专利名称：可直接检测基因的免冲洗pcr扩增管的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于基因扩增和直接检测的PCR扩增管(PCR扩增管是本领域技术人员熟知的技术名词)，尤其是指一种可直接检测扩增产物的免冲洗PCR扩增管。
二、技术背景目前，在分子生物学研究和医学临床诊断过程中，聚合酶链式反应(PCR)技术是不可缺少的。PCR通常是在一个封闭的管腔内进行，它可以将被检测的靶基因放大数万至数百万倍。但是，基因扩增之后，一般需要用电泳等方法对扩增产物进行检测。由于PCR方法灵敏度极高，其扩增产物在检测过程中不可避免的会进入空气中。当进行下一次试验时，这些飘浮在空中的产物将可能又被扩增出来，这就是PCR检测容易获得所谓“假阳性”的原因。为此，国际上一些生物技术公司发展了封闭式的基因扩增和检测技术。如荧光定量PCR技术。但是，该技术需要有十分复杂的动态光学检测装置，检测仪器十分复杂，在我国很难推广。同时，该技术每次试验只能检测一个基因的信息，不能满足生物信息时代人们需要对大量基因信息的检测的要求。
基因芯片技术为人们同时检测大量基因信息提供了工具。基因芯片把许多不同的核酸探针(单链寡核苷酸)固定于玻片上。把样品中基因的扩增产物标记荧光，并与芯片上的核酸探针进行杂交，通过荧光扫描仪进行检测。虽然基因芯片获得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于细胞的mRNA表达检测等实验室研究应用。在重要病原微生物检测方面，至今没有成熟的应用实例和过硬的产品问世。就其主要原因在于样品的处理、扩增标记、杂交、检测等操作过程都是分开来单独进行的，由此导致现有技术存在着操作繁琐、复杂的缺陷，并因此而增加了污染的机会，降低了所得结果的可靠性。尽管目前已将基因扩增技术与芯片检测方法合为一体，但其特点是整个基因扩增过程在一个微反应池中进行，因而，需要对器件的同一部位反复地升温降温，这将无法对结果进行动态跟踪和实时定量分析。为此，国内外一些研究者提出把基因芯片与微流体技术相结合，来实现所有操作过程的一体化。申请人对此也进行了研究，并已提出了基因扩增微阵列探针循环检测型生物芯片等。然而，由于这种芯片制备困难，并需要研制专门的反应器与之配套，故其成本很高。同时，基因芯片要求靶基因的扩增产物标记荧光，通过荧光信号来检测核酸探针的杂交状态。这就要求在样品处理过程中要掺入荧光，这不仅提高了样品处理的成本，增加了难度和不确定因素。而且，在这个过程中因标记效率问题，影响检测的可靠性。同时，由于整个操作过程的的复杂性提高，如样品处理过程的条件控制和杂交后非特异探针的反复清洗等，不利于集成化检测。因此，发展可以对被检测的基因序列进行非标记检测的低成本的生物芯片技术是实现生物芯片在医学和生命科学等领域中大量实际应用的关键之一。
三、技术内容技术问题本发明提供一种能使基因扩增、杂交及检测一体化操作方法的操作得以简便、靶基因扩增时无需掺入荧光、成本得以降低且可使所得结果的可靠性得以提高的可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管。
技术方案本发明即一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管由管盖11和管体12组成，在用于PCR的反应管1内固定有分子信标2。
有益效果①由于本发明将分子信标设置于反应管内反应管自身能够构成一个相对封闭的空间，使基因扩增、杂交及检测一体化的操作方法可以按如下步骤在上述相对封闭的空间内完成A)将制备好的待扩增基因提取物、扩增液(包括相应的引物和酶等)加入反应管本体中，把盖帽紧扣在反应管上；B)把封闭好的反应管放置于相应的基因扩增仪中进行扩增；基因扩增仪可以使用各种流行的仪器，也可以是通过改进的专用的扩增杂交和检测一体化仪器；C)将管内扩增后的溶液流倒固定的分子信标区域，与管内表面上的分子信标进行作用，控制一定的温度使其进行特异性的杂交；D)通过光学检测方法，读出反应管上分子信标的荧光信号，从而获得基因的杂交信息。而这种方法正是由于有了本发明，才能通过一些简单的操作，实现基因扩增、杂交、检测操作的连续，而且无需在靶基因的扩增过程中加入荧光基团等标记物，避免在PCR扩增后打开扩增管，以清洗非特异性杂交的靶基因，以及加入杂交液等操作，不仅简化了操作步骤，更重要的是完全避免了PCR扩增产物的检测假阳性并使该方法可以采用现有的设备或是对现有设备稍加改进后的设备，降低了成本。分子信标与普通的核酸探针(单链核酸探针)不同。分子信标是由荧光基团、荧光淬灭基团、和双链核酸的茎杆区、单链环形核酸区等4部分组成的。其中，单链环形核酸区为分子信标与被检测的靶基因杂交识别的区域。当分子信标与靶基因结合后，双链核酸的茎秆被打开，从而使荧光集团和荧光淬灭基团之间的距离改变，引起分子信标的荧光发光性质的改变。而普通的核酸的DNA单链探针是通过与被标记有荧光分子的靶基因杂交，实现检测的。分子信标一般直接在溶液中检测靶基因，但这只能检测一种靶基因。本发明用固定化的分子信标法检测靶基因，不仅可以同时对多个基因进行检测，而且可以无需对靶基因掺入荧光等特殊的操作处理，也无需对杂交后芯片上的非特异性吸附进行清洗，以降低荧光背景。木发明就是把分子信标直接固定于PCR扩增管内，在PRC扩增管内实现基因扩增和杂交检测一体化。分子信标内的荧光基团和荧光猝灭基团，在杂交检测时，用于与分子信标杂交的核酸片断不需要进行荧光标记，杂交后，核酸片断与分子信标结合，使分子信标内部具有的荧光基团和荧光猝灭基团在空间分开，其荧光基团的信号可以被检测，同时，没有进行杂交的分子信标具有的荧光基团和荧光猝灭基团在空间上保持微小距离，荧光信号不能被检测到，所以不需要进行冲洗，减少了操作步骤，降低了检测的难度。综上，本发明能使基因扩增、杂交及检测一体化操作方法的操作得以简便、成本得以降低且可使所得结果的可靠性得以提高，并可实现免冲洗。
②由于本发明能使操作方法进行多遍扩增、杂交及检测，故本发明能够使该方法实现动态跟踪检测并获得定量结果。
③本发明采用“将分子信标通过化学活性基团连接在透明窗口上”的连接，具有结合牢固，不容易脱离，可多次反复使用的优点，同时需要的检测样品少，分子探针的密度高。
④本发明“把分子信标固定于高分子凝胶介质中，再固定在透明窗口上”的技术措施提高了固定分子信标的密度，增强了杂交信号，使所得结果的可靠性得以进一步提高。
⑤本发明“把透明窗口分割成若干区域，分别在不同的区域上组装具有不同或相同碱基排列方式的核酸序列分子信标”的方法，可以在一次PCR试验中对数个甚至数万个基因片断进行杂交检测，可进行高通量的检测。
四
图1是本发明的结构示意图。
图2是本发明分子信标的直接化学连接关系图。
图3是本发明实施例的局部结构示意图。
图4是本发明实施例的局部结构示意图。
五、具体实施方案实施例1 一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管由管盖11和管体12组成，在用于PCR的反应管1内固定有分子信标2，在PCR反应管内固定分子信标的区域上有透明窗口3，分子信标2固定透明窗口3内侧，分子信标2通过化学活性基团R连接在透明窗口3上，本实施例可以采取如下具体连接方式将分子信标连接固定在透明窗口上1.在聚苯乙烯等透明塑料窗口、玻璃等表面上通过等离子体激活、紫外辐射激活、和化学激活等方法，在透明窗口表面上连接化学活性基团，如氨基、醛基、氰基、巯基等，再利用上述化学活性基团与分子信标上的化学基团反应，把分子信标连接到透明窗口上。
2.对透明塑料窗口、玻璃表面的修饰方法有很多种，如戊二醛修饰法、聚赖氨酸修饰法、巯基修饰法、多糖修饰法、BSA-NHS修饰法、水凝胶修饰法等，透明玻璃窗口的化学处理放入由1/3过氧化氢(30％)和2/3硫酸(18M)组成的溶液中，浸泡1小时(21)。再用去离子蒸馏水冲洗3遍；放入去离子蒸馏水煮沸10分钟；在氩气流下干燥，于干燥处保存备用。
氨基硅烷化处理将预处理后的基片浸入含有1％3-aminopropyltriethoxysilane(氨基硅烷)的95％丙酮/水的溶液10分钟，取出后，用丙酮和去离子水冲洗干净，在120℃下干燥45分钟后，置于干燥处保存。将硅烷化后的玻片放入含3％～4％戊二醛的PBS溶液中，室温浸泡2小时，取出，洗净，用氮气吹干，置于4℃保存备用。
BSA-NHS修饰制备将已经硅烷化的透明塑料窗口、玻片放入含有1.76g N-N′-disuccinimidyl carbonate，1.2 ml N-N′-diisopropylethylamine，和68.8ml N-N′-dimethylformamide(DMF)的溶液A中，室温反应3小时后取出，浸入含1％BSA的PBS溶液室温放置12小时，然后取出放入溶液A中，室温继续反应3小时，取出，洗净吹干备用。
琼脂糖修饰处理琼脂糖加双蒸水配制成1％的琼脂糖水溶液，完全混合煮沸3分钟。在每一片已经硅烷化的透明塑料窗口上都倾倒2ml的琼脂糖水溶液，待凝固后于37℃下过夜干燥，室温干燥条件下保存。使用前用20mM的NaIO4水溶液活化，再用双蒸水洗净即可。
巯基修饰处理配制含巯基硅烷1％的甲苯溶液，将要处理的透明塑料窗口放入溶液中，室温下过夜。取出玻片，用三氯甲烷、丙酮等有机溶剂清洗，吹干。
聚赖氨酸修饰处理将清洗干净的透明塑料窗口放入含3％聚赖氨酸的PBS溶液中浸泡2小时，洗净，吹干，于4℃保存。
实施例2 一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管由管盖11和管体12组成，在用于PCR的反应管1内固定有若干分子信标2，分别用于检测非典型性肺炎相关的冠状病毒的特定基因片断和甲型、乙型流感病毒的特定基因片断，在PCR反应管内固定分子信标的区域上有透明窗口3，分子信标2固定透明窗口3内侧，本实施例把透明窗口分割成若干区域，分别在不同的区域上组装具有不同或相同碱基排列方式的核酸序列分子信标，本实施例还可以把分子信标2固定于高分子凝胶介质4(如聚丙烯酰胺、琼脂糖、聚乙烯醇等)中，再固定在透明窗口3上。检测样品经病毒裂解处理后，放入免冲洗PCR扩增管中，同时加入反转录PCR(RT-PCT)试剂和冠状病毒和甲型、乙型流感病毒的扩增引物，封闭扩增管后，进行PCR反应装置上进行扩增反应。扩增完成后，将扩增产物引入窗口区；若在检测样品中存在有被检测的病毒，则在相应的分子信标固定区域将可检测到荧光信号。
实施例3 一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管由管盖11和管体12组成，在用于PCR的反应管1内固定有若干分子信标2，分别用于检测非典型性肺炎相关的冠状病毒的特定基因片断和甲型、乙型流感病毒的特定基因片断，在PCR反应管内固定分子信标的区域上有透明窗口3，分子信标2固定透明窗口3内侧，在本实施例中，在透明窗口3上设有透明的高分子凝胶层(如聚丙烯酰胺、琼脂糖、聚乙烯醇等)，再把分子信标2固定于高分子凝胶介质层上。
权利要求
1.一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管(1)由管盖(11)和管体(12)组成，其特征在于在用于PCR的反应管(1)内固定有分子信标(2)。
2.根据权利要求1所述的可直接检测基因的免冲洗PCR反应管，其特征在于在PCR反应管内固定分子信标的区域上有透明窗口(3)，分子信标(2)固定透明窗口(3)内侧。
3.根据权利要求1或2所述的可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，其特征在于分子信标(2)通过化学活性基团(R)连接在透明窗口(3)上。
4.根据权利要求1或2所述的所述的可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，其特征在于把分子信标(2)固定于高分子凝胶介质(4)中，再固定在透明窗口(3)上。
5.根据权利要求1或2所述的所述的可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，其特征在于在透明窗口(3)上设有透明的高分子凝胶层，再把分子信标(2)固定于高分子凝胶介质层上。
6.根据权利要求2所述的所述的可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，其特征在于把透明窗口分割成若干区域，分别在不同的区域上组装具有不同或相同碱基排列方式的核酸序列分子信标。
全文摘要
本发明公开了一种可直接检测基因的免冲洗PCR扩增管，包括反应管且该反应管由管盖和管体组成，在用于PCR的反应管内固定有分子信标，在PCR反应管内固定分子信标的区域上有透明窗口，分子信标固定透明窗口内侧。本发明将分子信标引入技术方案后，能使基因扩增、杂交及检测一体化操作方法的操作得以简便、靶基因扩增时无需掺入荧光、成本得以降低且可使所得结果的可靠性得以提高。
文档编号C12P19/34GK1448500SQ0311338
公开日2003年10月15日 申请日期2003年5月1日 优先权日2003年5月1日
发明者陆祖宏, 刘全俊, 王宏 申请人:东南大学