始多肽显示出较短的循环半衰期。
41. 制备权利要求1或2的改变的多肽的方法，所述方法包括(a) 用包含编码所述改变的多肽的核苷酸序列的核酸分子转染细胞；和(b) 从所述细胞或细胞上清液纯化所述改变的多肽。
42. 制备权利要求11或13的抗体的方法，所述方法包括(a) 提供包含编码所述抗体轻链可变区(VO和恒定区(QJ的核苷酸序列 的第一核酸分子；(b) 提供包含编码所述抗体重链可变区(VH)和恒定区(CH,, CH2，和CH。 的核苷酸序列的第二核酸分子；(c) 用第一和第二核酸分子在允许表达包含所述编码的轻链和重链的 改变的抗体的条件下转染细胞；和(d) 从所述细胞或细胞上清液纯化所述抗体。
43. 权利要求42的方法，其中所述细胞是293细胞。
44. 包含第一和第二多肽链的二聚Fc结合蛋白，其中第一和第二多肽 链各包含至少一个可操作地和Fc结合域连接的Fc区结构域。
45. 权利要求44的二聚Fc结合蛋白，其中突变所述Fc结构域以降低 或消除与FcRn的结合。
46. 权利要求44的二聚Fc结合蛋白，其中所述第一和第二多肽链共价 连接。
47. 4又利要求44的二聚Fc结合蛋白，其中Fc结合结构域包含FcRn 的胞外域。
48. 权利要求44的二聚Fc结合蛋白，其中Fc结合结构域结合到P2 微球蛋白结合上。
49. 权利要求44的二聚Fc结合蛋白，其中Fc结合结构域来源于人 FcRn。
50. 权利要求59的二聚Fc结合蛋白，其中所述结合蛋白包含SEQID NO: 10中所示的氨基酸序列。
51. 用于测量包含至少Fc区FcRn结合部分的多肽针对FcR的结合亲 和力的方法，该方法包括使包含至少Fc区的FcRn结合部分的多肽与权利 要求44的二聚Fc结合蛋白接触，和确定该相互作用的亲和力。
52. 用于在包含至少Fc区的FcRn结合部分的多肽的文库中筛选对 FcRn具有改变的结合亲和力的那些多肽的方法，其中所述方法包括(a) 使文库成员与权利要求44的二聚Fc结合蛋白接触；和(b) 测量所述多肽对二聚Fc结合蛋白的结合亲和力；和(c) 选择对FcRn具有改变的结合亲和力的那些多肽。
53. 用于从多肽混合物中纯化含有至少Fc区的FcRn结合部分的多肽的 方法，所述方法包括将混合物加样至含有权利要求44的二聚Fc结合蛋白 的亲和柱，洗脱包含至少Fc区的FcRn结合部分的多肽，由此纯化所述多 肽。
54. 权利要求53的方法，其中在第一 pH时将所述混合物加样至亲和 柱，并在第二pH时从亲和柱洗脱所述多肽。
55. 权利要求54的方法，其中所述多肽在纯化工程中不被变性。
56. 用于鉴定与起始多肽相比对FcRn具有改变的结合亲和力的多肽的 方法，所述方法包括(a) 确定在溶剂中结合FcRn时起始多肽氨基酸的最佳电荷分布的空间 表现和起始多肽的结合自由能的相关变化；(b) 鉴定为结合FcRn时改变起始多肽的结合自由能而有待修饰的起始 多肽中的至少一个候选氨基酸残基位置；和(c) 鉴定位于该氨基酸位置的当选氨基酸，以便该突变在起始多肽中的 ^^入将导致对FcRn具有改变的结合亲和力的改变的多肽。
57. 权利要求56的方法，还包括将选定的氨基酸掺入起始多肽中。
58. 权利要求56的方法，还包括计算改变的多肽在结合FcRn时与起 始多肽在结合FcRn时相比结合自由能的变化。.
59. 权利要求58的方法，其中所述计算步骤首先包括在计算机上在起 始多肽中模建所述突变，然后计算结合自由能的变化。
60. 权利要求58的方法，其中所述计算步骤使用选自以下的至少一种 确定方法使用基于Poisson-Boltzmann公式的方法确定静电结合能；确定 范德瓦耳氏结合能；和使用基于溶剂可及表面面积的方法确定结合能。
61. 权利要求56的方法，其中所述突变是氨基酸替代。
62. 权利要求61的方法，其中所述氨基酸替代导致掺入与候选氨基酸 具有不同电荷的当选氨基酸。
63. 权利要求56的方法，其中所述突变增加改变的含Fc的多肽和 FcRn在溶剂中结合时两者之间的结合自由能，由此降低所述改变的含Fc 多肽对FcRn的结合亲和力。
64. 权利要求56的方法，其中所述突变降低改变的含Fc的多肽和 FcRn在溶剂中结合时两者之间的结合自由能，由此增加所述改变的含Fc 多肽对FcRn的结合亲和力。
65. 鉴定在两个不同pH水平对FcRn具有改变的结合亲和力的含有Fc 的改变的多肽的方法，所述方法包括(a) 确定在第一 pH水平在溶剂中与FcRn结合时起始多肽的氨基酸的 最佳电荷分布的空间表现以及起始多肽的结合自由能的相关变化；(b) 确定在第二 pH水平在溶剂中与FcRn结合时起始多肽的氨基酸的最 佳电荷分布的空间表现以及起始多肽的结合自由能的相关变化；(c) 通过比较电荷分布、在第一和第二 pH水平下的显示不同电荷分布 的残基，鉴定起始多肽中有待修饰以改变起始多肽与FcRn结合时的结合自 由能的至少一个候选氨基酸残基位置；和(d) 选择位于所述氨基酸位置的当选氨基酸，以便该当选氨基酸掺入起 始多肽后导致对FcRn具有改变的结合亲合性的、含有Fc的、改变的多肽。
66. 权利要求65的方法，其中第一pH是大约7.4。
67. 权利要求65的方法，其中所述多肽的亲和力在第一 pH时比在第 二pH时高大约1.5倍至大约100倍。
68. 在第一pH时对FcRn显示出一种亲和力而在第二pH时对FcRn显 示出不同亲和力的改变的多肽，其中所述多肽包含通过权利要求56的方法 预测的氨基酸序列。
69. 包含权利要求68的多肽的药物组合物。
70. 包含编码权利要求68的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
全文摘要
本发明的组合物和方法部分地基于我们的发现——由含有Fc的多肽介导的效应子功能可以通过修饰该多肽中的一个或多个氨基酸残基(通过，例如静电优化)而改变。可以根据本发明方法产生的多肽是高度可变的，它们可以包括含有Fc区的抗体和融合蛋白质或其生物活性部分。
文档编号C12N15/10GK101124245SQ200480040299
公开日2008年2月13日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者亚历克西·A·卢戈夫斯科伊, 埃伦·加伯, 格雷厄姆·K·法林顿, 约翰·K·埃尔德雷奇 申请人:比奥根艾迪克Ma公司