专利名称：生产杆状病毒的方法
技术领域：
本发明涉及杆状病毒的生产，特别涉及一种生产工业产量的杆状病毒的方法。
背景技术：
杆状病毒具有多种应用，包括生产重组蛋白和作为生物杀虫剂的使用。目前，工业使用杆状病毒的问题是不能生产大量的感染性杆状病毒。
经济的杆状病毒工业生产要求至少10000升的培养液体积，每个细胞的病毒产量要大于150个包含体(OB，Occlusion Bodies)(Greenfield，P.F.，Reid，S.，Weiss，S.，Scholz，B.(1999).Baculoviruses asbiological control agentsresearch.production and commercial issues.InThe 5thAsia-Pacific Biochemical Engineering Conference Proceedings.Phuket，Thailand)。用于大规模杆状病毒生产的标准放大过程需要将冷冻的杆状病毒工作保藏品在细胞培养液中培养5代，来获取足量的病毒。另外还需要6代培养来使生产过程放大至10000升，以达到经济生产的目的(Rhodes，D.J.(1996).Economics of baculovirus-insect cellproduction systems.Cytotechnology 20，291-297)。根据这个标准的放大过程，将需要11代培养来获得最终10000升规模的病毒产品，这里假设病毒在连续传代过程中是稳定的并保持产量大于150个包含体/细胞。
然而，杆状病毒在细胞培养液中连续传代的过程中是不稳定的，因为它们会自发突变而形成FP(few polyhedra，即一个包埋体含有少数病毒颗粒)突变株或缺陷干扰颗粒(DIP，defective interferingparticles)突变株。由于病毒基因组25Kb的FP基因中发生自发性突变，FP突变株在细胞培养液中迅速富集。对于棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HaSNPV)，FP突变发生的非常迅速，以至于到了第六代，全部病毒都是FP突变株。其产量低于10个包含体/细胞，并且生成的包含体没有生物学活性(Lua，L.H.L.，Pedrini，M.，Reid，S.，Robertson，A.& Tribe，D.E.(2002).Phenotypic and genotypic analysis of Helicoverpaarmigera nucleopolyhedrovirus serially passaged in cell culture.Journalof General Virology 83，947-957)。同样，在具有高感染复数(MOIs)的杆状病毒在细胞培养液中连续传代的过程中，DIP突变株也能够快速富集。当感染复数为10个蚀斑(PFU)/细胞时，早在第四代就已经发现了苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒(AcMNPV)感染的DIP突变株。DIP突变株的产生是病毒基因组大量缺失的结果。DIP突变株需要一种“辅助病毒”(野生型病毒)来进行复制(Pijilman，G.P.，van denborn，E.，Martens，D.E.& Vlak，J.M.(2001).Autographa californicabaculoviruses with large genomic deletions are rapidly generaed ininfected insect cells.Virology 283，132-138)。这些突变的发生导致了从病毒接种物到大规模生产的放大过程中的一些问题。
与出现DIP突变株相比，FP突变在棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HaSNPV)连续传代过程中会对放大生产产生更大的威胁。FP突变的发生要比DIP突变快得多、早得多，且不受感染复数(MOI)的限制。
在细胞培养液中不存在任何对感染性包含体的选择性压力。感染了FP突变株的细胞比感染了MP(many polyhedra，即一个包埋体中含有许多个病毒颗粒)突变株的细胞生成更多的杆状病毒，从而为FP突变株提供了一种选择性优势。与在细胞培养液中不同，感染性包含体在幼虫里倾向于以一种感染其他幼虫的杆状病毒形式存在(Potter，K.N.，Jaques，R.P.，Faulkner，P.(1978).Modification of Trichoplusia ninuclear polyhedrosis virus passaged in vivo.Intervirology 9，76-85)。
连续传代培养可以产生大量的杆状病毒，但是这种病毒没有感染性。而从幼虫中生产大量病毒又是不现实的，因为这需要有大量的幼虫，而且后续分离病毒所必需的大规模纯化也是困难的。在大规模生产过程中，从每次传代后的包含体中提取包含体衍生病毒的方法也存在技术困难，也不现实，因为必需将包含体从细胞中提取出来并在每次传代后进行浓缩，同时保持整个过程的无菌操作。
目前，还没有经济的大规模工业生产感染性杆状病毒的方法。
发明内容
本发明的目的是要提供一种生产大量杆状病毒的替代方法。
本发明是根据生产工业产量的感染性杆状病毒的需要而设计并予以实施的。本发明的建立利用了感染性杆状病毒在幼虫中生成包含体以及在细胞培养液中连续传代而生成大量病毒颗粒的优势。因此，本发明设计了两个步骤首先在幼虫中生成感染性病毒，然后将所得到的感染性病毒作为接种物进行限定次数的连续传代细胞培养，进而生产大量的感染性杆状病毒。
一方面，本发明立足于一种生产大量杆状病毒的方法，包括将杆状病毒接种物接种到幼虫；培养接种后的幼虫；从被感染的幼虫中收集杆状病毒包含体；从包含体中提取包含体衍生病毒；将包含体衍生病毒作为接种物接种到宿主昆虫细胞培养液中；
培养病毒/细胞培养液；然后从培养后的病毒/细胞培养液中收集杆状病毒。
病毒/细胞培养液的培养时间优选为能够培养出4或5代杆状病毒。
本发明中所称杆状病毒是一个总称，涵盖了不同种类的杆状病毒，包括棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(Helicoverpa armigera SNPV)，玉米穗夜蛾单粒包埋核多角体病毒(Helicoverpa zea SNPV)，草地夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Spodoptera frugiperda MNPV)，黎豆夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Anticarsia gemmatalis MNPV)，苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Autographa caiifornica MNPV)，芹菜夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Anagrapha falcifera MNPV)，舞毒蛾多粒包埋核多角体病毒(Lymantria dispar MNPV)，家蚕多粒包埋核多角体病毒(Bombyxmori MNPV)，甜菜夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Spodoptera exiguaMNPV)，银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒(Trichoplusia ni MNPV)，黄杉毒蛾多粒包埋核多角体病毒(Orgyia pseudotsugata MNPV)，油桐尺蠖多粒包埋核多角体病毒(Buzura supperssaria SNPV)。优选的是从棉铃虫(Helicoverpa armigera)中分离出来一种杆状病毒，一个优选的分离株是H25EA1毒株。
最初的杆状病毒接种物可以是从任何适宜来源中衍生出来的，包括从幼虫或细胞培养液中得到的包含体。
为了生成适量的包含体工作保藏品，从幼虫中生成杆状病毒的方法可能会有多个步骤。在一种优选方式中，从幼虫中制备杆状病毒可以首先制备包含体总保藏品。接着，包含体总保藏品可以为包含体工作保藏品的制备提供接种物。在一个优选方式中，包含体工作保藏品的包含体数量优选为约2×1012个，而包含体总保藏品的包含体数量优选为约109个包含体。总保藏品和工作保藏品都可以在4℃或冷冻保藏。
优选在相对高的感染复数(MOI)条件下在细胞培养液中培养包含体衍生病毒(ODV)的优选条件是具有。在一个优选实施方式中，从少量(2.5×1010)包含体中获得包含体衍生病毒接种物，并将其放入10升(细胞浓度为5×105个/毫升)的生物反应器中。逐级放大培养液体积，从10升(P1)到100升(P2)，然后再到1000升(P3)，最后达到10000升。10升的培养液产出约为107PFU(杆状病毒)/毫升。10000升的培养液优选的细胞浓度约为1.5-2.0×109细胞/升，2.5×1011包含体/升(即大约150个包含体/细胞)。包含体对棉铃虫幼虫(heliothiscaterpillars)的致死中浓度(LC50)为0.2-1.0个包含体/平方毫米。
从工作保藏品中提取包含体衍生病毒(ODV)可以采用任何适宜的方法。优选的提取方式是碱裂解包含体，并将所得到的病毒颗粒在适宜的缓冲介质中稳定。这个优选的提取方法包括将碱溶液和包含体悬浮液进行混合，并将混合液在一定温度下保温一段时间来分离病毒颗粒。然后，包含体衍生病毒优选的被悬浮在一个稳定介质中，稳定介质优选为VPM3(如图2所示)。优选不要加入酸中和步骤。优选的包含体衍生病毒(ODV)提取方法是下面描述的VPM3提取方法。VPM3提取方法的优点是不使用胰蛋白酶处理并且VPM3介质不含血清，因此该方法较传统方法更加经济而更适合大规模工业生产。
另一方面，本发明立足于从上述方法制成的杆状病毒产品，其特征是感染性杆状病毒的量约为2.5×1015个包含体，对棉铃虫(Helicoverpa spp)幼虫的致死中浓度为0.2-1.0包含体/平方毫米。在此之前，还没有一个单独的体外生产方法能够获得这一数量的感染性杆状病毒。本发明进一步的优点是这一数量的感染性杆状病毒的生产是经济的。
本发明所得到的杆状病毒具有多种用途，包括作为生物杀虫剂。例如棉铃虫(Helicoverpa armigera)包含体以5×1011-5×1012包含体/棉铃虫作用于农作物，能够确保对棉铃虫幼虫虫害的控制。
为了使本发明更容易理解并达到实际效果，现在对
如下图1是生产大量杆状病毒的流程示意图；图2显示了优选实施方式中提取稳定介质VPM3的组成；图3比较了用于提取的包含体数量和相应的第4代每个细胞的包含体数量；图4采用两个样本(摇瓶A和B)来表示4代的包含体产量。
具体实施例方式
生产大量杆状病毒的方法的优选实施方式涉及两步过程，首先在幼虫中生成病毒，然后将来源于幼虫的包含体衍生病毒接种到细胞培养液中并对细胞培养液进行限定次数的连续传代培养(图1)。
该方法首先涉及幼虫包含体的总保藏品和工作保藏品的制备，通过喂养大量的棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫，给每个幼虫喂大约1000个包含体。幼虫死亡后(感染后6-10天)，收集虫体于4℃保藏。10升体积培养(第一代)的接种物大约需要1.5-2个幼虫，因为每次需要2.5×1010个包含体而每个幼虫大约生成1.7×1010个包含体。当储备了足够数量的虫体后，用SDS溶液(终浓度为0.5％)提取30分钟、均匀化处理(混合过程)、过滤(粗棉布，cheesecloth)、离心沉淀、用水悬浮沉淀(1010包含体/毫升)。可以用大量水来洗涤沉淀以去除过剩杂质。包含体悬浮液可以冷藏或冷冻保藏。
采用VPM3提取方法提取包含体包括以下步骤于每0.7毫升包含体悬浮液(1010包含体/毫升)中加入40μl碱溶液(0.5M Na2CO3，1MNaCl)，充分混合后于28℃保温30分钟。然后，对于每份体积为0.74毫升的提取的包含体，用10毫升VPM3介质(VPM3的组成见图2)稀释保温的包含体混合液。稀释后的包含体衍生病毒悬浮液通过0.22μm的过滤器过滤除菌，所得到的包含体衍生病毒悬浮液即可作为接种物。
图3举例说明了用于提取的每个细胞的包含体产量以及其第4代每个细胞的包含体产量。
大约需要2.5×1010个包含体来产生足够的包含体衍生病毒作为接种物来感染10升的细胞培养液(5×105个细胞/毫升)。
接种于10升培养液中的杆状病毒在生物反应器中通气培养大约3天，培养温度为28℃。这是第1代培养。发酵过程被逐级放大，使第2、3、4代的培养规模分别达到100升、1000升、10000升。所有培养过程都是在28℃条件下通气约2天，除了最后一次的培养时间为10-15天。
10000升培养液中的细胞浓度约为1.5-2.0×109个细胞/升，2.5×1011包含体/升(即大约150包含体/细胞)。包含体对棉铃虫(Helicoverpaspp)幼虫的致死中浓度为0.2-1.0包含体/平方毫米。
在图4显示的另一实施例中，1011个包含体被成功提取并过滤。抽取一些经过滤除菌的提取液来感染两份同样的100毫升培养液(摇瓶A和摇瓶B)。经过第4代后，包含体产量相对较高，摇瓶A和摇瓶B分别为263和269个包含体/细胞。
变化我们当然明白，虽然前面对本发明做了举例说明，但是所有那些对于所属技术领域人员来说是显而易见的类似或其他的调整变化都被视为落入了本发明的范围。
整个说明书和权利要求书中使用的“包括”一词及其变化形式，无意排除其他的添加剂、组成部分、整体或步骤。
权利要求
1.一种生产大量杆状病毒的方法，包括将杆状病毒接种物接种到幼虫中；培养接种后的幼虫；从被感染的幼虫中收集杆状病毒包含体；从包含体中提取包含体衍生病毒；用包含体衍生病毒接种宿主昆虫细胞培养液；培养病毒/细胞培养液；和从培养后的病毒/细胞培养液中收集杆状病毒。
2.权利要求1所述的生产大量杆状病毒的方法，其中病毒/细胞培养液的培养时间要能够使杆状病毒传代4或5次。
3.权利要求1或2所述的生产大量杆状病毒的方法，其中杆状病毒选自下列任何一个群体棉铃虫单粒包埋核多角体病毒、玉米穗夜蛾单粒包埋核多角体病毒、草地夜蛾多粒包埋核多角体病毒、黎豆夜蛾多粒包埋核多角体病毒、苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒、芹菜夜蛾多粒包埋核多角体病毒、舞毒蛾多粒包埋核多角体病毒、家蚕多粒包埋核多角体病毒、甜菜夜蛾多粒包埋核多角体病毒、银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒、黄杉毒蛾多粒包埋核多角体病毒、油桐尺蠖多粒包埋核多角体病毒。
4.权利要求1-3中任意一项所述的生产大量杆状病毒的方法，其中杆状病毒是从棉铃虫中分离出来的毒株。
5.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其特征是从幼虫中生成杆状病毒的步骤不只一步，目的是生成适量的包含体工作保藏品。
6.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其特征是首先在幼虫中生成杆状病毒来制备包含体总保藏品，然后利用所述包含体总保藏品提供接种物来制备包含体工作保藏品。
7.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其特征是包含体工作保藏品的包含体数目约为2×1012个，包含体总保藏品的包含体数目约为109个。
8.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其特征是包含体衍生病毒是在相对高的感染复数条件下于细胞培养液中培养的。
9.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其中包含体衍生病毒接种物是从低至2.5×1010个包含体中获得并被引入到10升的生物反应器，所述反应器中的细胞浓度为5×105个细胞/毫升，然后，培养被逐级放大，体积从10升(第1代)到100升(第2代)，再到1000升(第3代)，最后达到10000升(第4代)；其中10升的培养液产出约为107个PFU(杆状病毒)/毫升，10000升的培养液中每升培养液含有约1.5-2.0×109个细胞以及2.5×1011个包含体(即每个细胞约含有150个包含体)，其包含体针对棉铃虫幼虫的致死中浓度为0.2-1.0包含体/平方毫米。
10.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其中包含体衍生病毒的提取是采用碱裂解包含体后将所得到的病毒颗粒稳定在适当的缓冲介质中。
11.上述任何一个权利要求所述的生产大量杆状病毒的方法，其中提取方法包括将包含体悬浮液与碱液混合，于一定温度下将混合物保温一段时间来分离病毒颗粒，以及将包含体衍生病毒悬浮于稳定介质中；包含体衍生病毒的提取没有使用胰蛋白酶处理，也没有在VPM3介质中使用血清。
12.杆状病毒产品，其根据上述任何一个权利要求所述方法生产。
全文摘要
本发明涉及制备大量杆状病毒的方法，其利用方法组合，包括感染性杆状病毒在幼虫中生成包含体以及在细胞培养液中连续传代而生成大量病毒颗粒。本发明设计了两个步骤首先在幼虫中生成感染性病毒，然后将所得到的感染性病毒作为接种物进行限定次数的连续传代细胞培养，进而生产大量的感染性杆状病毒。
文档编号C12N7/02GK1902308SQ200480040144
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月10日 优先权日2003年11月10日
发明者S·雷德, L·卢瓦 申请人:昆士兰大学