一种具有免疫效果的基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种从半滑舌鳎中分离的，与免疫有关的新基因，并进行体外重组表达，获得重组表达产物、鉴定重组表达产物抗病活性及功能，为半滑舌鳎病害防治及绿色饲料添加剂、抗菌剂提供基因资源和技术方法。本发明基因编码如下的蛋白质：a)氨基酸序列为SEQ?ID?NO:2的蛋白质；b)包含a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白质；c)在a)或b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有a)中蛋白质活性的蛋白质。本发明的基因与免疫抗病密切相关，其基因表达量与病原刺激相关，其体外重组蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌、阳性菌及病毒的增殖，因此，在半滑舌鳎病害防治、绿色饲料添加剂及杀菌剂方面有应用潜力。
【专利说明】一种具有免疫效果的基因
【技术领域】
[0001]本发明属于功能基因筛选【技术领域】，具体涉及一种从半滑舌鳎中分离的，与免疫有关的新基因，命名为CsghClq基因。
【背景技术】
[0002]半滑舌鳎是我国北方及东南沿海重要的海水养殖鱼类，具有较高的经济价值。其人工养殖年产值已达15-20亿元人民币。然而,近年来随着海水污染问题的加剧而导致陆地周边养殖环境的不断恶化，半滑舌鳎养殖规模的不断扩大，长期使用具有某种优良性状鱼种进行多代近亲繁殖等诸多原因导致半滑舌鳎种质发生退化，抗病力下降。海水中存在大量半滑舌鳎致病菌如鳗弧菌，发光杆菌等，病害严重直接导致半滑舌鳎的幼苗成熟率低，给半滑舌鳎养殖业带来了严重影响，现在病害问题已经成为制约半滑舌鳎产业发展的瓶颈之一。为了治疗及预防疾病，在传统养殖实践中通过在饲料中添加化学药物来实现，不但大大增加了养殖成本，而且导致了药物残留问题严重，该问题直接影响了半滑舌鳎的商品质量，降低了成品价值，使养殖业遭受了更多的损失。同时大量使用抗生素类药物提高了致病微生物的抗药性，进而使其他的海水鱼类养殖业面临同样严峻的挑战；因此，开发高效绿色低成本的抗病方法是解决该问题的关键所在，对免疫基因的研究成果，可作为高抗病性半滑舌鳎家系的筛选依据。将获取的免疫相关蛋白进行加工制作成绿色环保高效的新型抗病渔用药物可作为半滑 舌鳎治疗疾病的新突破点。
[0003]鱼类是天然免疫和适应性免疫并存的脊椎动物，在鱼类对外界刺激及病原生物侵袭的防御反应中，天然免疫起着重要作用。半滑舌鳎的免疫相关基因研究已获得初步进展。现已完成了对激活免疫反应的部分基因的克隆及表达分析如主要组织相容性抗原(MHC)的IIA、IIB、Ia基因的分子克隆、基因结构及表达分析[Tian-jun Xu, Song-1inChen, Xiang-shan Ji, et al., Fish and Shellfish Immunology, 2009, (27): 192-201] ；Toll样家族的 TLR9 的分离及表达鉴定[Yan Yu, Q1-wang Zhong, Chun-mei Li, et al.,Fishand Shellfish Immunology, 2009, (26):492-499];半滑舌鳎 TLR 信号通路中重要的信号转导功能的接头蛋白髓样分化分子(MyD88)在不同病原体刺激下的表达模式[沙珍霞，王娜，王启龙等.中国水产科学，2010，(4):659-670];半滑舌鳎IRF-7基因的克隆及表达分析[刘万建，史成银，宋展等.渔业科学进展，2012，(5):39-47];同样可以直接用于清除病原菌或病原物的免疫反应下游基因如鹅型溶菌酶在不同组织的表达模式也得到了初步研究[Zhen-xia Sha, Q1-1ong Wang, Yang Liu, Fish and ShellfishImmunology, 2012, (32): 914-921]。根据相应的研究结果结合育种方法可以筛选获得高抗病性半滑舌鳎家系，提高半滑舌鳎养殖经济效益。然而先前进行的研究多集中于对免疫基因的克隆及表达分析，对于基因的功能性研究还极度匮乏，不利于后续绿色药物及抗体的开发。
[0004]鱼类补体系统是天然免疫系统的关键组分,其中，Clq(Complementlq)是补体系统经典途径的重要识别分子，能够启动经典途径，并且在固有免疫和特异性免疫之间发挥主要的连接作用[Kishore U, Reid KB.1mmunopharmacology, 2000, 49 (1-2): 159-170]。除此以外，众多含有与补体Clq分子类似的Clq球状结构域(Clq domain-containingprotein, ClqDC protein)的非补体蛋白分子，共同组成了一个薪新的Clq蛋白家族[Kishore U, Reid KB.1mmunopharmacology, 1999, 42(1-3):15-21 ；Kishore U, GaboriaudC, Waters P, et al.Trends Immunol, 2004，25(10): 551-561]，ClqDC 蛋白包含一些非常重要的信号传导分子，在适应性免疫调节、炎症调节和维持机体平衡等方面发挥关键作用[Ghebrehiwet B, Hosszu KK, Valentino A, et al.Front Immunol, 2012, 3:52],有些 ClqDC 蛋白可作为药物开发的重要靶点，具有成为新型治疗药物的潜力。ghClq蛋白是ClqDC蛋白中的一类，在物种中含量丰富，具有非常重要的功能。在鱼类中，关于ClqDC蛋白的研究报道很少，关于补体分子ghClq的克隆、表达变化、重组蛋白制备及活性分析则未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从半滑舌鳎中分离的，与免疫有关的新基因，并进行体外重组表达，获得重组表达产物、鉴定重组表达产物抗病活性及功能，为半滑舌鳎病害防治及绿色饲料添加剂、抗菌剂提供基因资源和技术方法。
[0006]本发明涉及一种基因(命名为CsghClq),该基因编码如下的蛋白质:
[0007]a)氨基酸序列为SEQ ID NO:2的蛋白质；
[0008]b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白质；
[0009]c)在a)或b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有a)中蛋白质活性的蛋白质。
[0010]上述的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ；
[0011]本发明还提供用于重组表达上述蛋白的重组质粒，以及转化或转染有重组质粒的转化体；
[0012]本发明的基因可用于制备亚单位疫苗；
[0013]本发明的蛋白用于制备用于病害防治的制品；
[0014]本发明蛋白还用于制备饲料添加剂或抗菌剂。
[0015]本发明的基因与免疫抗病密切相关，其基因表达量与病原刺激相关，其体外重组蛋白能够明显抑制革兰氏阴性菌、阳性菌及病毒的增殖，因此，在半滑舌鳎病害防治、绿色饲料添加剂及杀菌剂方面有应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:本发明基因cDNA全长序列及氨基酸序列分析图；
[0017]图2:感染鳗弧菌后半滑舌鳎不同免疫组织中CsghClq基因表达水平分析；
[0018]图3:半滑舌鳎CsghClq重组蛋白的SDS-PAGE电泳、蛋白纯化及纯化蛋白验证图；
[0019]其中:A:CsghClq重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，M代表蛋白marker ；1:pET_32a空载体转化对照；2:PET-32a-ghClq诱导前；3:pET_32a-ghClq诱导；
[0020]B = CsghClq重组蛋白在细胞破碎后的SDS-PAGE电泳图，M代表蛋白marker ;1、2分别代表超声波破碎后菌液沉淀和上清中的蛋白；
[0021 ] C:纯化CsghClq重组蛋白SDS-PAGE电泳图，M代表蛋白marker ； I代表纯化后的蛋白；
[0022]D:CsghClq重组蛋白的western印记，右侧为marker ;左侧是单一条带western印记；
[0023]E:肽指纹图谱和基峰。
[0024]图4 =CsghClq重组蛋白对革兰氏阴性菌抑菌曲线图；
[0025]图5 =CsghClq重组蛋白对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抑菌效果图。
[0026]A:CsghClq重组蛋白浓度0.lmg/ml时抑菌效果；B:CsghClq重组蛋白浓度0.025mg/ml时抑菌效果；C:不加CsghClq重组蛋白时金黄色葡萄球菌菌落。
[0027]图6 =CsghClq重组蛋白对病毒的抑制效果图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合附图实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0029]一、半滑舌鳎免疫相关基因CsghClq的克隆及其序列
[0030]半滑舌鳎CsghClq基因cDNA部分序列来自于中国水产科学研究院黄海研究所水产基因组学及细胞工程研究室构建的半滑舌鳎混合免疫组织cDNA文库的EST，通过对克隆进行Sanger测序，获得其cDNA全长，其全长序列为SEQ ID NO:1 (图1)。并对cDNA序列及其编码的蛋白质进行了分析，CsghClq蛋白序列为SEQ ID N0:2(图1)。半滑舌鳎CsghClq基因的cDNA全长905bp，其中包括ORF (开放阅读框)768bp，编码255aa (氨基酸)以及5' -UTR(非编码区)25bp，3' -UTRl12bPo利用SMART软件分析推测的氨基酸序列，确定信号肽的位置为l_19aa ;61_102aa的位置为复合螺旋区；117_255aa的位置为补体Clq的球端；用Swiss-Model预测了 ghClq的球状结构域模型,预测结果表明ghClq的球状结构域是有10个β折叠形成的β桶的结构；并用ClustalXl.83对多序列进行了比对，比对结果表明CsghClq的球状区高度保守(图1)。
[0031]二、半滑舌鳎免疫基因CsghClq在鳗弧菌感染后的免疫组织中的表达模式
[0032]采用适时定量PCR技术分析了鳗弧菌感染半滑舌鳎后CsghClq基因在不同免疫相关组织(血液、肝脏、脾脏、小肠、头肾、皮肤)的表达情况，表达分析结果表明，感染了鳗弧菌后，CsghClq基因在血液、头肾、脾脏中迅速出现上调，在感染12h后，表达量都有不同程度的升高；而在肠、肝脏中，CsghClq基因在感染12h后表现为下调，在感染24h后，在肠、肝脏中的表达出现明显上调。以上结果表明CsghClq基因参与了免疫应答(图2)。CsghClq基因在不同组织中表达检测的具体步骤为:
[0033](I)半滑舌鳎不同组织总RNA的提取及反转录:分别对感染组和对照组的半滑舌鳎(2龄)腹腔注射等量的鳗弧菌(0.2ml，滴度5.06 X 105CFU/ml)和PBS溶液，取感染后0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h和7d八个时间点的血液、肝脏、脾脏、小肠、头肾、皮肤组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用常规方法通过M-MLV反转录酶(Takara)反转录成cDNA。
[0034](2)实时荧光定量PCR反应条件
[0035]根据半滑舌鳎CsghClq基因cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物CsghClq-RT_F(5’ ATTTTCACAGCAACCGT CAAGG3’) CsghClq-RT-R (5，AATCACTCCCTGAGGTGTCCCA3’)，对半滑舌鳎不同组织((血液、肝脏、脾脏、小肠、头肾、皮肤))中CsghClq的表达进行分析。
[0036]实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件(20 μ I反应体系):
[0037]10 μ I SYBR Taq
[0038]0.4 μ I primer F
[0039]0.4 μ I Primer R
[0040]0.4μ I Rox RD II[0041 ] I μ I cDNA (lOOng/ μ I)
[0042]7.8 μ I H2O
[0043]反应条件如下:
[0044]95°C IOs ；95°C 5s, 60°C 34s, 40 个循环
[0045]感染了鳗弧菌后，CsghClq基因在血液、头肾、脾脏中迅速出现上调，在感染12h后，表达量都有不同程度的升高；而在肠、肝脏中，CsghClq基因在感染12h后表现为下调，在感染24h后，在肠、肝脏中的表达出现明显上调。以上结果表明CsghClq基因参与了半滑舌鳎的免疫应答(图2)。
[0046]三、半滑舌鳎CsghClq基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌的重组表达和表达产物的分离纯化
[0047]采用常规PCR技术，扩增了 CsghClq基因的开放阅读框ORF区域，并将其克隆到pET-32a(+)表达载体上，构建了 CsghClq原核表达载体，将该表达载体转化大肠杆菌BL21中，进行了 CsghClq基因的体外重组表达，获得了重组表达产物，重组表达产物经过GE公司His-tag亲和层析柱纯化后，获得了纯化的CsghClq重组蛋白，重组蛋白分子量为46kD左右(图3)。实现上述目标的具体方案如下:
[0048]1.CsghClq重组表达载体的构建方法:
[0049]对PET_32a (+)载体序列和CsghClq基因ORF区序列进行酶切位点分析，设计了含有酶切位点 BamH 1.Hind III 的特异引物 PET-32-CsghClq-F 和 PET-32-CsghClq-R，序列如下:
[0050](PET-32-CsghClq-F:CGCGGATCCATGGCGAGGTTGTCAGGGG, PET-32-CsghClq-R:CCAAGCTTTTAGATTGGAAAGACCAAAAAACCAC)
[0051 ] 以肝组织cDNA为模板进行PCR反应，扩增CsghClq编码区。将PCR产物纯化后与克隆载体PMD18-T连接，将阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆质粒与PET-32a(+)同时用BamH I和Hind III进行双酶切，琼脂糖电泳回收CsghClq片段与表达载体质粒，按照连接酶说明书，用T4DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PET-32a_CshClq，转化大肠杆菌TOPlO感受态，将检测阳性克隆进行测序，测序正确的克隆提取质粒。再将PET-32a-CsghClq质粒转化表达感受态BL21 (DE3) pLysS细菌。
[0052]2.重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析
[0053]将pet-32 a-CsghClq转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态中，挑取阳性单克隆到Iml含有终浓度50 μ g/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37°C 200rpm摇动培养8h到对数生长期，按1:100扩大培养，37°C、200rpm振荡培养至0D600为0.4-0.6，加IPTG至终浓度lmM，28°C、200rpm诱导表达6h。取Iml表达后菌液与对照组空载体和未诱导的菌液进行蛋白表达的SDS-PAGE电泳初步检测，蛋白在46kDa有表达(图3A)。菌液于4°C，8000r/min离心5min，收集菌体，湿菌体中加入裂解液(裂解液:每Ig湿菌体中加入结合缓冲液10ml，DNAase I20U，MgCl220U，PMSF400 μ I (50mM)，溶菌酶 400 μ I (10mg/ml)。其中，结合缓冲液配制方法如下:每1000ml水中加入磷酸钠3.8g，氯化钠14.61g，咪唑1.02g)，室温裂解半个小时，然后冰浴中超声破碎20min，破碎条件为超声0.5s，暂停2s，功率为200W。在微量上清和破碎后的沉淀中分别加入等体积2 X SDS上样Buffer，煮沸5min ;进行SDS-PAGE电泳，结果表明沉淀中蛋白含量明显高于上清，CsghClq重组蛋白主要以包涵体的形式存在，结果见图3B。
[0054]3.半滑舌鳎CsghClq重组蛋白的纯化和验证
[0055]重组蛋白的分离纯化
[0056]将上述沉淀用7M尿素变性到基本溶解后，高速离心分离得到上清液，上清液用0.45 μ m微孔滤膜过滤后,经GE公司的HisTrap FF crude的纯化柱过柱,具体操作如下:
[0057]首先，用5mL蒸馏水洗ImL柱子一次，随后5ml结合缓冲液(20mM/L Na3P04,0.5MNaCl，20mM/L咪唑)洗柱子，再将收集的预处理的上清过柱子，流速为l_2mL/min，用5mL结合缓冲液洗柱子，再用5mL的洗脱缓冲液(20mM/L Na3P04,0.5M NaCl,500mM/L咪唑)洗脱一次，最后用5mL的结合缓冲液再生柱子。收集经过亲和层析后纯化的重组蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳检测，观察到重组蛋白分子量为46kD左右，纯化后的蛋白采用尿素透析液的浓度逐渐降低的方法复性蛋白，通过考马斯亮蓝方法检测浓度，采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋 白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行定量分析，具体操作按照说明书进7TT。结果见图3C。
[0058]重组蛋白的验证
[0059](I)western-blotting
[0060]SDS-PAGE不连续电泳结束后，利用电转法将蛋白转移至PVDF膜上，转移至膜上时应注意膜对着正极、凝胶对着负极，转膜时参数设置为200mA、lh ;转膜结束后用5% (5g脱脂奶粉溶解在100mLl XTBST缓冲液中)脱脂奶粉封闭，封闭时间为3个小时；以ant1-His为一抗(过夜结合)，稀释比例为1:7000、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗(结合为2h)稀释比例为1:5000，依次与PVDF膜结合，注意两次结合前后都应该用I X TBST缓冲液洗涤目的膜；最后用北京中衫金桥公司的DAB显色试剂盒进行显色，操作按照试剂盒说明书进行。结果显示纯化蛋白条带单一，且符合预测大小(46KD)，结果见图3D。
[0061](2)质谱分析
[0062]考马斯亮蓝染色的目的蛋白切割下来后放在一个96孔板上，切割下来的胶首先要用60ul50mM的碳酸氢铵和50%氰化甲烧脱色两次；然后,干的page胶在12.5ng/ μ I的胰蛋白酶和20mM碳酸氢铵消化液中低温消化20分钟，之后在37°过夜消化；最后，用提取液(5%的甲酸溶解在50的氰化甲烷)提取两次，收集上清中的多肽。收集的上清多肽需要在氮气保护的环境下干燥，用8ul的基质溶液(5mg/ml α -cyano-4-hydroxy-cinnamic aciddiluted in0.1%TFA, 50%ACN)重新溶解，然后在基质复制激光电离目的板上点样，进行激光电解。使用ABSCIEX5800T0F/T0F质谱仪进行质谱分析。紫外激光设在400Hz的重复率，波长为355nm,加速电压设定在20kv,蛋白质质量的分辨率最大设定在1600Da,质谱仪器的内部校准模式是采用胰蛋白酶消化的肌红蛋白来进行校对的。所有获得的样品光谱是采用TOF/TOF ExplorerTM软件的默认模式处理的。得到的数据在MASCOT网上进行搜索比对，搜索的参数如下:数据库为表达理论序列，胰酶消化，允许最多一个错误断裂，质谱允许偏差设定在百分之一，检索的设置的容差范围为0.6Da。结果显示与预测氨基酸序列比对得分为202，大于16，说明此得分可靠；表达蛋白大小为28158Da，等电点6.49，测序结果覆盖率为40%，说明该序列正确。肽指纹图谱和Mascot检测结果分别见图3E、图3F。
[0063]5.纯化的CsghClq重组蛋白抑菌活性分析
[0064]采用打孔器打孔并测量抑菌圈的方法检测CsghClq重组蛋白对革兰氏阴性菌:哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、獲弧菌(Vibrioanguillarum)、的抑菌活活性，培养以上菌种至对数期，用PBS溶液稀释菌液至浓度为IO7~IO8个/ml，取稀释 后的菌液150 μ I涂平板，用6mm打孔器在每个平板上打五个孔，孔中分别加入2倍梯度稀释的蛋白，以及10mg/ml的氨苄做对照，各20 μ 1，每次三个重复，28°C或者35°C (细菌最适生长温度)培养箱培养12h后观察并测量抑菌圈。抑菌的最小浓度视为最低抑菌浓度。半滑舌鳎CsghClq重组蛋白对革兰氏阴性菌哈维氏弧菌、假单胞菌和鳗弧菌均有抑菌活性，都观察到了明显的抑菌圈。相同浓度的CsghClq重组蛋白对哈维氏弧菌的抑制作用最强，对鳗弧菌的抑制作用次之，对假单胞菌的抑制作用最低。对哈维氏弧菌、鳗弧菌、假单胞菌最小抑菌浓度分别为0.043mg/ml、0.087mg/ml、0.174mg/ml (图4)。
[0065]用菌落计数法测量抑菌效果的方法检测CsghClq重组蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活活性,培养金黄色葡萄球菌至对数期,用PBS溶液稀释菌液至浓度为IO7~IO8个/ml，取稀释后的菌液80 μ 1，加入20 μ I不同浓度的CsghClq重组蛋白涂平板，以及10mg/ml的卡那霉素做对照，各100 μ 1，每次三个重复，370C (细菌最适生长温度)培养箱培养12h后观察并测量抑菌圈。抑菌的最小浓度视为最低抑菌浓度。结果显示CsghClq重组蛋白对革兰氏阳性菌有抑菌活性，最小抑菌浓度为
0.025mg/mlo 见图 5。
[0066]6.纯化的CsghClq重组蛋白对病毒的抑制作用分析
[0067]神经坏死病毒(Nervous necrosis virus)通过匀衆方法从半滑舌鳎病鱼组织获得，将含病毒的匀浆上清液分别稀释10倍和100倍感染半滑舌鳎头肾细胞(第28代)，细胞在25cm2的培养瓶中培养，细胞接种密度为2X IO5个/ml，实验组分为3组:一组为不同稀释倍数的病毒感染组，一组为添加终浓度分别为0.06mg/ml和0.012mg/ml半滑舌鳎CsghClq重组蛋白的病毒感染组，另一组为正常培养细胞。每组设两个平行样。将细胞置于24°C培养。感染高浓度病毒(稀释10倍)的细胞在19h开始出现CPE，两个加入蛋白组的细胞都生长正常，CPE出现的时间有明显推迟，图6(a-c)。在44h比较各组细胞CPE程度，0.06mg/ml重组蛋白组的细胞CPE程度稍稍减轻，而加入0.012mg/ml重组蛋白组对病毒无明显抑制作用，结果见图6(d-f)。
[0068]对于感染低浓度病毒(稀释100倍)的细胞，加入0.012mg/ml的蛋白，其CPE程度降低；而0.06mg/ml的重组蛋白对此浓度病毒抑制作用极显著，基本没有细胞病变图6(g-1)。可见，半滑舌鳎CsghClq重组蛋白对病毒在体外培养细胞中的增殖有抑制作用。
[0069]四、CsghClq基因的应用
[0070]1.CSghClq基因可作为一个鉴定高抗病性半滑舌鳎个体的标记基因，取半滑舌鳎一小部分组织如抽取少量血液，剪取少量鱼鳍等，提取RNA通过实时定量PCR技术，筛选同一时期本基因表达量显著高于其他个体的半滑舌鳎进行家系培养，借此筛选获得高抗病家系的半滑舌鳎品种；
[0071]2.将本蛋白进行加工改造，做成抗体，通过直接注射到半滑舌鳎的幼鱼体内的方式提高半滑舌鳎的抗病能力，减少半滑舌鳎染病的几率该蛋白来自半滑舌鳎物种本身，并且是小分子蛋白，基本不会产生排异反应；
[0072]3由于本蛋白具有抗菌活性，可以作为药物释放到半滑舌鳎的养殖环境中，降低环境中病原数量，而且可以对蛋白进行改造后，作为一种治疗性的药物，用来治疗因病菌导致患病的鱼体，借此部分替代抗生素的使用，减少抗生素使用产生的不良影响；
[0073]4.实验中发现该蛋白具有较好的稳定性，可以在低温下保存较长时间，并且具有较好的抗菌作用，可以通过发酵工程大量制备后，作为一种食品添加剂使用加入到食品如鱼加工制品及其他熟食类食品，通过本蛋白的抑菌抗菌作用，减少腐败菌在食物中的繁殖，借此防止食品的快速腐败，实验表明，本蛋白在低温下可拥有数月的稳定性，足以满足大部分食品的保险工作，本蛋白人体可消化吸收，小分子无抗原性，对人体无影响，绿色环保，大量使用可部分替代现有的防腐剂，减少对人体的损害。
[0074]五、CsghClq基因的衍生序列及功能分析
[0075]在构建CsghClq重组蛋白时，使用保真性最差的taq酶去扩增目的基因，获得的序列存在碱基变化，借此获得了多种差异序列，通过重组蛋白活性检测发现只要gClq功能域中的关键氨基酸不发生替换，蛋白功能就不会发生变化这个实验证明氨基酸的变化对蛋白的功能影响较小，说明即使在本发明的CsghClq蛋白的基础上进行适当的改造并不会影响本发明蛋白的功能。 蛋白的功能在于拥有相应的功能域，本实验通过使用氨基酸替代后，进行抑菌活性、抑病毒活性分析(参照本说明书三、半滑舌鳎CsghClq基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌的重组表达和表达产物的分离纯化中记载的方法及检测标准)，发现作出如下改变并不影响结构域的形成，进而不会影响蛋白功能:
[0076]1、N端19个信号肽氨基酸的缺失及任意改变，并不影响本蛋白的功能。
[0077]2、1_116号氨基酸属于非功能域，其对应的基因进行定点突变导致的部分碱基的替换、添加、缺失不影响该基因表达出的蛋白具有本发明中蛋白的功能。将氨基酸序列为SEQ ID NO: 2的蛋白的前116个氨基酸进行相应改造后，还具有与氨基酸序列为SEQ ID NO: 2的蛋白相近的功能。
[0078]3、本发明基因编码的蛋白具有一个疏水性内核，该内核由多个疏水残基构成，主要包括 126 (F)、128 (A、V、M)、145 (L、I)、150 (V、I)、165 (F)、169 (V、I)、172 (V、A、L)、175 (F)、217(V、A、M)、219(L、I)、221 (L)、227 (V、1、M、L)、247 (F)、251 (L、I)、252(V、L、I)等氨基酸
残基位点，通过对相应位点中的氨基酸使用不同氨基酸替换发现，仍可形成疏水性内核，故在本蛋白的基础上对部分氨基酸进行替换不影响本蛋白功能。
[0079]几个进行改造后的序列范例:SEQ ID NO:3的蛋白，相比于SEQ ID NO:2的蛋白，其在 123、124、164、172、221、223、261 位置的氨基酸分别由 k、1、T、K、Ι、Τ、I 变为 Q、V、A、Q、V、M、M后，抑菌活性、抑病毒活性没有变化(P < 0.05);序列为SEQ ID NO:4的蛋白，相比于SEQ ID NO:2 的蛋白，其在 161、162、220、260、261 位置的氨基酸由 S、P、A、P、I 变为 D、S、V、Q、V后，原245和249位氨基酸之间增加N、D、Q氨基酸之后，抑菌活性、抑病毒活性没有变化(P < 0.05)。序列为SEQ ID NO:5的蛋白，相比于SEQ ID NO:2的蛋白，原1-19位氨基酸存在缺失，原132-134位之间增加E、S氨基酸，在161、162、220、260、261位置的氨基酸由S、P、A、P、I变为D、S、V、Q、V后，原187、188位氨基酸G、E缺失，原213和214位氨基酸D、E缺失，抑菌活性、抑病毒活性没有变化(P < 0.05)。序列为SEQ ID NO:6的蛋白，相比于SEQID NO:2的蛋白，原1-43位氨基酸存在缺失，原81-83位氨基酸存在缺失，原112-117位氨基酸存在缺失，原132-134位之间增加E、S氨基酸，在161、162、220、260、261位置的氨基酸由S、P、A、P、I变为D、S、V、Q、V后，抑菌活性、抑病毒活性没有变化(P < 0.05)。序列为 SEQ IDNO:7 的蛋白，相比于 SEQ IDNO:2 的蛋白，其在 124、138、139、221、222、260、261 位置的氨基酸由1、1、V、1、L、P、I变为L、L、L、1、Q、L后，抑菌活性、抑病毒活性没有变化(p< 0.05)。因此，本领域的技术人员可以通过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸来获得本发明蛋白的衍生蛋白。
【权利要求】
1.一种基因，其特征在于，所述的基因编码如下的蛋白质: a)氨基酸序列为SEQID NO:2的蛋白质； b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白质； c)在a)或b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有a)中蛋白质活性的蛋白质。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQID NO:1。
3.一种蛋白，其特征在于，所述的蛋白由权利要求1所述的基因编码的，包括有: a)氨基酸序列为SEQID NO:2的蛋白质； b)包含或至少含有a)中第117-255位的氨基酸，具有a)功能的蛋白质； c)在a)或b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，且具有a)中蛋白质活性的蛋白质。
4.如权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:3—7中任一项。
5.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于表达权利要求3所述的蛋白。
6.一种转化体 ，其特征在于，所述的转化体为转化或转染有权利要求5所述的重组质粒的菌株或细胞。
7.利要求I所述的基因在制备亚单位疫苗中的应用。
8.权利要求3所述的蛋白在制备用于病害防治的制品中的应用。
9.权利要求3所述的蛋白作为饲料添加剂或抗菌剂的应用。
10.一种具有免疫和/或抗菌效果的制品，其特征在于，所述的制品包含有权利要求3所述的蛋白或权利要求1所述的基因，其中所述的制品为饲料添加剂或抗菌剂。
【文档编号】C12N15/12GK104004765SQ201410249584
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】沙珍霞, 陈亚东, 曾艳, 向晋松, 路飏, 陈松林, 公光业, 王天姿, 邵长伟 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所