病理或生理性病况的体外模型的制作方法

病理或生理性病况的体外模型的制作方法
【专利摘要】本发明总体上涉及模拟体内病理或生理性病况的体外方法。所述方法包括将剪切力施加至涂铺于细胞培养容器内的表面上的细胞类型。还描述在这类系统中测试药物或化合物的方法。
【专利说明】病理或生理性病况的体外模型

【技术领域】
[0001] 本发明总体上涉及模拟体内病理或生理性病况的体外方法。本发明也涉及在这类 系统中测试药物或化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 病理或生理性病况的常规体外模型总体上涉及在静态条件下培养一种或多种细 胞类型。然而，这类模型通常需要添加比在体内病理或生理性病况下观察到的浓度高得多 的浓度下的一种或多种因子。举例来说，为了在静态组织培养物中保持肝细胞，胰岛素和葡 萄糖必须以显著高于在健康个体体内观察到的浓度的浓度添加至培养基（对于葡萄糖，大 约2至4倍，并且对于胰岛素，约10, 000倍至40, 000倍）。类似地，在用于将血栓形成建模 的内皮细胞的常规静态单一培养物中，需要与在人循环血液中观察到的水平相比显著较高 水平的TNF α来诱导纤维蛋白沉积。
[0004] 此外，对于在体内诱导响应的浓度下的药物或化合物，常规系统经常不展现响应， 而是需要高得多浓度的药物或化合物来诱导相同响应。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明的一方面涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加 至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容 器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备 诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流 动。培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者，培 养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0007] 本发明的另一个方面是测试药物或化合物对于病理性病况的效应的体外方法。所 述方法包括模拟病理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物 的至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的 变化指示药物或化合物对于病理性病况具有效应。在此测试药物或化合物的体外方法中， 病理性病况可通过如上所述的模拟病理性病况的体外方法来模拟。
[0008] 本发明也提供测试药物或化合物的效应的体外方法。所述方法包括将培养基添加 至细胞培养容器、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上、将药物 或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切 力。培养基中的药物或化合物的浓度在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。剪 切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内所暴露 的流动。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物具有效 应。效应可为例如对于生理性病况的效应或对于病理性病况的效应。
[0009] 本发明的另一个方面是在体外模拟生理性病况的方法。所述方法包括将培养基添 加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养 容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设 备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的 流动。培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者， 培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0010] 本发明也涉及测试药物或化合物对于生理性病况的效应的体外方法。所述方法包 括模拟生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一 种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的变化指示 药物或化合物对于生理性病况具有效应。在此测试药物或化合物的体外方法中，生理性病 况可通过如上所述的模拟生理性病况的体外方法来模拟。
[0011] 本发明的另一个方面是在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括 将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种肝细胞类型涂 铺于细胞培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。剪 切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内病理或 生理性病况下所暴露的流动。模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可在病理性病况下 观察到的因子的体内浓度范围内。或者，培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合 物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案，培养基中的因子的浓度在剪切力下 能够保持在体外模拟的病理性病况一段时间，相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不 能保持在体外模拟的病理性病况一段时间。模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可在 生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或者，培养基中的因子的浓度可在体内施 用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案，培养基中的因子的浓 度在剪切力下能够保持在体外模拟的生理性病况一段时间，相同浓度的因子在不存在剪切 力的情况下不能保持在体外模拟的生理性病况一段时间。
[0012] 本发明也提供测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法。所述 方法包括模拟病理或生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化 合物的至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺肝细 胞类型的变化指示药物或化合物对于病理或生理性病况具有效应。在此测试药物或化合物 的体外方法中，病理性病况可通过如在前一段落中所描述的模拟病理或生理性病况的体外 方法来模拟。
[0013] 本发明的另一个方面涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包 括将培养基添加至细胞培养容器、将至少一种细胞外基质组分沉积在细胞培养容器内的表 面上、将肝细胞涂铺在至少一种细胞外基质组分上并且间接地对于至少一种细胞外基质组 分和肝细胞施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细 胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。
[0014] 本发明也提供在体外模拟肝的病理或生理性病况的另一种方法。所述方法包括将 培养基添加至细胞培养容器并且将肝细胞涂铺在多孔膜的第一表面上。多孔膜悬浮于细胞 培养容器中以使得第一表面为近端并且与容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在容器内 界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的 上部容积中的多孔膜的第二表面，剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动 模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。自喷设备包括适于定位于容器的上 部容积中的培养基中的主体和适于使主体旋转的电动机。
[0015] 附图简述
[0016] 图IA描绘在静态培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案。
[0017] 图IB和IC展示在静态培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结 果。
[0018] 图2A示出将动脉粥样硬化易发性（atheroprone)或动脉粥样硬化预防性 (atheroprotective)血液动力学流动施加至内皮细胞和平滑肌细胞的共培养物的示例性 方案。
[0019] 图2B展示在动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性血液动力学流动条件下 生长的内皮细胞和平滑肌细胞中，与血栓形成相关的基因的基因表达的示例性热图。
[0020] 图3A展示在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案。
[0021] 图3B展示在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结 果。
[0022] 图4A描绘在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性方案，其中在 血块形成期间持续施加剪切应力。
[0023] 图4B描绘在血液动力学培养条件下执行的血栓形成测定的示例性荧光显微术结 果，其中在血块形成期间持续施加剪切应力。
[0024] 图5展示测定方案，其中内皮细胞与平滑肌细胞的共培养物经受血液动力学预调 节，随后用一种或多种因子处理。
[0025] 图6A-F描绘使用oxLDL的测定的示例性基因表达数据。
[0026] 图7A-E示出响应于oxLDL的基因表达的变化。
[0027] 图8描绘展示响应于oxLDL的NF κ B活性的示例性数据。
[0028] 图9展示用oxLDL处理的细胞的示例性差异基因调控数据。
[0029] 图10展示显示响应于TNFa的基因表达的示例性数据。
[0030] 图IlA-B展示响应于用oxLDL和TNF a处理的示例性基因表达数据。
[0031] 图12A-C描绘展示响应于用葡萄糖和TNF a处理的NF κ B活性和涉及炎症信号转 导的基因表达变化的示例性数据。
[0032] 图13A-B展示在血液动力学条件下用血管紧张素 II处理的内皮细胞和平滑肌细 胞的示例性基因阵列数据。
[0033] 图14A-B展示在血液动力学条件下用醛固酮处理的内皮细胞和平滑肌细胞的示 例性基因阵列数据。
[0034] 图15A是肝窦的示意图。
[0035] 图15B描绘锥板式设备和将间接剪切力施加至肝细胞。
[0036] 图15C描绘体外肝模型中的肝细胞的涂铺配置。
[0037] 图16A-F是在静态条件下或在受控血液动力学存在下培养的肝细胞的示例性荧 光显微术图像。
[0038] 图17A是在受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0039] 图17B是体内肝的示例性荧光显微术图像。
[0040] 图17C展示在受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性透射电子显微术图像。
[0041] 图18A-B展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的尿素和白蛋白分 泌的示例性数据。
[0042] 图19A-D展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性代谢基因 表达数据。
[0043] 图20A-B展示在静态条件或受控血液动力学下培养的肝细胞的示例性细胞色素 P450活性数据。
[0044] 图20C是在受控血液动力学下培养的肝细胞中的转运蛋白活性的测定的示例性 荧光显微术图像。
[0045] 图21展示体外脂肪肝模型的示例性基因表达数据。
[0046] 图22展示体外脂肪肝模型的示例性基因表达数据。
[0047] 图23是安装在细胞培养皿上并且固定流入和流出导管以灌注上部和下部容积的 夹具的透视图。
[0048] 图24展示细胞培养容器内的内皮细胞和平滑肌细胞的示例性涂铺配置。
[0049] 图25A-B展示在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性荧 光显微术图像。
[0050] 图26展示高葡萄糖/高胰岛素条件下培养的大鼠肝细胞的透射电子显微术图像。
[0051] 图27A-B展示测量在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的总脂 质和总甘油三酯的测定的示例性结果。
[0052] 图28A-B展示在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性基 因表达数据。
[0053] 图29A-B提供在健康条件或模拟脂肪肝疾病的条件下培养的肝细胞的示例性代 谢基因表达数据和细胞色素 P450活性数据。
[0054] 图30A-3C展示在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的 条件下培养的肝细胞的示例性荧光显微术图像。
[0055] 图31提供测量在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的 条件下培养的肝细胞的总甘油三酯的测定的示例性结果。
[0056] 图32提供在健康条件下或在存在或不存在吡格列酮时在模拟脂肪肝疾病的条件 下培养的肝细胞的示例性代谢基因表达数据。
[0057] 图33展示在苯巴比妥或利福平的存在下、在受控血液动力学条件或静态条件下 培养的肝细胞的示例性细胞色素活性数据。
[0058] 图34A提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞对于体内血浆C最大浓度下 的氯丙嗪的毒性响应的示例性荧光显微术图像。
[0059] 图34B提供展示在受控血液动力学或静态条件下培养并且暴露于变化浓度的氯 丙嗪的肝细胞的毒性剂量响应的示例性数据。
[0060] 图35提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中，响应于氯丙嗪的氧化 应激相关毒性基因（图35A)和代谢基因（图35B)的上调的示例性数据。
[0061] 图36展示在受控血液动力学或静态条件下培养的肝细胞中，通过响应于氯丙嗪 的miRNA122的释放来测量的示例性急性毒性数据。
[0062] 图37提供展示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中，响应于用曲格列酮处 理的亚致死毒性和胆汁淤积变化的示例性荧光显微术图像。
[0063] 图38展示显示在受控血液动力学条件下培养的肝细胞中，响应于用曲格列酮处 理的氧化应激相关基因和MRP3和MRP4基因的上调的示例性数据。
[0064] 图39A提供展示在受控血液动力学条件下培养的犬肝细胞中的极化形态的保留 的示例性荧光显微术图像。
[0065] 图39B展示显示在受控血液动力学条件或静态条件下培养的犬肝细胞中的 CYPlAl和CYP3A1的表达的示例性基因表达数据。
[0066] 图40提供展示在受控血液动力学条件下培养的来自可诱导多能干细胞（iPSC)的 肝细胞的极化形态的保留的示例性荧光显微术图像。
[0067] 图41展示显示在受控血液动力学条件下培养的来自iPSC的肝细胞中的代谢基因 和分化基因的表达的不例性基因表达数据。
[0068] 在整个附图中对应的参考字符指示对应的部分。
[0069] 优选实施方案的描述
[0070] 本发明提供模拟体内病理或生理性病况的外方法。不同于目前由药物和生物制药 行业用作标准体外模型的静态模型，本发明方法将剪切力施加至培养细胞并且使用体内病 理或生理浓度的各种因子来复制体内病理或生理性病况。举例来说，已经发现体外肝模型， 其中肝细胞可保持在与标准静态模型中使用的浓度相比显著较低的胰岛素和葡萄糖的体 内生理浓度下。进一步发现当在这类模型中使用较高浓度的胰岛素和葡萄糖时，肝细胞展 现脂肪肝疾病的许多标志。
[0071] 本发明也涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞 培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的 至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的 培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。
[0072] 培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或 者，培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0073] 为了证实体内病理性病况得到模拟，病理性病况的标记物的水平的变化可在本发 明的方法与不存在施加剪切力的相同方法之间进行比较。将在施加剪切力后的至少一种涂 铺细胞类型或培养基中的标记物的水平与不存在施加剪切力的至少一种涂铺细胞类型或 培养基中的标记物的水平进行比较。举例来说，如果已知标记物与病理性病况相关联并且 已知其在血清中的浓度当所述条件在体内存在时会增加，那么与不存在施加剪切力的培养 基中的标记物的水平相比，施加剪切力的本发明方法的培养基中的标记物的水平增加证实 体内病理性病况通过本发明的体外方法来模拟。
[0074] 在描述本发明各种方法之后，用于本发明方法的病理性病况、对于病理性病况的 效应、生理性病况、自喷设备、血液动力学模式、细胞类型和包括添加至细胞培养基的因子 的细胞培养基在以下详细描述。
[0075] 本发明也涉及测试药物或化合物对于病理性病况的效应的体外方法。所述方法包 括模拟病理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一 种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的变化指示 药物或化合物对于病理性病况具有效应。
[0076] 在此测试药物或化合物的体外方法中，病理性病况可通过如上所述的模拟病理性 病况的体外方法来模拟。
[0077] 测试药物或化合物的体外方法的病理性病况也可通过涂铺来自具有病理性病况 的一个或多个受试者的原代细胞或永生细胞，并且在细胞培养基中培养细胞来模拟。
[0078] 本发明也涉及在体外模拟病理性病况的方法。所述方法包括将培养基添加至细胞 培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的 至少一个表面上并且对于至少一种涂铺细胞类型施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的 培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内生理性病况下所暴露的流动。
[0079] 培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到的因子的体内浓度范围内。或 者，培养基中的因子的浓度可在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。
[0080] 为了证实体内生理性病况得到模拟，生理性病况的标记物的水平的变化可在本发 明的方法与不存在施加剪切力的相同方法之间进行比较。将在施加剪切力后的至少一种涂 铺细胞类型或培养基中的标记物的水平与不存在施加剪切力的至少一种涂铺细胞类型或 培养基中的标记物的水平进行比较。举例来说，如果已知标记物与生理性病况相关联并且 已知其在血清中的浓度当所述条件在体内存在时会增加，那么与不存在施加剪切力的培养 基中的标记物的水平相比，施加剪切力的本发明方法的培养基中的标记物的水平增加证实 体内生理性病况通过本发明的体外方法来模拟。
[0081] 本发明也涉及测试药物或化合物对于生理性病况的效应的体外方法。所述方法包 括模拟生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一 种涂铺细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的变化指示 药物或化合物对于生理性病况具有效应。
[0082] 在此测试药物或化合物的体外方法中，生理性病况可通过如上所述的模拟生理性 病况的体外方法来模拟。
[0083] 测试药物或化合物的此体外方法的生理性病况也可通过涂铺原代细胞或永生细 胞，并且在细胞培养基中培养细胞来模拟。原代或永生细胞在以下详细描述。
[0084] 本发明也涉及测试药物或化合物的效应的体外方法。所述方法包括将培养基添加 至细胞培养容器、将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的至少一个表面上、将药物 或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化合物的至少一种涂铺细胞类型施加剪切 力。培养基中的药物或化合物的浓度在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。剪 切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内所暴露 的流动。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺细胞类型的变化指示药物或化合物具有效 应。
[0085] 效应可为对于病理性病况的效应。或者，效应可为对于生理性病况的效应。其它 效应在以下详细描述。
[0086] 在任何本发明方法中，所述方法可进一步包括针对以下项目来分析细胞培养基： 细胞因子分泌、趋化因子分泌、体液因子分泌、微粒分泌、生长因子分泌、蛋白质从细胞表 面脱落、化合物的代谢物、免疫细胞、氮氧化物分泌、血管舒张蛋白质、血管收缩蛋白质、 miRNA、分泌蛋白质或分泌生物物质。细胞培养基可通过测量硝酸盐或亚硝酸盐浓度来针对 氮氧化物分泌来进行分析。
[0087] 当细胞培养基针对蛋白质从细胞表面脱落来进行分析时，蛋白质可包括血管细胞 粘附分子（VCAM)、E-选择素或细胞内粘附分子（ICAM)。
[0088] 在任何本发明方法中，所述方法可进一步包括培养一种或多种细胞类型的步骤。
[0089] 在其中药物或化合物添加至培养基的任何本发明方法中，所述方法可进一步包括 以下步骤：将在培养基包括药物或化合物时，施加剪切力一段时间之后的至少一种细胞类 型与在培养基不包括药物或化合物时，施加剪切力一段时间之后的至少一种细胞类型进行 比较，以确定药物或化合物对于至少一种细胞类型的效应。
[0090] 体外肝模型
[0091] 当测试药物或化合物对于健康肝的效应时，因子包括胰岛素和葡萄糖，将肝细胞 涂铺于细胞培养容器内的表面上，并且将剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。
[0092] 举例来说，肝细胞可涂铺于多孔膜的第一表面上。然后，将多孔膜悬浮于细胞培养 容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细 胞培养容器内界定下部容积和上部容积。下部容积包括肝细胞并且上部容积包括多孔膜的 第二表面。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。
[0093] 在任何本发明方法中，在涂铺细胞中，优选使用悬浮于细胞培养容器中的多孔膜。 当剪切力施加涂铺细胞或多孔膜的表面时（例如，当剪切施加至不存在涂铺细胞的膜的表 面时），剪切力可使得细胞培养基从上部容积灌注至下部容积。这类灌注有利地影响因子从 上部容积运输至下部容积，或反之亦然。
[0094] 本发明也涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基 添加至细胞培养容器、将至少一种因子添加至培养基、将至少一种肝细胞类型涂铺于细胞 培养容器内的至少一个表面上并且对于至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。剪切力通过 自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟至少一种细胞类型在体内病理或生理性病 况下所暴露的流动。
[0095] 在此方法中，模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可在病理性病况下观察到 的因子的体内浓度范围内。或者，在此方法中，模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度可 在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案，在此方法中， 模拟病理性病况的培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的病理性病况 一段时间，相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的病理性病况一 段时间。
[0096] 在此方法中，模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可在生理性病况下观察到 的因子的体内浓度范围内。或者，在此方法中，模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度可 在体内施用药物或化合物所产生的因子的浓度范围内。作为另一个替代方案，在此方法中， 模拟生理性病况的培养基中的因子的浓度在剪切力下能够保持在体外模拟的生理性病况 一段时间，相同浓度的因子在不存在剪切力的情况下不能保持在体外模拟的生理性病况一 段时间。
[0097] 在此方法中，如与不存在施加剪切力时的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的 标记物的水平相比，在施加剪切力后的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的病理或生理 性病况的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。
[0098] 或者，在此方法中，至少一种涂铺肝细胞类型可包括肝细胞，并且在肝细胞中的对 于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实生理性病况得到模拟。葡萄糖底物可为 例如甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组合（例如，乳酸酯与丙酮酸酯的组合）。
[0099] 本发明也涉及测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法。所述 方法包括模拟病理或生理性病况、将药物或化合物添加至培养基并且对于暴露于药物或化 合物的至少一种涂铺肝细胞类型施加剪切力。在药物或化合物存在下，至少一种涂铺肝细 胞类型的变化指示药物或化合物对于病理或生理性病况具有效应。
[0100] 在此测试药物或化合物的体外方法中，病理性病况可通过如上所述的模拟病理或 生理性病况的体外方法来模拟。
[0101] 测试药物或化合物的体外方法的病理或生理性病况也可通过涂铺来自具有病理 性病况的一个或多个受试者的原代细胞或永生细胞，并且在细胞培养基中培养细胞来模 拟。
[0102] 本发明也涉及在体外模拟肝的病理或生理性病况的方法。所述方法包括将培养基 添加至细胞培养容器、将至少一种细胞外基质组分沉积在细胞培养容器内的表面上、将肝 细胞涂铺在至少一种细胞外基质组分上并且间接地对于至少一种细胞外基质组分和肝细 胞施加剪切力。剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动模拟肝细胞在体内 病理或生理性病况下所暴露的流动。
[0103] 在肝细胞涂铺于多孔膜上的本发明方法中，至少一种细胞外基质组分可涂铺于多 孔膜的第一表面上并且肝细胞可随后涂铺于至少一种细胞外基质组分上。任选地，非实质 肝细胞（例如，肝窦内皮细胞）可涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切应力施加至非实质 肝细胞。
[0104] 在涉及沉积例如细胞外基质组分的本发明方法中，至少一种细胞外基质组分可沉 积于多孔膜的第一表面上。肝细胞类型（例如，肝细胞）随后涂铺于至少一种细胞外基质组 分上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部 表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定下部容积和上部容积。下部容积包含至 少一种细胞外基质组分和肝细胞类型（例如，肝细胞），并且上部容积包含多孔膜的第二表 面。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地，非实质肝细胞（例 如，肝窦内皮细胞）可涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切应力施加至非实质肝细胞。
[0105] 本发明也提供在体外模拟肝的病理或生理性病况的另一种方法。所述方法包括将 培养基添加至细胞培养容器并且将肝细胞涂铺在多孔膜的第一表面上。多孔膜悬浮于细胞 培养容器中以使得第一表面为近端并且与容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在容器内 界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的 上部容积中的多孔膜的第二表面，剪切力通过自喷设备诱导的培养基的流动来产生。流动 模拟肝细胞在体内病理或生理性病况下所暴露的流动。自喷设备包括适于定位于容器的上 部容积中的培养基中的主体和适于使主体旋转的电动机。优选地，主体具有锥形表面。也 优选自喷设备适于将主体的锥形表面定位于容器中并且与细胞培养基接触。
[0106] 此方法可进一步包括将非实质肝细胞涂铺于多孔膜的第二表面上，其中剪切应力 施加至非实质肝细胞。非实质肝细胞可包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组 合。
[0107] 在模拟肝的病理或生理性病况的体外方法中，病理或生理性病况的标记物的水平 的变化可在本发明方法中与不存在施加剪切力的相同方法相比较。如与不存在施加剪切力 的肝细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的肝细胞或培养基中的任何一 个的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。举例来说，如与不存在施加剪 切力的肝细胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的肝细胞 或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平的变化证实病理或生理性病况得到模拟。
[0108] 或者，当至少一种涂铺肝细胞类型包括肝细胞时，在肝细胞中的对于胰高血糖素、 胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实生理性病况得到模拟。葡萄糖底物可为例如甘油、乳酸 酯、丙酮酸酯或其组合（例如，乳酸酯与丙酮酸酯的组合）。
[0109] 病理性病况和相关因子
[0110] 病理性病况包括但不限于晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经 病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、 心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、肺纤维化、 慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化 斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动 脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成（例如深静脉血栓形成）、血管再狭窄、血管钙化、心 肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤 维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
[0111] 病理性病况可包括解剖学病况，如萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、 憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器（例如，左心耳）。
[0112] 对于血管病理性病况，内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞可涂铺于细胞培养容 器内的表面上，并且剪切力施加于涂铺内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞上。
[0113] 对于血管病理性病况，因子可包括氧化低密度脂蛋白（OXLDL)、肿瘤坏死因 子-a (TNFa)、葡萄糖、组织生长因子-β (TGF-β)、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、维 生素 D、无机磷酸盐、瘦蛋白、脂肪连接蛋白、爱帕琳肽、醛固酮、血管紧张素 II、甘油三酯、 高密度脂蛋白（HDL)、氧化高密度脂蛋白（oxHDL)、富含甘油三酯的脂蛋白、低密度脂蛋白 (LDL)、胰岛素、脂肪酸或其组合。
[0114] 富含甘油三酯的脂蛋白可包括极低密度脂蛋白（vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒或乳 糜微粒残余。
[0115] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况，心内膜细胞可涂铺于多孔膜的第一表面 上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表 面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含心内膜细胞的下部容积和包含多孔膜 的第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地，内皮 细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切力施加于涂铺内皮细胞上。
[0116] 心内膜细胞可包括平滑肌细胞。
[0117] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动，或心房纤维性颤动和相关联高血压时，细 胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞、心内膜细胞或其组合。优选地，细胞类型是内皮；平滑 肌；内皮和平滑肌；心内膜；或心内膜和内皮。
[0118] 对于血管病理性病况如心房纤维性颤动，或心房纤维性颤动和相关联高血压，涂 铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、年老受试者或基因修 饰以将糖尿病、高血压或老化建模的动物。
[0119] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动，或心房纤维性颤动和相关联高血压时，流 动或血液动力学模式可从心脏窦或心房纤维性颤动节律获得。
[0120] 当血管病理性病况是心房纤维性颤动，或心房纤维性颤动和相关联高血压时，因 子可包括oxLDL、TNF α、醛固酮、血管紧张素 II或其组合。举例来说，因子可包括oxLDL ; TNFa ;0XLDL和TNFa ;醛固酮；血管紧张素 II;醛固酮和血管紧张素 II;0XLDL、TNFa和 血管紧张素 Π ;oxLDL、TNFa和醛固酮；或〇xLDL、TNFa、醛固酮和血管紧张素 II。
[0121] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况，平滑肌细胞可涂铺于多孔膜的第一表面 上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表 面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含平滑肌细胞的下部容积和包含多孔膜 的第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地，内皮 细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。
[0122] 对于其中使用多孔膜的血管病理性病况，内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面 上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的 底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积 和包含内皮细胞的上部容积。剪切力施加至上部容积中的内皮细胞。任选地，平滑肌细胞 可涂铺于多孔膜的第一表面上。
[0123] 当血管病理性病况是晚期炎症，如动脉粥样硬化时，细胞类型可包括内皮细胞、平 滑肌细胞或其组合。优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0124] 当血管病理性病况是晚期炎症，如动脉粥样硬化时，涂铺细胞类型可来自正常受 试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0125] 当血管病理性病况是晚期炎症，如动脉粥样硬化时，流动或血液动力学模式可为 动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性（即，本文中也描述为"健康状态"）、从股动脉 获得或从小动脉获得。
[0126] 当血管病理性病况是晚期炎症如动脉粥样硬化时，因子可包括LDL、oxLDL、TNF a、 HDL、富含甘油三酯的脂蛋白或其组合。举例来说，因子可包括LDL ;LDL和oxLDL ;〇xLDL ; HDL ;HDL 和 oxLDL ;TNF a ;TNF a 和 oxLDL ;TNF a、oxLDL 和 HDL ;或 TNF a、oxLDL 和富含甘 油三酯的脂蛋白。
[0127] 当血管病理性病况是晚期炎症，如高甘油三酯血症时，细胞类型可包括内皮细胞、 平滑肌细胞或其组合。优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0128] 当血管病理性病况是晚期炎症，如高甘油三酯血症时，涂铺细胞类型可来自正常 受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0129] 当血管病理性病况是晚期炎症，如高甘油三酯血症时，流动或血液动力学模式可 为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
[0130] 当血管病理性病况是晚期炎症如高甘油三酯血症时，因子可包括富含甘油三酯的 脂蛋白。
[0131] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时，细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其 组合。优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0132] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时，涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿 病的受试者、高血压受试者、吸烟者、患有腹主动脉瘤的受试者或基因修饰以将糖尿病或高 血压建模或修饰以将腹主动脉瘤建模的动物。
[0133] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时，流动或血液动力学模式可从腹动脉获得或从 腹内主动脉瘤节律获得。
[0134] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时，因子可包括oxLDL、TNFa、葡萄糖、弹性蛋白 降解产物、弹性蛋白酶、血管紧张素 II、醛固酮、胰岛素、TGF-β或其组合。举例来说，因 子可为oxLDL ;TNFa ;葡萄糖；弹性蛋白降解产物；弹性蛋白酶；血管紧张素 II ;醛固酮； 胰岛素；TGF-β ;oxLDL和TNFa ;0XLDL和葡萄糖；oxLDL和弹性蛋白降解产物；oxLDL和 弹性蛋白酶；oxLDL和血管紧张素 II ;oxLDL和醛固酮；oxLDL和胰岛素；oxLDL和TGF-β ; TNFa和葡萄糖；TNFa和弹性蛋白降解产物；TNFa和弹性蛋白酶；TNFa和血管紧张素 II ;TNF a和醛固酮；TNF a和胰岛素 ；TNF a和TGF-β ;葡萄糖和弹性蛋白降解产物；葡萄 糖和弹性蛋白酶；葡萄糖和血管紧张素 II ;葡萄糖和醛固酮；葡萄糖和胰岛素；葡萄糖和 TGF-β ;弹性蛋白降解产物和弹性蛋白酶；弹性蛋白降解产物和血管紧张素 II ;弹性蛋白 降解产物和醛固酮；弹性蛋白降解产物和胰岛素；弹性蛋白降解产物和TGF-β ;弹性蛋白 酶和血管紧张素 II ;弹性蛋白酶和醛固酮；弹性蛋白酶和胰岛素；弹性蛋白酶和TGF-β ; 血管紧张素 II和醛固酮；血管紧张素 II和胰岛素；血管紧张素 II和TGF-β ;醛固酮和胰 岛素；醛固酮和TGF-β ;胰岛素和TGF-β ;oxLDL、TNFa和葡萄糖；〇xLDL、TNFa和弹性蛋 白降解产物；〇xLDL、TNFa和弹性蛋白酶；〇xLDL、TNFa和血管紧张素 II ;0XLDL、TNFa和 醛固酮；oxLDL、TNFa和胰岛素；〇xLDL、TNFa和TGF-β ;TNFa、葡萄糖和弹性蛋白降解产 物；TNFa、葡萄糖和弹性蛋白酶；TNFa、葡萄糖和血管紧张素 II ;TNF a、葡萄糖和醛固酮； TNFa、葡萄糖和胰岛素；TNFa、葡萄糖和TGF-β等。
[0135] 当血管病理性病况是腹主动脉瘤时，烟提取物可添加至培养基。
[0136] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况，如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或 糖尿病性视网膜病时，细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。优选地，细胞类型 是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0137] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况，如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或 糖尿病性视网膜病时，涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的受试者或基因修饰 以将糖尿病建模的动物。
[0138] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况，如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或 糖尿病性视网膜病时，流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预 防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
[0139] 当血管病理性病况是糖尿病性血管病况，如糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变或 糖尿病性视网膜病时，因子可包括oxLDL、TNF a、葡萄糖、HDL、oxHDL、富含甘油三酯的脂蛋 白、胰岛素或其组合。举例来说，因子可包括葡萄糖；葡萄糖和胰岛素；葡萄糖、oxLDL和 TNFa ;葡萄糖、胰岛素 、oxLDL 和 TNFa ;葡萄糖、〇xLDL、TNFa 和 HDL;葡萄糖、oxLDL、TNFa 和 oxHDL ;葡萄糖、oxLDL、TNF a、HDL 和 oxHDL ;葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNF a 和 HDL ;葡萄 糖、胰岛素、oxLDL、TNF a和oxHDL ;葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNF a、HDL和oxHDL ;葡萄糖、 oxLDL、TNFa和富含甘油三酯的脂蛋白；或葡萄糖、胰岛素、oxLDL、TNFa和富含甘油三酯 的脂蛋白。
[0140] 当血管病理性病况是高血压时，细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组合。 优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0141] 当血管病理性病况是高血压时，涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病的 受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0142] 当血管病理性病况是高血压时，流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发 性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0143] 当血管病理性病况是高血压时，因子可包括oxLDL、TNFa、血管紧张素 II、醛固酮 或其组合。举例来说，因子可包括血管紧张素 II;醛固酮；血管紧张素 II和醛固酮；或血管 紧张素 Π 、醛固酮、OXLDL和TNFa。
[0144] 当血管病理性病况是动脉钙化时，细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组 合。优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0145] 当血管病理性病况是动脉钙化时，涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病 的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0146] 当血管病理性病况是动脉钙化时，流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发 性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0147] 当血管病理性病况是动脉钙化时，因子可包括oxLDL、TNF a、维生素 D、无机磷酸、 瘦蛋白、脂肪连接蛋白或其组合。举例来说，因子可包括〇xLDL;TNFa ;维生素 D;无机磷 酸；瘦蛋白；脂肪连接蛋白；oxLDL和TNFa ;0XLDL和维生素 D ;〇xLDL和无机磷酸；oxLDL 和瘦蛋白；oxLDL和脂肪连接蛋白；TNF a和维生素 D ;TNF a和无机磷酸；TNF a和瘦蛋白； TNFa和脂肪连接蛋白；维生素 D和无机磷酸；维生素 D和瘦蛋白；维生素 D和脂肪连接蛋 白；无机憐Ife和瘦蛋白；无机憐Ife和脂肪连接蛋白；瘦蛋白和脂肪连接蛋白；oxLDL、TNFa 和维生素0;〇1〇^、1即〇和无机磷酸；(《〇^、1即〇和瘦蛋白；(《〇^、1即〇和脂肪连接蛋 白；TNFa、维生素 D和无机磷酸；TNFa、维生素 D和瘦蛋白；TNFa、维生素 D和脂肪连接蛋 白等。
[0148] 当血管病理性病况是血栓形成时，细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞或其组 合。优选地，细胞类型是内皮；平滑肌；或内皮和平滑肌。
[0149] 当血管病理性病况是血栓形成时，涂铺细胞类型可来自正常受试者、患有糖尿病 的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
[0150] 当血管病理性病况是血栓形成时，流动或血液动力学模式可为动脉粥样硬化易发 性、动脉粥样硬化预防性或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
[0151] 当血管病理性病况是血栓形成时，因子可包括TNFa、oxLDL、葡萄糖或其组合。举 例来说，因子可包括TNF a ;〇xLDL ;葡萄糖；或oxLDL和葡萄糖。
[0152] 当病理性病况是脂肪肝疾病时，细胞类型可包括肝细胞、非实质肝细胞或其组合。 非实质肝细胞可包括肝窦内皮细胞、肝星形细胞、库柏法细胞或其组合。
[0153] 当血管病理性病况是脂肪肝疾病时，流动或血液动力学模式可来自正常受试者、 患有脂肪肝疾病的受试者或基因修饰以将脂肪肝疾病建模的动物。
[0154] 当病理性病况是脂肪肝疾病并且使用多孔膜时，肝细胞可涂铺于多孔膜的第一表 面上。将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部 表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的 第二表面的上部容积。将剪切力施加至上部容积中的多孔膜的第二表面。任选地，非实质 肝细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切力施加至上部容积中的非实质肝细胞。任 选地，细胞外基质组分可沉积于多孔膜的第一表面上，并且随后肝细胞可涂铺于细胞外基 质组分上。
[0155] 当病理性病况是脂肪肝疾病并且使用多孔膜时，非实质肝细胞可涂铺于多孔膜的 第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培 养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含多孔膜的第一表面的 下部容积和包含非实质肝细胞的上部容积。剪切力施加至上部容积中的非实质肝细胞。任 选地，细胞外基质组分可沉积于多孔膜的第一表面上，并且随后肝细胞可涂铺于细胞外基 质组分上。
[0156] 当血管病理性病况是脂肪肝疾病时，因子可包括胰岛素、葡萄糖或其组合。举例来 说，因子可包括胰岛素；葡萄糖；或胰岛素和葡萄糖。
[0157] 当病理性病况是糖尿病时，细胞类型可包括胰腺β -细胞、胰腺α -细胞或其组 合；并且因子可包括胰岛素、葡萄糖或胰岛素和葡萄糖。
[0158] 生理性病况
[0159] 可在本发明方法中模拟的生理性病况包括对应于所感兴趣的任何病理性病况的 生理性病况，这类病理性病况在本文中描述。举例来说，对应于脂肪肝疾病的生理性病况可 为健康肝状态，并且对应于动脉粥样硬化的生理性病况可为动脉粥样硬化预防性状态。
[0160] 自喷设备
[0161] 剪切力可使用能够诱导培养基流动的任何合适自喷设备来施加，其中流动模拟所 培养的一种或多种细胞类型在体内病理或生理性病况下暴露的流动。举例来说，自喷设备 可为锥板式设备或平行板自喷设备。
[0162] 自喷设备可为大致上如美国专利号7, 811，782和Hastings等人， Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming, AMERICAN J.PHYSI0L0GY&CELL PHYSIOLOGY 293 :1824-33(2007)描述的锥板式设备，其内容各自通过 引用并入本文。这类设备的实例描绘于图15B中。设备200包括接收一组电子指令的电子 控制器、由电子控制器操作的电动机220,和可操作地连接至电动机以便由电动机驱动的剪 切力施加器。剪切力施加器可包括连接至电动机的圆锥体230,并且圆锥体可直接由电动机 驱动。电动机导致圆锥体在任一方向（顺时针或逆时针）旋转。
[0163] 锥板式设备容纳细胞培养容器，例如皮氏培养皿（例如，75-_直径皮氏培养皿）。 圆锥体适于配合于细胞培养容器内部。因此，例如，在适于与75-_直径皮氏培养皿一起使 用的设备中，圆锥体具有约71. 4mm直径。圆锥体总体上具有较浅圆锥角。举例来说，圆锥 体的表面与皮氏培养皿的表面之间的角度为大约1°。
[0164] 当设备的圆锥体浸没于皮氏培养皿中的培养基中并且由电动机旋转时，圆锥体对 于培养基施加旋转力，并且此进而将剪切力施加至细胞培养容器内涂铺的细胞或悬浮于细 胞培养容器中的多孔膜的表面。
[0165] 锥板式设备也可包括牢固地保持细胞培养容器的底座。设备也可包括安装于皮 氏培养皿上并且固定用于灌注上部和下部容积的流入和流出导管的夹具，如以下进一步描 述。
[0166] 流动可由以前测量的血液动力学模式获得，并且可建模成一组电子指令。剪切力 基于所述一组电子指令。自喷设备包括接收所述一组电子指令的电子控制器。电动机由电 子控制器操作。可操作地连接至电动机的剪切力施加器由电动机驱动。优选地，剪切力施 加器包括连接至电动机的圆锥体。
[0167] 自喷设备结合细胞培养容器来使用。细胞培养容器可包括细胞培养基、因子、药 物、化合物和其它组分流入细胞培养容器以及从其中流出的入口和出口。
[0168] 自喷设备的入口和出口可通过夹具固定至细胞培养容器。图23描绘这类夹具。每 个夹具由三个部分组成：主体1和两段细金属导管2和3,如23图中展示。夹具可通过螺 钉4从外部固定至细胞培养皿一侧。举例来说，两个夹具可通过螺钉4从外部连接并且紧 固至培养皿一侧，如图24A和B)展示。主体1由经过处理的不锈钢金属制成并且出于连接 和接近目的，围绕培养皿的边缘成一定角度。将每个夹具的两段细金属导管（2和3)弯曲 以便接近培养皿以有效地供应并抽吸培养基，而不阻碍圆锥体旋转。主体1的任一侧的定 位螺丝5将金属导管2、3固定至主体并且将金属导管保持在适当位置以使得它延伸至培养 基内的正确深度。然后，挠性导管在金属导管上滑动，其用于抽吸培养基（例如，经由示例 设备中的机械蠕动泵，从来源瓶子中抽吸至培养皿）。
[0169] 图24A和24B展示定位于细胞培养容器中的夹具。在图24展示的配置中，悬浮的 多孔膜悬浮于细胞培养容器中，仅内皮细胞（图24B)或内皮细胞和平滑肌细胞（图24A) 涂铺于多孔膜的表面上。
[0170] 血液动力学模式
[0171] 血液动力学模式可从具有病理性病况或疾病促进性病况的一个或多个受试者获 得。疾病促进性病况可包括萎缩、结石、迷芽瘤、病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、 脱垂、破裂、动静脉瘘或附器（例如，左心耳）。
[0172] 血液动力学模式可从动脉、小动脉、静脉、小静脉或器官的至少一部分获得。
[0173] 当血液动力学模式从动脉或小动脉的至少一部分获得时，动脉或小动脉可包括颈 动脉、胸动脉、腹部动脉、肺动脉、股动脉、肾输出动脉、肾输入动脉、冠状动脉、肱动脉、乳房 内动脉、大脑动脉、主动脉、毛细血管前小动脉、肝动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动 脉、基底动脉、颈外动脉、颈内动脉、脊椎动脉、锁骨下动脉、主动脉弓、腋动脉、胸廓内动脉、 鳃动脉、深鳃动脉、桡侧返动脉、腹壁上动脉、降主动脉、腹壁下动脉、骨间动脉、桡动脉、尺 动脉、腕掌弓、腕背弓、掌浅弓或掌深弓、指动脉、降支旋股动脉、膝降动脉、膝上动脉、膝下 动脉、胫前动脉、胫后动脉、腓动脉、足底深弓、弓状动脉、颈总动脉、肋间动脉、胃左或右动 脉、腹腔干、脾动脉、肝总动脉、肠系膜上动脉、肾动脉、肠系膜下动脉、睾丸动脉、髂总动脉、 髂内动脉、髂外动脉、旋股动脉、穿通支、股深动脉、胭动脉、跖背动脉或指背动脉。
[0174] 当血液动力学模式从静脉或小静脉的至少一部分获得时，静脉或小静脉可包括毛 细管后小静脉、隐静脉、肝门静脉、上腔静脉、下腔静脉、冠状静脉、心最小静脉（Thesbian vein)、浅静脉、交通静脉、全身静脉、肺静脉、颈静脉、乙状窦、颈外静脉、颈内静脉、甲状腺 下静脉、锁骨下静脉、胸廓内静脉、腋静脉、头静脉、鳃静脉、肋间静脉、贵要静脉、肘正中静 脉、胸腹壁静脉、尺静脉、前臂正中静脉、腹壁下静脉、掌深弓、掌浅弓、指掌侧静脉、心脏静 脉、下腔静脉、肝静脉、肾静脉、腹部腔静脉、睾丸静脉、髂总静脉、穿通支、髂外静脉、骼内静 脉、阴部外静脉、股深静脉、大隐静脉、股静脉、附隐静脉、膝上静脉、胭静脉、膝下静脉、大隐 静脉、小隐静脉、胫骨前或后静脉、足底深静脉、足背静脉弓或指背静脉。
[0175] 当血液动力学模式从器官的至少一部分获得时，器官可包括肝、肾、肺、脑、胰腺、 脾、大肠、小肠、心脏、骨骼肌、眼睛、舌头、生殖器或脐带。
[0176] 血液动力学模式可从超声波数据的分析来获得。
[0177] 血液动力学模式可从磁共振成像（MRI)数据的分析来获得。
[0178] 流动或血液动力学模式可随时间变化。
[0179] 流动或血液动力学模式可从心腔、窦性节律期间的左心耳、心房纤维性颤动或心 室纤维性颤动获得。
[0180] 当流动或血液动力学模式从心腔获得时，心腔可包括左心房、右心房、左心室或右 心室。
[0181] 流动或血液动力学模式可由病理性病况导致的物理变化产生。
[0182] 流动或血液动力学模式可从以下受试者获得，其中如与不存在施用药物的受试者 的流动或血液动力学模式相比，作为将药物施用至受试者的直接或间接效应，血液流动或 血液动力学模式已经改变。
[0183] 流动或血液动力学模式可从动物，如基因修饰动物或人获得。优选地，模式从人获 得。
[0184] 细胞类型
[0185] 用于本发明方法的细胞类型包括原代细胞和永生细胞。原代细胞或永生细胞可包 括从具有病理或生理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素 的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受 试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或 从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0186] 用于涉及生理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞包括从具有生 理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者 分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞、 从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物毒 性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0187] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从具有 病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至少一个受 试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细 胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具有与药物 毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0188] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从不具 有病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从不具有病理性病况的风险因素的至少一个 受试者分离的细胞、从不具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离 的细胞、从不具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从不具 有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
[0189] 用于涉及病理性病况的本发明体外方法中的原代细胞或永生细胞可包括从具有 不同病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有不同病理性病况的风险因素的至少 一个受试者分离的细胞或从具有与不同病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受 试者分离的细胞。
[0190] 当从具有病理性病况的风险因素的至少一个受试者分离细胞时，风险因素可包括 但是不限于吸烟、年龄、性别、种族、表观遗传印记、与病理性病况相关的已识别基因型、与 病理性病况相关的已识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化 斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰 竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞 性肺病、肺动脉疾病、肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、动脉血 栓形成、静脉血栓形成（例如深静脉血栓形成）、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、 高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维症、细菌感 染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝疾病。
[0191] 原代细胞可包括从干细胞（例如，成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或 骨髓衍生干细胞）或干细胞样细胞衍生的细胞谱系。从干细胞或干细胞样细胞衍生的细 胞谱系可包括内皮细胞、平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元细胞、内分泌细胞、胰腺 β -细胞、胰腺α -细胞或骨骼肌细胞。
[0192] 原代细胞可包括来自具有病理性病况的受试者的可诱导多能干细胞（iPSC)衍 生细胞。举例来说，来自具有病理性病况的受试者的iPSC衍生细胞可包括来自患有以下 疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞：家族性高胆固醇血症、糖原贮积病类型I、威尔逊氏病 (Wilson' s disease)、Al抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征（Crigler-Najjar syndrome)、渐进性家族性遗传性胆汁淤积或遗传性酪氨酸血症型1。或者，来自具有病 理性病况的受试者的iPSC衍生细胞可包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血 管细胞（例如，iPSC衍生平滑肌细胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞） ： 哈钦森-吉尔福特早衰症（Hutchinson-Gilford progeria)、威廉姆斯-博伊伦综合征 (Williams-Beuren syndrome)、法布里氏病（Fabry's disease)、苏萨克氏综合征（Susac's syndrome)、全身毛细管渗漏综合征、格莱克综合征（Gleich syndrome)、血管内乳突状内皮 增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
[0193] 用于本发明方法中的细胞类型包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、 肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肌肉细胞、脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞 或造血细胞。
[0194] 用于方法中的具体细胞类型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上 皮足细胞、α细胞、细胞、S细胞、胰多肽（PP)细胞、ε细胞、神经胶质细胞、肝细胞、 神经元、非实质肝细胞、足细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细 胞、白细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内 皮祖细胞、干细胞、循环干细胞和循环造血细胞。非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮 细胞和库柏法细胞。优选地，特定细胞类型可包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞、肝窦内皮 细胞或其组合。
[0195] 用于本发明方法中的细胞类型可为动物细胞类型，如来自基因修饰动物的细胞。 动物细胞类型优选地是人细胞类型。人细胞类型可基于年龄、性别、种族、表现遗传学、疾 病、民族性、存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性、如本文描述的风险因素，或与病理 或生理性病况相关的一些其它特性来选择。
[0196] 在本发明方法中施加的剪切力可间接地施加至至少一种涂铺细胞类型。
[0197] 在本发明方法中施加的剪切力可直接地施加至至少一种涂铺细胞类型。
[0198] 细胞类型、额外组分如细胞外基质组分和多孔膜在本发明方法中的培养基内 (即，以培养基覆盖）。
[0199] 本发明方法可进一步包括针对由药物或化合物产生的毒性、炎症、渗透性、相容 性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来分析至少一种细胞类型。
[0200] 细胞培养基
[0201] 标准细胞培养基可用于本发明方法中。
[0202] 添加至细胞培养基的因子
[0203] 可添加至细胞培养基的因子在整个说明书中结合相关联病理或生理性病况来描 述。
[0204] 体内因子浓度
[0205] 因子的生理体内浓度以及确定这些体内浓度的方法在本领域中是熟知的。举例来 说，健康人和患有动脉粥样硬化的人体内的HDL的相应体内浓度大于30mg/dl至200mg/dl， 和少于30mg/dl，如由全血来确定。确定因子的体内浓度的方法可在美国药典和其它文献中 获得。
[0206] 因子的所报告体内浓度范围可取决于以下因素来变化：用于确定范围的方法、获 得因子的来源（例如，全血或血清）、患者的医学条件（即，是否患者具有病理性病况或生 理性病况）和相对于正常睡眠和进食排程的当天时间。然而，本领域普通技术人员已知文 献中所报告的体内生理浓度范围以外的浓度是使用为了确定浓度所报告的方法的体内病 理浓度。同样地，低于文献中所报告的体内病理浓度范围的下端点或高于其上端点的浓度 是使用为了确定浓度所报告的方法的体内生理浓度；是否体内生理浓度低于下端点或高于 上端点取决于所述因子。举例来说，因子HDL的体内生理浓度高于范围的上端点，但是因子 oxLDL的体内生理浓度低于范围的下端点,如本领域普通技术人员认识到。
[0207] 其它组分
[0208] 细胞外基质组分
[0209] 用于本发明方法中的细胞外基质组分可包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角 质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。胶原是优选细 胞外基质组分，并且优选地是存在于针对具体病理或生理性病况来涂铺的一种或多种细胞 类型的体内环境中的胶原类型。
[0210] 细胞外基质组分可由涂铺于细胞培养容器内的表面上的成纤维细胞、软骨细胞或 成骨细胞来分泌。
[0211] 细胞外基质组分尤其适用于涉及肝的本发明方法中。
[0212] 药物或化合物
[0213] 药物或化合物可为抗炎症剂、抗肿瘤剂、抗糖尿病剂、蛋白激酶抑制剂、抗血栓形 成剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、抗凝血剂、钙通道阻滞剂、螯合剂、rho激酶抑制剂、抗高血 脂剂、升高HDL的药剂、抗再狭窄剂、抗生素、免疫抑制剂、抗高血压剂、利尿剂、减食欲剂、 食欲抑制剂、抗抑郁剂、精神抑制药、避孕药、拟钙剂（calcimimetic)、生物医药产品、多发 性硬化疗法、止痛药、激素替代疗法、抗痉挛药或其组合。
[0214] 当药物是抗炎症剂时，抗炎症剂可包括类固醇（例如，泼尼松（prednisone)、氢化 可的松（hydrocortisone)、泼尼松龙（prednisolone)、倍他米松（betamethasone)或地塞 米松（dexamethasone))、非类固醇抗炎症药物（NSAID)(例如，水杨酸盐如乙酰水杨酸、布 洛芬、对乙酰氨基酚、萘普生（naproxen)、酮洛芬或双氯芬酸）、选择性环氧合酶抑制剂（例 如，塞来昔布（celecoxib)、罗非昔布（rofecoxib)或伐地考昔（valdecoxib))、非选择性环 氧合酶抑制剂、免疫选择性抗炎症剂（例如，苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸三肽）或其组合。
[0215] 当药物包括抗肿瘤剂时，抗肿瘤剂可包括烷化剂（例如，顺钼、卡波钼 (carboplatin)、奥沙利钼（oxaliplatin)、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环 磷酰胺）、抗代谢物（例如，硫唑嘌呤或巯基嘌呤）、植物碱（例如，紫杉烷如紫杉醇或多西紫 杉醇、长春花生物碱如长春新碱、长春碱，或长春地辛，或鬼白毒素如依托泊苷（etoposide) 或替尼泊苷（teniposide))、拓扑异构酶抑制剂（例如，伊立替康（irinotecan)、拓扑 替康（topotecan)或安Π 丫陡（amsacrine))、细胞毒性抗生素（例如，放线菌素、博来 霉素（bleomycin)、普卡霉素 （pi icamysin)、丝裂霉素、多柔比星（doxorubicin)、柔 红霉素（daunorubicin)、戊柔比星（valrubicin)、伊达比星（idarubicin)、表柔比星 (epirubicin)或利福平（rifampicin))，或其组合。
[0216] 当药物是抗糖尿病剂时，抗糖尿病剂可包括双胍（例如，二甲双胍（metformin))、 噻唑烧二酮（例如，罗格列酮（rosiglitazone)、曲格列酮（troglitazone)或批格列酮 (pioglitazone))、磺酰脲（例如，甲苯胺丁脲（tolbutamine)、醋磺己脲（acetohexamide)、 妥拉磺脲（tolazamide)、氯磺丙脲（chlorpropamide)、格列批嗪（glipazide)、格 列本脲（glyburide)、格列美脲（glimepiride)、格列齐特（gliclazide)、格批嗪胺 (glycopyramide)或格列喹酮（gliquidone))、肠促胰岛素模拟物（例如，伊森泰德 (exenatide)、利拉鲁肽（Iiraglutide)或他司鲁泰（taspoglutide))、二肽基肽酶IV抑制 剂（例如，维达列汀（vildagliptin)、西他列汀（sitagliptin)、沙格列汀（saxaglitpin)、 利拉利汀（linagliptin)、阿格列汀（alogliptin)或塞格立汀（septagliptin))、钠-葡萄 糖协同转运蛋白2抑制剂（例如，达格列净（dapagliflozin)、坎格列净（canagliflozin)、 艾帕列净（empagliflozin)、伊格列净（ipragliflozin)、瑞格列净（remogliflozin)或舍 格列净（sergliflozin))、葡糖激酶活化剂（例如，匹瑞格汀（piragliatin))、氯茴苯酸 (例如，瑞格列奈（r印aglinide))、GPR40激动剂（例如，TAK-875)或胰高血糖素受体拮抗 剂。
[0217] 抗糖尿病剂也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说，抗糖尿病剂可包括噻 唑烷二酮（例如，吡格列酮）与二甲双胍的组合；噻唑烷二酮（例如，吡格列酮）与格列美 脲的组合；二肽基肽酶IV抑制剂（例如，西他列汀）与斯达汀（例如，辛伐他汀）的组合； 或二肽基肽酶IV抑制剂（例如，西他列汀）与二甲双胍的组合。作为进一步实例，抗糖尿 病剂可包括达格列净与二甲双胍的组合，或达格列净与沙格列汀的组合。
[0218] 当药物包括蛋白激酶抑制剂时，蛋白激酶抑制剂可包括丝氨酸/苏氨酸特 异性激酶抑制剂、酪氨酸特异性激酶抑制剂（例如，伊马替尼（imatinib)、贝伐单抗 (bevacizumab)、西妥昔单抗（cetuximab)、阿西替尼（axitinib)、拉帕替尼（Iapatinib)、 卢佐替尼（ruxolitinib)、索拉非尼（sorafenib)、费斯替尼（fostimatinib)、巴利替尼 (baricitinib)或托法替尼（tofacitinib))、表皮生长因子（EGF)受体抑制剂、成纤维细胞 生长因子（FGF)受体抑制剂、血小板衍生生长因子（PDGF)受体抑制剂或血管内皮生长因子 (VEGF)受体抑制剂。
[0219] 当药物包括抗血栓形成剂时，抗血栓形成剂可包括双啼达莫（dipyridamole)、尿 激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、瑞替普酶（reteplase)、阿替普酶（alteplase)、链激酶、 rt-PA、TNK-rt-PA、孟替普酶（monteplase)、葡萄球菌激酶、帕米普酶（pamiteplase)、未分 级肝素或APSAC。
[0220] 当药物包括血栓溶解剂时，血栓溶解剂可包括链激酶、尿激酶或组织纤溶酶原活 化剂。
[0221] 当药物包括抗血小板剂时，抗血小板剂可包括糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、凝血烷抑 制剂、二磷酸腺苷受体抑制剂、前列腺素类似物或磷酸二酯酶抑制剂。举例来说，抗血小板 剂可包括氯批格雷（clopidogrel)、阿昔单抗（abciximab)、替罗非班（tirofiban)、奥波非 班（orbofiban)、珍米洛非班（xemilofiban)、西拉非班（sibrafiban)、罗昔非班（roxifiban)或 噻氯匹定（ticlopinin)。
[0222] 当药物包括抗凝血剂时，抗凝血剂可包括维生素 K拮抗剂（例如，华法林 (warfarin))、因子Xa抑制剂（例如，阿哌沙班（apixaban)、贝曲西班（betrixaban)、 依杜沙班（edoxaban)、奥米沙班（otamixaban)、利伐沙班（rivaroxaban)、横达肝 癸（fondaparinux)或艾屈肝素 Qdraparinux))、或直接凝血酶抑制剂（例如，水蛭 素、比伐卢定（bivalirudin)、来匹卢定（Iepirudin)、地西卢定（desirudin)、达比 加群（dab igatran)、希美加群（ximelagatran)、美拉加群（meIagatran)或阿加曲班 (argatroban)) 〇
[0223] 当药物包括钙通道阻滞剂时，钙通道阻滞剂可包括维拉帕米（verapamil)、 地尔硫卓（diltiazem)、氨氯地平（amlodipine)、阿雷地平（aranidipine)、阿折 地平（azelnidipine)、巴尼地平（bamidipine)、贝尼地平（benidipine)、西尼 地平（cilnidipine)、氯维地平（clevidipine)、伊拉地平（isradipine)、依福 地平（efonidipine)、非洛地平（felodipine)、拉西地平（Iacidipine)、乐卡地 平（Iercanidipine)、马尼地平（manidipine)、尼卡地平（nicardipine)、硝苯地 平（nifedipine)、尼伐地平（nilvadipine)、尼莫地平（nimodipine)、尼索地平 (nisoldipine)、尼群地平（nitrendipine)或普拉地平（pranidipine)。
[0224] 当药物包括螯合剂时，螯合剂可包括青霉胺、三乙烯四胺盐酸盐、EDTA、DMSA、甲磺 酸去铁胺或巴马司他（batimastat)。
[0225] 当药物包括rho激酶抑制剂时，riio激酶抑制剂可包括Y27632。
[0226] 当药物包括抗高血脂剂时，抗高血脂剂可包括斯达汀（例如，阿托伐他 汀（atorvastatin)、西伐他汀（cerivastatin)、氟伐他汀（fluvastatin)、洛伐他 汀（Iovastatin)、美伐他汀（mevastatin)、匹伐他汀（pitavastatin)、普伐他汀 (pravastatin)、罗苏伐他汀（rosuvastatin)或辛伐他汀（simvastatin))、非诺贝特 (fibrate)(例如，苯扎贝特（bezafibrate)、苯扎贝特酸（benzafibric acid)、环丙贝特 (ciprofibrate)、环丙贝特酸（ciprofibric acid)、氯贝特（clofibrate)、氯贝酸（clofibric acid)、吉非贝齐（gemfibrozil)、非诺贝特（fenofibrate)或非诺贝酸（fenofibric acid))、 膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂（例如，依折麦布（ezetimibe))、胆固醇酯转移蛋白抑制 剂（例如，安塞曲匹（anacetrapib)、达塞曲匹（dalcetrapib)、托彻普（torcetrapib)或 伊沃曲匹（evacetrapib))、前列腺素 D2受体拮抗剂（例如，拉罗皮兰（laropiprant))、 Ω-3-脂肪酸（例如，二十碳五烯酸（EPA)或二十二碳六烯酸（DHA))或降胆固醇剂（例如， 烟酸）。
[0227] 抗高血脂剂也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说，抗高血脂剂可包括烟 酸与拉罗皮兰的组合或依折麦布与辛伐他汀的组合。
[0228] 当药物包括升高HDL的药剂，升高HDL的药剂可包括前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白 酶/kexin类型9 (PCSK9)的抑制剂，如AMG145。
[0229] 当药物包括抗再狭窄剂时，抗再狭窄剂可包括地塞米松噻氯匹定（dexamethasone ticlopidine)、氯卩比格雷（clopidogrel)、西罗莫司（sirolimus)、紫杉醇（paclitaxel)、佐 他莫司（zotarolimus)、依维莫司（everolimus)或乌米莫司（umirolimus)。
[0230] 当药物包括抗生素时，抗生素可包括放线菌素_D。
[0231] 当药物包括免疫抑制剂时，免疫抑制剂可包括糖皮质激素、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、 巯基票呤、更生霉素、丝裂霉素 C、博来霉素、光神霉素、环孢素、他克莫司（tacrolimus)、西 罗莫司（sirolimus)、干扰素、英利昔单抗（infliximab)、依那西普（etanercept)或阿达木 单抗（adalimumab)。
[0232] 当药物包括抗高血压剂时，抗高血压剂可包括β肾上腺素受体拮抗剂（例 如，烯丙洛尔（alprenolol)、布新洛尔（bucindolol)、卡替洛尔（carteolol)、卡维地洛 (carvedilol)、拉贝洛尔（Iabetalol)、纳多洛尔（nadolol)、氧烯洛尔（oxprenolol)、 喷布洛尔（penbutalol)、卩引哚洛尔（pindolol)、普萘洛尔（propranolol)、索他洛尔 (sotalol)、噻吗洛尔（timolol)、醋丁洛尔（acebutolol)、阿替洛尔（atenolol)、倍他洛尔 (betaxolol)、比索洛尔（bisoprolol)、美托洛尔（metoprolol)或奈必洛尔（nebivolol))、 血管紧张素 Π 受体拮抗剂（例如，洛沙坦（losartan)、奥美沙坦（olmesartan)、缬 沙坦（valsartan)、替米沙坦（telmisartan)、厄贝沙坦（irbesartan)或阿齐沙坦 (azilsartan))或血管紧张素转化酶抑制剂（例如，卡托普利（captopril)、依那普利 (enalapril)、赖诺普利（Iisinopril)、喹那普利（quinapril)、佐芬普利（zofenopril)、 咪达普利（imidapril)、贝那普利（benazepril)、群多普利（trandolapril)或雷米普利 (ramipril)) 〇
[0233] 当药物包括利尿剂时，利尿剂可包括咲塞米（furoseamide)、阿米洛利 (amiloride)、螺内酯（spironolactone)或双氢氯噻嗪（hydrochlorothiazide)。
[0234] 当药物包括减食欲剂时，减食欲剂可包括苯丁胺（phentermine)、芬氟拉明 (fenfluramine)、右芬氟拉明（dexfenfluramine)、西布曲明（sibutramine)、氯卡色林 (Iorcaserin)、托卩比酯（topiramate)或其组合。
[0235] 当药物包括抗抑郁剂时，抗抑郁剂可包括丙米嗪（imipramine)、脱甲丙咪 嗪（desipramine)、阿米替林（amitryptiline)、帕罗西汀（paroxetine)、西酞普兰 (citalopram)、氟西汀（fluoxetine)或依地普仑（escitalopram) 〇
[0236] 当药物包括精神抑制药时，精神抑制药可包括阿立哌唑（aripiprazole)、利培酮 (risperidone)、奥氮平（olanzapine)、喹硫平（quetiapine)、卡利拉（cariprazine)、鲁拉 西（Iurasidone)或阿塞那平（asenapine)。
[0237] 当药物包括避孕药时，避孕药可包括β_雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕 酮或屈螺酮。举例来说，避孕药可包括屈螺酮与乙炔基雌二醇的组合。
[0238] 当药物包括拟I丐剂时，拟I丐剂可包括西那卡塞（cinacalcet)。
[0239] 当药物包括生物医药产品时，生物医药产品可包括合成多糖，合成、部分合成或人 源化免疫球蛋白，或重组治疗蛋白质。
[0240] 当药物包括多发性硬化疗法时，多发性硬化疗法可包括多发性硬化的口服疗法。 举例来说，多发性硬化疗法可包括延胡索酸的甲酯（例如，延胡索酸单甲酯或延胡索酸二 甲酯）、鞘氨醇-1-磷酸酯（SlP)受体激动剂（例如，芬戈莫德（fingolimod))，或免疫调节 剂（例如，特立氟胺（terifIunomide)或拉喹莫德（Iaquinimod))。
[0241] 当药物包括止痛药时，止痛药可包括麻醉性止痛药（例如，丙氧芬 (propoxyphene)、芬太尼（fentanyl)、吗啡（morphine)，或吗啡代谢物如3-葡糖苷酸或吗 啡6-葡糖苷酸）或阿片样肽（例如，强啡肽A)。
[0242] 当药物包括激素替代疗法时，激素替代疗法可包括偶联雌激素 、β -雌二醇、乙炔 基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮、屈螺酮，或睾酮。
[0243] 当药物包括抗痉挛药时，抗痉挛药可包括苯巴比妥（phenobarbital)。
[0244] 所述药物也可包括两种或更多种药物的组合。举例来说，药物可包括利尿剂与钙 通道阻滞剂的组合（例如，双氢氯噻嗪与氨氯地平的组合）；利尿剂与血管紧张素受体II 拮抗剂的组合（例如，双氢氯噻嗪与洛沙坦的组合）；利尿剂与β_肾上腺素受体拮抗剂的 组合（例如，双氢氯噻嗪与普萘洛尔的组合）；或利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合 (例如，双氢氯噻嗪与卡托普利的组合）。作为进一步实例，药物可包括抗高血脂剂、抗高血 压剂、利尿剂和钙通道阻滞剂的组合（例如，辛伐他汀、洛沙坦、双氢氯噻嗪和氨氯地平的 组合）。
[0245] 药物或化合物可包括造影剂、放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗 药物递送微球体、微珠、纳米颗粒、凝胶或细胞浸渍凝胶或其组合。
[0246] 化合物可能够抑制、活化或改变至少一种细胞类型中的蛋白质或基因的功能。
[0247] 当针对从血管支架材料上洗脱来评估药物或化合物时,所述方法可进一步包括针 对与血管支架材料的相容性、细胞粘附或表型调节来测试至少一种细胞类型。血管支架材 料可相邻于内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞。
[0248] 在涉及测试药物或化合物的任何方法中，培养基中的药物或化合物的浓度适当地 在体内实现此效应的药物或化合物的浓度范围内。举例来说，培养基中的药物或化合物的 浓度适当地在药物或化合物的体内治疗的浓度范围内。
[0249] 血清
[0250] 在本文描述的涉及将因子添加至培养基或将药物或化合物添加至培养基的任何 方法中，将因子添加至培养基的步骤或将药物或化合物添加至培养基的步骤可包括将受试 者的血清添加至培养基，其中血清包含因子、药物或化合物。
[0251] 受试者可为动物，例如基因修饰动物或人。优选地，血清从人受试者获得。
[0252] 血清可来自具有生理性病况的受试者或具有病理性病况的受试者。举例来说，当 血清来自具有病理性病况的受试者时，病理性病况可包括晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病 性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜 病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤 动、肾脏疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化 斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉 疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成（例如深静脉血栓形成）、 血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低α脂蛋白血症、丙型肝炎、乙 型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
[0253] 对于生理或病理性病况的效应
[0254] 在测试药物或化合物效应的方法，所述效应可包括对于生理性病况的效应或对于 病理性病况的效应。举例来说，对于生理性病况或病理性病况的效应可为毒性效应、保护 效应、病理效应、疾病促进效应、炎症效应、氧化效应、内质网应激效应、线粒体应激效应、凋 亡效应、坏死效应、重构效应、增殖效应、对于蛋白质活性的效应，如抑制蛋白质或活化蛋白 质，或对于基因表达的效应，如增加基因表达或减少基因表达。
[0255] 自喷设备的多细胞类型配置
[0256] 本发明方法可进一步包括将培养基、因子、药物或化合物灌注进入和离开细胞容 器。
[0257] 当细胞培养容器内的表面包括悬浮于细胞培养容器中的多孔膜时，所述方法可进 一步包括将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的表面上包括将第一细胞类型涂铺 于多孔膜的第一表面上，和任选地将第二细胞类型涂铺于多孔膜的第二表面上的步骤，其 中多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面 呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含第一细胞类型的下部容积和包含任选第 二细胞类型的上部容积。多孔膜可适于允许细胞培养基的流体连通以及第一细胞类型的细 胞与任选第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通。将剪切力施加至上部容积中的 第二细胞类型或多孔膜的第二表面。所述方法可进一步包括将培养基灌注进入和离开上部 容积以及将培养基灌注进入和离开下部容积。所述方法可进一步包括将药物或化合物灌注 至上部容积和下部容积中的至少一个。
[0258] 当细胞培养容器内的表面包括悬浮于细胞培养容器中的多孔膜时，所述方法可进 一步包括将至少一种细胞类型涂铺于细胞培养容器内的表面上包括任选地将第一细胞类 型涂铺于多孔膜的第一表面上，和任选地将第二细胞类型涂铺于多孔膜的第二表面上的步 骤，其中多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部 表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含任选第一细胞类型的下部容积和包 含第二细胞类型的上部容积。多孔膜可适于允许细胞培养基的流体连通以及任选第一细胞 类型的细胞与第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通。剪切力施加至上部容积中 的第二细胞类型。所述方法可进一步包括将培养基灌注进入和离开上部容积以及将培养基 灌注进入和离开下部容积。所述方法可进一步包括将药物或化合物灌注至上部容积和下部 容积中的至少一个。
[0259] 细胞培养容器的入口和出口可在界定上部和下部容积的细胞培养容器部分内。
[0260] 在此部分中描述的方法可进一步包括针对由药物或化合物产生的毒性、炎症、渗 透性、相容性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来分析第一细胞类型或第二细胞 类型中的至少一个。
[0261] 这些方法可进一步包括将第三细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一表面 或第二表面上，将第三细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中，或将第三细胞类型悬浮于 下部容积内的培养基中。
[0262] 这些方法可进一步包括将第四细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一或第 二表面上，将第四细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中，或将第四细胞类型悬浮于下部 容积内的培养基中。
[0263] 这些方法可进一步包括将第五细胞类型涂铺于容器的表面或多孔膜的第一或第 二表面上，将第五细胞类型悬浮于上部容积内的培养基中，或将第五细胞类型悬浮于下部 容积内的培养基中。
[0264] 第一、第二、第三、第四和第五细胞类型可为如以上关于细胞类型的部分中所描述 的各种原代或永生细胞类型。
[0265] 在这些组合中的每一个中，第三细胞类型的细胞、第四细胞类型的细胞或第五细 胞类型的细胞可附着至容器的底部表面。
[0266] 定义
[0267] 出于本文描述的发明目的，术语"疾病促进性病况"是指可促成疾病状态的异常解 剖学病况（即，偏离显著医学上公认正常解剖的血管解剖）。
[0268] 术语"因子"是指有助于产生病理或生理性病况的生物物质。优选地，与不存在施 加剪切力时的至少一种涂铺细胞类型或培养基中的标记物的水平相比，所述因子提供在施 加剪切力后的至少一种涂铺肝细胞类型或培养基中的病理或生理性病况的标记物的水平 的变化。
[0269] 术语"血液动力学"是指模拟在体内所感兴趣的组织的血液流动的血液流动。举例 来说，当动脉血液流动受到关注时，加速/减速率、逆流、前向基础流动等是表征动脉血液 动力学流动的一些参数。在其它组织，如肝中，恒定血液流动可用于表征体内血液动力学。
[0270] 术语"病理性病况"是指异常解剖或生理性病况，包括疾病的客观或主观表现。
[0271] 术语"生理性病况"是指并非病理的正常医学状态，并且可为特征为身体或组织或 器官的正常运作或状态或与其一致的医学状态。
[0272] 术语"受试者"是指动物（例如，基因修饰动物或人）。动物可包括小鼠、大鼠、兔、 猫、犬或灵长类动物，或通常用于医学研究中的任何动物。
[0273] 以下描述本发明方法尤其在体外模型中的使用。
[0274] 血栓形成
[0275] 本发明方法可用于在体外将血栓形成建模。在凝血级联中，凝血酶将纤维蛋白原 转化成纤维蛋白，其沉积在血管表面上以开始血液凝块形成（血栓形成）。TNFa是有效炎 症细胞因子。TNFa和其它细胞因子已被证明是体外内皮和平滑肌细胞衍生组织因子的有 效介体，所述组织因子介导血管壁中的纤维蛋白沉积。在患有心血管疾病的人体内检测到 的TNFa的循环水平为约〇. 〇lng/ml至约0. lng/ml。在健康个体中，TNFa的循环水平低 得多或不可检测到，例如约〇ng/ml至约0. 001ng/ml。
[0276] 在体外将血栓形成建模的方法中，将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上。 细胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面，并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器中以使得多 孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养 基内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部 容积。或者，内皮细胞涂铺于其上的表面是细胞培养容器的底部。
[0277] -种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养 容器中的培养基中。举例来说，平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面 上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔 膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养基 内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内 皮细胞的上部容积。
[0278] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白 细胞可任选地悬浮于上部或下部容积内的细胞培养基中。
[0279] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上，剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流 动产生。流动模拟在体内血栓形成可能发生的血管区域处内皮细胞暴露的流动。举例来说， 流动是动脉粥样硬化易发性血液动力学流动。
[0280] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间，然后将一种或多种因子添加至培养 基。举例来说，剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、 约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间，然后将一种或多种因子添加至培 养基。例如，剪切力可施加至涂铺内皮细胞约24小时，然后添加一种或多种因子。或者，剪 切力可与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0281] 一种或多种因子可添加至培养基。举例来说，添加至培养基的一种或多种因子可 为涉及血栓形成发展或进展的因子。一种或多种因子以患有血管疾病的受试者中所观察到 的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说，TNFa可以患有血管疾病的个 体中所观察到的TNF a的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说，TNFa可以约 0· 005ng/ml 至约 0· 2ng/ml、约 0· 01ng/ml 至约 0· lng/ml、约 0· 03ng/ml 至约 0· 07ng/ml 或 约0· 04ng/ml至约0· 06ng/ml的浓度添加至培养基。TNFa可以约〇· 〇5ng/ml或约0· Ing/ ml的浓度添加至培养基。
[0282] 除了 TNFa以外，其它因子也可添加至培养基。举例来说，氧化LDL(oxLDL)、葡萄 糖或oxLDL和葡萄糖两者可与TNF a组合添加至培养基。这类因子以患有血管疾病的受试 者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。在健康个体中，oxLDL的血 浆浓度总体上小于约25 μ g/ml，而在患有血管疾病的患者中，oxLDL的血浆浓度大于约25 至约100 μ g/ml。因此，例如，oxLDL可以约25 μ g/ml至约120 μ g/ml、约30 μ g/ml至约 100 μ g/ml、约40 μ g/ml至约80 μ g/ml或约25 μ g/ml至约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。 例如，oxLDL可以约25 μ g/ml或约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。
[0283] 葡萄糖也可添加至培养基。糖尿病和相关联的升高的葡萄糖水平是血栓形成的风 险因素。在健康个体中，血糖浓度为约5mM至约10mM，而在糖尿病个体中，血糖浓度在大于 约IOmM至约20mM范围内。因此,例如，葡萄糖可以约IOmM至约25mM、约12mM至约20mM或 约HmM至约18mM的浓度添加至培养基。例如，葡萄糖可以约15mM或约17. 5mM的量来添 加至培养基。
[0284] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后，将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适 当地持续一段时间。
[0285] 施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36小时或约20 至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如，在将一种或 多种因子添加至细胞培养基之后，剪切应力可持续约24小时。
[0286] 然后，可通过将内皮细胞与无血小板血浆（PLP)、钙和纤维蛋白原一起孵育来诱导 血块形成。此孵育可在静态条件下执行。或者，内皮细胞的剪切力施加可在此孵育期间持 续。可将细胞培养基从上部容积去除并且内皮细胞可随后与PLP、钙和纤维蛋白原一起孵 育，伴以或不伴以持续施加剪切至内皮细胞。或者，PLP、钙和纤维蛋白原可添加至上部容积 中的细胞培养基，伴以或不伴以持续施加剪切力。
[0287] 血栓形成的模拟可通过许多方法中的任何一种来评估。通常，如与不存在施加剪 切力的内皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的内皮细 胞或平滑肌细胞或培养基中的血栓形成标记物的水平的变化证实血栓形成得到模拟。举例 来说，血栓形成的模拟可通过检查纤维蛋白沉积、检查与血栓形成相关的基因或蛋白质和/ 或分泌微粒或蛋白质的表达，或检查与血栓形成相关的蛋白质的活性来评估。
[0288] 动脉粥样硬化
[0289] 本发明方法也可用于在体外将动脉粥样硬化建模。动脉粥样硬化是以血管区域内 的炎症信号转导为标志的局灶性炎症疾病，其中低和振荡剪切应力（动脉粥样硬化易发性 剪切应力）使内皮对于炎症响应"预敏化"。炎症响应的重要介体是转录因子NFk B，其通 过体内和体外的动脉粥样硬化易发性剪切应力来活化。氧化低密度脂蛋白（oxLDL)是晚期 动脉粥样硬化的标志，发现于动脉粥样硬化病灶中，并且在患有心血管并发症的患者的循 环中升高。氧化1-棕榈酰-2-花生四烯酸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（oxPAPC)，oxLDL的 主要成分，展示不经由典型NF κ B途径来起作用，并且虽然oxLDL能够在体外静态单一培养 物中增加 NFk B依赖性基因的表达，但是与在患有心血管疾病的个体体内所观察到的浓度 相比，这经常需要较高浓度的oxLDL (> 100 μ g/ml)。在健康患者中，oxLDL的血浆浓度平 均为7 μ g/ml，而在患有心肌梗塞的患者中，平均血楽浓度为约28至约34 μ g/ml，并且一些 患者具有约60 μ g/ml的水平。TNFa也在晚期动脉粥样硬化病灶中分泌并且在经历心肌梗 塞的患者的循环中升高。TNFa是能够在较高浓度（> lng/ml)下活化NF κ B信号转导的 有效、促炎症性细胞因子。
[0290] 以前体外研究全部在内皮细胞的静态单一培养物内执行。在本发明方法中，相比 之下，动脉粥样硬化易发性血液动力学剪切力通过启用NFk B信号转导来使内皮细胞的单 一培养物或内皮细胞与平滑肌细胞的共培养物"预敏化"，并且添加 oxLDL和/或TNF a，和 任选地在患有血管疾病的患者中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度的某些其它因 子进一步增强NF κ B活性和下游炎症信号转导。
[0291] 在体外将动脉粥样硬化建模的本发明方法中，将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内 的表面上。细胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面，并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器 中以使得多孔膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而 在细胞培养基内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮 细胞的上部容积。或者，内皮细胞涂铺于其上的表面是细胞培养容器的底部。
[0292] -种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养 容器中的培养基中。举例来说，平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面 上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔 膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养基 内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内 皮细胞的上部容积。
[0293] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白 细胞可任选地悬浮于上部或下部容积内的细胞培养基中。
[0294] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上，剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流 动产生。流动模拟在体内动脉粥样硬化可能发生的血管区域处内皮细胞暴露的流动。举例 来说，流动是动脉粥样硬化易发性血液动力学流动。
[0295] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间，然后将一种或多种因子添加至培养 基。举例来说，剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、 约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间，然后将一种或多种因子添加至培 养基。例如，剪切力可施加至涂铺内皮细胞约24小时，然后添加一种或多种因子。或者，剪 切力可与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0296] -种或多种因子可添加至培养基。举例来说，添加至培养基的一种或多种因子可 为涉及动脉粥样硬化发展或进展的因子。这类一种或多种因子以患有血管疾病的个体中所 观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。
[0297] oxLDL可在患有血管疾病的个体中所观察到的oxLDL的体内浓度范围内的浓度 下添加至培养基。因此，例如，oxLDL可以约25 μ g/ml至约120 μ g/ml、约30 μ g/ml至约 100 μ g/ml、约40 μ g/ml至约80 μ g/ml或约25 μ g/ml至约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。 例如，oxLDL可以约25 μ g/ml或约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。
[0298] 其它因子也可代替或与oxLDL组合来添加至培养基。这些因子包括但不限于； TNF α、高密度脂蛋白（HDL);甘油三酯；包括极低密度脂蛋白（vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒 和/或乳糜微粒残余的富含甘油三酯的脂蛋白；低密度脂蛋白（LDL);葡萄糖；胰岛素；月旨 肪酸；TGFii或其组合。举例来说，TNFa可代替oxLDL来添加至培养基。或者，oxLDL和 TNFa两者可添加至培养基。HDL也可任选地添加至培养基。举例来说，HDL可单独，或与 其它因子如TNF a和oxLDL组合添加至培养基。甘油三酯或包括vLDL、vLDL残余、乳糜微 粒和/或乳糜微粒残余的富含甘油三酯的脂蛋白也可任选地单独或与一种或多种其它因 子组合来添加至培养基。葡萄糖也可任选地添加至培养基。举例来说，葡萄糖可单独，或与 其它因子如TNFa组合添加至培养基。LDL或TGFii也可单独或与其它因子组合来添加至 培养基。
[0299] 因子以患有血管疾病的个体中所观察到的因子的体内浓度范围内的浓度添加至 培养基。因此，例如，TNFa可以约〇· 〇〇5ng/ml至约0· 2ng/ml、约0· 01ng/ml至约0· Ing/ ml、约0· 03ng/ml至约0· 07ng/ml或约0· 04ng/ml至约0· 06ng/ml的浓度添加至培养基。例 如，TNFa可以约〇. 〇5ng/ml或约0. lng/ml的浓度添加至培养基。
[0300] oxLDL可以约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。
[0301] TNF a可以约〇. 〇5ng/ml的浓度添加至培养基。
[0302] HDL可以患有血管疾病的个体或处于血管疾病风险的个体中所观察到的HDL的体 内浓度范围内的浓度来添加至培养基。处于血管疾病风险的个体中的HDL浓度总体上小于 约300 μ g/ml，而健康个体中的HDL浓度在大于约300 μ g/ml直至约2, OOO μ g/ml健康锻炼 患者范围内。因此，例如，HDL可以约1 μ g/ml至约300μ g/ml、约10μ g/ml至约250μ g/ ml、约45 μ g/ml至约200 μ g/ml或约90 μ g/ml至约150 μ g/ml的浓度添加至培养基。例 如，HDL可以约45 μ g/ml或约90 μ g/ml的浓度添加至培养基。
[0303] HDL可适当地与TNF α和oxLDL组合来添加至培养基。HDL、TNF α和oxLDL适 当地各自以患有血管疾病的个体中所观察到的这些因子的体内浓度范围内的浓度存在， 例如，以上对于这些组分中的每一种列出的浓度范围。举例来说，HDL以约45 μ g/ml或约 90 μ g/ml的浓度添加至培养基，TNF α以约〇. 〇5ng/ml的浓度添加至培养基，并且oxLDL以 约50 μ g/ml的浓度添加至培养基。
[0304] 甘油三酯或包括极低密度脂蛋白（vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒和/或乳糜微粒残 余的富含甘油三酯的脂蛋白，可以患有血管疾病的个体中所观察到的这些因子的体内浓度 范围内的浓度来添加至培养基。健康患者中的甘油三酸酯水平在约40mg/dL至约150mg/dL 范围内。在患有高甘油三酯血症的患者中，甘油三酯水平在大于约200mg/dL至约1500mg/ dL范围内。因此，例如甘油三酯适当地以约175mg/dL至约1600mg/dL、约200mg/dL至约 1500mg/dL、约400mg/dL至约1200mg/dL或约600mg/dL至约1000mg/dL的浓度添加至培养 基。
[0305] 糖尿病和相关联升高水平的血糖是动脉粥样硬化的风险因素。因此，在体外将动 脉粥样硬化建模的本发明方法中，葡萄糖也可适当地添加至培养基。葡萄糖以如患有糖尿 病的个体中所观察到的葡萄糖的体内浓度范围内的浓度来添加至培养基。在健康个体中， 血糖浓度为约5至约10mM，而在糖尿病个体中，血糖浓度在大于约IOmM至约20mM范围内。 因此，例如，葡萄糖适当地以约IOmM至约25mM、约12mM至约20mM，或约14mM至约18mM的 浓度来添加至培养基。例如，葡萄糖可以约15mM或约17. 5mM的量来添加至培养基。
[0306] 葡萄糖可连同TNFa -起添加至培养基。葡萄糖和TNFa以患有例如糖尿病或血 管疾病的个体中所观察到的葡萄糖和TNFa的体内浓度范围内的浓度添加至培养基，这些 组分中的每一种的浓度范围在以上列出。举例来说，葡萄糖适当地以约15mM的浓度添加至 培养基并且TNFa适当地以〇. 〇5ng/ml的浓度添加至培养基。
[0307] 当葡萄糖和TNF α均添加至培养基时，葡萄糖可添加至培养基并且细胞在葡萄糖 存在下培养一段时间，然后施加剪切应力。举例来说，细胞适当地在葡萄糖存在下培养约1 至约7天，例如约3至约5天，或约4天，然后施加剪切应力。然后，剪切应力可施加于涂铺 内皮细胞上一段时间，然后将TNF α添加培养基。举例来说，剪切应力可施加至内皮细胞约 12小时至约48小时、约12小时至约36小时、约16小时至约32小时、约18小时至约28小 时或约24小时的时间，然后将TNFa添加至培养基。
[0308] LDL和/或TGF β可以患有血管疾病的个体中所观察到的LDL或TGF β的体内浓 度范围内的浓度添加至培养基。在健康个体中，LDL水平总体上在约50mg/dL至约IOOmg/ dL范围内，而在患有动脉粥样硬化的个体中，LDL水平总体上高于约100mg/dL。因此，例如， LDL 适当地以约 100mg/dL 至约 500mg/dL、约 100mg/dL 至约 300mg/dL，或约 100mg/dL 的浓 度来添加至培养基。
[0309] 在健康个体中，TGFP水平总体上小于约30ng/ml，而患有血管疾病的个体中的水 平为约30ng/ml至约100ng/ml。因此，TGFP适当地以约30ng/ml至约150ng/ml、约30ng/ ml至约100ng/ml、约50至约lOOng/ml或约60至约90ng/ml的浓度添加至培养基。
[0310] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后，将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适 当地持续一段时间。施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36 小时或约20至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如， 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后，剪切应力可持续约24小时。
[0311] 动脉粥样硬化的模拟可通过许多方法来评估。通常，如与不存在施加剪切力的内 皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的内皮细胞或平滑 肌细胞或培养基中的动脉粥样硬化标记物的水平的变化证实动脉粥样硬化得到模拟。举例 来说，动脉粥样硬化的模拟可通过检查与动脉粥样硬化相关的基因或蛋白质的表达、检查 与动脉粥样硬化相关的蛋白质的活性，或检查分泌细胞因子的水平来评估。
[0312] 高血压
[0313] 本发明的方法也可用于在体外将高血压建模。血管紧张素 II (ANG2)水平在患有 心血管并发症，如动脉粥样硬化、糖尿病或高血压的患者中增加。在健康患者中，ANG2的典 型浓度在约InM至约5nM范围内，并且在高血压患者中大于约6nM至约20nM。另外，醛固酮 是在肾素-血管紧张素系统中的ANG2下游的重要信号转导激素。它的水平可在包括动脉 粥样硬化、糖尿病和高血压的多个病状下变化。在健康个体中，醛固酮的浓度为约〇. 3mM。 在患有醛固酮过多症的个体中，醛固酮浓度在约0. 8mM至约ImM范围内。
[0314] 在体外将高血压建模的方法中，将内皮细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上。细 胞培养容器内的表面可为多孔膜的表面，并且多孔膜可悬浮于细胞培养容器中以使得多孔 膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养基 内界定包含多孔膜的第一表面的下部容积和包含多孔膜的第二表面和内皮细胞的上部容 积。或者，内皮细胞涂铺于其上的表面可为细胞培养容器的底部。
[0315] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于细胞培养 容器中的培养基中。举例来说，平滑肌细胞可涂铺于细胞培养容器内的多孔膜的第一表面 上并且内皮细胞可涂铺于多孔膜的第二表面上。多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得多孔 膜的第一表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养基 内界定包含多孔膜的第一表面和平滑肌细胞的下部容积以及包含多孔膜的第二表面和内 皮细胞的上部容积。
[0316] 单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、内皮祖细胞、循环干细胞、循环造血细胞或白 细胞可任选地悬浮于上部或下部容积中的细胞培养基中。
[0317] 剪切力施加于涂铺内皮细胞上，剪切力由血液动力学自喷设备诱导的培养基的流 动产生。流动模拟在体内高血压中内皮细胞暴露的流动。
[0318] 剪切力可施加于涂铺内皮细胞上一段时间，然后将一种或多种因子添加至培养 基。举例来说，剪切力可施加至内皮细胞约12小时至约48小时、约12小时至约36小时、 约16小时至约32小时或约18小时至约28小时的时间，然后将一种或多种因子添加至培 养基。例如，剪切力施加至涂铺内皮细胞约24小时，然后添加一种或多种因子。或者，剪切 力与将一种或多种因子添加至培养基同时施加至涂铺内皮细胞。
[0319] 一种或多种因子可添加至培养基。举例来说，添加至培养基的一种或多种因子可 为涉及高血压发展或进展的因子。一种或多种因子以患有血管疾病的受试者中所观察到的 因子的体内浓度范围内的浓度添加至培养基。举例来说，血管紧张素适当地以约5. 5nM至 约25nM、约6nM至约20nM、约8nM至约15nM，或约9nM至约12nM的浓度，例如，约IOnM的浓 度添加至培养基。
[0320] 血管紧张素可单独或与另一种因子如醛固酮组合来添加至培养基。或者，醛固酮 可单独地或与除了血管紧张素以外的因子组合来添加至培养基。当醛固酮添加至培养基 时，它适当地以约0. 5mM至约I. 5mM，或约0. 8mM至约ImM的浓度，例如，约ImM的浓度存在。
[0321] 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后，将剪切应力施加至涂铺内皮细胞适 当地持续一段时间。施加剪切应力可持续例如约12小时至约48小时、约18小时至约36 小时或约20至约30小时、约18小时至约72小时或约24小时至约72小时的时间。例如， 在将一种或多种因子添加至细胞培养基之后，剪切应力可持续约24小时。
[0322] 动脉粥样硬化的模拟可通过许多方法来评估。通常，如与不存在施加剪切力的内 皮细胞或平滑肌细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的内皮细胞或平滑 肌细胞或培养基中的动脉粥样硬化标记物的水平的变化证实动脉粥样硬化得到模拟。举例 来说，动脉粥样硬化的模拟可通过检查与动脉粥样硬化相关的基因或蛋白质和/或分泌微 粒或蛋白质的表达、检查与动脉粥样硬化相关的蛋白质的活性，或检查分泌细胞因子、趋化 因子或生长因子的水平来评估。
[0323] 生理肝模型
[0324] 本发明方法也可用于产生肝的生理体外模型。在这类方法中，肝细胞涂铺于细胞 培养容器内的表面上，并且剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。举例来说，肝细胞适当地涂铺 于多孔膜的第一表面上，其中将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一表面为近端并且 与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定包含肝细胞的下 部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部容积中的多孔膜 的第二表面。因此，设备中的细胞的配置（图15C)基于肝小叶的体内微体系结构（图15A)。
[0325] 如图15A展示，在体内肝小叶中，肝细胞条带100通过肝窦内皮细胞的过滤层110 和细胞外基质层140与肝窦血液流动150分离。细胞外基质层140提供肝细胞的锚定，涉 及信号转导，并且提供细胞因子和生长因子的库。肝细胞110具有极化形态并且胆小管120 存在于肝细胞层中。肝窦血液流动150和间隙血液流动130提供氧和营养物运输。
[0326] 图15B和15C描绘用于本发明体外肝模型中的不例性配置。如图15B的插图和图 15C中展示，肝细胞260涂铺于悬浮于细胞培养容器240中的多孔膜250上，并且剪切力施 加器（在图15B和15C中展示为圆锥体230)用于将剪切力施加至多孔膜的相反侧。剪切 力由细胞培养容器中的培养基的流动产生。多孔膜与存在于肝中的肝窦内皮细胞过滤层类 似地来起作用。肝细胞被屏蔽以避免流动的直接效应的影响，如其在体内那样。细胞培养 容器内的上部和下部体积的入口和出口 270允许连续灌注培养基和灌注药物或化合物进 入和离开细胞培养基。施加剪切力产生受控血液动力学，其调控间隙流动和溶质转移穿过 多孔膜。在本发明的体外模型中，肝细胞保持其极化形态和胆小管。
[0327] 如图15C中示出，一种或多种细胞外基质组分280(例如，胶原凝胶）的至少一个 层可适当地沉积于多孔膜的第一表面上。然后，肝细胞260涂铺于细胞外基质组分上。然 后，细胞外基质组分的一个或多个额外层可沉积于肝细胞的顶部，以使得肝细胞大致上由 细胞外基质组分来包围。细胞外基质组分适当地包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质 素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。举例来说，细胞 外基质组分可包括胶原。
[0328] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于培养基中。 举例来说，非实质肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切力施加至涂铺非实 质细胞。非实质细胞可包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞、库柏法细胞或其组合。肝细胞和非 实质肝细胞适当地为从动物的肝，例如人的肝分离的原代细胞。或者，肝细胞和/或非实质 肝细胞是永生细胞。
[0329] 培养基适当地连续灌注于多孔膜的两侧上，同时由一系列生理血液流动值获得的 剪切力连续施加至多孔膜的第二表面或施加至涂铺非实质肝细胞。施加至多孔膜的第二 表面的剪切力模拟在体内发生的穿过肝窦的流动。剪切速率适当地为约〇. ldyne/cm2至 约 3. Odyne/cm2、约 0· 2dyne/cm2 至约 2. 5dyne/cm2、约 0· 3dyne/cm2 至约 I. Odyne/cm2 或约 0. 4dyne/cm2至约0. 8dyne/cm2。举例来说，剪切速率可为约0. 6dyne/cm2。或者，剪切速率 可为约 2. Odyne/cm2。
[0330] 在生理体外肝模型中，一种或多种因子存在于培养基中。这些一种或多种因子可 以在剪切力下能够保持体外生理肝条件的模拟一段时间的浓度添加至培养基，其中相同浓 度的这些因子在不存在剪切力下不能保持体外生理肝条件的模拟一段时间。举例来说，因 子可包括胰岛素、葡萄糖或胰岛素与葡萄糖的组合。如与通常用于静态培养物中的浓度 (约17. 5mM葡萄糖和约2μΜ胰岛素）相比，葡萄糖和胰岛素适当地以降低的浓度存在。举 例来说，葡萄糖可以约5mM至约IOmM的浓度，或约5. 5至约7mM的浓度，例如，约5. 5mM的 浓度存在于培养基中。胰岛素可以约〇. 〇5nM至约5nM的浓度，例如约0. InM至约3nM，或约 0. 5至约2. 5nM，例如，约2nM的浓度存在于培养基中。一种或多种因子适当地在施加剪切 力之前或同时添加至培养基。
[0331] 一种或多种因子的浓度适当地能够保持体外生理肝条件的模拟至少约7天、至少 约14天、至少约21天、至少约30天或更长。
[0332] 生理肝条件的模拟可通过许多方法来评估。通常，如与不存在施加剪切力的肝细 胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的肝细胞或非实质肝 细胞或培养基中的生理肝条件的标记物的水平的变化证实生理肝条件得到模拟。举例来 说，可评估生理肝条件的模拟，通过针对涉及将肝保持于生理状态下的基因或蛋白质的表 达（例如，在肝细胞中，代谢和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因）来检查肝细胞或非实质肝 细胞；针对脂质积累来检查肝细胞；针对分化功能的变化（例如，在肝细胞中，测量尿素和 白蛋白分泌）来检查肝细胞或非实质肝细胞；针对代谢活性（例如，在肝细胞中，使用细胞 色素 P450测定）或转运蛋白活性的变化来检查肝细胞或非实质肝细胞；或针对形态变化来 检查肝细胞或非实质肝细胞。也可评估肝的生理性病况，通过将肝细胞或非实质肝细胞对 于异生物质、营养物、生长因子或细胞因子的响应与对于相同异生物质、营养物、生长因子 或细胞因子的体内肝响应进行比较。
[0333] 如以下实施例4中进一步描述，不同于在静态条件下培养的肝细胞，本发明的生 理体外肝模型中培养的肝细胞保持其对于胰高血糖素、胰岛素和葡萄糖底物的响应性。因 此，对于胰高血糖素、胰岛素或一种或多种葡萄糖底物的响应性（例如，使用糖质新生测 定）也可用于评估生理肝条件的模拟。合适葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其组 合（例如，乳酸酯与丙酮酸酯的组合）。此外，因为肝细胞保持对于胰高血糖素的响应性，所 以本发明的生理体外肝模型可用于体外测试与胰高血糖素受体相互作用的药物（例如，胰 高血糖素受体拮抗剂）。
[0334] 另外，与静态培养系统相比，在本发明的生理体外肝模型中培养的肝细胞在更接 近于体内和临床水平的浓度下显示对于药物的诱导和毒性响应。因此，此模型可用于 在体内实现效应的药物或化合物的浓度范围内的浓度下来体外测试药物和化合物。
[0335] 脂肪肝
[0336] 本文描述的方法也可用于产生脂肪肝疾病的体外模型。肝细胞内的脂质调控是复 杂和动态的过程。甘油三酯积累可由于高脂肪饮食导致脂肪酸吸收增加、外周脂肪分解增 力口，或重新脂肪生成增加而发生。胰岛素和葡萄糖是重新脂肪生成的关键调控剂并且有助 于通过刺激甘油三酯合成以及抑制经由β氧化的脂肪酸代谢来增加肝细胞内的甘油三酯 含量。
[0337] 非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD)与在存在胰岛素抵抗下的肥胖症、II型糖尿病和代 谢综合征相关联。NAFLD的特征为肝脂肪变性（肝中的过量脂质积累），如果保持不治疗， 会进展至炎症性变化（脂肪性肝炎）和肝硬化。许多动物模型经由高血糖-高胰岛素环境 来诱导脂肪变性（例如，经由使用低脂肪/高碳水化合物饮食来刺激脂肪生成）。然而，当 前体外肝细胞模型缺乏诱导脂肪变性的足够胰岛素-葡萄糖响应，大概是因为在静态条件 下保持培养物中的肝细胞需要超生理水平的胰岛素/葡萄糖。这类体外模型未能诱导经由 胰岛素和葡萄糖实现的肝细胞的脂肪变化，或许归因于在静态培养条件下肝细胞的胰岛素 响应性被削弱和在体外肝细胞的快速去分化。
[0338] 相比之下，如上相对于生理肝模型所述，在存在受控肝衍生血液动力学和运输下 培养的肝细胞在生理葡萄糖和胰岛素水平下保持分化功能、形态和响应。在此系统中，引入 高浓度的胰岛素和葡萄糖（"疾病环境"）诱导肝细胞的脂肪变化。因此，受控血液动力学 和运输在肝细胞中产生对于胰岛素和葡萄糖的更多生理响应，从而在高胰岛素、高血糖环 境中诱导与脂肪变性相关联的脂肪变化，如通常最初在糖尿病的胰岛素抗性条件下所见。 另外，与静态培养系统相比，在存在受控血液动力学和运输的情况下培养的肝细胞在更接 近于体内和临床水平的浓度下显示对于药物的诱导和毒性响应。因此，本发明系统提 供脂肪肝疾病的体外模型。
[0339] 在此模型中，肝细胞总体上以与如上对于生理肝模型所述相同的方式来涂铺。肝 细胞涂铺于细胞培养容器内的表面上，并且剪切力间接地施加至涂铺肝细胞。举例来说，肝 细胞适当地涂铺于多孔膜的第一表面上，其中将多孔膜悬浮于细胞培养容器中以使得第一 表面为近端并且与细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在细胞培养容器内界定 包含肝细胞的下部容积和包含多孔膜的第二表面的上部容积。将剪切力施加至容器的上部 容积中的多孔膜的第二表面。
[0340] 一种或多种细胞外基质组分的至少一个层可适当地沉积于多孔膜的第一表面上。 然后，肝细胞涂铺于细胞外基质组分上。然后，细胞外基质组分的一个或多个额外层可沉积 于肝细胞的顶部，以使得肝细胞大致上由细胞外基质组分来包围。细胞外基质组分适当地 包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连 蛋白、玻连蛋白或其组合。举例来说，细胞外基质组分可包括胶原。
[0341] 一种或多种额外细胞类型可涂铺于细胞培养容器内的表面上或悬浮于培养基中。 举例来说，非实质肝细胞适当地涂铺于多孔膜的第二表面上，并且剪切力施加至涂铺非实 质细胞。非实质细胞可包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞、库柏法细胞或其组合。肝细胞和非 实质肝细胞适当地为从动物的肝，例如人的肝分离的原代细胞。或者，肝细胞和/或非实质 肝细胞是永生细胞。
[0342] 培养基适当地连续灌注于多孔膜的两侧上，同时由一系列生理血液流动值获得的 剪切力连续施加至多孔膜的第二表面或施加至涂铺非实质肝细胞。施加至多孔膜的第二 表面的剪切力模拟在体内发生的穿过肝窦的流动。剪切速率适当地为约〇. ldyne/cm2至 约 3. Odyne/cm2、约 0· 2dyne/cm2 至约 2. 5dyne/cm2、约 0· 3dyne/cm2 至约 I. Odyne/cm2 或约 0. 4dyne/cm2至约0. 8dyne/cm2。举例来说，剪切速率可为约0. 6dyne/cm2。或者，剪切速率 可为约 2. Odyne/cm2。
[0343] 在体外脂肪肝模型中，一种或多种因子存在于培养基中。这些一种或多种因子以 在剪切力下能够保持体外脂肪肝疾病的模拟一段时间的浓度添加至培养基，其中相同浓 度的因子在不存在剪切力下不能保持脂肪肝疾病的模拟一段时间。因子可包括例如胰岛 素、葡萄糖或其组合。葡萄糖适当地以约IOmM至约25mM、约12mM至约20mM，或约14mM至 约18mM，例如，约17. 5mM的浓度存在于培养基中。胰岛素适当地以约ΙμΜ至约3μΜ、约 1. 5 μ M至约2. 5 μ Μ，或约1. 8 μ M至约2. 2 μ Μ，例如，约2 μ M的浓度存在于培养基中。一种 或多种因子适当地在施加剪切力之前或同时添加至培养基。
[0344] -种或多种因子的浓度适当地能够保持体外脂肪肝疾病的模拟至少约7天、至少 约14天、至少约21天、至少约30天或更长。
[0345] 脂肪肝疾病的模拟可通过许多方法来评估。通常，如与不存在施加剪切力的肝细 胞或非实质肝细胞或培养基中的标记物的水平相比，在施加剪切力后的肝细胞或非实质肝 细胞或培养基中的脂肪肝疾病的标记物的水平的变化证实脂肪肝疾病得到模拟。举例来 说，可评估脂肪肝疾病的模拟，通过针对涉及脂肪肝疾病状态的基因或蛋白质的表达（例 如，在肝细胞中，代谢和胰岛素/葡萄糖/脂质途径基因）来检查肝细胞或非实质肝细胞； 针对脂质积累来检查肝细胞（例如，在肝细胞中，测量甘油三酯水平或观测脂质小滴）；针 对分化功能的变化（例如，在肝细胞中，测量尿素和白蛋白分泌）来检查肝细胞或非实质肝 细胞；针对代谢活性（例如，在肝细胞中，使用细胞色素 Ρ450测定）或转运蛋白活性的变化 来检查肝细胞或非实质肝细胞；或针对形态变化来检查肝细胞或非实质肝细胞。也可评估 脂肪肝变化的后遗症，通过测量肝细胞的氧化状态的变化和周围细胞外基质组合物和量的 变化。
[0346] 本发明已详细描述，在不脱离附加的权利要求界定的本发明范畴情况下，可能的 改良和变化是显而易见的。 实施例
[0347] 实施例1 :动脉和静脉血栓形成的体外模型
[0348] 在凝血级联中，凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，其沉积在血管表面上以开 始血液凝块形成（血栓形成）。TNFa是有效炎症细胞因子。TNFa和其它细胞因子已被 证明是体外内皮和平滑肌细胞衍生组织因子的有效介体，所述组织因子介导血管壁中的纤 维蛋白沉积。在患有心血管疾病的人体内检测到的TNFa的循环水平为约O.Olng/ml至 约0. lng/ml。在健康个体中，TNFa的循环水平低得多或不可检测到，例如约〇ng/ml至约 0·001ng/ml。
[0349] 方法：
[0350] 在存在或不存在人衍生、区域特异性血液动力学的情况下，人内皮细胞与或不与 平滑肌细胞一起共培养。内皮细胞暴露于各种浓度的TNFa并且在补充有ALEXA FLUOR 488(A488,荧光染料）标记纤维蛋白原的人、无血小板血浆中孵育。A488-纤维蛋白原至 A488-纤维蛋白的转化并在内皮上的沉积通过共焦显微术来量化。
[0351] (i)静态单一培养物血栓形成测定
[0352] 对于内皮细胞的静态单一培养物，内皮细胞以100, 000个细胞/cm2涂铺于盖片上 并允许粘附24小时。24小时之后，将培养基更换成含有0ng/ml、lng/ml、10ng/ml或20ng/ ml TNFa的培养基。在37°C下孵育细胞4小时。孵育之后，将培养基去除并且细胞用PBS 洗涤两次。然后，细胞在37°C下用补充有37. 5μ g/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20μ g/mL 玉米胰蛋白酶抑制剂和IOmM钙的人无血小板血浆（PFP)再孵育15分钟。此方案描绘于图 IA中。15分钟之后，细胞用4%多聚甲醛（PFA)固定并且用IOmM Tris、ImM EDTA缓冲液中 的0. 5nM SYT083 (荧光核酸染色剂）染色45分钟。盖片使用FLU0R0M0UNT-G (封固剂）封 固至盖玻片上并成像。
[0353] (ii)使用剪切应力的单一培养物血栓形成测定
[0354] 内皮细胞以100, 000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL (聚碳酸酯，10 μ m 厚度和0. 4 μ m孔径，no. 3419, Corning)的多孔膜上，并经受使用锥板式设备的动脉粥样硬 化易发性或动脉粥样硬化预防性血液动力学模式。
[0355] 24小时剪切应力施加（动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性）之后，培养 基用0.051^/1^或0.101^/11^浓度下的了即〇补充并且剪切应力继续再进行24小时，如图 3A展示。然后，将培养基从上部和下部腔室去除，并且内皮细胞用PBS洗涤两次。然后，内 皮细胞在37°C下与补充有37. 5 μ g/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20 μ g/mL玉米胰蛋白酶 抑制剂和IOmM钙的PFP -起孵育15分钟。15分钟之后，细胞用4% PFA固定并且用IOmM Tris、lmM EDTA缓冲液中的0. 5nM SYT083染色45分钟。使用FLU0R0M0UNT-G将小部分多 孔膜封固至盖玻片上并成像。
[0356] (iii)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案A
[0357] 平滑肌细胞以20, 000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL的多孔膜的第一 表面并且允许粘附至膜两小时。然后，将TRANSWELL翻转并且细胞在减少血清生长培养基 (补充有2%FBS、2mML-谷酰胺和lOOU/ml青霉素-链霉素的M199)中孵育四十八小时。然 后，在相同培养基条件下，将内皮细胞以100, 〇〇〇个细胞/cm2的密度涂铺于TRANSWELL多 孔膜的第二表面上，并且再孵育二十四小时，然后施加剪切应力。
[0358] 24小时剪切应力施加（动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性）之后，培养 基用0.051^/1^或0.101^/11^浓度下的了即〇补充并且剪切应力继续再进行24小时，如图 3A展示。然后，将培养基从上部和下部腔室去除，并且内皮细胞和平滑肌细胞用PBS洗涤两 次。然后，内皮细胞在37°C下与补充有37. 5μ g/mLALEXA-488人纤维蛋白原、20μ g/mL玉 米胰蛋白酶抑制剂和IOmM钙的PFP -起孵育15分钟，并且如上对于单一培养物所述来固 定并成像。
[0359] (iv)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案B
[0360] 将平滑肌细胞和内皮细胞涂铺，经受动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性 剪切应力，并且如上对于方案A所述用TNF α处理。补充有37. 5 μ g/mL ALEXA-488人纤维 蛋白原和20 μ g/mL玉米胰蛋白酶抑制剂的PFP添加至上部容积以产生大约27%的PFP的 最终浓度。PFP进一步用钙补充至PFP/培养基组合中的IOmM钙的最终浓度。然后，内皮细 胞在37°C下再孵育15分钟并且如上所述来固定并成像。
[0361] (V)使用剪切应力的共培养物血栓形成测定-方案C
[0362] 将平滑肌细胞和内皮细胞涂铺，经受动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防 性剪切应力，并且如上对于方案A所述用TNFa处理。然后，将锥板式设备的圆锥体抬高 约2mm并且将流入/流出夹具去除。然后，圆锥体降低回到操作高度。补充有37. 5 μ g/mL ALEXA-488人纤维蛋白原、20 μ g/mL玉米胰蛋白酶抑制剂的PFP添加至上部容积以产生大 约27%的PFP的最终浓度。PFP进一步用钙补充至PFP/培养基组合中的IOmM钙的最终浓 度。然后，在施加动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性剪切应力的情况下，将共培养 物再孵育30分钟，如图4A展示。30分钟之后，将细胞培养皿从设备上去除并且培养基从下 部容积去除。然后,如上所述将内皮细胞固定并成像。
[0363] 结果：
[0364] (i)静态内皮细胞单一培养物
[0365] 在静态条件下培养24小时并用TNFa处理4小时的内皮细胞的培养物中，用Ing/ ml TNFa处理的样品展示最小纤维蛋白沉积，而用l〇ng/ml或20ng/ml处理的样品展示稠 密纤维蛋白网络（分别为I. 17e5相比于2. 69e7相比于3. 61e7平均荧光强度）（图IB ;插 图为彩色图像）。如图IB的下部中间图中展示，具有从左至右的"X轴"和上下走向的"z 轴"的血块的横截面叠加成像，以测量表面上方的血块的高度（z轴）。平均灰度值是细胞 表面上方的指定高度的堆叠的每个图像的荧光强度（图IB的下部最右侧图）。
[0366] 纤维蛋白沉积是组织因子依赖性的并且由抗-⑶142抗体阻断。图IC的上图展示 在针对组织因子的抗体（抗-CD142,左侧）或对照抗体（IgGlK，右侧）存在下的纤维蛋白 沉积。下图展示相同场中的细胞核的染色，证明细胞的存在。
[0367] 因此,在静态条件下，内皮细胞需要由TNFa活化以启始凝血级联。此活化取决于 组织因子活性和比生理水平高大约200倍的TNFa浓度。
[0368] (ii)经受剪切的内皮细胞/平滑肌细胞共培养物
[0369] 图2B描绘内皮和平滑肌细胞（在动脉粥样硬化易发性或动脉粥样硬化预防性条 件下生长；参见图2A)中的与血栓形成相关的若干基因的相对基因表达的热图。组织因子 (F3)和凝血调节蛋白（THBD)的基因表达的相对变化呈现于热图下方。与动脉粥样硬化预 防性剪切应力相比，动脉粥样硬化易发性血液动力学将组织因子（F3)上调。此外，结合凝 血酶并且抑制凝血级联的凝血调节蛋白得以下调。另外，TNFa刺激减少内皮和平滑肌细 胞中的组织因子通道抑制剂（TFPI)。
[0370] 从颈内动脉窦获得并且用0. 05ng/ml TNF a处理的用炎症易发性血液动力学预敏 化的内皮/平滑肌细胞共培养物沉积稠密纤维蛋白网络（I. 9e7平均荧光强度）（图3B ;数 据使用如上所述方案A来产生）。因此，动脉粥样硬化易发性血液动力学将内皮层预敏化 以便对于细胞因子活化更具有响应性，如与静态培养物相比，允许100至200倍更低水平的 TNFa来诱导纤维蛋白沉积。
[0371] 只培养内皮细胞的相同实验产生类似结果（数据未展示），证明结果是血液动力 学特异性的并且不是存在平滑肌细胞的结果。
[0372] 图4B展示如上所述根据方案C执行的实验的结果，其中剪切应力在血块形成期间 保持，从而更接近地模拟生理性病况。图4B的两个上图展示每个条件的叠加图像并稍微成 角度以展示血块形态。图4B中的条形图展示细胞表面上方的指示距离处的这些图像中的 每一个的荧光强度。细胞表面上方6 μ m和21 μ m处的代表性图像展示于图4B的下部右侧 图中。
[0373] 结论：
[0374] 内皮细胞的静态单一培养物需要与人循环血液浓度不相关的显著升高水平的 TNFa以便诱导纤维蛋白沉积。与动脉粥样硬化预防性血液动力学相比，动脉粥样硬化易 发性血液动力学上调凝血因子并下调凝血抑制剂。在体外内皮细胞的血液动力学预敏化将 对于TNFa的剂量依赖性纤维蛋白沉积响应移位至与患有心血管疾病的人中所观察到的 TNFa的循环水平类似的浓度范围中，比在静态内皮细胞培养物中诱导纤维蛋白沉积所需 要的水平低两个数量级。
[0375] 实施例2 :动脉粥样硬化的体外模型
[0376] (i)血液动力学环境中的oxLDL的效应
[0377] (a)方法
[0378] 为了氧化LDL，天然LDL(nLDL)用PBS渗析24小时以去除EDTA。然后，LDL在含有 13. 8 μ M CuSO4的PBS中渗析3天。然后，LDL用含有50 μ M EDTA的PBS再渗析24小时。 相对电泳迁移数量用于证实每个批次的氧化水平。在氧化结束后，oxLDL在氮下在4°C下存 储直到使用为止。
[0379] 平滑肌细胞以20, 000个细胞/cm2的涂铺密度涂铺于TRANSWELL (聚碳酸酯，10 μ m 厚度和0.4μπι孔径，no. 3419, Corning)的多孔膜的第一表面并且允许粘附至膜两小时。 然后，将TRANSWELL翻转并且细胞在减少血清生长培养基（补充有2% FBS、2mM L-谷酰胺 和lOOU/ml青霉素-链霉素的M199)中孵育四十八小时。然后，在相同培养基条件下，将内 皮细胞以100, 〇〇〇个细胞/cm2的密度涂铺于TRANSWELL多孔膜的第二表面上，并且再孵育 二十四小时，然后施加剪切应力。
[0380] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力来剪切应力预调节 16-24小时之后，oxLDL以10-50 μ g/ml的浓度添加至上部容积（含有内皮细胞）（图5)。 在未接收oxLDL的设备中，nLDL以相同浓度添加至上部容积并且用作媒介物对照。oxLDL 的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的oxLDL的血浆浓度。在oxLDL存在 下，剪切应力施加再继续24小时。
[0381] 在内皮细胞和平滑肌细胞中的动脉粥样硬化易发性血液动力学环境内，五种不同 供体对用于分析与nLDL (50 μ g/ml)相比的oxLDL (50 μ g/ml)响应。在实验结束后，收集RNA 以进行基因阵列分析。有效基因使用0.01的FDR来考虑。基因表达结果以与β-2微球蛋 白（Β2Μ)的表达相比的基因的相对表达来报告。蛋白质表达结果以与肌动蛋白的表达相比 的蛋白质的相对表达来报告。NF κ B的活性使用在EC和SMC中感染的腺病毒NF κ B-荧光 素酶（Ad-NFicB-Iuc)报告物来评估。
[0382] (b)结果
[0383] 如图6展示，不同浓度的oxLDL对于基因表达的效应在动脉粥样硬化易发性血液 动力学环境与传统静态培养物之间进行比较。这些数据进一步与没有oxLDL的"健康"血 液动力学条件比较。（在图6中，"健康"指示施加动脉粥样硬化预防性血液动力学，"动脉 粥样硬化易发性"指示施加动脉粥样硬化易发性血液动力学；并且"传统"指示施加静态培 养条件。平均值土SE，n = 4，*p < 0. 05，t-测试。）血液动力学环境显著调控许多促和抗 炎症基因（IL8、E-选择素（SELE)、KLF2、eN0S)。与nLDL相比，对于添加 oxLDL的响应产生 取决于血液动力学环境的基因表达的剂量依赖性变化。
[0384] 具体地说，传统静态培养物中的以前公开的研究展示HO-I和ATF3是"典型"oxLDL 敏感基因。如图6A和6B展示，与传统静态条件相比，oxLDL在动脉粥样硬化易发性条件下 以高得多的水平活化这些基因。
[0385] 只有动脉粥样硬化易发性条件才有的，还发现oxLDL活化炎症基因如IL8和E-选 择蛋白（SELE)，这些基因在传统静态培养物中未得到调控（图6C和6D)。有趣地，oxLDL减 少动脉粥样硬化预防性信号转导（eNOS和KLF2)(图6E和6F)。
[0386] 图7示出在动脉粥样硬化易发性血液动力学环境中的响应于oxLDL处理的蛋白质 表达的变化。与基因表达一致，oxLDL处理导致VCAM-I蛋白质表达升高（促炎症性；图7A) 和动脉粥样硬化预防性eNOS信号转导的磷酸化减少（图7B)。此外，oxLDL处理导致分泌 细胞因子，如IL6、IL8和MCP-I的水平增加（图7C-7E)。在图7中，平均值土SE, η = 4， *ρ < 0· 05, t_ 测试。
[0387] 因为许多受oxLDL影响的基因和蛋白质是NF κ B依赖性的，所以NF κ B活性在内 皮细胞和平滑肌细胞中使用荧光素酶报告物来评估。图8展示在内皮细胞中（图8A)，与健 康条件相比，动脉粥样硬化易发性血液动力学使细胞对于升高的NF κ B活性"预敏化"。此 响应通过用oxLDL处理来进一步增强。同样地，平滑肌细胞（图8B)通过用oxLDL处理展 示升高的NF κ B信号转导（虽然oxLDL添加至只包含内皮细胞的上部容积）。在图8中，平 均值土SE, η = 4, *p < 0· 05, t-测试。
[0388] 完全基因组阵列用于调查50 μ g/ml nLDL与50 μ g/ml oxLDL之间的在动脉粥样 硬化易发性条件内的EC和SMC的基因表达差异。图9展示5个供体（内皮细胞）或4个 供体（平滑肌细胞）的在两个不同条件下的基因表达的热图。使用严格统计截止标准（SAM 和wLPE方法），如与用nLDL处理的细胞相比，688个基因在内皮细胞中得到调控并且304 个基因在平滑肌细胞中得到调控。这些基因图富集有剪切应力调控、促-(VCAM、E-选择蛋 白）和抗-(KLF2、eNOS)炎症基因。
[0389] 总而言之，在传统静态培养物中，已知oxLDL活化一些途径（H0-1、ATF3)，但是不 活化其它途径（E-选择蛋白、IL6)。在这里，发现在动脉粥样硬化易发性血液动力学环境内 添加 oxLDL优先减少内皮"动脉粥样硬化预防性"信号转导（KLF2、eNOS表达和磷酸化），并 且进一步活化促炎症性信号转导，包括粘附分子表达和细胞因子分泌。虽然未直接暴露于 动脉粥样硬化易发性剪切应力或LDL，许多基因在此共培养系统中的潜在SMC中受这些条 件调控，包括炎症基因。调查生理剪切应力情形内的oxLDL的作用发现增强动脉粥样硬化 易发性调控基因谱朝向更加促炎症性的表型。这些条件模拟存在于人动脉中的血管壁炎症 并且提供测试旨在处理晚期动脉粥样硬化的药物的理想环境。
[0390] (ii)血液动力学环境中的TNFa的效应
[0391] (a)方法
[0392] TNF-α是有效炎症细胞因子。TNF-α的浓度按照患有慢性心力衰竭的患者的严 重程度来调节至?〇. 〇2ng/ml的水平，而在健康个体中，TNF-α通常低得多或不可检测到。 如以上提及，在患有心血管疾病的人体内检测到的TNFa的循环水平为约〇. 〇lng/ml至 约0. lng/ml。在健康个体中，TNFa的循环水平低得多或不可检测到，例如约〇ng/ml至约 0. 001ng/ml。相比之下，静态体外实验通常使用l-10ng/ml的TNFa浓度。
[0393] 平滑肌细胞和内皮细胞以与如上对于oxLDL实验所述的相同的方式涂铺于 TRANSWELL的多孔膜的第一和第二表面。
[0394] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力来剪切应力预调节 24小时之后，了即 〇以〇.〇5-11^/1111的浓度添加至上部容积（含有内皮细胞）（参见图5)。 TNFa的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的TNF α的血浆浓度。在TNF a 存在下，剪切应力施加再继续24小时。
[0395] (b)结果
[0396] 如图10展示，发现与传统静态培养物相比，血液动力学预敏化18-24小时使内皮 细胞和平滑肌细胞对于较低水平TNFa敏化。用0.1-lng/ml TNFa处理内皮细胞诱导在 相同水平下未见于静态培养物中的炎症响应，如经受动脉粥样硬化易发性血液动力学力的 培养物中的E-选择蛋白、ICAM、VCAM和IL8的表达增加所示出。在图10中，"传统"指示 细胞在静态条件下培养，并且"疾病"指示细胞经受动脉粥样硬化易发性血液动力学力。图 10中的数据展示为平均值土SE, η = 4, *p < 0. 05, t-测试。
[0397] (iii)血液动力学环境中的oxLDL和TNF α的效应
[0398] (a)方法
[0399] 为了模拟动脉粥样硬化的更多炎症阶段，需要将多个循环因子组合以更好地模拟 存在于人血管中的复杂性。对于这些实验，内皮细胞和平滑肌细胞以如上所述相同的方式 涂铺并且经受动脉粥样硬化易发性剪切应力预调节18-24小时。然后，将上部容积中的培 养基更换成含有〇. 〇5ng/ml TNF α和50 μ g/ml oxLDL的培养基。只含有50 μ g/ml nLDL 的培养基用作对照。
[0400] 用动脉粥样硬化预防性或动脉粥样硬化易发性血液动力学力24小时剪切应力 预调节之后，将50 μ g/ml oxLDL和0. 05ng/ml TNF α添加至上部容积（含有内皮细胞）。 TNFa的此浓度类似于在患有心血管疾病的患者中所观察到的TNFa的血浆浓度。在未接 收oxLDL的设备中，nLDL以相同浓度添加至上部容积并且用作媒介物对照。在TNF-α和 oxLDL存在下，剪切应力施加再继续24小时（参见图5)。基因表达分析使用RT-PCR来执 行。
[0401] (b)结果
[0402] 这些因子的组合（oxLDL和TNFa )在基因和蛋白质表达中展示协同增加，同时与 单独oxLDL或TNFa相比，也提供更广泛的信号转导活化。图IlA展示与单独oxLDL相比， E-选择蛋白（SELE)，一种促炎症性粘附分子的基因表达升高。因此，类似于图6展示的结 果，与用nLDL处理的对照相比，oxLDL导致更高水平的E-选择蛋白基因表达。添加 TNF a 与oxLDL导致甚至更大水平的炎症基因表达。
[0403] 另外，经由eNOS转录（N0S3)的动脉粥样硬化预防性信号转导在炎症条件下大大 减少。此响应通过动脉粥样硬化易发性剪切应力+oxLDL+TNFa的组合来放大（图11B)。 因此，eNOS基因表达（N0S3)通过oxLDL来减少，但是使用TNF- a与oxLDL的组合，动脉粥 样硬化预防性信号转导甚至进一步被抑制。最终产物是与单独动脉粥样硬化易发性相比， 具有较高基础水平的炎症信号转导的系统。
[0404] (iv)血液动力学环境中的高密度脂蛋白（HDL)的效应
[0405] (a)方法
[0406] 不同于nLDL或oxLDL的血浆胆固醇的额外组分是HDL。为了评估血液动力学环 境中的HDL的效应，内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺并且经受使用动脉粥样硬化易 发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。然后，将HDL以45-1，000 μ g/ml的浓度添 加至上部容积。此广泛范围反映可存在于人患者体内的广泛范围的HDL浓度。处于血管疾 病风险的个体中的HDL浓度总体上小于约300 μ g/ml，而健康个体中的HDL浓度在大于约 300 μ g/ml直至约2, 000 μ g/ml健康锻炼患者范围内。
[0407] 在额外实验中，将如上所述来涂铺的内皮细胞/平滑肌细胞共培养物在血液动力 学剪切应力下预处理16小时。从16-24小时，在上部容积中，细胞另外用0. 05ng/ml TNFa 和50 μ g/ml oxLDL预敏化（与含有50 μ g/ml nLDL的媒介物对照相比）。在24小时，将 45 μ g/ml或90 μ g/ml HDL添加至上部容积中的培养基并且血液动力学剪切应力再持续24 小时（24-48小时）。
[0408] (b)结果
[0409] 添加45 μ g/ml或90 μ g/ml的HDL活化许多动脉粥样硬化预防性基因，同时阻断 促炎症性基因和蛋白质的活化。
[0410] (V)血液动力学环境中的含有脂蛋白的甘油三酯的效应
[0411] 甘油三酯（TG)是心血管疾病的重要生物标记物。包括极低密度脂蛋白（vLDL)和 vLDL残余以及乳糜微粒（CM)残余的富含甘油三酯的脂蛋白（TRL)的一些物质，似乎与LDL 独立地促进动脉粥样化形成。健康患者中的TG水平在约40至约150mg/dL范围内。在患 有高甘油三酯血症的患者中，TG水平在大于约200mg/dL至约1500mg/dL范围内。
[0412] 内皮细胞/平滑肌细胞共培养物可如上所述来涂铺并且用动脉粥样硬化易发性 剪切应力预处理24小时。含有TG的脂蛋白，包括极低密度脂肪蛋白（vLDL)、乳糜微粒（CM) 以及vLDL和CM的残余颗粒可以500mg/dL，代表在患有高甘油三酯血症的患者中所见的水 平的浓度，添加至系统。每个组分的处理浓度基于这些组分中的每一种所代表的TG的分 率：对于高甘油三酯血症条件，vLDL构成约53 %的TG，因此0. 53x500mg/dL = 265mg/dL ;CM 构成约38%的了6，因此0.38150〇11^/(11^=19〇11^/(11^。这可与基于15〇11^/(11^的甘油三酯的 循环水平（代表在健康患者中所见的水平）的对照条件相比较，其中对于vLDL为80mg/dL 并且对于CM为57mg/dL。24小时血液动力学预调节之后，对于实验的剩余24小时，可添加 vLDL、CM或vLDL+CM。vLDL和CM残余样蛋白质（RLP)可通过用脂蛋白脂肪酶（LPL)处理 以上列出的相同浓度来产生。RLP可个别地或与vLDL和/或CM组合来添加。
[0413] (Vi)血液动力学环境中的葡萄糖与TNFa组合的效应
[0414] (a)方法
[0415] 糖尿病是特征在于胰岛素和葡萄糖稳态发生改变的疾病。在健康个体中，血糖浓 度为约5至约10mM，而在糖尿病个体中，血糖浓度在大于约IOmM至约20mM范围内。糖尿病 和相关联的升高的葡萄糖水平是动脉粥样硬化的风险因素。
[0416] 内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来涂铺。施加剪切应力之前四天时间，内皮细胞 和平滑肌细胞在发现于大多数培养基制剂中的升高葡萄糖（15mM)或基础葡萄糖（5mM)条 件的存在下培养，所述培养基制剂补充有作为葡萄糖的媒介物对照的甘露糖以考虑到渗透 性的潜在变化。然后，培养物在动脉粥样硬化易发性血液动力学下预处理24小时，随后 再暴露于〇.〇5ng/ml TNFa (类似于患有心血管疾病的患者中所观察到的循环水平的浓 度）24小时。在实验结束后，收集RNA以经由RT-PCR来进行基因表达分析。在一些实验 中，内皮细胞用具有NFk B-荧光素酶构建体的腺病毒来感染,所述构建体经由荧光素酶测 定来测量NF κ B活性。评估NF κ B活性以及促炎症性基因（E-选择素和ICAM)和抗炎症基 因（KLF2 和 eNOS)。
[0417] (b)结果
[0418] 细胞长期暴露于升高水平的葡萄糖，然后针对血液动力学实验来涂铺。对于图12 展示的实验，对于实验的剩余部分，在升高的葡萄糖存在下，内皮细胞使用动脉粥样硬化易 发性血液动力学力来预处理。在实验结束时，评估随着葡萄糖处理与TNFa而变化的基因 表达和NF κ B活性。
[0419] 虽然升高的葡萄糖对于基础水平的基因（未处理）没有效应，但是与甘露糖对照 相比，用动脉粥样硬化易发性剪切应力和TNF-a处理的样品在用升高的葡萄糖预处理时 具有较高水平炎症信号转导。图12A和12B表明升高的葡萄糖增加炎症信号转导的活化， 包括NF κ B (图12A)活性和粘附分子E-选择蛋白和ICAM的下游基因活化（图12B)。与甘 露糖处理的对照相比（图12C)，升高的葡萄糖也导致动脉粥样硬化预防性信号转导（eNOS、 KLF2)的较大减少。图12中的结果呈现为平均值土SE, η = 4, *p < 0. 05, t-测试。
[0420] 实施例3 :高血压的体外模型
[0421] (i)血管紧张素 II (ANG2)
[0422] 血管紧张素 II (ANG2)水平在患有心血管并发症，如动脉粥样硬化、糖尿病或高血 压的患者中增加。在健康患者中，ANG2的典型浓度在约InM至约5nM范围内，并且在高血 压患者中大于约6nM至约20nM。
[0423] 为了评估血液动力学环境中的ANG2的效应，内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来 涂铺并且经受使用健康和动脉粥样硬化易发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。 10nM(10. 46ng/ml)浓度的ANG2或DMSO媒介物对照（VEH)添加至上部容积并且收集RNA以 进行基因阵列分析。
[0424] 与DMSO媒介物对照相比的此条件的基因阵列分析显示通过ANG2上调的许多显著 炎症基因。图13展示在健康和动脉粥样硬化易发性（疾病）条件下用ANG2处理的内皮细 胞（图13A)和平滑肌细胞（图13B)的基因表达热图。如图13所见，许多基因通过ANG2 来显著调控并且ANG2条件以公正的方法分选在一起。
[0425] (ii)醛固酮
[0426] 醛固酮是在肾素-血管紧张素系统中的ANG2下游的重要信号转导激素。它的水 平可在包括动脉粥样硬化、糖尿病和高血压的多个病状下变化。在健康个体中，醛固酮的浓 度为约0. 3mM。在患有醛固酮过多症的个体中，醛固酮浓度在约0. 8mM至约ImM范围内。
[0427] 为了评估血液动力学环境中的醛固酮的效应，内皮细胞和平滑肌细胞如上所述来 涂铺并且经受使用健康和动脉粥样硬化易发性血液动力学力的24小时剪切应力预调节。 ImM浓度的醛固酮或媒介物对照（VEH)添加至上部容积并且收集RNA以进行基因阵列分析。
[0428] 与DMSO媒介物对照相比的此条件的基因阵列分析显示通过醛固酮上调的许多显 著炎症基因。图14展示在健康和动脉粥样硬化易发性（疾病）条件下用醛固酮（醛）处 理的内皮细胞和平滑肌细胞的基因表达热图。许多显著基因通过这些条件来调控，其中大 部分调控基因存在于动脉粥样硬化易发性血液动力学环境中。
[0429] 实施例4 :生理体外肝模型
[0430] 静态肝细胞培养方法受不佳的体外体内相关性影响，部分地归因于缺乏在体内随 着时间的推移保持代谢表型的生理参数。本发明人现在发现与标准静态肝细胞胶原凝胶配 置相比，恢复生理血液动力学和运输保持体外肝细胞表型和功能。
[0431] 为了重新产生具有类似于体内肝循环的流体力学和运输的肝细胞系统，使用基于 锥板式设备的技术，其广泛用于重新建立体内血管细胞表型，通过在体外重新产生血管内 皮细胞暴露于人衍生血液动力学血液流动力。此技术描述于美国专利号7, 811，782中，其 内容通过引用并入本文。此技术（图15B)经过调适和修改以设计大鼠肝单一培养物系统， 其采用反映体内肝循环值的血液动力学流动和运输条件。设备中的细胞的配置（图15C) 基于肝小叶的体内微体系结构（参见图15A)，其中肝细胞条带通过内皮细胞过滤层与肝窦 血液流动分离。此设计使用悬浮于细胞培养容器中的多孔聚碳酸酯膜，其中在多孔膜的一 侧上，原代大鼠肝细胞夹在胶原凝胶中。多孔膜与存在于肝中的肝窦内皮细胞过滤层类似 地来起作用。培养基连续灌注于多孔膜的两侧，同时从一系列生理血液流动值获得的血液 动力学力连续施加至多孔膜的非细胞侧。整个设置容纳于具有5% CO2和37°C的受控环境 中。有效地建立基于流动的培养系统，由此肝细胞被屏蔽以避免受流动的直接效应影响，如 其在体内那样。通过再现血液动力学并且在被设计来模拟肝窦的微观结构的系统中导致稳 定保留与体内肝的表型类似的分化肝和代谢表型。
[0432] 方法
[0433] (i)动物手术和肝细胞分离
[0434] 用于实验的所有动物根据由HemoShear动物护理和使用委员会（HemoShear' s Animal Care&Use Committee)批准的方案来处理。通过修改的Seglen两步胶原酶灌注 程序使用20mL/min流动速率将肝细胞与雄性Fischer大鼠（250g-350g)分离（Seglen， Hepatocyte Suspensions and Cultures as Tools in Experimental Carcinogegnesis, J. Toxicology&Environmental Health，5 (2-3) :551-560 (1979)，其内容通过引用并入本 文）。简单地说，将大鼠用异氟醚麻醉，之后将腹腔切割并且下腔静脉插套管，同时切除制成 门静脉以便流出。肝分两步灌注，首先用无 Ca++-的缓冲液以冲掉血液并且分裂细胞间结， 随后用含Ca++-缓冲液中的胶原酶以消化细胞外胶原基质。肝适当地灌注之后，将它切除 并且在无菌罩下的皮氏培养皿中从被膜中释放。富集肝细胞群体（?95%纯度）通过各 自10分钟的两个依序65g离心和洗涤循环，随后使用90% PERC0LU涂布有聚乙烯吡咯烷 酮（PVP)的15-30nm直径的硅胶颗粒（水中的23%w/w);用于建立可用于分离细胞的密度 梯度）的10分钟旋转来获得。肝细胞的生存力通过锥虫蓝排除测试来确定并且使用具有 85%生存力的细胞。
[0435] (ii)细胞培养和设备操作条件
[0436] 肝细胞培养基：对于图16-20展示的数据，大鼠肝细胞培养基包含基础培养基 01^1/^12，其含有高葡萄糖（17.5禮)，补充有胎牛血清（在涂铺时为10 (%并且24小时之后 减少至2 %以便维持）。培养基还包含庆大霉素（50 μ g/ml)、ITS (胰岛素浓度2 μ Mol)、1 % NEAA、I % GLUTAMAX和地塞米松（在涂铺时1 μ M并且24小时之后，250ηΜ以便维持）。
[0437] 对于表4和图36和37中展示的数据，大鼠肝细胞培养基包含基础培养基DMEM/ F12,其含有低葡萄糖（5. 5mM)，补充有HEPES(3% vol/vol)和胎牛血清（在涂铺时为10% ￥〇1八〇1并且24小时之后减少至2%以便维持）。培养基还包含庆大霉素（5(^ 8/1111)、 ITS (胰岛素浓度2nMol)、1 % NEAA、1 % GLUTAMAX和地塞米松（在涂铺时1 μ M并且24小时 之后，IOOnM以便维持）。
[0438] 为了培养人或犬肝细胞，培养基包含基础培养基DMEM/F12,其含有低葡萄糖 (5. 5mM)，补充有HEPES(3% vol/vol)和胎牛血清（在涂铺时为10% vol/vol并且24小时 之后减少至2 %以便维持）。培养基还包含庆大霉素（50 μ g/ml)、ITS (胰岛素浓度2nMol)， 和地塞米松（在涂铺时1 μ M和24小时之后为IOOnM以便维持）。
[0439] 胶原涂布和涂铺：胶原溶液通过在预定比率的无菌蒸馏水、10X磷酸缓冲盐水 (PBS)和0. 2N氢氧化钠中混合I型大鼠尾部胶原来制成（为了构成lml，组分分别为 440μ 1、375μ 1、100μ 1 和 85μ 1)。
[0440] 对于经受静态条件的培养物，100mm组织培养物处理的无菌细胞培养皿用7 μ I/ cm2胶原溶液涂布。对于经受受控血液动力学的培养物，75mm TRANSWELLS (聚碳酸酯，10 μ m 厚度和0. 4 μ m孔径，no. 3419, Corning)的多孔膜的下表面用7 μ 1/cm2胶原溶液涂布。允 许溶液胶凝一小时之后，表面用DPBS洗涤，肝细胞以125, 000个活细胞/cm2的接种密度涂 铺，并且4小时之后添加第二层胶原凝胶。1小时之后，将TRANSWELLS翻转并且安置于细胞 培养皿中，并且添加培养基（下部容积中9ml和上部容积中6ml)。7ml培养基添加至用于 静态培养的组织培养皿。24小时之后，培养基转换成维持培养基（含有2% FBS)，并且将含 有TRANSWELLS的细胞培养皿安置于锥板式设备中。受控血液动力学施加至上部容积中的 TRANSWELL的多孔膜的表面。
[0441] 冷冻保存的人肝细胞从商业供应商（Kaly-Cell，France)采购并且根据供应商规 定方案来解冻。对于涂铺人肝细胞，我们遵循如上对于大鼠肝细胞所述的类似程序，但是使 用有限细胞接种区域。第二层胶原如上所述来施加。
[0442] 来自小猎犬的新鲜分离犬肝细胞从商业供应商（Triangle Research Laboratories，Research Triangle Park，North Carolina)米购并且根据供应商规定方案 来处理。对于涂铺犬肝细胞，我们遵循如上对于大鼠肝细胞所述的类似程序，但是使用有限 细胞接种区域。第二层胶原如上所述来施加。
[0443] 操作条件：基于牛顿流体压力驱动流动穿过滚筒的公式来计算典型肝窦的以 dyne/cm2〇)为单位的剪切应力，

【权利要求】
1. 一种在体外模拟病理或生理性病况的方法，所述方法包括： 将培养基添加至细胞培养容器； 将至少一种因子添加至所述培养基； 将至少一种细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上；以及 对于所述至少一种涂铺细胞类型施加剪切力，所述剪切力通过自喷设备诱导的所述培 养基的流动来产生，所述流动模拟在所述病理或生理性病况下所述至少一种细胞类型在体 内所暴露的流动，其中： 模拟所述病理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是： (i) 在所述病理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内；或 (ii) 在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内；或 模拟所述生理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是： (i) 在所述生理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内；或 (ii) 在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
2. -种测试药物或化合物对于所述病理或生理性病况的效应的体外方法，所述方法包 括： 根据如权利要求1所述的方法来模拟所述病理或生理性病况； 将药物或化合物添加至所述培养基；以及 对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺细胞类型施加所述剪切力；其 中在所述药物或所述化合物存在下，所述至少一种涂铺细胞类型的变化指示所述药物或所 述化合物对于所述病理或生理性病况具有效应。
3. -种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法，所述方法包括： 将培养基添加至细胞培养容器； 将至少一种因子添加至所述培养基； 将至少一种肝细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上；以及 对于所述至少一种涂铺肝的细胞类型施加剪切力，所述剪切力通过自喷设备诱导的所 述培养基的流动来产生，所述流动模拟在所述病理或生理性病况下所述至少一种肝细胞类 型在体内所暴露的流动，其中模拟所述病理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是： (i) 在所述病理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内；或 (ii) 在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内；或 (iii) 在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的病理性病况一段时间，所述相同浓度 的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的病理性病况所述一段时间； 或 模拟所述生理性病况的所述培养基中的所述因子的浓度是： (i) 在所述生理性病况下观察到的所述因子的体内浓度范围内；或 (ii) 在体内施用药物或化合物所产生的所述因子的浓度范围内；或 (iii) 在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的生理性病况一段时间，相同浓度的因 子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的生理性病况所述一段时间。
4. 一种测试药物或化合物对于病理或生理性病况的效应的体外方法，所述方法包括： 根据如权利要求3所述的方法来模拟所述病理或生理性病况； 将药物或化合物添加至所述培养基；以及 对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺肝细胞类型施加所述剪切力； 其中在所述药物或所述化合物存在下，所述至少一种涂铺肝细胞类型的变化指示所述药物 或所述化合物对于所述病理或生理性病况具有效应。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述病理性病况得到模拟。
6. 如权利要求5所述的方法，其中所述培养基中的所述因子的浓度在所述病理性病况 下观察到的所述因子的体内浓度范围内。
7. 如权利要求5所述的方法，其中所述培养基中的所述因子的浓度在体内施用药物或 化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
8. 如权利要求1、2和5至7中任一项所述的方法，其中与不存在所述剪切力的施加时 时的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比，在施加所述剪 切力后的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述病理性病况的所述标记物的 水平的变化证实所述病理性病况得到模拟。
9. 如权利要求3或4所述的方法，其中所述病理性病况得到模拟，并且所述培养基中的 所述因子的浓度在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的病理性病况一段时间，相同浓度 的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的病理性病况所述一段时间。
10. 如权利要求3至7和9中任一项所述的方法，其中与不存在所述剪切力的施加时时 的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比，在施加所述剪 切力后的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述病理性病况的所述标记物 的水平的变化证实所述病理性病况得到模拟。
11. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生理性病况得到模拟。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述培养基中的所述因子的浓度在所述生理性病 况下观察到的所述因子的体内浓度范围内。
13. 如权利要求11所述的方法，其中所述培养基中的所述因子的浓度在体内施用药物 或化合物所产生的所述因子的浓度范围内。
14. 如权利要求1、2和11至13中任一项所述的方法，其中与不存在所述剪切力的施加 时时的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比，在施加所述 剪切力后的所述至少一种涂铺细胞类型或所述培养基中的所述生理性病况的所述标记物 的水平的变化证实所述生理性病况得到模拟。
15. 如权利要求3或4所述的方法，其中所述生理性病况得到模拟，并且所述培养基中 的所述因子的浓度在所述剪切力下能够保持在体外所模拟的生理性病况一段时间，相同浓 度的因子在不存在所述剪切力的情况下不能保持在体外所模拟的生理性病况所述一段时 间。
16. 如权利要求3、4、11至13和15中任一项所述的方法，其中与不存在所述剪切力的 施加时时的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述标记物的水平相比，在施 加所述剪切力后的所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述培养基中的所述生理性病况的所 述标记物的水平的变化证实所述生理性病况得到模拟。
17. 如权利要求3、4、11至13和15至16中任一项所述的方法，其中至少一种涂铺肝细 胞类型包括肝细胞并且在所述肝细胞中的对于胰高血糖素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性 证实所述生理性病况得到模拟。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其 组合。
19. 如权利要求1至4和11至18中任一项所述的方法，其中所述生理性病况是健康肝， 所述因子包括胰岛素和葡萄糖，所述涂铺步骤包括将肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内的 表面上；以及将所述剪切力间接地施加至所述涂铺肝细胞。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上，将所述 多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器 的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含所述肝细胞的下部容积 和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积，以及将所述剪切力施加至所述容器的上部容积 中的所述多孔膜的第二表面。
21. 如权利要求3至7、9至13和15至18中任一项所述的方法，其中至少一种细胞外 基质组分沉积于多孔膜的第一表面上，所述至少一种肝细胞类型涂铺于所述至少一种细胞 外基质组分上，所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与 所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含所述 至少一种细胞外基质组分和所述至少一种肝细胞类型的下部容积和包含所述多孔膜的第 二表面的上部容积，以及将所述剪切力施加至所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二 表面。
22. -种测试药物或化合物的效应的体外方法，所述方法包括： 将培养基添加至细胞培养容器； 将至少一种细胞类型涂铺于所述细胞培养容器内的至少一个表面上； 将药物或化合物添加至所述培养基，其中所述培养基中的所述药物或化合物的浓度在 体内实现所述效应的所述药物或所述化合物的浓度范围内；以及 对于暴露于所述药物或所述化合物的所述至少一种涂铺细胞类型施加所述剪切力，所 述剪切力通过自喷设备诱导的所述培养基的流动来产生，所述流动模拟所述至少一种细胞 类型在体内所暴露的流动，其中在所述药物或所述化合物存在下，所述至少一种涂铺细胞 类型的变化指示所述药物或所述化合物具有所述效应。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述效应包括对于生理性病况的效应。
24. 如权利要求22所述的方法，其中所述效应包括对于病理性病况的效应。
25. 如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述效应包括毒性效应、保护效应、 病理效应、疾病促进效应、炎症效应、氧化效应、内质网应激效应、线粒体应激效应、凋亡效 应、坏死效应、重构效应、增殖效应、对于蛋白质活性的效应，或对于基因表达的效应。
26. 如权利要求25所述的方法，其中所述效应包括对于蛋白质活性的效应，所述效应 包括抑制所述蛋白质或活化所述蛋白质。
27. 如权利要求25所述的方法，其中所述效应包括对于基因表达的效应，所述效应包 括所述基因的表达的增加或所述基因的表达的减少。
28. -种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法，所述方法包括： 将培养基添加至细胞培养容器； 将至少一种细胞外基质组分沉积于所述细胞培养容器内的表面上： 将肝细胞涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上；以及 将剪切力间接地施加至所述至少一种细胞外基质组分和所述肝细胞上，所述剪切力通 过自喷设备诱导的培养基的流动来产生，所述流动模拟肝细胞所述病理或生理性病况下在 体内所暴露的流动。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述至少一种细胞外基质组分沉积于多孔膜的第 一表面上，所述肝细胞涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上，所述多孔膜悬浮于所述细 胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开 的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含至少一种细胞外基质组分和所述肝细胞的下 部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积，以及将所述剪切力施加至所述容器的上 部容积中的所述多孔膜的第二表面。
30. -种在体外模拟所述肝的病理或生理性病况的方法，所述方法包括： 将培养基添加至细胞培养容器； 将肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上，其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以 使得所述第一表面为近端并且与所述容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述容器内 界定包含所述肝细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积；以及 将剪切力施加于所述容器的上部容积中的所述多孔膜的第二表面，所述剪切力通过自 喷设备诱导的所述培养基的流动来产生，所述流动模拟所述肝细胞所述病理或生理性病况 下在体内所暴露的流动，其中所述自喷设备包括适于定位于所述容器的上部容积中的所述 培养基中的主体和适于使所述主体旋转的电动机。
31. -种测试药物或化合物对于所述肝的病理或生理性病况的效应的体外方法，所述 方法包括： 根据如权利要求28至30中任一项所述的方法来模拟所述病理或生理性病况； 将药物或化合物添加至所述培养基；以及 对于暴露于所述药物或所述化合物的所述肝细胞施加所述剪切力；其中在所述药物或 所述化合物存在下，所述肝细胞的变化指示所述药物或所述化合物对于所述病理或生理性 病况具有效应。
32. 如权利要求30或31所述的方法，其中所述主体具有锥形表面。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述自喷设备适于将所述主体的锥形表面定位于 所述容器中并且与所述细胞培养基接触。
34. 如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述流动从以前测量的血液动力学 模式获得并且建模成一组电子指令，所述剪切力基于所述一组电子指令，并且所述自喷设 备包括接收所述一组电子指令的电子控制器，所述电动机由所述电子控制器来操作。
35. 如权利要求30至34中任一项所述的方法，其中至少一种细胞外基质组分涂铺于所 述多孔膜的第一表面上并且所述肝细胞随后涂铺于所述至少一种细胞外基质组分上。
36. 如权利要求29至35中任一项所述的方法，其进一步包括将非实质肝细胞涂铺于所 述多孔膜的第二表面上，以及其中将所述剪切应力施加至所述非实质肝细胞。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述非实质肝细胞包括肝窦内皮细胞、肝星形细 胞、库柏法细胞或其组合。
38. 如权利要求28、29和35至37中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞外基质 组分包括硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、层 粘连蛋白、玻连蛋白或其组合。
39. 如权利要求28、29和35至38中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将成 纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞涂铺于所述细胞培养容器内的表面上，并且所述至少一种 细胞外基质组分由所述涂铺成纤维细胞、软骨细胞或成骨细胞来分泌。
40. 如权利要求28至39中任一项所述的方法，其中与不存在所述剪切力的施加时的所 述肝细胞或非实质肝细胞或所述培养基中的所述标记物的水平相比，在所述施加剪切力后 的所述肝细胞或非实质肝细胞或所述培养基中的病理或生理性病况的标记物的水平的变 化证实所述病理或生理性病况得到模拟。
41. 如权利要求28至39中任一项所述的方法，其中在所述肝细胞中的对于胰高血糖 素、胰岛素或葡萄糖底物的响应性证实所述生理性病况得到模拟。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述葡萄糖底物包括甘油、乳酸酯、丙酮酸酯或其 组合。
43. 如权利要求2、4至21和31至42中任一项所述的方法，其中所述培养基中的所述 药物或所述化合物的浓度在体内实现所述效应的所述药物或所述化合物的浓度范围内。
44. 如权利要求22至27和43中任一项所述的方法，其中所述培养基中的所述药物或 所述化合物的浓度在所述药物或所述化合物的体内治疗(^±的浓度范围内。
45. 如权利要求1至27和31至44中任一项所述的方法，其中将至少一种因子添加至 所述培养基的步骤或将药物或化合物添加至所述培养基的步骤包括将来自受试者的血清 添加至所述培养基，其中所述血清包括所述因子、所述药物或所述化合物。
46. 如权利要求45所述的方法，其中所述受试者是动物。
47. 如权利要求46所述的方法，其中所述动物是基因修饰动物。
48. 如权利要求46所述的方法，其中所述动物是人。
49. 如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述受试者是具有所述生理性病况 的受试者或具有所述病理性病况的受试者。
50. 如权利要求49所述的方法，其中所述受试者具有病理性病况，包括晚期炎症、动脉 粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜病、高血压、高血压性脑病、 高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中风、马凡综合征、颈动脉内膜中层增 厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、高脂血症、高胆固醇血症、糖尿 病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、 脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形成、血管再 狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低a脂蛋白血症、丙型肝炎、乙型肝炎、 肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝疾病。
51. 如权利要求50所述的方法，其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
52. 如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述 肝细胞包括原代细胞。
53. 如权利要求52所述的方法，其中所述原代细胞包括从干细胞或干细胞样细胞衍生 的细胞谱系。
54. 如权利要求53所述的方法，其中所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱系，所 述细胞谱系从包括成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或骨髓衍生干细胞的干细 胞来衍生。
55. 如权利要求1、2、5至8、11至14和22至27和43至51中任一项所述的方法，其中 所述至少一种涂铺细胞类型包括原代细胞并且所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱 系，其中从干细胞衍生的细胞谱系包括内皮细胞、平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元 细胞、内分泌细胞、胰腺0 -细胞、胰腺a -细胞或骨骼肌细胞。
56. 如权利要求52或53所述的方法，其中所述原代细胞包括来自具有病理性病况的受 试者的可诱导多能干细胞（iPSC)衍生细胞。
57. 如权利要求56所述的方法，其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细 胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞：家族性高胆固醇血症、糖原贮积病 类型I、威尔逊氏病、A1抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征、渐进性家族性遗传性 胆汁淤积或遗传性酪氨酸血症类型1。
58. 如权利要求56所述的方法，其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生细 胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血管细胞：哈钦森-吉尔福特早衰症、威廉 姆斯-博伊伦综合征、法布里氏病、苏萨克氏综合征、全身毛细管渗漏综合征、格菜克综合 征、血管内乳突状内皮增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
59. 如权利要求58所述的方法，其中所述iPSC衍生血管细胞包括iPSC衍生平滑肌细 胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞。
60. 如权利要求1至51中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述 肝细胞包括永生细胞。
61. 如权利要求52至60中任一项所述的方法，其中所述原代细胞或所述永生细胞包括 从具有所述病理或生理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有所述病理性病况的风 险因素的至少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少 一个受试者分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的 细胞或从具有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
62. 如权利要求61所述的方法，其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有所述病 理性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞，所述风险因素包括吸烟、年龄、性别、 种族、表观遗传印记、与所述病理性病况相关的已识别基因型、与所述病理性病况相关的已 识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬 化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰竭、中风、马凡综合征、 颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肺动脉疾病、 肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、动脉血栓形成、静脉血栓形 成、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、高甘油三酯血症、低a脂蛋白血症、脂肪肝 疾病、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝 疾病。
63. 如权利要求62所述的方法，其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
64. 如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至63中任一项所述的方法，其中所 述至少一种涂铺细胞类型包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、肝细胞、胰腺细 胞、心脏细胞、肌肉细胞、脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞或造血细胞。
65. 如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至65中任一项所述的方法，其中所 述至少一种涂铺细胞型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上皮足细胞、a 细胞、￠-细胞、S细胞、胰多肽（PP)细胞、e细胞、神经胶质细胞、肝细胞、神经元、非实质 肝细胞、足细胞、平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、白细胞、单 核细胞、肌细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内皮祖细胞、干细 胞、循环干细胞或循环造血细胞。
66. 如权利要求65所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型包括所述非实质肝细 胞，所述非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞或库柏法细胞。
67. 如权利要求1、2、5至8、11至14、22至27和43至65和H5中任一项所述的方法， 其中所述至少一种涂铺细胞类型包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞或肝窦内皮细胞。
68. 如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型、所述原 代细胞、所述肝细胞或所述永生细胞细胞来自动物。
69. 如权利要求68所述的方法，其中来自动物的所述细胞是来自基因修饰动物。
70. 如权利要求68所述的方法，其中来自动物的所述细胞是来自人的细胞。
71. 如权利要求70所述的方法，其中来自人的所述细胞基于年龄、性别、种族、表现遗 传学、疾病、民族性或存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性来选择。
72. 如权利要求1至71中任一项所述的方法，其中所述剪切力间接地施加至所述至少 一种涂铺细胞类型、所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述肝细胞。
73. 如权利要求1至72中任一项所述的方法，其中将所述剪切力直接地施加至所述至 少一种涂铺细胞类型、所述至少一种涂铺肝细胞类型或所述肝细胞。
74. 如权利要求1、2、5至8、10、22、24至27和44至51中任一项所述的方法，其中所 述病理性病况包括血管病理性病况，所述因子包括氧化低密度脂蛋白（oxLDL)、肿瘤坏死 因子-a (TNFa)、葡萄糖、组织生长因子-0 (TGF-P)、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、维 生素D、无机磷酸盐、瘦蛋白、脂肪连接蛋白、爱帕琳肽、醛固酮、血管紧张素II、甘油三酯、 高密度脂蛋白（HDL)、氧化高密度脂蛋白（oxHDL)、富含甘油三酯的脂蛋白、低密度脂蛋白 (LDL)、胰岛素、脂肪酸或其组合；所述涂铺步骤包括将内皮细胞、平滑肌细胞或心内膜细胞 涂铺于所述细胞培养容器内的表面上；并且所述剪切力施加于所涂铺的内皮细胞、平滑肌 细胞或心内膜细胞上。
75. 如权利要求74所述的方法，其中所述因子是富含甘油三酯的脂蛋白，所述富含甘 油三酯的脂蛋白包括极低密度脂蛋白（vLDL)、vLDL残余、乳糜微粒或乳糜微粒残余。
76. 如权利要求74或75所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型包括内皮细胞。
77. 如权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型包括平 滑肌细胞。
78. 如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型包括心 内膜细胞。
79. 如权利要求74或75所述的方法，其进一步包括将所述心内膜细胞涂铺于多孔膜的 第一表面上，其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并 且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含 所述心内膜细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积，以及将所述剪切力 施加至所述上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
80. 如权利要求79所述的方法，其进一步包括将所述内皮细胞涂铺在所述多孔膜的第 二表面上，其中所述剪切力施加于所涂铺的内皮细胞上。
81. 如权利要求79或80所述的方法，其中所述心内膜细胞包括平滑肌细胞。
82. 如权利要求74至81中任一项所述的方法，其中所述血管病况包括心房纤维性颤 动，或心房纤维性颤动和相关联的高血压。
83. 如权利要求74至82中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正 常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者、年老受试者或基因修饰以将糖尿病、高血 压或老化建模的动物。
84. 如权利要求74至83中任一项所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式从心脏 窦或心房纤维性颤动节律获得。
85. 如权利要求74至84中任一项所述的方法，其中所述因子包括oxLDL、TNF a、醛固 酮、血管紧张素II或其组合。
86. 如权利要求74或75所述的方法，其进一步包括将所述平滑肌细胞涂铺于多孔膜的 第一表面上，其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并 且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含 所述平滑肌细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积，以及将所述剪切力 施加至所述上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
87. 如权利要求86所述的方法，其进一步包括将所述内皮细胞涂铺于所述多孔膜的第 二表面上。
88. 如权利要求74或75所述的方法，其进一步包括将所述内皮细胞涂铺于多孔膜的第 二表面上，其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述多孔膜的第一表面为近 端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定 包含所述多孔膜的第一表面的下部容积和包含所述内皮细胞的上部容积，以及将所述剪切 力施加至所述上部容积中的所述内皮细胞。
89. 如权利要求88所述的方法，其进一步包括将平滑肌细胞涂铺于所述多孔膜的第一 表面上。
90. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病况包括晚期炎症。
91. 如权利要求90所述的方法，其中所述晚期炎症包括动脉粥样硬化。
92. 如权利要求90或91中任一项所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正 常受试者、患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动 物。
93. 如权利要求90至92中任一项所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是动脉 粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
94. 如权利要求90至93中任一项所述的方法，其中所述因子包括LDL、oxLDL、TNF a、 HDL、富含甘油三酯的脂蛋白或其组合。
95. 如权利要求90所述的方法，其中所述晚期炎症包括高甘油三酯血症。
96. 如权利要求95所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患 有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
97. 如权利要求95或96所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样硬化 易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
98. 如权利要求95至97中任一项所述的方法，其中所述因子包括富含甘油三酯的脂蛋 白。
99. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病理性病况是腹主动脉 瘤。
100. 如权利要求99所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、患 有糖尿病的受试者、高血压受试者、吸烟者、患有腹主动脉瘤的受试者或基因修饰以将糖尿 病或高血压建模或修饰以将腹主动脉瘤建模的动物。
101. 如权利要求99和100所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式从腹动脉获得 或从腹内主动脉瘤节律获得。
102. 如权利要求99至101中任一项所述的方法，其中所述因子包括oxLDL、TNF a、葡 萄糖、弹性蛋白降解产物、弹性蛋白酶、血管紧张素II、醛固酮、胰岛素、TGF-0或其组合。
103. 如权利要求99至102中任一项所述的方法，其中烟提取物添加至所述培养基。
104. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病况包括糖尿病血管病 况。
105. 如权利要求104所述的方法，其中所述糖尿病血管病况包括糖尿病性肾病、糖尿 病神经病或糖尿病视网膜病。
106. 如权利要求104或105所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受 试者、患有糖尿病的受试者或基因修饰以将糖尿病建模的动物。
107. 如权利要求104至106中任一项所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是 动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性、从股动脉获得或从小动脉获得。
108. 如权利要求104至107中任一项所述的方法，其中所述因子包括oxLDL、TNF a、葡 萄糖、HDL、oxHDL、富含甘油三酯的脂蛋白、胰岛素或其组合。
109. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病况包括高血压。
110. 如权利要求109所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、 患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
111. 如权利要求109或110所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样 硬化易发性、动脉粥样硬化预防性，或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
112. 如权利要求109至111中任一项所述的方法，其中所述因子包括oxLDL、TNF a、血 管紧张素II、醛固酮或其组合。
113. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病况包括动脉钙化。
114. 如权利要求113所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、 患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
115. 如权利要求113或114所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是动脉粥样 硬化易发性、动脉粥样硬化预防性，或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
116. 如权利要求113至115中任一项所述的方法，其中所述因子包括oxLDL、TNF a、维 生素D、无机磷酸酯、瘦蛋白、脂肪连接蛋白或其组合。
117. 如权利要求86至89中任一项所述的方法，其中所述血管病理性病况包括血栓形 成。
118. 如权利要求117所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型来自正常受试者、 患有糖尿病的受试者、高血压受试者或基因修饰以将糖尿病或高血压建模的动物。
119. 如权利要求117或权利要求118所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式是 动脉粥样硬化易发性、动脉粥样硬化预防性，或从股动脉、肺动脉或小动脉获得。
120. 如权利要求117至119中任一项所述的方法，其中所述因子包括TNF a、0XLDL、葡 萄糖或其组合。
121. 如权利要求1至10、21和24至73中任一项所述的方法，其中所述病理性病况包 括脂肪肝疾病。
122. 如权利要求121所述的方法，其中所述至少一种涂铺细胞类型或所述至少一种涂 铺肝细胞类型包括肝细胞、非实质肝细胞或其组合。
123. 如权利要求122所述的方法，其中所述非实质肝细胞包括肝窦内皮细胞、肝星形 细胞、库柏法细胞或其组合。
124. 如权利要求122至123中任一项所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式来 自正常受试者、患有脂肪肝疾病的受试者或基因修饰以将脂肪肝疾病建模的动物。
125. 如权利要求1至10、21和24至73中任一项所述的方法，其中所述病理性病况包 括脂肪肝疾病，并且所述涂铺步骤包括将肝细胞或非实质肝细胞涂铺于所述细胞培养容器 内的表面上。
126. 如权利要求125所述的方法，其进一步包括将所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表 面上，其中将所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述第一表面为近端并且与所 述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界定包含所述肝 细胞的下部容积和包含所述多孔膜的第二表面的上部容积，以及将所述剪切力施加至所述 上部容积中的所述多孔膜的第二表面。
127. 如权利要求126所述的方法，其进一步包括将所述非实质肝细胞涂铺于所述多孔 膜的第二表面上，其中所述剪切力施加至所述上部容积中的所述非实质肝细胞。
128. 如权利要求125所述的方法，其进一步包括将所述非实质肝细胞涂铺于多孔膜的 第二表面上，其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中以使得所述多孔膜的第一表面为 近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在所述细胞培养容器内界 定包含所述多孔膜的第一表面的下部容积和包含所述非实质肝细胞的上部容积，以及将所 述剪切力施加至所述上部容积中的所述非实质肝细胞。
129. 如权利要求126至128中任一项所述的方法，其进一步包括将细胞外基质组分沉 积于所述多孔膜的第一表面上，并且随后将肝细胞涂铺于所述细胞外基质组分上。
130. 如权利要求125至129中任一项所述的方法，其中所述因子包括胰岛素、葡萄糖或 其组合。
131. 如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法，其中所述病理 性病况包括糖尿病，所述涂铺步骤包括将胰腺3 _细胞、胰腺a-细胞或其组合涂铺于所述 细胞培养容器内的表面上，并且所述因子包括胰岛素、葡萄糖或其组合。
132. 如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法，其中所述病理 性病况包括晚期炎症、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病变、糖尿病性视网膜 病、高血压、高血压性脑病、高血压性视网膜病、脂肪肝疾病、高血压、心力衰竭、中风、马凡 综合征、颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾脏疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、高 脂血症、高胆固醇血症、糖尿病、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬化斑块侵蚀、胸主动脉 瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、肺动脉疾病、肺动脉高压、外周动脉疾病、动脉血栓形 成、静脉血栓形成、血管再狭窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖、高甘油三酯血症、低a脂蛋白 血症、丙型肝炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化和酒精诱导肝 疾病。
133. 如权利要求132所述的方法，其中所述静脉血栓形成包括深静脉血栓形成。
134. 如权利要求1、2、5至8、24至27和43至73中任一项所述的方法，其中所述病理 性病况包括解剖学病况。
135. 如权利要求134所述的方法，其中所述解剖学病况包括萎缩、结石、迷芽瘤、病理 性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器。
136. 如权利要求1至135中任一项所述的方法，其中所述流动从以前测量的血液动力 学模式获得并且建模成一组电子指令，并且所述剪切力基于所述一组电子指令。
137. 如权利要求136所述的方法，其中所述自喷设备包括接收所述一组电子指令的电 子控制器；由所述电子控制器操作的电动机；和可操作地连接至所述电动机以便由所述电 动机驱动的剪切力施加器。
138. 如权利要求137所述的方法，其中所述剪切力施加器包括连接至所述电动机的圆 锥体。
139. 如权利要求1至138中任一项所述的方法，其进一步包括所述细胞培养容器内的 入口和出口。
140. 如权利要求136至139中任一项所述的方法，其中所述血液动力学模式从具有所 述病理性病况或疾病促进性病况的一个或多个受试者获得。
141. 如权利要求140所述的方法，其中所述疾病促进性病况包括萎缩、结石、迷芽瘤、 病理性狭窄、病理性扩张、憩室、肥大、息肉、脱垂、破裂、动静脉瘘或附器。
142. 如权利要求136至141中任一项所述的方法，其中所述血液动力学模式从动脉、小 动脉、静脉、小静脉或器官的至少一部分获得。
143. 如权利要求142所述的方法，其中当所述血液动力学模式从动脉或小动脉的至少 一部分获得时，所述动脉或小动脉包括颈动脉、胸动脉、腹部动脉、肺动脉、股动脉、肾输出 动脉、肾输入动脉、冠状动脉、肱动脉、乳房内动脉、大脑动脉、主动脉、毛细血管前小动脉、 肝动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉、基底动脉、颈外动脉、颈内动脉、脊椎动脉、 锁骨下动脉、主动脉弓、腋动脉、胸廓内动脉、觸动脉、深觸动脉、烧侧返动脉、腹壁上动脉、 降主动脉、腹壁下动脉、骨间动脉、桡动脉、尺动脉、腕掌弓、腕背弓、掌浅弓或掌深弓、指动 脉、降支旋股动脉、膝降动脉、膝上动脉、膝下动脉、胫前动脉、胫后动脉、腓动脉、足底深弓、 弓状动脉、颈总动脉、肋间动脉、胃左或右动脉、腹腔干、脾动脉、肝总动脉、肠系膜上动脉、 肾动脉、肠系膜下动脉、睾丸动脉、髂总动脉、髂内动脉、髂外动脉、旋股动脉、穿通支、股深 动脉、胭动脉、跖背动脉或指背动脉。
144. 如权利要求142所述的方法，其中当血液动力学模式从静脉或小静脉的至少一部 分获得时，静脉或小静脉包括毛细管后小静脉、隐静脉、肝门静脉、上腔静脉、下腔静脉、冠 状静脉、心最小静脉、浅静脉、交通静脉、全身静脉、肺静脉、颈静脉、乙状窦、颈外静脉、颈内 静脉、甲状腺下静脉、锁骨下静脉、胸廓内静脉、腋静脉、头静脉、鳃静脉、肋间静脉、贵要静 脉、肘正中静脉、胸腹壁静脉、尺静脉、前臂正中静脉、腹壁下静脉、掌深弓、掌浅弓、指掌侧 静脉、心脏静脉、下腔静脉、肝静脉、肾静脉、腹部腔静脉、睾丸静脉、髂总静脉、穿通支、髂外 静脉、骼内静脉、阴部外静脉、股深静脉、大隐静脉、股静脉、附隐静脉、膝上静脉、胭静脉、膝 下静脉、大隐静脉、小隐静脉、胫骨前或后静脉、足底深静脉、足背静脉弓或指背静脉。
145. 如权利要求142所述的方法，其中当血液动力学模式从器官的至少一部分获得 时，所述器官包括肝、肾、肺、脑、胰腺、脾、大肠、小肠、心脏、骨骼肌、眼睛、舌头、生殖器或脐 带。
146. 如权利要求136至145中任一项所述的方法，其中所述血液动力学模式从分析超 声波数据获得。
147. 如权利要求136至145中任一项所述的方法，其中所述血液动力学模式从分析磁 共振成像（MRI)数据获得。
148. 如权利要求1至147中任一项所述的方法，其中所述流动或所述血液动力学模式 是时间变化的。
149. 如权利要求1至148中任一项所述的方法，其中所述流动或所述血液动力学模式 可从心腔、窦性节律期间的左心耳、心房纤维性颤动或心室纤维性颤动获得。
150. 如权利要求149所述的方法，其中当所述流动或所述血液动力学模式从心腔获得 时，所述心腔包括左心房、右心房、左心室或右心室。
151. 如权利要求1至150中任一项所述的方法，其中所述流动或所述血液动力学模式 由病理性病况导致的物理变化产生。
152. 如权利要求1至150中任一项所述的方法，其中所述流动或血液动力学模式从以 下受试者获得，其中与不存在施用药物的受试者的所述流动或所述血液动力学模式相比， 作为将所述药物施用至受试者的直接或间接效应，血液流动或血液动力学模式已经改变。
153. 如权利要求1至152中任一项所述的方法，其中所述流动或所述血液动力学模式 从动物获得。
154. 如权利要求153所述的方法，其中所述动物是基因修饰动物。
155. 如权利要求153所述的方法，其中所述动物是人。
156. 如权利要求2、4至27、31至155中任一项所述的方法，其中所述药物包括抗炎症 齐IJ、抗肿瘤剂、抗糖尿病剂、蛋白激酶抑制剂、抗血栓形成剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、抗凝 血剂、钙通道阻滞剂、螯合剂、rho激酶抑制剂、抗高血脂剂、升高HDL的药剂、抗再狭窄剂、 抗生素、免疫抑制剂、抗高血压剂、利尿剂、减食欲剂、食欲抑制剂、抗抑郁剂、精神抑制药、 避孕药、拟钙剂、生物医药产品、多发性硬化疗法、止痛药、激素替代疗法、抗痉挛药或其组 合。
157. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括抗炎症剂，所述抗炎症剂包括类 固醇、非类固醇抗炎症药物（NSAID)、选择性环氧合酶抑制剂、非选择性环氧合酶抑制剂、免 疫选择性抗炎症剂或其组合。
158. 如权利要求157所述的方法，其中所述抗炎症剂包括所述类固醇，所述类固醇包 括泼尼松、氢化可的松、泼尼松龙、倍他米松或地塞米松；其中所述抗炎症剂包括所述非类 固醇抗炎症药物，所述非类固醇抗炎症药物包括水杨酸盐、布洛芬、对乙酰氨基酚、萘普生、 酮洛芬或双氯芬酸；其中所述抗炎症剂包括所述选择性环氧合酶抑制剂，所述选择性环氧 合酶抑制剂包括塞来昔布、罗非昔布或伐地考昔；或其中所述抗炎症剂包括所述免疫选择 性抗炎症剂，所述免疫选择性抗炎症剂包括苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸三肽。
159. 如权利要求158所述的方法，其中所述水杨酸盐包括乙酰水杨酸。
160. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂包括烷 化剂、抗代谢物、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素或其组合。
161. 如权利要求160所述的方法，其中所述抗肿瘤剂包括所述烷化剂，所述烷化剂包 括顺钼、卡波钼、奥沙利钼、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环磷酰胺；其中所 述抗肿瘤剂包括所述抗代谢物，所述抗代谢物包括硫唑噪呤或巯基噪呤；其中所述抗肿瘤 剂包括所述植物碱，所述植物碱包括紫杉烷、长春花生物碱或鬼白毒素；其中所述抗肿瘤剂 包括所述拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂包括伊立替康、拓扑替康或安吖啶；其 中所述抗肿瘤剂包括所述细胞毒性抗生素，所述细胞毒性抗生素包括放线菌素、博来霉素、 普卡霉素、丝裂霉素、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星、表柔比星或利福平。
162. 如权利要求161所述的方法，其中所述植物碱包括所述紫杉烷，所述紫杉烷包括 紫杉醇或多西紫杉醇；其中所述植物碱包括所述长春花生物碱，所述长春花生物碱包括长 春新碱、长春碱或长春地辛；或其中所述植物碱包括所述鬼白毒素，所述鬼白毒素包括依托 泊苷或替尼泊苷。
163. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括抗糖尿病剂，所述抗糖尿病剂包 括双胍、噻唑烷二酮、磺酰脲、肠促胰岛素模拟物、二肽基肽酶IV抑制剂、钠-葡萄糖协同转 运蛋白2抑制剂、葡糖激酶活化剂、氯茴苯酸、GPR40激动剂或胰高血糖素受体拮抗剂。
164. 如权利要求163所述的方法，其中所述抗糖尿病剂包括所述双胍，所述双胍包括 二甲双胍；其中所述抗糖尿病剂包括所述噻唑烷二酮，所述噻唑烷二酮包括罗格列酮、曲格 列酮或吡格列酮；其中所述抗糖尿病剂包括所述磺酰脲，所述磺酰脲包括甲苯胺丁脲、醋 磺己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲、格列美脲、格列齐特、格吡嗪胺或格列喹 酮；其中所述抗糖尿病剂包括所述肠促胰岛素模拟物，所述肠促胰岛素模拟物包括伊森泰 德、利拉鲁肽或他司鲁泰；其中所述抗糖尿病剂包括所述二肽基肽酶IV抑制剂，所述二肽 基肽酶IV抑制剂包括维达列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀、阿格列汀或塞格立汀；其 中所述抗糖尿病剂包括所述钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，所述钠-葡萄糖协同转运 蛋白2抑制剂包括达格列净、坎格列净、艾帕列净、伊格列净、瑞格列净或舍格列净；其中所 述抗糖尿病剂包括所述葡糖激酶活化剂，所述葡糖激酶活化剂包括匹瑞格汀；其中所述抗 糖尿病剂包括所述氯茴苯酸，所述氯茴苯酸包括瑞格列奈；或其中所述抗糖尿病剂包括所 述GPR40激动剂，所述GPR40激动剂包括TAK-875。
165. 如权利要求163所述的方法，其中所述抗糖尿病剂包括噻唑烷二酮与二甲双胍的 组合；噻唑烷二酮与格列美脲的组合；二肽基肽酶IV抑制剂与斯达汀的组合；或二肽基肽 酶IV抑制剂与二甲双胍的组合。
166. 如权利要求165所述的方法，其中所述抗糖尿病剂包括噻唑烧二酮与二甲双胍的 组合或噻唑烷二酮与格列美脲的组合，所述噻唑烷二酮包括吡格列酮；其中所述抗糖尿病 剂包括二肽基肽酶IV抑制剂与斯达汀的组合，所述二肽基肽酶IV抑制剂包括西他列汀并 且所述斯达汀包括辛伐他汀；或其中所述抗糖尿病剂包括二肽基肽酶IV抑制剂与二甲双 胍的组合，所述二肽基肽酶IV抑制剂包括西他列汀。
167. 如权利要求163所述的方法，其中所述抗糖尿病剂包括达格列净与二甲双胍的组 合，或达格列净与沙格列汀的组合。
168. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括蛋白激酶抑制剂，所述蛋白激酶 抑制剂包括丝氨酸/苏氨酸特异性激酶抑制剂、酪氨酸特异性激酶抑制剂、表皮生长因子 (EGF)受体抑制剂、成纤维细胞生长因子（FGF)受体抑制剂、血小板衍生生长因子（PDGF)受 体抑制剂或血管内皮生长因子（VEGF)受体抑制剂。
169. 如权利要求168所述的方法，其中所述蛋白激酶抑制剂包括所述酪氨酸特异性激 酶抑制剂，所述酪氨酸特异性激酶抑制剂包括伊马替尼、贝伐单抗、西妥昔单抗、阿西替尼、 拉帕替尼、卢佐替尼、索拉非尼、费斯替尼、巴利替尼或托法替尼。
170. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗血栓形成剂，所述抗血 栓形成剂包括双嘧达莫、尿激酶、r-尿激酶、r-尿激酶原、瑞替普酶、阿替普酶、链激酶、 rt-PA、TNK-rt-PA、孟替普酶、葡萄球菌激酶、帕米普酶、未分级肝素或APSAC。
171. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述血栓溶解剂，所述血栓溶解 剂包括链激酶、尿激酶或组织纤溶酶原活化剂。
172. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗血小板剂，所述抗血小板 剂包括糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、凝血烷抑制剂、二磷酸腺苷受体抑制剂、前列腺素类似物 或磷酸二酯酶抑制剂。
173. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗血小板剂，所述抗血小板 齐IJ包括氯吡格雷、阿昔单抗、替罗非班、奥波非班、珍米洛非班、西拉非班、罗昔非班或噻氯 匹定。
174. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗凝血剂，所述抗凝血剂包 括维生素K拮抗剂、因子Xa抑制剂或直接凝血酶抑制剂。
175. 如权利要求174所述的方法，其中所述抗凝血剂包括维生素K拮抗剂，所述维生素 K拮抗剂包括华法林；其中所述抗凝血剂包括所述因子Xa抑制剂，所述因子Xa抑制剂包括 阿哌沙班、贝曲西班、依杜沙班、奥米沙班、利伐沙班、磺达肝癸或艾屈肝素；或其中所述抗 凝血剂包括所述直接凝血酶抑制剂，所述直接凝血酶抑制剂包括水蛭素、比伐卢定、来匹卢 定、地西卢定、达比加群、希美加群、美拉加群或阿加曲班。
176. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述钙通道阻滞剂时，所述钙通 道阻滞剂包括维拉帕米、地尔硫卓、氨氯地平、阿雷地平、阿折地平、巴尼地平、贝尼地平、西 尼地平、氯维地平、伊拉地平、依福地平、非洛地平、拉西地平、乐卡地平、马尼地平、尼卡地 平、硝苯地平、尼伐地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平或普拉地平。
177. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述螯合剂，所述螯合剂可包括 青霉胺、三乙烯四胺盐酸盐、EDTA、DMSA、甲磺酸去铁胺或巴马司他。
178. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述rho激酶抑制剂，所述rho激 酶抑制剂包括Y27632。
179. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗高血脂剂，所述抗高血脂 剂包括斯达汀、非诺贝特、膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂、胆固醇酯转移蛋白抑制剂、前 列腺素D2受体拮抗剂、Q -3-脂肪酸或降胆固醇剂。
180. 如权利要求179所述的方法，其中所述抗高血脂剂包括所述斯达汀，所述斯达汀 包括阿托伐他汀、西伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他 汀或辛伐他汀；其中所述抗高血脂剂包括所述非诺贝特，所述非诺贝特包括苯扎贝特、苯扎 贝特酸、环丙贝特、环丙贝特酸、氯贝特、氯贝酸、吉非贝齐、非诺贝特或非诺贝酸；其中所述 抗高血脂剂包括所述膳食胆固醇吸收的选择性抑制剂，所述膳食胆固醇吸收的选择性抑制 剂包括依折麦布；其中所述抗高血脂剂包括所述胆固醇酯转移蛋白抑制剂，所述胆固醇酯 转移蛋白抑制剂包括安塞曲匹、达塞曲匹、托彻普或伊沃曲匹；其中所述抗高血脂剂包括所 述前列腺素D2受体拮抗剂，所述前列腺素D2受体拮抗剂包括拉罗皮兰；其中所述抗高血脂 剂包括所述Q-3-脂肪酸，所述Q-3-脂肪酸包括二十碳五烯酸（EPA)或二十二碳六烯酸 (DHA);或其中所述抗高血脂剂包括所述降胆固醇剂，所述降胆固醇剂包括烟酸。
181. 如权利要求179所述的方法，其中所述抗高血脂剂包括烟酸与拉罗皮兰的组合或 依折麦布与辛伐他汀的组合。
182. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述升高HDL的药剂，所述升高 HDL的药剂包括前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin类型9 (PCSK9)的抑制剂。
183. 如权利要求182所述的方法，其中所述PCSK9抑制剂包括AMG145。
184. 如权利要求183所述的方法，其中所述药物包括所述抗再狭窄剂，所述抗再狭窄 剂包括地塞米松噻氯匹定、氯吡格雷、西罗莫司、紫杉醇、佐他莫司、依维莫司或乌米莫司。
185. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗生素，所述抗生素包括放 线菌素-D。
186. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述免疫抑制剂，所述免疫抑制 剂包括糖皮质激素、甲氨喋呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、更生霉素、丝裂霉素C、博来霉素、光神 霉素、环孢素、他克莫司、西罗莫司、干扰素、英利昔单抗、依那西普或阿达木单抗。
187. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗高血压剂，所述抗高血压 剂包括3肾上腺素受体拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂或血管紧张素转化酶抑制剂。
188. 如权利要求187所述的方法，其中所述抗高血压剂包括所述3肾上腺素受体拮 抗剂，所述3肾上腺素受体拮抗剂包括烯丙洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛 尔、纳多洛尔、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、醋丁洛尔、阿 替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔或奈必洛尔；其中所述抗高血压剂包括所述血管紧 张素II受体拮抗剂，所述血管紧张素II受体拮抗剂包括洛沙坦、奥美沙坦、缬沙坦、替米沙 坦、厄贝沙坦或阿齐沙坦；或其中所述抗高血压剂包括所述血管紧张素转化酶抑制剂，所述 血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利、依那普利、赖诺普利、喹那普利、佐芬普利、咪达普 利、贝那普利、群多普利或雷米普利。
189. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述利尿剂，所述利尿剂包括呋 塞米、阿米洛利、螺内酯或双氢氯噻嗪。
190. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述减食欲剂，所述减食欲剂包 括苯丁胺、芬氟拉明、右芬氟拉明、西布曲明、氯卡色林、托吡酯或其组合。
191. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗抑郁剂，所述抗抑郁剂包 括丙米嗪、脱甲丙咪嗪、阿米替林、帕罗西汀、西酞普兰、氟西汀或依地普仑。
192. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述精神抑制药，所述精神抑制 药包括阿立哌唑、利培酮、奥氮平、喹硫平、卡利拉、鲁拉西或阿塞那平。
193. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述避孕药，所述避孕药包括 3 -雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮或屈螺酮。
194. 如权利要求193所述的方法，其中所述避孕药包括屈螺酮与乙炔基雌二醇的组 合。
195. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述拟钙剂，所述拟钙剂包括西 那卡塞。
196. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述生物医药产品，所述生物医 药产品包括合成多糖，合成、部分合成或人源化免疫球蛋白，或重组治疗蛋白质。
197. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述多发性硬化疗法，所述多发 性硬化疗法包括多发性硬化的口服疗法。
198. 如权利要求156或197所述的方法，其中所述药物包括所述多发性硬化疗法，所述 多发性硬化疗法包括延胡索酸的甲酯、鞘氨醇-1-磷酸酯（S1P)受体激动剂或免疫调节剂。
199. 如权利要求198所述的方法，其中所述多发性硬化疗法包括所述延胡索酸的甲 酯，所述延胡索酸的甲酯包括延胡索酸单甲酯或延胡索酸二甲酯；其中所述多发性硬化疗 法包括所述S1P受体激动剂，所述S1P受体激动剂包括芬戈莫德；其中所述多发性硬化疗法 包括所述免疫调节剂，所述免疫调节剂包括特立氟胺或拉喹莫德。
200. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述止痛药，所述止痛药包括麻 醉性止痛药或阿片样肽。
201. 如权利要求200所述的方法，其中所述止痛药包括所述麻醉性止痛药，所述麻醉 性止痛药包括丙氧芬、芬太尼、吗啡或吗啡代谢物；或其中所述止痛药包括所述阿片样肽， 所述阿片样肽包括强啡肽A。
202. 如权利要求201所述的方法，其中所述吗啡代谢物包括吗啡3-葡糖苷酸或吗啡 6_葡糖苷酸。
203. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述激素替代疗法，所述激素替 代疗法包括偶联雌激素、3 -雌二醇、乙炔基雌二醇、孕酮、左炔诺孕酮、屈螺酮或睾酮。
204. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括所述抗痉挛药，所述抗痉挛药包 括本巴比妥。
205. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括利尿剂与钙通道阻滞剂的组合； 利尿剂与血管紧张素受体II拮抗剂的组合；利尿剂与3 -肾上腺素受体拮抗剂的组合；或 利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合。
206. 如权利要求205所述的方法，其中所述药物包括利尿剂与钙通道阻滞剂的组合， 所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述钙通道阻滞剂包括氨氯地平；其中所述药物包括利尿 剂与血管紧张素受体II拮抗剂的组合，所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述血管紧张素 受体II拮抗剂包括洛沙坦；其中所述药物包括利尿剂与3 _肾上腺素受体拮抗剂的组合， 所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述￠-肾上腺素受体拮抗剂包括普萘洛尔；或其中所述 药物包括利尿剂与血管紧张素转化酶抑制剂的组合，所述利尿剂包括双氢氯噻嗪并且所述 血管紧张素转化酶抑制剂包括卡托普利。
207. 如权利要求156所述的方法，其中所述药物包括抗高血脂剂、抗高血压剂、利尿剂 和钙通道阻滞剂的组合。
208. 如权利要求207所述的方法，其中所述抗高血脂剂包括辛伐他汀，所述抗高血压 剂包括洛沙坦，所述利尿剂包括双氢氯噻嗪，并且所述钙通道阻滞剂包括氨氯地平。
209. 如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法，其中所述药物或所述 化合物包括造影剂、放射性同位素、前药、抗体片段、抗体、活细胞、治疗药物递送微球体、微 珠、纳米颗粒、凝胶或细胞浸渍凝胶或其组合。
210. 如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法，其中所述化合物能够抑 制、活化或改变所述至少一种细胞类型中的蛋白质或基因的功能。
211. 如权利要求2、4至27和31至155中任一项所述的方法，其中所述药物或所述化 合物针对从血管支架材料上洗脱来评估，并且所述方法进一步包括针对与所述血管支架材 料的相容性、细胞粘附或表型调节来测试至少一种细胞类型。
212. 如权利要求74至120中任一项所述的方法，其中血管支架材料相邻于内皮细胞、 平滑肌细胞或心内膜细胞。 213?如权利要求 2、3 至 10、21、24 至 27、31 至 73、121 至 130、132、136 至 140、142、145 至145、151至156、163和164中任一项所述的方法，其中所述病理性病况是脂肪肝疾病，所 述因子包括胰岛素和葡萄糖，并且所述药物或化合物包括吡格列酮。
214. 如权利要求1至213中任一项所述的方法，其进一步包括灌注培养基进入和离开 所述细胞容器。
215. 如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125和130至214 中任一项所述的方法，其中所述细胞培养容器内的表面包括悬浮于所述细胞培养容器中的 多孔膜。
216. 如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125,和130至 214中任一项所述的方法，其中将至少一种细胞类型或肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内 的表面上的步骤包括将第一细胞类型或所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上，并且任选 地将第二细胞类型涂铺于所述多孔膜的第二表面上，其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养 容器中以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系， 从而在所述细胞培养容器内界定包含所述第一细胞类型的下部容积和包含所述任选第二 细胞类型的上部容积，所述多孔膜适于允许所述细胞培养基的流体连通以及所述第一细胞 类型的细胞与所述任选第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通；并且将所述剪切 力施加至所述上部容积中的所述第二细胞类型或所述多孔膜的第二表面。 217?如权利要求1至19、22至28、31至34、38至78、82至85、121至125,和130至 214中任一项所述的方法，其中将至少一种细胞类型或肝细胞涂铺于所述细胞培养容器内 的表面上的步骤包括将第一细胞类型或所述肝细胞涂铺于多孔膜的第一表面上，并且将第 二细胞类型涂铺于所述多孔膜的第二表面上，其中所述多孔膜悬浮于所述细胞培养容器中 以使得所述第一表面为近端并且与所述细胞培养容器的底部表面呈间隔开的关系，从而在 所述细胞培养容器内界定包含所述任选第一细胞类型的下部容积和包含所述第二细胞类 型的上部容积，所述多孔膜适于允许所述细胞培养基的流体连通以及所述任选第一细胞类 型的细胞与所述第二细胞类型的细胞之间的物理相互作用和连通；并且将所述剪切力施加 至所述上部容积中的所述第二细胞类型。
218. 如权利要求216或217所述的方法，其进一步包括将培养基灌注进入和离开所述 上部容积以及将培养基灌注进入和离开所述下部容积。
219. 如权利要求218所述的方法，其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌注至所 述上部容积和所述下部容积中的至少一个。
220. 如权利要求219所述的方法，其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌注至所 述上部容积中。
221. 如权利要求219或220所述的方法，其中所述方法进一步包括将药物或化合物灌 注至所述下部容积中。
222. 如权利要求216至221中任一项所述的方法，其中所述细胞培养容器进一步包括 界定所述上部和下部容积的所述细胞培养容器的部分的入口和出口。
223. 如权利要求216至222中任一项所述的方法，其进一步包括针对由所述药物或所 述化合物产生的毒性、炎症、渗透性、相容性、细胞粘附、细胞重构、细胞迁移或表型调节来 分析所述第一细胞类型或所述第二细胞类型中的至少一种。
224. 如权利要求216至223中任一项所述的方法，其进一步包括将第三细胞类型涂铺 于所述容器的表面或所述多孔膜的第一表面或第二表面上，将第三细胞类型悬浮于所述上 部容积内的所述培养基中，或将第三细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
225. 如权利要求224所述的方法，其进一步包括将第四细胞类型涂铺于所述容器的表 面或所述多孔膜的第一或第二表面上，将第四细胞类型悬浮于所述上部容积内的所述培养 基中，或将第四细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
226. 如权利要求225所述的方法，其进一步包括将第五细胞类型涂铺于所述容器的表 面或所述多孔膜的第一或第二表面上，将第五细胞类型悬浮于所述上部容积内的所述培养 基中，或将第五细胞类型悬浮于所述下部容积内的所述培养基中。
227. 如权利要求224、225或226所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型包括 原代细胞。
228. 如权利要求227所述的方法，其中所述原代细胞包括从干细胞或干细胞样细胞衍 生的细胞谱系。
229. 如权利要求228所述的方法，其中所述原代细胞包括从干细胞衍生的细胞谱系， 所述细胞谱系从包括成人干细胞、胚胎干细胞、可诱导多能干细胞或骨髓衍生干细胞的干 细胞来衍生。
230. 如权利要求229所述的方法，其中从干细胞衍生的所述细胞谱系包括内皮细胞、 平滑肌细胞、心脏肌细胞、肝细胞、神经元细胞、内分泌细胞、胰腺￠-细胞、胰腺细胞或 骨骼肌细胞。
231. 如权利要求227或228所述的方法，其中所述原代细胞包括来自具有病理性病况 的受试者的可诱导多能干细胞（iPSC)衍生细胞。
232. 如权利要求231所述的方法，其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生 细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生肝细胞：家族性高胆固醇血症、糖原贮积 病类型I、威尔逊氏病、A1抗胰蛋白酶缺乏症、克里格勒-纳贾尔综合征、渐进性家族性遗传 性胆汁淤积或遗传性酪氨酸血症类型1。
233. 如权利要求232所述的方法，其中来自具有病理性病况的受试者的所述iPSC衍生 细胞包括来自患有以下疾病的受试者的iPSC衍生血管细胞：哈钦森-吉尔福特早衰症、威 廉姆斯-博伊伦综合征、法布里氏病、苏萨克氏综合征、全身毛细管渗漏综合征、格菜克综 合征、血管内乳突状内皮增生、镰状细胞疾病或肝静脉闭塞疾病。
234. 如权利要求233所述的方法，其中所述iPSC衍生血管细胞包括iPSC衍生平滑肌 细胞、iPSC衍生内皮细胞或iPSC衍生心内膜细胞。
235. 如权利要求224、225或226所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型包括 永生细胞。
236. 如权利要求227至235中任一项所述的方法，其中所述原代细胞或所述永生细胞 包括从具有病理性病况的至少一个受试者分离的细胞、从具有病理性病况的风险因素的至 少一个受试者分离的细胞、从具有与病理性病况相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者 分离的细胞、从具有与药物毒性相关的已识别基因型的至少一个受试者分离的细胞或从具 有与药物毒性相关的单核苷酸多态性的至少一个受试者分离的细胞。
237. 如权利要求236所述的方法，其中所述原代细胞或所述永生细胞包括从具有病理 性病况的风险因素的至少一个受试者分离的细胞，其中所述风险因素是吸烟、年龄、性别、 种族、表观遗传印记、与所述病理性病况相关的已识别基因型、与所述病理性病况相关的已 识别单核苷酸多态性、糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块破裂、动脉粥样硬 化斑块侵蚀、胸主动脉瘤、脑动脉瘤、腹主动脉瘤、脑动脉瘤、心力衰竭、中风、马凡综合征、 颈动脉内膜中层增厚、心房纤维性颤动、肾疾病、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、肺动脉疾病、 肺动脉高压、高脂血症、家族性高胆固醇血症、外周动脉疾病、深静脉血栓形成、血管再狭 窄、血管钙化、心肌梗塞、肥胖症、高甘油三酯血症、低a脂蛋白血症、脂肪肝疾病、丙型肝 炎、乙型肝炎、肝纤维化、细菌感染、病毒感染、肝硬化、肝纤维化或酒精诱导肝疾病。
238. 如权利要求224至237中任一项所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型 包括肾细胞、气道细胞、血脑屏障细胞、血管细胞、肝细胞、胰腺细胞、心脏细胞、肌肉细胞、 脾细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肝细胞、免疫细胞或造血细胞。
239. 如权利要求224至237中任一项所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类 型包括星形细胞、内皮细胞、肾小球有孔内皮细胞、肾上皮足细胞、a细胞、￠-细胞、S细 胞、胰多肽（PP)细胞、e细胞、神经胶质细胞、肝细胞、神经元、非实质肝细胞、足细胞、平滑 肌细胞、肾小球系膜细胞、周细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、白细胞、单核细胞、肌细胞、巨噬 细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、T-细胞、B-细胞、内皮祖细胞、干细胞、循环干细胞或循 环造血细胞。
240. 如权利要求239所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型包括所述非实 质肝细胞，所述非实质肝细胞包括肝星形细胞、肝窦内皮细胞或库柏法细胞。
241. 如权利要求224至237中任一项所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型 包括内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞或肝窦内皮细胞。
242. 如权利要求224至241中任一项所述的方法，其中所述第三、第四或第五细胞类型 是动物细胞类型。
243. 如权利要求242所述的方法，其中所述动物细胞类型是人细胞类型。
244. 如权利要求243所述的方法，其中所述人细胞类型基于年龄、性别、种族、表现遗 传学、疾病、民族性或存在或不存在一个或多个单核苷酸多态性来选择。
245. 如权利要求224至244中任一项所述的方法，其中所述第三细胞类型的细胞、所述 第四细胞类型的细胞或所述第五细胞类型的细胞附着至所述容器的底部表面。
246. 如权利要求1至245中任一项所述的方法，所述方法进一步包括针对以下项目来 分析所述细胞培养基：细胞因子分泌、趋化因子分泌、体液因子分泌、微粒分泌、生长因子分 泌、蛋白质从细胞表面脱落、化合物的代谢物、免疫细胞、氮氧化物分泌、血管舒张蛋白质、 血管收缩蛋白质、miRNA、分泌蛋白质或分泌生物物质。
247. 如权利要求246所述的方法，其中所述细胞培养基针对蛋白质从所述细胞表面的 脱落来进行分析，并且所述蛋白质包括血管细胞粘附分子（VCAM)、E-选择素或细胞内粘附 分子（ICAM)。
248. 如权利要求246所述的方法，其中所述细胞培养基通过测量硝酸盐或亚硝酸盐浓 度来针对氮氧化物分泌来进行分析。
249. 如权利要求1至248中任一项所述的方法，其进一步包括培养所述细胞类型、细胞 类型或肝细胞的步骤。
250. 如权利要求2、4至27和31至249中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤： 将在所述培养基包括所述药物或所述化合物时，施加所述剪切力一段时间之后的至少一种 细胞类型与在所述培养基不包括所述药物或所述化合物时，施加所述剪切力所述一段时间 之后的所述至少一种细胞类型进行比较，以确定所述药物或化合物对于所述至少一种细胞 类型的效应。
251. 如权利要求124至130和134至249中任一项所述的方法，其中所述受试者是动 物。
252. 如权利要求251所述的方法，其中所述动物是基因修饰动物。
253. 如权利要求251所述的方法，其中所述动物是人。
254. 如权利要求 3 至 7、9 至 13、15 至 21、28 至 40、52 至 63、68 至 73、121 至 133、136 至 210和213至253中任一项所述的方法，其中所述剪切力以约0.1 dyne/cm2至约3.0 dyne/ cm2的速率来施加。
255. 如权利要求254所述的方法，其中所述剪切力以约0. 2dyne/Cm2至约2. 5 dyne/ cm2的速率来施加。
256. 如权利要求254所述的方法，其中所述剪切力以约0.3dyne/cm2至约1.0 dyne/ cm2的速率来施加。
257. 如权利要求254所述的方法，其中所述剪切力以约0.4dyne/cm2至约0.8 dyne/ cm2的速率来施加。
258. 如权利要求254所述的方法，其中所述剪切力以约0. 6dyne/Cm2的速率来施加。
259. 如权利要求254所述的方法，其中所述剪切力以约2. Odyne/cm2的速率来施加。
【文档编号】C12M3/00GK104350142SQ201380031039
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年4月18日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】B·R·布莱克曼, B·R·瓦姆霍夫, A·达什, M·B·希莫斯, R·E·菲弗 申请人:海莫希尔有限责任公司