65)和HLA Α2限制性VLE (IE-I)肽表位在体外在IL-2 的存在下刺激脾细胞达10天，然后使用ICS分析评估细胞因子表达。图A显示了使用基 于CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL的疫苗制剂免疫之后CMV特异性CD8+T细胞的频 率。图B显示使用CMVpoly、CMVpoly-PL或CMVpoly-PTL蛋白免疫接种后，表达细胞因子 (IFN- γ，TNF和/或IL-2)不同组合的CMV特异性⑶8+T细胞的绝对百分比。误差棒代表 平均值土 SEM。*表示统计学显著（Ρ〈0. 05)。
[0065]图13 :具有蛋白酶体接头的爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV)多表位构建体的设计方案 和蛋白质纯化。图A显不具有蛋白酶体接头的EBV多表位蛋白（称为HWpoly)的设计。每 个可选择的CD8+T细胞表位序列以斜体和下划线表示。对于EBVpoly，每个表位序列是靶向 蛋白酶体降解靶标的氨基酸残基（以红色显示）所分开。图B显示EBVpoly蛋白的纯化。 编码EBVpoly蛋白质的DNA序列克隆到IPTG诱导质粒pjexpress 404,并转化到大肠杆菌 中用于蛋白质表达。使用Ni-NTA亲和层析来纯化EBVpoly蛋白，然后用SDS-PAGE分析。 EBVpoly预测尺寸为25Kd。
[0066] 图14 :使用EBVpoly蛋白在体外扩大来自健康血清阳性供体的EBV特异性⑶8+T 细胞。使用或不使用EBVpoly蛋白在体外刺激来自健康供体组（η = 8)的PBMC，在IL-2存 在下培养14天，然后使用ICS分析评估细胞的EBV特异性T细胞的扩大。条形图表示在使 用EBVpoly蛋白刺激之后，来自每个供体的EBV特异性⑶8+Τ细胞的比较百分比。
[0067] 图15 :CMV和EBV多表位蛋白的氨基酸序列和编码核酸的核苷酸序列。A :CMV多表 位是SEQ ID NO:42 ;编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :50 ;B :CMV多表位是SEQ ID NO :43 ;编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :51 ;C :CMV多表位是SEQ ID NO :44 ; 编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :52 ;D :CMV多表位是SEQ ID NO :45 ;编码CMV 多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :53 ;E :CMV多表位SEQ ID NO:46 ;编码CMV多表位的核 苷酸序列是SEQ ID NO :54 ;F :CMV多表位是SEQ ID NO:47 ;编码CMV多表位的核苷酸序列 是SEQ ID NO :55;G:CMV多表位是SEQ ID NO :48;编码CMV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :56 ;H :EBV多表位是SEQ ID NO :49 ;编码EBV多表位的核苷酸序列是SEQ ID NO :57。
【具体实施方式】
[0068] 本发明至少部分地确定了意想不到的发现：即，一种分离的蛋白，其包括多个疱瘆 病毒表位（诸如CMV和/或EBV表位），在作为外源蛋白施用给个体时该分离的蛋白可引起 保护性的、CD8+细胞毒性T细胞应答。看上去，施用时外源蛋白是由新的、细胞TAP非依赖 性的、蛋白酶体和自噬依赖性途径进行处理，这通过在外源蛋白中加入蛋白酶体释放氨基 酸进行辅助。这导致处理过的CMV表位以HLA I类依赖性提呈至⑶8+细胞毒性T细胞。这 个意想不到的发现也至少部分涉及到避免或减少重组蛋白质聚集的改进的重组蛋白纯化 方法。使用这样的蛋白通常遇到的困难在于T细胞表位为疏水的和/或包含多个疏水性氨 基酸，这意味着该蛋白质易于疏水聚集，这可能损害以所述蛋白的CTL表位以上述方式被 处理的方式递送所述重组蛋白的能力。使用通常是疏水性的干扰TAP识别基序使其恶化。 本文中所述的改进的重组多表位蛋白纯化方法避免了或至少降低了多表位（polytope)蛋 白的聚集，从而允许多表位蛋白的有效递送和处理。本发明人还发现通过在分离的蛋白中 使用使用少于二十（20)个CTL表位来优化分离的多表位蛋白的生产、纯化和免疫。接着上 文，本发明利用特定的免疫原性组分，如toll样受体（TLR)激动剂，增强分离蛋白质的免疫 原性。
[0069] 在整个本说明书中，除非另外指出，"包括（comprise) "、"含有（comprises) "和"包 含（comprising) "用于包括性而非排他地，以使所述的整数或整数组可以包括一个或多个 其它未述及的整数或整数组。
[0070] 还应当理解的是，不定冠词"一个（a) "和"一种（an) "不应理解为单数不定冠词、 或者排除不定冠词所指的多于一个对象或不只是单个对象。例如，"一种"蛋白质包括一种 蛋白质，一种或多种蛋白质或多种蛋白质。
[0071] 在第一方面，一种分离的蛋白包括来自两个或更多不同疱瘆病毒抗原的多个CTL 表位每个的各氨基酸序列，所述分离的蛋白还包括在至少两个所述CTL表位之间的干扰氨 基酸或氨基酸序列，所述干扰氨基酸或氨基酸序列包含蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序 列，以及任选地，与抗原处理相关的转运子（transporter) (TAP)识别基序，其中所述分离 的蛋白通过以外源蛋白施用给动物能够引发细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。
[0072] 通过"分离的"，是指从其天然状态移除的、或以其它方式受到人为操作的材料。分 离的材料可以是实质上或基本上不含在其自然状态下通常与之相伴的组份，或者可以被操 作以便在人工状态下结合在其自然状态下通常与之相伴的组份。
[0073] 如本领域中公知的，"蛋白质"是指氨基酸聚合物，其包括本领域公知的天然和/或 非天然氨基酸、D-或L-氨基酸。
[0074] "肽"是具有不多于五十（50)个氨基酸的蛋白质。
[0075] "多肽"是指具有多于五十（50)个氨基酸的蛋白质。
[0076] 如本文所使用的，分离的蛋白可以称为分离的多表位或多表位蛋白。例如，分离的 "CMV多表位"，"EBV多表位"或分离的"CMV多表位蛋白"或"EBV多表位蛋白"。
[0077] 另外，在本发明的上下文中，"外源的"蛋白或多表位蛋白是动物外部产生的随后 向动物施用的蛋白。有效地，外源的蛋白质是施用或可施用到动物，而不是将编码所述蛋 白的核酸或遗传构建体递送至动物后通过动物原位生产或表达（例如，由动物的细胞或组 织）。优选的外源的蛋白质是在分离的宿主细胞中离体产生的重组蛋白，例如细菌宿主细 胞。
[0078] 如本文所用，"CTL表位"是肽、或所述肽的氨基酸序列，其能够刺激或激活细胞毒 性T淋巴细胞以在合适的MHC I类分子环境中识别靶细胞提呈表位。靶细胞的识别可以包 括或导致细胞因子的产生（例如，IFN-γ、IL-2、MIP-I β和/或TNF)，改变细胞表面标记 物表达（例如，CD107a)和/或裂解和/或杀死靶细胞。
[0079] 通常，尽管非排他地，CTL表位包括源自、获自或基于相应的疱瘆病毒抗原的7、8、 9、10、11、12、13、14或15个连续氨基酸。
[0080] 多表位蛋白优选地包括源自多个不同CMV蛋白抗原的多个CMV和/或EBV CTL表 位。优选地，该表位为选自pp50、pp65、ppl50和IE-L的CMV抗原的表位，和/或选自BMLFl、 LMP2a、BRLFl、LMP2、EBNA3A、BZLFl、EBNA3C、EBNAl 以及 EBNA3B 的 EBV 抗原的表位。
[0081] 适当地，CMV和/或EBV多表位蛋白包括选择的CTL表位以提供群体的广泛覆盖。 在人类中，这其中就包括 HLA I 类特异性 HLA-Al，-A2、-A3、-Al I、-A23、-A24、-A26、-A29、-A 30、-B7、-B8、-B27、-B35、-B38、-B40、-B41、-B44、-B51、-B57、-B58 和-cw6。
[0082] 在某些实施方案中，CTL表位限制在表1或表2中显示的HLA I类特异性中。
[0083] 在具体的实施方案中，CMV多表位蛋白包括多个HLA I类限制性的CTL表位，其选 自表 1(SEQ ID N0:l-21)或表 3(SEQ ID N0:22-41)。
[0084] 在具体的实施方案中，EBV多表位蛋白包括选自表3(SEQ ID N0:22-41)的多个HLA I类限制性CTL表位。
[0085] 还应当理解的是，本发明考虑包含源自相同或不同疱瘆病毒（如CMV和/或EBV) 的CTL表位。因此，分离蛋白的一个实施方案包括来自CMV和EBV抗原两者的CTL表位。
[0086] 合适地，所述多个表位包括总计少于二十个（20)表位。
[0087] 在一个具体的实施方案中，所述多个表位包括总计十（10)至十五个（15)表位。
[0088] 一个具体实施方案提供了一种分离的蛋白，其包含如表2所示的十三个（13) 个CMV CTL表位。在一个优选实施方案中，所述表位的至少一个包括CMV氨基酸序列 VTEHDTLLY(SEQ ID NO :11)。
[0089] 全长，连续多表位蛋白包含如SEQ ID NO :42-48所示的氨基酸序列，并显示在图 15A-G。
[0090] 还应当理解，如在国际公开WO 03/000720所述，可以使用其它CMV CTL表位。
[0091] 一个具体实施方案提供了一种分离的蛋白，其包含如在表3中所示的十三个（13) 个EBV CTL表位。全长、连续的EBV多表位蛋白包含如SEQ ID NO :49所示的氨基酸序列， 如图15H所示。
[0092] 还应当进一步理解的是，其它EBV CTL表位可以使用，如在国际公开 W095/024925 ;W0 97/45444 ;W0 99/02550 和 WO 04/041849 所述。
[0093] 分离的多表位蛋白可进一步包含一种或多种HLA II类限制性CTL表位。
[0094] 本领域技术人员可以理解，可定制选择表位以适应任何人群、种族或其它个体的 组。
[0095] 纳入疱瘆病毒多表位的其它标准包括以下：（i)具有很少或没有序列变异；（ii ) 选自具有最少亚型的HLA 在健康血清阳性中具有高频率的CTL应答；和（iv)基于表 位疏水性，其中个体表位中的新相继次序被布置为使得疏水性是沿着多表位长度均匀分布 以帮助细胞间移动。
[0096] 此外，应当理解的是，构成的CTL表位的特定数量和次序可以容易地改变而同时 保持宽的HLA I类限制性的免疫原性。
[0097] 除了 CTL表位，分离的蛋白可进一步包括干扰氨基酸或氨基酸序列。干扰氨基酸 或氨基酸序列可以存在于至少两个CTL表位氨基酸序列之间，或在每个相邻的CTL表位氨 基酸序列之间。
[0098] 适当地，干扰氨基酸或氨基酸序列相对所述的CTL表位氨基酸序列进行定位或放 置以有利蛋白酶体体处理，和运送蛋白酶体产生的、各CTL表位肽进入内质网（ER)用于后 续使用HLA-I类分子提呈。
[0099] 在一个实施方案中，所述干扰氨基酸或氨基酸序列是蛋白酶体释放氨基酸或氨基 酸序列。
[0100] 蛋白酶体释放氨基酸或氨基酸序列的非限制性实例是或包括AD、K或R。
[0101] 在一个可选的实施方案中，干扰氨基酸或氨基酸序列是TAP识别基序。典型地， TAP识别基序可以符合下式：(R/N :I/Q :W/Y)n，其中η是彡1的任意整数。
[0102] TAP识别基序的非限制性实例包括RIW、RQW、NIW和NQY。
[0103] 在一个优选形式中，CMV和/或EBV的CTL表位通过蛋白酶体释放氨基酸序列连 接或接合，任选地TAP识别基序在每个表位的羧基末端。
[0104] TAP识别基序、蛋白酶体释放氨基酸及其相对于CTL表位氨基酸序列的位置的非 限制性实例分别示于表1和表2,并且也显示在图1(SEQ ID N0:58)和图15A-H(SEQ ID NO: 42-49)中所示的多表位氨基酸序列中。
[0105] 令人惊奇的是，一旦施用，包含干扰氨基酸或氨基酸序列的外源蛋白通过新的、细 胞TAP非依赖性蛋白酶体和自噬依赖性途径进行处理。这导致处理的CMV表位经HLA I类 依赖性提呈至⑶8+细胞毒性T细胞。
[0106] 因此，TAP氨基酸序列可以被省略或不存在，在这种情况下，建议或预期TAP-非依 赖性途径可以充分地处理该分离的蛋白以促使通过HLA-I类分子进行提呈。
[0107] 在另一个实施方案中，分离的多表位蛋白可进一步包括一种或多种CD4+辅助性T 细胞表位。
[0108] 还应当理解，本文所描述的分离的蛋白可以进行进一步的修改、变化和/或衍生 过程，而不脱离本发明的概念。
[0109] 氨基酸序列中的变异可以是在疱瘆病毒多表位蛋白中天然存在的序列变异结果。
[0110] 在本领域中可以理解，一些氨基酸可以改变为其它具有广泛相似性质而不改变分 离蛋白活性性质的氨基酸（保守取代）。
[0111] 通常情况下，进行保守取代以使得氨基酸性质如电荷、亲水性、疏水性和/或侧链 大小或"蓬松性（bulkiness) "被保留或至少改变最少。
[0112] 可以在肽合成或通过编码核酸诱变容易地实现氨基酸取代的引入。
[0113] 核酸的诱变方法的非限制性实例提供在⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY 的第九章中，Ausubel 等人，同上，Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9110747，Shafikhani 等人，1997,Biotechniques 23304，Jenkins 等人，1995,EMBO J. 144276-4287 和 Zaccolo 等人，1996, J. Mol. Biol. 25558 和试剂盒，诸如 QuickChange?定 点诱变试剂盒（Stratagene)和Diversify?随机诱变试剂盒（Clontech公司）。
[0114] 通常，本发明关注的蛋白质变体个别地或组合地与组成型CTL表位序列具有至少 75%、优选至少80%、更优选至少85%或甚至更优选地至少90、91、92、93、94、95、96、97、98 或99%氨基酸序列同一性。在其它实施方案中，这可以包括CTL表位的一（1)个、两（2) 个、三（3)个氨基酸残基的保守变异或取代。
[0115] 在本文中使用的术语"序列同一性"以其最广泛的意义包括使用标准算法进行合 适的比对的精确氨基酸匹配的数目，与所述序列在比较窗中一致性的程度有关。使用计算 机算法可以确定序列同一性，例如公开于Altschul等人，1997, Nucl. Acids Res. 253389 中的，如程序的GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST家族。序列分析的详细讨论见于⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 的 19. 3 单元中，Ausubel 等人编·（John Wiley&Sons Inc NY, 1995-1999)〇
[0116] 如本文所用，本发明的"衍生"蛋白质已被改变，例如本领域中所理解的通过缀合、 融合其它蛋白序列、通过与其它化学部分络合或通过翻译后修饰技术。
[0117] 氨基酸的"附加"可包括与其它蛋白质的氨基酸序列融合，例如，协助重组蛋白纯 化和/或鉴定的"融合伴侣"或"表位标签"。
[0118] 融合伴侣的公知的例子包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶（GST)，人IgG的Fc部 分、麦芽糖结合蛋白（MBP)和六组氨酸（HIS 6)，它们特别用于通过亲和层析分离融合多肽。 对于通过亲和层析纯化融合蛋白的目的，用于亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽、直链 淀粉、和镍或钴缀合树脂。许多这样的基质以"试剂盒"的形式提供，如用于（HIS6)融合伴 侣的 QIAexpress?系统（Qiagen)和 Pharmacia GST 纯化系统。
[0119] 另一个本领域中公知的融合伴侣是绿色荧光蛋白（GFP)。此融合伴侣用作荧光"标 签"，其允许本发明的融合蛋白以通过荧光显微镜或流式细胞仪来鉴定。当评估本发明的融 合多肽的亚细胞定位时，或分离表达本发明的融合多肽的细胞时，GFP标签是有用的。流式 细胞方法，如荧光激活细胞分选（FACS)在后一种应用中特别有用。
[0120] 优选地，融合伴侣还具有蛋白酶切割位点，如Xa因子或凝血酶，其允许相关的蛋 白酶部分消化本发明的融合蛋白，从而从其中释放本发明的重组蛋白。然后释放的蛋白质 可以从通过随后的色谱分离从融合伴侣分离。
[0121] 根据本发明的融合伴侣还包括在其范围内的"表位标签"，其通常为特异性抗体可 用的短序列。表位标签的公知例子对于特定的单克隆抗体是容易获得的，包括c-myc、流感 病毒血细胞凝集素和FLAG标签。
[0122] 本发明考虑的其它衍生物包括但不限于，修饰侧链、生物素化、荧光染料修饰、在 肽、多肽或蛋白质的合成中并入非天然氨基酸和/或其衍生物，使用交联剂以及加强本发 明分离的蛋白构象约束的其它方法。本发明关注的侧链修饰的实例包括：氨基修饰，如通过 酰化；通过0-酰基异脲形成接着进行衍生激活碳二亚胺进行的羧基修饰；巯基修饰，如通 过过甲酸氧化为磺基丙氨酸方法；形成水银衍生物；形成混合二硫化物；色氨酸残基的烷 基化；酪氨酸残基的硝化；以及通过烷基化进行的组氨酸残基的咪唑环修饰；而不限于此。
[0123] 非天然氨基酸的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟 基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基 甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
[0124] 在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明的上述分离的蛋白。
[0125] 本发明的分离的核酸可以用于在动物体内表达重组蛋白质，或在宿主细胞中用于 随后重组蛋白纯化的目的。
[0126] 本领域技术人员将理解可以利用遗传密码子简并性的优点以改变氨基酸序列的 编码核苷酸序列。
[0127] 在一个特定实例中，可以根据在生物体或细胞类型中密码子偏好或使用对核苷酸 序列进行工程化从而优化在所述生物体或细胞类型中编码蛋白质的翻译和表达。
[0128] 如本文所用的术语"核酸"指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA和DNA，所述DNA包括 cDNA和基因组DNA。
[0129] 核酸可以包括基因编码的碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶， 或经修饰的碱基如肌苷、甲肌苷（methylinosine)和甲肌腺苷（methyladenosine)、硫代和 甲基胞嘧啶，而不局限于此。
[0130] 如本文所用的术语"重组"是指通过人工操作遗传材料而人工产生的，例如在本领 域中理解为通常落入"重组DNA技术"范围的技术。
[0131] "多核苷酸"是指具有八十（80)个或更多个连续核苷酸的核酸，而"寡核苷酸"具 有少于八十（80)个连续的核苷酸。
[0132] "探针"可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，例如适当标记用于在Northern或 Southern印迹中检测互补序列。
[0133] "引物"通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续的核苷酸，其能够退火到 互补核酸"模板"，以及通过激活DNA聚合酶，如Taq聚合酶、RNA依赖性DNA聚合酶或 SequenaseTM以模板依赖性方式扩增。
[0134] "扩增产物"是指通过核酸扩增技术产生的核酸产物。
[0135] 分离的核酸的一个实施例包括如SEQ ID NO:50-57中任一项所示的和在图15中 所示的核苷酸序列。
[0136] 根据本发明还包括分离的核酸，其编码如上所述的分离的蛋白的变体和/或衍生 物。
[0137] 在一些实施方案中，核酸变体编码如上所述的分离的蛋白变体。
[0138] 在其它实施方案中，核酸变体编码本文所公开的分离的蛋白、或其变体，所述核酸 变体采用的核苷酸序列改变由遗传密码子冗余所造成。在一种特定形式中，这种变体是"密 码子优化"的以在特定生物体或细胞类型中表达。
[0139] 分离的核酸变体可以与编码分离多表位蛋白的分离核酸在高严谨洗涤条件下杂 交。
[0140] 高严谨条件包括和包含：
[0141] ( i )用于在42°C杂交的至少约31% v/v到至少约50% v/v的甲酰胺、以及至少 约0.0 lM到至少约0. 15M的盐，用于在42°C洗涤的和至少约0.0 lM到至少约0. 15M的盐；
[0142] ( ii )用于在65°C杂交的 l%BSA、lmM EDTA、0. 5M NaHPO4(pH7. 2)、7% SDS，和用于 在超过65°C的温度中洗涤约 1 小时的（a)0. 1XSSC、0. 1% SDS ;或（b)0. 5%BSA、lmM EDTA， 40mM NaHPO4 (ρΗ7· 2)、I % SDS ;以及
[0143] (iii)0.2XSSC、0. 1% SDS用于在或超过68°C洗涤约20分钟。
[0144] 在另一个实施方案中，分离核酸变体可具有与参考核酸相比的至少60%、70%、 75%、80%、85%、90%、或95%的序列同一性。参考核酸的非限制性实例包括如SEQIDN0 : 50-57中的任一项所述的核苷酸序列。
[0145] 本发明的另一个方面提供了一种遗传构建体，其包括本发明的分离的核酸、或其 变体。
[0146] 遗传构建体可便于分离的核酸的增殖、克隆和/或表达。
[0147] 在一个优选形式中，遗传构建体是表达构建体，其包括可操作地连接至存在于表 达载体中的一个或多个调控序列的本发明的分离核酸。
[0148] "表达载体"可以是自我复制的染色体外载体，如质粒，或整合入宿主基因组的载 体。合适地，所述表达载体提供所述一个或多个调控核苷酸序列。通过"可操作地连接"是 指，所述调控核苷酸序列相对于本发明的重组核酸定位以启动、调节或以其它方式控制转 录。
[0149] 调控核苷酸序