免疫组库分析中样品污染的检测和定量的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于检测和定量个体的包含T细胞和/或B细胞的组织样品中的核酸污染的方法，其用于产生基于序列的克隆型谱。在一个方面，本发明通过测量借以可将来自预期个体的核酸与非预期个体的核酸区分开的内源性或外源性核酸标签的存在和/或水平来实现。内源性标签包括遗传身份标志物，诸如短串联重复序列、稀有克隆型等，且外源性标签包括用于确定来自序列读段的克隆型序列的序列标签。
【专利说明】免疫组库分析中样品污染的检测和定量
[0001] 本申请是W下每一个美国专利申请的部分继续申请案（continuation-in-part): 2013年3月15日提交的系列号13/835, 093和2013年3月15日提交的系列号13/834, 794， 并且要求来自W下的优先权；2012年4月13日提交的美国临时申请系列号61/624, 002 ; 2012年6月11日提交的系列号61/658,317 ;2012年12月17日提交的系列号61/738, 277 ; 和2013年2月22日提交的系列号61/768, 269 ;前述申请的每一个通过应用W其整体并入 本文。
[0002] 发明背景
[0003] 随着DNA测序的每个碱基成本已经下降，并且测序技术已变得更可靠和方便，正在 使用大规模DNA测序开发越来越多的诊断和预后应用，例如，F址am和Willis,美国专利公 布 2010/0151471 ;Rreeman 等人，Genome Research, 19:1817-1824(2009) ;Boyd 等人，Sci. Transl.Med. 化a23(2009) ;He 等人，Oncotarget(March 8, 2011);化lomaki 等人 Genet. Med. , 14 (3) : 296-305 (2012) ;Kohlmann 等人，Semin. Oncol. , 39 (1) : 26-36 (2012)。 特别是，编码免疫分子，诸如T细胞或B细胞受体，或其组分的核酸谱，包含了关于生物体 的健康或疾病的状态的大量信息，使得已提出了此类谱作为用于各种状况的诊断或预后指 标的用途，例如F址am和Willis( W上引用）；Boyd等人（W上引用）；化等人（W上引 用）。此外，此类基于序列的谱能够有比基于扩增的编码CDR区的尺寸分布、由微阵列序列 取样、来自PCR扩增子的杂交动力学曲线或其他方法大得多的灵敏度，例如Morley等人，美 国专利 5, 418, 134 ;van Dongen 等人，Leukemia, 17:2257-2317 (2003) ;0gle 等人，Nucleic Acids Research, 31: el39 (2003) ;Wang 等人，BMC Genomics, 8:329(2007) ;Baum 等人， 化1:山"6 Methods, 3 (11) : 895-901 (2006)。
[0004] 然而，与在采用扩增步骤的其他基于DNA的测定中一样，污染或交叉污染DNA的存 在可降低采用免疫组库（immune r巧ertoire)测序的测定中检测的有效限值（effective limit)。污染DM的来源包括测定试剂、设备，操作者的处理、气溶胶等，例如化ban等人， J.化rensic Sci.，45 化）：1307-1311 (2000) ;Kwok, 142-145 页，于 Innis 等人，编著，PCR Protocols (Academic Press, 1990)。
[0005] 癌症的微小残留病（minimal residual disease, M畑）的检测受该样的污染 影响。对于许多癌症进行治疗的患者常常保留与癌症相关的MRD。目P，即使患者可具有 响应于治疗的由临床测量的疾病的完全缓解，因某种原因或其他原因避开破坏的小部分 癌细胞可得W保留。该残留群体的类型和尺寸是患者的继续治疗的重要预后因素，例 如 Campana'Hematol. Oncol. Clin. North Am. ,23 巧）：1083-1098(2009) ;Buccisano 等 人，Blood, 119(2) : 332-341 (2012)。因此，MRD的测量越灵敏，随后的治疗过程将越可能 成功，例如 Szcz巧anski 等人，Best Pract. Res. Clin.化ematol. , 15 (1) : 37-57 (2002)。 已开发了用于评估该群体的几种技术，包括基于流式细胞仪、原位杂交、细胞遗 传学、核酸标志物的扩增等的技术，例如Buccisano等人，化rrent化inion in 0ncology，21:582-588(2009) ;van Dongen 等人，Le址emia, 17 (12): 2257-2317 (2003);等。 由于此类区段（本文还称为"克隆型（clonotype)")通常具有可用作用于其相关癌症细胞 的分子标签的独特序列，编码重组免疫受体的区段（即克隆型）的核酸的基于PCR和序列 的分析对于评估白血病和淋己瘤中的M畑是特别有用的，例如Van Dongen等人（如上引 用）；F址am和Willis,美国专利公布2011/0207134 ;等。然而，此类技术的灵敏度仍受到来 自其他个体的交叉污染的存在的限制。
[0006] 鉴于基于序列的诊断和预后应用的潜在影响，如果存在用于方便检测并定量样品 污染可用的方法，特别是在其中处理大量患者样品的设置下使用免疫组库测序的测定中， 将是非常期望的。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明提出了用于检测和定量免疫组库测定中污染性核酸的方法。本发明举例说 明了 一些实施方案和应用，其中的一些列于W下及整个说明书中。
[0009] 在一个方面，本发明涉及用于确定个体的包含T细胞和/或B细胞的组织样品的 克隆型谱（clonotype profile)中的污染水平的方法，其中所述方法包括W下步骤；（a)从 个体获得组织样品，该组织样品包含来自个体和可能来自一个或更多个其他个体的核酸， 该核酸包括来自T细胞和/或B细胞的重组核酸和非重组核酸；化）由组织样品的核酸生 成克隆型谱；（C)测序来自组织样品的核酸的一个或更多个基因座上的遗传标志物，W基 于根据遗传标志物的个体和一个或更多个其他个体的遗传鉴定获得来自一个或更多个其 他个体和来自所述个体的核酸的比例，其中遗传标志物出现在重组核酸和非重组核酸两者 中存在的基因座上，W及（d)确定克隆型谱中的污染性核酸的水平为组织样品的核酸中存 在的来自一个或更多个其他个体的核酸的比例。
[0010] 在另一个方面，W上方法还包括W下步骤；（i)测量所述组织样品中所述核酸的 总量；（ii)测量所述组织样品中所述重组核酸的总量；（iii)测序所述非重组核酸中存在 且所述重组核酸中不存在的核酸的可切除区段中的一个或更多个基因座上的遗传标志物， W获得来自所述个体和来自所述一个或更多个其他个体的所述非重组核酸的比例；W及 (iv)由所述组织样品的所述核酸中的污染性重组核酸的水平确定所述克隆型谱中的污染 性核酸的所述水平，污染性重组核酸的水平由W下来确定；核酸的总量、所述重组核酸的总 量、来自所述个体和来自所述一个或更多个其他个体的所述核酸的所述比例、W及所述个 体和所述一个或更多个其他个体的所述非重组核酸的比例。
[0011] 在另外的方面，本发明涉及用于确定个体的包含T细胞和/或B细胞的组织样品 的克隆型谱中相关克隆型的检测限的方法，所述方法包括W下步骤；(a)从个体获得组织 样品，该组织样品包含来自个体和可能来自一个或更多个其他个体的核酸，该核酸包括来 自T细胞和/或B细胞的重组核酸和非重组核酸；化）由组织样品的核酸生成克隆型谱； (C)测序来自组织样品的核酸的一个或更多个基因座上的遗传标志物，W基于根据遗传标 志物的所述个体和所述一个或更多个其他个体的遗传鉴定获得来自一个或更多个其他个 体和来自所述个体的核酸的比例，其中遗传标志物出现在重组核酸和非重组核酸两者中存 在的基因座上，W及（d)确定检测限为对于个体的一个或更多个基因座的任何等位基因的 水平为邻近最高的任何所述遗传标志物的等位基因的水平（determining the limit of detection as the level of an allele of any of said genetic markers next highest to that of any allele of the one or more loci of the individual)。
[0012] 本发明的该些W上特征方面，W及其他方面W-些说明性的实现和应用来示例， 其中的一些示于附图并表征于w下的权利要求书部分。然而，w上概述不意在描述本发明 的各个说明性实施方案或每个实现。
[0013] 附图简述
[0014] 本发明的新颖特征特别地记载在所附的权利要求书中。参考示出其中利用本发明 的原则的说明性实施方案的W下详细的说明书获得本发明的特征和优势的更好的理解，并 且其附图如下：
[0015] 图1A示意性地示出了用于扩增用于本发明的遗传标志物的典型方案。
[0016] 图1B示意性地示出了样品中的核酸，其包含患者核酸和污染性核酸，诸如来自一 个或更多个其他患者的遗留DNA。
[0017] 图1C示出了特定基因座上的遗传标志物的等位基因之间的序列读段的分布。
[0018] 图1D示意性地示出了样品中的DNA，其包含患者的非重组核酸（P。）和重组核酸 化）W及非重组核酸（C。）和重组核酸也）污染性核酸，诸如来自一个或更多个其他患者的 遗留DNA。
[0019] 图1E-1F示出了通过取样标记附加独特序列标签至核酸分子的实例。
[0020] 图1G示出了 I巧转录物和其内自然变异的来源。
[002。 图2A-2C示出了用于扩增TCR目基因的两阶段PCR方案。
[0022] 图3A示出了确定图2C的PCR产物的核巧酸序列的详细信息。图3B示出了确定 图2C的PCR产物的核巧酸序列的另一个实施方案的详细信息。
[0023] 图4A示出了在单一反应中由I巧链产生H个测序模板的PCR方案。图4B-4C示 出了用于在H个单独反应中由I巧链产生H个测序模板的PCR方案，在H个单独反应之后， 组合所得的扩增子用于加入P5和P7引物结合位点的第二PCR。图4D示出了对于I巧链产 生的序列读段的位置。图4E示出了 V和J区的密码子结构改进NDN区的碱基调用化ase call)的用途。
[0024] 图5示出了根据与相同序列标签相关的序列读段确定克隆型的序列的步骤的一 个实现。
[00幼发明详述
[0026] 除非另有指明，本发明的实践可采用，在本领域的技术范围内的分子生物学（包 括重组技术）、生物信息学、细胞生物学、和生物化学的常规技术和描述。此类常规技术包 括，但不限于，血细胞的取样和分析、核酸测序和分析等。合适的技术的具体说明可参考本 文W下的实施例。然而，当然，还可使用其他等同的常规方法。此类常规技术和描述可参 见标准实验室手册诸如 Genome Analysis:A L油oratory Manual Series(.I-IV卷）；PCR Primer:A Laboratory Manual ;and Molecular Cloning:A Laboratory Manual (全部来自 冷泉港实验室出版）；等。
[0027] 本发明涉及用于检测和定量用于产生克隆型谱的个体的组织样品中的核酸污染 的方法。特别是，感兴趣的核酸污染是起源自其他个体遗留污染，诸如起源自患者至患者或 测定操作者至患者的遗留污染，其中包含来自一个或更多个其他个体的克隆型的DNA不适 当地与意在测量的个体的DNA混合。此类遗留污染的存在可导致具有重大医学利益的克隆 型，诸如与癌症，诸如白血病相关的克隆型的存在和量的假性估计。
[0028] 在一个实施方案中，来自其他个体的核酸污染可通过测量具有不同于感兴趣的个 体，即意在测量或测定的个体的基因身份的基因身份的DM的量或比例来确定。核酸在组织 样品中的基因身份可通过基于短串联重复序列、单核巧酸多态性等的常规遗传鉴定测定来 确定，诸如公开于W下文献中的，其通过引用并入本文；Caskey等人，美国专利5, 364, 759 ; Weber 美国专利 5, 075, 217 Shumaker 等人，Human Mutation, 7:346-354(1996) ;Sobrino 等人，Forensic Sci. Int. , 154 (2-3) : 181-194 (2005) ;Mark, P'Ja^rvissenschaften, 84:181 -188(1997);等。如图lA中所示，典型地，基因组DM中的遗传标志物将具有可包含SNP或 STR连同分别的上游和下游侧翼区（172)和（174)的多态性区（170)，其可用于将遗传标志 物（170)定位在基因组上并提供引物结合位点用于其扩增和分析。在一个实施方案中，上 游和下游引物（176)和（180)连同来自免疫细胞的重组核酸可分别用于W两阶段PCR扩增 遗传标志物（170)(如图2A-2B和4B-4C所示）。在此类实施方案中，引物（176)和（180) 分别具有尾部（178)和（182)，其具有允许与在两阶段PCR的第二阶段中用于扩增重组核 酸的引物相同的引物用于扩增遗传标志物（170)的序列。尾部还可包含鉴定遗传标志物的 基因座的条形码或标签（例如，W鉴定其为来自基因座1、2、3、或等，参考图1A)。如W下所 述，尽量选择引物（176)和（180)的位置和长度使得其退火和解链温度与用于扩增重组核 酸的那些大约相同（例如图2A的（212)并使得所得扩增子具有与重组核酸分子的扩增子 大约相同的长度和GC含量。
[0029] 示例性实施方案示于图1B中。在该图中，从组织样品中提取的核酸（100)表示为 垂直线（101)，既指示来自感兴趣的个体，诸如患者，的基因组或基因组的片段，又指示来自 其他个体的基因组或基因组的片段，即污染性核酸（104)。全部个体在位点1、2、3、和4上 将具有遗传标志物，其对于感兴趣的个体具有值Si、S2、S3、和S4 (108)，W及对于污染性DNA 具有值S/、S2'、S3'、和S/ (110)，当然，如果污染来自一个W上其他个体，其可在各基因座 上包括一个W上的值。在任何情况下，如W下所提到的，感兴趣的个体的值可与可存在于组 织样品中的来自其他个体的值区分开。如果预先未知感兴趣的个体基于该些标志物的基因 身份，其可由测定中产生的信息来确定。假定感兴趣的个体的DNA将是核酸的主要级分，例 如80%、90%、95%，等，则相应于遗传标志物的不同等位基因的序列读段的分布将偏斜至 相应于感兴趣的个体的等位基因，即主要等位基因，如图1C中对于遗传标志物基因座1所 不。对于基因座1，比如说遗传 t不志物Si,具有六个等位基因，SiA、Sie、Sic、SiD、SiE和Sip。具 有最高数目序列读段（152)的等位基因，Sk，将相应于感兴趣个体的等位基因。Sk的一些 序列读段（150)可起因于其他个体，并且一些可分布在其他等位基因，例如（154)。从来自 其他基因座的单独计数的序列读段，可建立并求解线性方程组W产生来自感兴趣个体和来 自其他个体的核酸的比例的估计值。（例如，两个未知数可W是xi =来自感兴趣个体的遗 传标志物的总序列读段的比例，且x,=来自其他个体的遗传标志物的总序列读段的比例）。 序列读段在各遗传标志物的不同等位基因中的分布可用于鉴定感兴趣的个体所具有的等 位基因。克隆型谱测量的最大灵敏度的测量（例如对于检测相关克隆型，诸如白血病克隆） 通过最大非患者等位基因的值来提供，如由图1C中的线（155)所示。如果假定存在具有等 位基因 S1D的单一污染性基因组，则具有比S1D的值更大的值的任何克隆型将是患者克隆 型的精确测量。对于W小于S1D等位基因的水平的水平存在于克隆型谱中的任何克隆型， 存在克隆型不起源于患者的可能性。
[0030] 在一个方面，本发明提供了用于确定个体的包含T细胞和/或B细胞的组织样品 的克隆型谱中的相关克隆型的检测限的方法，其中此类方法包括W下步骤；(a)从个体获 得组织样品，该组织样品包含来自个体和可能来自一个或更多个其他个体的核酸，该核酸 包括来自T细胞和/或B细胞的重组核酸和非重组核酸；化）由组织样品的核酸生成克隆 型谱；（C)测序来自组织样品的核酸的一个或更多个基因座上的遗传标志物，W基于根据 遗传标志物的所述个体和所述一个或更多个其他个体的遗传鉴定获得来自所述一个或更 多个其他个体和来自所述个体的核酸的比例，其中遗传标志物出现在重组核酸和非重组核 酸两者中存在的基因座上，W及（d)确定检测限为对于个体的一个或更多个基因座的任何 等位基因的水平为邻近最高的任何所述遗传标志物的等位基因的水平。
[0031] 在某些情况下，组织样品，诸如全血或PBMC中的细胞类型的比例（并因此重组DNA 对非重组DNA的比例），可在来自患者，例如经历治疗，诸如癌症化疗的样品和来自另一个 个体，诸如健康个体的污染之间显著不同。在该种情况下，另外的测量可确定源自来自可包 括污染性细胞或核酸的组织样品的不同细胞的核酸的不同级分。在本实施方案中，核酸的 此类级分可称为患者（或感兴趣的个体）非重组（P。)、患者重组（Pf)、污染非重组（C。)、污 染重组（Ct)。本发明的该方面示于图1D中，其是来自组织样品的核酸的组成的示意性表示。 两个条带（120)和（122)分别表示来自患者（或感兴趣的个体）的核酸和污染性核酸。患 者核酸对污染性核酸的示例性比例可W是约90:10。各条带进一步分为重组核酸（Pf (124) 和Cr(128))和非重组核酸任。(126)和C"(130))。如W上所提及的，在某些情况下，比例Py P。可非常不同于比例eye。。在各条带中，遗传标志物基因座Si至S4可用于确定患者核酸 对污染性核酸的比例，其是（P"+Pr) / ((；+Cr) = Rstri，其中Rstri是来自患者核酸的遗传标志物 的序列读段对来自其他个体的遗传标志物的序列读段的比例，即来自W上的Xi/X2。
[0032] 组织样品中的总核酸的量或浓度可将重组核酸和非重组核酸两者共同的核酸区 段，诸如"管家基因"，例如GAPDH(本文称为"共同区段"）的量，与用于此类区段、或基因的 一个或更多个内标（internal standard)比较来确定。例如，在一阶段或两阶段PCR中，在 处理之前，W已知的量或浓度将一种或更多种内标加入来自组织样品的核酸中。使用此类 总核酸内标，人们可获得组织样品中总核酸的值Wg，即，值Wg = Pf+Pt+Cf+C。。同样地，组织 样品中重组核酸的总量或浓度可通过将克隆型的序列读段的量与在处理之前加入至来自 组织样品的核酸的一个或更多个重组序列内标，例如V值)J内标的序列读段的量比较来确 定。在一个实施方案中，应用代表待分析的免疫组库特别是在长度和组成上代表待分析的 免疫组库的一组重组序列内标。在另一个实施方案中，此类一个或更多个重组序列内标的 数目可在1和10之间变化。使用此类内标，可确定值Wp = Cf+Pf。
[0033] 非重组核酸的比例或量可通过测量通常将在其中组装TCR和/或BCR的体细胞重 组过程，即V值)J重组，期间被切除的核酸的区段来确定。对于患者核酸和污染性核酸，此 类区段，本文称为"可切除区段"，分别由盒子（132)和（134)示于图1D中。一个或更多个 此类区段从重组核酸中切除，如线（133)和（135)所示，指示盒子（132)和（134)的不存 在。在TCR和BCR二者的V值)J重组期间，至少两个区段总是被切除并丢失；在包含V区基 因的基因组段（the stretch of genome)和包含D区基因的基因组段之间的第一切除的区 段，和在包含D区基因的基因组段和包含J区基因的基因组段之间的第二切除的区段。该 些区段的序列容易从公开可得的基因组图谱中获得，所述公开可得的基因组图谱诸如NCBI 基因组浏览器（NCBI Genome Browser) (ht1:p:// www.ncbi.nih.gov/map)，加利福尼亚大 学 Santa Cruz OJCSC)基因组浏览器（the University of 化lifornia, Santa Cruz OJCSC) Genome Browser) (ht1:p://genome.ucsc.edu/cgi-bin/h)、或类似的图谱。例如，编码人 BCR的V、D、和J基因见于基因组区14q32. 33中或附近；在J基因和D基因之间的第一切 除的区段具有位于人基因组的NCBI图谱的染色体14上坐标-106, 335K至-106, 345K内 的序列，且位于D基因和V基因之间的第二切除的区段具有位于人基因组的NCBI图谱的 染色体14上坐标-106, 40服至-106, 385K之间的序列。对于位于染色体7的7q32-35上 的编码人TCR目链的V、D、和J基因存在类似的可切除的区段，例如化dges等人，J. Clin. Pathol.，56:1-11 (2003)。在本发明的一个方面，非重组核酸，即，仍存在第一和第二切除的 区段的核酸的比例和/或量，可至少两种方式来确定。使用位于切除的区段中的多态 性遗传标志物，人们可比较来自患者（或感兴趣的个体）和来自污染性核酸的非重组核酸 的相对量。目P，比例pyc" =氏可由来自非重组核酸的遗传标志物的序列读段来计算。可 选地，人们可使用内标计算非重组序列的总数目。第一和/或第二切除的片段的此类内标 由W上NCBI序列使用常规技术容易地构建，诸如W下更充分讨论的。关于总核酸，此类测 量允许确定量P"+C。= Wy，其中Wx是非重组核酸的总数目或浓度。
[0034] W上测量和关系可概述于W下表中：
[00 巧]
【权利要求】
1. 一种确定待监测微小残留病的患者中遗留污染的方法，所述方法包括以下步骤： 由以下步骤通过定期地测量所述患者的克隆型谱监测患者的微小残留病： (i) 从个体获得包含T细胞和/或B细胞的样品； (ii) 将序列标签附着至T细胞和/或B细胞的T细胞受体基因或免疫球蛋白基因的重 组核酸的分子以形成标签-分子缀合物，其中所述标签-分子缀合物的基本上每个分子具 有独特序列标签； (iii) 扩增所述标签-分子缀合物； (iv) 测序所述标签-分子缀合物； (v) 从由相似序列标签比对的序列读段确定克隆型，并从此类克隆型生成克隆型谱； 以及记录克隆型谱的每次测量的序列标签的核苷酸序列；以及由随后克隆型谱中来自任何 先前克隆型谱的序列标签的存在、不存在和/或水平确定遗留污染。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述比对步骤还包括通过确定所述相似序列标签的 所述克隆型的每个核苷酸位置上的主要核苷酸确定每个所述标签-分子缀合物的每个所 述克隆型的核苷酸序列。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述附着步骤包括通过取样标记所述重组核酸分 子。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述附着步骤在反应混合物中实施，使得所述序列 标签以所述重组核酸分子浓度的至少100倍的浓度存在于所述反应混合物中。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述序列标签掺入进特异于所述重组核酸分子的引 物。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述克隆型是编码选自由以下组成的组的免疫受体 或免疫受体组分的区段的各25个至400个核苷酸的序列：IgH的VDJ重排、IgH的DJ重排、 IgK的VJ重排、IgL的VJ重排、TCRP的VDJ重排、TCRP的DJ重排、TCRa的VJ重排、 TCRy的VJ重排、TCRS的VDJ重排、和TCRS的VD重排。
7. -种用于确定个体的包含T细胞和/或B细胞的组织样品的克隆型谱中的污染水平 的方法，所述方法包括以下步骤： 从个体获得组织样品，所述组织样品包括来自所述个体和可能来自一个或更多个其他 个体的核酸，所述核酸包括来自T细胞和/或B细胞的重组核酸以及非重组核酸； 由所述组织样品的核酸生成克隆型谱； 测序来自所述组织样品的核酸的一个或更多个遗传基因座上的遗传标志物以基于根 据所述遗传标志物对所述个体和所述一个或更多个其他个体的遗传鉴定获得来自所述一 个或更多个其他个体以及来自所述个体的核酸的比例，其中所述遗传标志物出现在存在于 所述重组核酸和所述非重组核酸两者的基因座上；以及 确定所述克隆型谱中污染性核酸的水平为来自所述组织样品的核酸中存在的所述一 个或更多个其他个体的核酸的比例。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述比例由鉴定所述个体的一个或更多个所述遗传 标志物的序列读段和所述一个或更多个其他个体的一个或更多个所述遗传标志物的序列 读段的数目来确定。
9. 如权利要求7所述的方法，其中对所述个体鉴定遗传基因座上具有最高序列读段数 目的所述遗传标志物，且对来自所述一个或更多个其他个体的核酸鉴定各遗传基因座上的 剩余遗传标志物。
10. 如权利要求9所述的方法，其中所述污染水平与以下成比例：由基因座上的交叉污 染性核酸鉴定的遗传标志物的序列读段的最高数目除以由所述个体的另一个基因座上鉴 定的遗传标志物的序列读段的最低数目。
11. 如权利要求7所述的方法，所述方法还包括以下的步骤： 测量所述组织样品中所述核酸的总量； 测量所述组织样品中所述重组核酸的总量； 测序所述非重组核酸中存在的以及所述重组核酸中不存在的核酸的可切除区段中的 一个或更多个遗传基因座上的遗传标志物以获得来自所述个体和来自所述一个或更多个 其他个体的所述非重组核酸的比例；以及 由所述组织样品的所述核酸中污染性重组核酸的水平确定所述克隆型谱中污染性核 酸的所述水平，污染性重组核酸的水平由以下来确定：核酸的总量、所述重组核酸的总量、 来自所述个体与来自所述一个或更多个其他个体的所述核酸的所述比例，以及所述个体与 所述一个或更多个其他个体的所述非重组核酸的比例。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述可切除区段是在V(D)J重组期间切除的核酸 的区段。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述核酸包括来自人B细胞的重组核酸，并且所述 可切除区段包括在染色体14上编码D区的基因和编码V区的基因之间的区。
14. 如权利要求12所述的方法，其中所述核酸包括来自人T细胞的重组核酸，并且所述 可切除区段包括在染色体11上编码D区的基因和编码V区的基因之间的区。
15. 如权利要求11所述的方法，其中测量所述核酸的所述总量的所述步骤包括将已知 量的用于总核酸的一种或更多种内标与来自所述组织样品的所述核酸组合，使得所述核酸 的共同区段的数目可与所述一种或更多种内标的数目比较。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述共同区段包括选自由以下组成的组的基因的 部分：GAPDH、0 2-微球蛋白、18S核糖体RNA、和0 -肌动蛋白。
17. 如权利要求11所述的方法，其中测量所述重组核酸的所述总量的所述步骤包括将 已知量的用于重组核酸的一种或更多种内标与来自所述组织样品的所述核酸组合，使得所 述克隆型谱的克隆型的数目可与用于重组核酸的所述一种或更多种内标的数目比较。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述克隆型的每个包括编码V(D) J区的部分的序 列，并且其中所述测量的步骤包括以PCR使用来自相同集合的引物扩增来自所述组织样品 的所述核酸以及用于重组核酸的所述一种或更多种内标。
19. 如权利要求7所述的方法，所述方法还包括以下步骤： 测量所述组织样品中所述核酸的总量； 测量所述组织样品中所述重组核酸的总量； 测量所述组织样品中所述非重组核酸的总量；以及 由所述组织样品的所述核酸中污染性重组核酸的水平确定所述克隆型谱中污染性核 酸的所述水平，污染性重组核酸的水平由以下来确定：核酸的总量、所述重组核酸的总量、 来自所述个体与来自所述一个或更多个其他个体的所述核酸的所述比例，以及所述非重组 核酸的总量。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述非重组核酸的所述总量包括将已知量的用于 非重组核酸的一种或更多种内标与来自所述组织样品的所述核酸组合，使得非重组核酸中 存在的以及重组核酸中不存在的可切除区段的数目可与所述一种或更多种内标的数目比 较。
21. 如权利要求20所述的方法，其中所述核酸包括来自人B细胞的重组核酸，且所述可 切除区段包括在染色体14上编码D区的基因和编码V区的基因之间的区。
22. 如权利要求20所述的方法，其中所述核酸包括来自人T细胞的重组核酸，且所述可 切除区段包括在染色体11上编码D区的基因和编码V区的基因之间的区。
【文档编号】C12Q1/68GK104395481SQ201380031219
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年4月9日 优先权日:2012年4月13日
【发明者】托马斯·阿斯布瑞, 维多利亚·卡尔顿, 马利克·法哈姆, 斯蒂芬·梅斯维兹, 马丁·穆尔黑德, 托马斯·威利斯, 建标·郑 申请人:赛昆塔公司