含磷脂组合物的制造方法及含磷脂组合物的制作方法

含磷脂组合物的制造方法及含磷脂组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供含磷脂组合物整体中含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量为10～40重量％的含磷脂组合物的制造方法，利用包括以下的工序(1)、(2)及工序(3)、(4)的方法，低价且稳定地供给包含2位键合有大量高度不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物。工序(1)：利用磷脂酶A2(PLA2)，进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到磷脂；工序(2)：在工序(1)之后，使磷脂中的PLA2活性为10U/g(磷脂)以下；工序(3)：在磷脂酶D(PLD)的存在下，进行磷脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反应，形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物；工序(4)：分离该组合物。
【专利说明】含磯脂组合物的制造方法及含磯脂组合物

【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物的制造方法及含磯脂组合物。

【背景技术】
[0002] 磯脂醜丝氨酸被认为对认知功能障碍、记忆力、集中力的改善等脑功能的提高是 有效的，已知通过键合DHA(二十二碳六帰酸）其效果进一步提高。DHA键合磯脂醜丝氨酸 可W通过从牛脑中萃取来生产，但出于疯牛病的影响近年来没有进行。另外，已知DHA键合 磯脂醜丝氨酸可W通过在丝氨酸的存在下使磯脂酶D作用于DHA键合磯脂醜胆碱、DHA键 合磯脂醜己醇胺等来合成（专利文献1)。另外，关于作为DHA键合磯脂醜丝氨酸的原料的 DHA键合磯脂醜胆碱，有从包含大量多元不饱和脂肪酸的、金枪鱼、纏鱼、始鱼、沙下鱼、秋刀 鱼、竹芙鱼等鱼类的组织；由用包含多元不饱和脂肪酸的饲料饲养的鸡得到的鸡蛋中萃取 的方法（专利文献1)。另外，还已知将来自大豆的磯脂醜丝氨酸与海洋性的DHA键合磯脂 醜丝氨酸（丝氨酸甘油磯脂接合体）混合来使用的方法（专利文献2)。但是，该些方法中 原料高价，且供给不稳定。
[0003] 另一方面，作为使DHA键合于磯脂来制作DHA键合磯脂的方法，有使用磯脂酶A2 将磯脂的2位的脂肪酸水解而得的溶血磯脂、或在市售的溶血磯脂中导入DHA的方法（专 利文献3)。
[0004] 但是，在专利文献3中记载的方法中，未进行将磯脂的2位的脂肪酸水解时所使用 的磯脂酶A2的除去和失活操作，因此磯脂酶A2等量残留，因而有时键合于溶血磯脂的DHA 在保存中经时性脱离。另外，若想要将该DHA键合磯脂按照专利文献1记载的方法进行丝 氨酸化，则基于丝氨酸和磯脂酶D的丝氨酸化需要水，因而存在反应中在2位发生水解的问 题，未能高效地进行DHA键合磯脂醜丝氨酸的合成。
[0005] 现有技术文献 [000引专利文献
[0007] 专利文献1 ;日本特开平9 - 121879号公报
[0008] 专利文献2 :日本特表2011 - 525525公报
[0009] 专利文献3 ;日本特开2010 - 068799号公报


【发明内容】

[0010] 发明要解决的课题
[0011] 使用安全的原料低价且稳定地供给大量键合有高度不饱和脂肪酸的磯脂醜丝氨 酸、尤其是DHA键合磯脂醜丝氨酸的方法尚未知。
[0012] 因此，本发明的目的在于，提供能够低价且稳定地供给包含2位键合有大量高度 不饱和脂肪酸的磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物的制造方法、W及包含大量键合有高度不饱 和脂肪酸的磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物。
[0013] 用于解决课题的手段
[0014] 本发明人为了解决上述课题而反复认真研究的结果发现，若W磯脂和高度不饱和 脂肪酸为原料，并实施包括特定的工序的制造方法，则能够得到W高效率导入了高度不饱 和脂肪酸的含磯脂组合物，并完成了本发明。
[0015] 目P，本发明的第一发明涉及一种含磯脂组合物的制造方法，其是含磯脂组合物整 体中含有10重量％W上的磯脂醜丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量 为10?40重量％的含磯脂组合物的制造方法，并包括W下的工序（1)、（2)及工序（3)、 (4)。
[001引工序（1);通过磯脂酶A2(PLA2)，进行溶血磯脂与高度不饱和脂肪酸的醋化反应， 得到磯脂。
[0017] 工序（2);在工序（1)之后，使磯脂中的PLA2活性为lOU/g(磯脂）W下。
[0018] 工序（3);在磯脂酶D(PLD)的存在下，进行磯脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反 应，形成包含磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物。
[0019] 工序（4);将包含磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物分离。
[0020] 作为本发明的实施方式，可W采用在上述工序（2)中从磯脂除去PLA2的方式、和 在上述工序（2)中使磯脂中的PLA2失活的方式中的至少一种。
[0021] 本发明的一实施方式中，在工序（2)中，在工序（1)之后，向磯脂中添加无机盐 的甘油溶液、碳数4W下的醇、W及不与甘油混溶且溶解磯脂的有机溶剂，揽拌后静置，形 成包含磯脂的有机溶剂层、和包含PLA2的甘油溶液层，将该有机溶剂层从该甘油溶液层分 离，由此从磯脂中除去PLA2。
[0022] 在此，优选无机盐的甘油溶液中的水分量为10重量％W下。
[0023] 优选不与甘油混溶且溶解磯脂的有机溶剂是碳数为5?8的姪溶剂和/或離。
[0024] 优选甘油溶液中的无机盐浓度为0. 2?40重量％。
[00巧]优选无机盐为选自由硫酸锋、氯化钟、氯化镇、硫酸镇、氯化轴及氯化巧构成的组 的至少1种。
[0026] 优选有机溶剂为己焼。
[0027] 优选碳数4W下的醇为己醇。
[002引本发明的其它实施方式中，在工序（2)中，在工序（1)之后，向磯脂中添加酸性蛋 白酶，使磯脂中的PLA2失活。另外，还可W用酸性蛋白酶处理磯脂后，进一步向该磯脂中添 加中性蛋白酶，使磯脂中的PLA2失活。
[0029] 在本发明中，例如，高度不饱和脂肪酸为DHA。另外，溶血磯脂为来自植物或蛋黄的 溶血卵磯脂。进一步，溶血磯脂为来自大豆的溶血卵磯脂。
[0030] 本发明的第二发明涉及一种含磯脂组合物，其是W来自植物的磯脂、或来自植物 及来自蛋黄的磯脂为原料而合成的含磯脂组合物，其中，含有10重量％^上的磯脂醜丝氨 酸，构成脂肪酸整体中DHA的含量为10?40重量％且亚油酸的含量为15?40重量％。 [00引]发明效果
[0032] 根据本发明，能够低价且稳定地供给在2位键合有高度不饱和脂肪酸的磯脂醜丝 氨酸、尤其是包含DHA键合磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物。

【具体实施方式】
[0033] W下，对本发明进一步详细地进行说明。本发明的含磯脂组合物的制造方法的特 征在于，包括特定的工序。另外，本发明的含磯脂组合物的特征在于，其是W来自植物、蛋黄 的磯脂等为原料而合成的含磯脂组合物，含有特定量的磯脂醜丝氨酸，并包含特定量的高 度不饱和脂肪酸作为磯脂的构成脂肪酸。
[0034] 本发明的磯脂醜丝氨酸是磯脂的一种，集中存在于神经细胞中，在脑内的信息传 递、血流中发挥重要的作用。
[00巧]本发明的高度不饱和脂肪酸是指碳一碳间的双键为4个W上的不饱和脂肪酸、W及共辆亚油酸。高度不饱和脂肪酸具有提高学习能力、预防动脉硬化、改善脂质代谢等功 能。对于该些高度不饱和脂肪酸而言，与磯脂键合的形态被认为比与甘油H醋键合的形态 的抗氧化性强，稳定性提高，摄取时的吸收性也好。作为具体的高度不饱和脂肪酸，可W举 出DHA、EPA、花生四帰酸等，从获得的容易程度和功能的强度的观点出发，优选DHA。
[0036] 本发明的含磯脂组合物优选在组合物整体中含有磯脂醜丝氨酸10重量％W上， 更优选为10?80重量％、进一步优选为30?80重量％、特别优选为40?80重量％。若 含量少于10重量％，则有时不能得到本发明的效果。另外，含磯脂组合物中的高度不饱和 脂肪酸的含量优选在构成脂肪酸整体中为10?40重量％。若高度不饱和脂肪酸的含量少 于10重量％，则存在基于高度不饱和脂肪酸的效果低的情况，多于40重量％时存在制造上 成本花费过高的情况。
[0037] <磯脂醜丝氨酸的定量方法>
[00測磯脂或含磯脂组合物中的磯脂醜丝氨酸的定量按照化urnalof化曲Resolution C虹omatography,13 (1990)，PP126-129中记载的方法，利用HPLC_化SD装置进行分析。对 于磯脂醜丝氨酸的定量，使用预先用标准的方法由大豆卵磯脂使用磯脂酶D进行合成并利 用娃胶柱色谱法精制的磯脂醜丝氨酸标准样品制成标准曲线，W其为基准进行定量。
[0039] 本发明的含磯脂组合物的制造方法基本上按顺序包括W下的工序（1)、（2)，且按 顺序包括工序（3)、（4)。
[0040] < 工序（1) >
[0041] 使用磯脂酶A2 (W下也称PLA2)，进行溶血磯脂与高度不饱和脂肪酸的醋化反应， 得到键合有高度不饱和脂肪酸的磯脂。所述醋化反应按照常法进行即可，但考虑到酶的最 适温度、脂肪酸的氧化等，优选在30?8(TC的温度范围内进行，更优选在40?7(TC的范围 内进行。若低于3(TC则存在酶活性低的情况，若超过8(TC则存在酶失活、或脂肪酸发生氧 化的情况。另外，反应时间优选为3?72小时。PLA2的添加量相对于每100重量份的溶血 磯脂优选为1?100重量份。优选反应在分析磯脂的脂肪酸组成，并确认高度不饱和脂肪 酸达到构成脂肪酸中的至少10重量％W上后结束。
[0042] 在此使用的磯脂酶A2是用于将磯脂的2位水解、或在溶血磯脂的2位导入脂肪酸 的酶。对于其来源没有特别要求，但通常优选能够用于食用的酶，可W举出来自猪膜脏的 酶、来自微生物的酶。
[0043] 本发明的溶血磯脂可W通过将工业上通过磯脂酶A2而键合于磯脂的2位的脂肪 酸进行水解而得到。其中，从获得的容易程度出发，优选由来自植物或蛋黄的卵磯脂得到的 溶血卵磯脂，更优选由大豆、蛋黄中含有的卵磯脂得到的溶血卵磯脂，从成本方面考虑，进 一步优选来自大豆的溶血卵磯脂。将键合于来自大豆的磯脂的2位的脂肪酸按照常法通过 磯脂酶A2进行水解而得到的糊状、粉末状的来自大豆的溶血卵磯脂中，溶血磯脂醜胆碱的 含量为18?30重量％左右，浓缩后的含量为60?75重量％。另外，将键合于来自蛋黄 的磯脂的2位的脂肪酸按照常法进行水解而得到的糊状、粉末状的来自蛋黄的溶血卵磯脂 中，溶血磯脂醜胆碱的含量为50?80重量％左右。
[0044] 如上所述，使用来自大豆的溶血卵磯脂作为溶血磯脂时，最终在工序（2)或（4)中 得到的含磯脂组合物中，含有大量亚油酸作为构成脂肪酸。此时，构成脂肪酸整体中的亚油 酸的含量大致在15?40重量％的范围内，更优选在20?40重量％的范围内。
[0045] < 工序（2) >
[0046] 在工序（1)之后，使工序（1)中得到的磯脂中的PLA2活性为lOU/g(磯脂）W下。 具体来说，该工序通过W下说明的从磯脂中除去PLA2的工序（2) - 1、或使磯脂中的PLA2 失活的工序（2) - 2来实现。也可W并用工序（2) - 1和工序（2) - 2该两个。
[0047] < 工序（2) _ 1 >
[0048] 在工序（1)之后，对磯脂（从在工序（1)中发生醋化反应而得到的含磯脂反应溶 液中将磯脂萃取到有机溶剂中的萃取溶液、从该萃取溶液中蒸觸除去有机溶剂而得到的含 磯脂组合物、或进一步利用丙丽等除去了脂肪酸的含磯脂组合物）添加无机盐的甘油溶 液、碳数4W下的醇、W及不与甘油混溶且溶解磯脂的有机溶剂，进行混合。它们的添加量 考虑PLA2的除去效果来适当决定即可，所述反应溶液、萃取溶液预先包含该溶剂的情况下 可W进行适当调整。
[0049] 在混合后，将温度调整到20?6(TC，强力揽拌W使溶解有磯脂的有机溶剂与甘油 不分离。优选将温度调整到40?6(TC。然后充分揽拌后静置，形成包含PLA2的甘油溶液 层、和包含磯脂的有机溶剂层，分离（分取）该有机溶剂层。即，通过使在磯脂中残留的PLA2 转移到甘油溶液层侧而将其除去，从而降低磯脂中的磯脂酶A2活性。考虑到纯度的提高和 工作效率，可W适当重复上述那样的规定溶剂的添加和分取操作。
[0050] 在分离上述有机溶剂层后，蒸觸除去有机溶剂能够回收磯脂。优选在蒸觸除去有 机溶剂后，用不溶解磯脂而溶解脂肪酸、水的溶剂进行洗涂处理，并回收沉淀的磯脂的方 法。
[0051] 在此，作为上述碳数4 W下的醇，可W举出甲醇、己醇、丙醇及下醇，可W使用选自 它们中的至少1种。其中，从毒性低可W作为食品添加物利用出发，优选己醇。
[0052] 作为无机盐，若为具有对甘油的溶解性的无机盐则没有特别限定，但优选使用选 自由氯化镇、硫酸镇、硫酸锋、氯化钟、氯化轴及氯化巧构成的组的至少1种。优选无机盐按 照在甘油溶液整体中为0. 2重量％W上的方式进行混合来使用。若无机盐的浓度少于0. 2 重量％则存在PLA2的除去不充分的情况。无机盐的浓度越浓则PLA2的除去效率越变高， 但优选在甘油溶液整体中为40重量％ ^下。若无机盐的浓度超过40重量％，则存在甘油 溶液的粘度上升、或无机盐析出而变得难W使用的情况。
[0053] 上述无机盐的甘油溶液的制备考虑到无机盐向甘油的分散性，优选使无机盐形成 水溶液后再与甘油进行混合。另外，无机盐的甘油溶液整体中的水分量越少越优选，优选为 30重量％ ^下，更优选为10重量％ ^下，进一步优选为1重量％ ^下。若甘油溶液中的水 分量超过30重量％，则存在PLA2的除去不能充分进行的情况。另外，使无机盐形成水溶液 后制备甘油溶液的情况下，优选在蒸觸除去甘油溶液中的水后使用。
[0054]作为不与甘油混溶且溶解磯脂的有机溶剂，优选碳数为5?8的姪溶剂和/或離。 具体来说，可W举出庚焼、己焼、戊焼、二己基離、二异丙基離等，从在食品用途中的利用的 观点出发，更优选己焼。
[0055]作为不溶解磯脂而溶解脂肪酸、水的溶剂，可W举出丙丽等。
[005引在工序似一1之后，磯脂中的磯脂酶A2活性越低越化优选为lOU/g(磯脂）W下，更优选为lU/gW下。若磯脂酶A2活性高于lOU/g，则存在工序（1)中键合于磯脂的高 度不饱和脂肪酸过度脱离的情况。
[0057] 需要说明的是，作为工序（2)，可W实施工序（2) - 1，也可W实施下面的工序 (2) - 2〇
[0058] < 工序（2) _ 2 >
[005引在工序（1)之后，向磯脂添加酸性蛋白酶，从而使磯脂中的PLA2失活而降低磯脂 中的磯脂酶A2活性。该蛋白酶是切断蛋白质中的肤键的酶，在动物、植物、微生物中广泛存 在。
[0060]具体来说，从工序（1)中发生醋化反应而得到的含磯脂反应溶液中利用有机溶剂 萃取磯脂，从萃取溶剂中蒸觸除去溶剂，优选向将利用丙丽等溶剂除去了脂肪酸的含磯脂 组合物分散于水中的含磯脂水溶液（酸性的水溶液）中添加酸性蛋白酶，优选保持在规定 温度并揽拌0. 5?48小时来发生酶反应。若反应时间短于0. 5小时，则存在磯脂酶A2活 性降低效果小的情况，若长于48小时，则存在磯脂劣化、或磯脂凝集、或蛋白酶失活等而磯 脂酶A2活性降低效果令人头疼的情况。上述规定温度可W是酶的最适温度，为了防止磯脂 的劣化优选不超过6(TC的温度。作为酸性蛋白酶，可W举出例如，来自动物的胃蛋白酶、来 自Aspergillusniger的酸性蛋白酶等。酸性蛋白酶的添加量相对于每含磯脂溶液100重 量份优选为0. 1?10重量份。
[006。工序似一2可W在使用酸性蛋白酶的处理后结束，但优选在使用酸性蛋白酶的 处理后，继续将含磯脂溶液的抑中和到4. 0?8. 0,并向其中添加中性蛋白酶。更优选将含 磯脂溶液的抑中和到5. 0?7. 0,并向其中添加中性蛋白酶。优选在添加中性蛋白酶后， 保持在规定温度并揽拌0. 5?48小时来发生酶反应。若反应时间短于0. 5小时，则存在磯 脂酶A2活性降低效果小的情况，若长于48小时，则存在磯脂劣化、或磯脂凝集、或蛋白酶失 活等而磯脂酶A2活性降低效果令人头疼的情况。上述规定温度可W是酶的最适温度，为 了防止磯脂的劣化优选不超过6(TC的温度。作为中性蛋白酶，可W举出来自Aspergillus 化yzae、来自BacillusSubtilis等。中性蛋白酶的添加量相对于每含磯脂溶液100重量 份优选为0. 1?10重量份。
[0062] 可W在利用酸性蛋白酶的酶反应、或利用酸性蛋白酶及中性蛋白酶的酶反应结束 后，相对于含磯脂水溶液100重量份，添加10?200重量份的溶解磯脂且不与水混溶的溶 剂（例如己焼等）并进行揽拌，分取上层（溶剂层），从该层除去溶剂而萃取磯脂。在含磯 脂水溶液的粘度变高等、而难W仅凭上述溶剂萃取磯脂的情况下，有时进一步加入己醇等 与水混溶的醇溶剂从而提高萃取效率。在加入醇溶剂的情况下，优选相对于含磯脂水溶液 100重量份加入10?100重量份。通过W上的处理而得的磯脂中的磯脂酶A2活性大幅降 低。
[0063] 在上述中，从上层除去溶剂后，优选用丙丽洗涂磯脂。通过丙丽洗涂，能够除去残 留的水分、因水解而游离的脂肪酸等。
[0064]在工序似一2之后，磯脂中的磯脂酶A2活性越低越化优选为lOU/g(磯脂）W下，更优选为lU/gW下。若高于lOU/g，则存在工序（1)中键合于磯脂的高度不饱和脂肪酸 过度脱离的情况。
[0065] <磯脂酶A2活性的测定方法>
[0066]本发明中的磯脂中的磯脂酶A2活性的测定方法如下。首先，在脱脂大豆卵磯脂6g中加入蒸觸水400mL在室温下揽拌30分钟。在该脱脂大豆卵磯脂溶液中，加入将脱氧胆酸 轴0. 7g及氯化巧二水合物0. 5g溶于水110血的溶液，边用冰浴冷却边W8000巧m均化15 分钟。将得到的溶液作为活性测定溶液。将活性测定溶液20mL称取至50mL的样品瓶中， 加入IM氨氧化轴水溶液将抑调整到8. 0。将作为测定对象的磯脂样品20mg分散于ImL的 蒸觸水中，将该溶液加入调整到抑8. 0的活性测定溶液中，再次将抑调整到8. 0,测定为了 将抑保持在8. 0所需的20mM氨氧化轴溶液的每1分钟的滴定量。利用预先用酶标准溶液 制作的标准曲线，算出磯脂中的PLA2活性。
[0067] < 工序（3) >
[006引将工序似中得到的磯脂或市售的磯脂与丝氨酸进行混合，在磯脂酶D(W下也称PLD)的存在下，进行碱交换反应，在磯酸基上键合丝氨酸。由此，形成包含磯脂醜丝氨酸的 含磯脂组合物。作为上述碱交换反应，有W溶解磯脂的有机溶剂与溶解丝氨酸、磯脂酶D的 水的二层系来实施的方法、或者仅W水来实施的方法等，可W采用任意方法，但从磯脂的溶 解性的观点出发，优选W二层系实施的方法。
[0069] 具体来说，展示W二层系实施的方法。首先，制备溶解了工序（2)中得到的磯脂或 市售的磯脂的有机溶剂溶液。另外，预先制备溶解了丝氨酸及磯脂酶D的水。然后将它们 混合，优选在20?55C的温度下按照不发生层分离的方式强力揽拌0. 5?48小时而使其 反应。若在低于2(TC的温度下使其反应，则存在反应效率差的情况，若在高于55C的温度 下使其反应，则存在磯脂酶D失活的情况。另外，若反应时间少于0. 5小时，则存在反应效 率差的情况，若反应时间超过48小时，则存在水解等副反应进行的情况。
[0070] 工序做中使用的有机溶剂的种类没有特别要求，可W使用例如己焼、丙丽、己酸 己醋等。在并用己焼和丙丽的情况下，优选将己焼/丙丽（体积比）设为20/1?1/1。若 己焼/丙丽（体积比）大于20,则存在与水的混溶性变差而反应效率变差的情况，若己焼/ 丙丽（体积比）小于1，则存在磯脂的溶解变差而反应效率变差的情况。
[0071]有机溶剂的量若为磯脂充分溶解的量则没有问题，但相对于磯脂100重量份，优 选使用500?20000重量份。若有机溶剂的量少于500重量份，则存在磯脂的溶解不充分 而反应效率变差的情况，若有机溶剂的量多于20000重量份，则存在溶剂的使用量多而回 收等的成本过度增加的情况。
[0072]对于水的量，若为能够与溶剂混溶并高效地揽拌的量即可，但相对于溶剂100重 量份优选使用10?1000重量份。若水的量少于10重量份，则存在丝氨酸、酶的溶解不充 分因而反应效率降低的情况，若水的量多于1000重量份，则存在基于磯脂酶D的水解占优 势而反应效率降低的情况。
[0073] 关于丝氨酸的量，与所使用的水的量等相关，但相对于磯脂100重量份优选使用 50?5000重量份。若丝氨酸的量少于50重量份，则存在反应效率降低的情况，若丝氨酸的 量多于5000重量份，则存在成本过度增加的情况。
[0074] 本发明的磯脂酶D是用于交换键合于磯脂中的磯酸基上的氨基的酶，可W举出 来自洋白菜等植物的磯脂酶、来自植物中的花生等豆类的磯脂酶、来自Actinoma化ra属、Str巧tomyces属等微生物的磯脂酶。关于磯脂酶D的量，优选按照每Ig磯脂为20?IOOOU 左右的方式使用，若磯脂酶D的量少于20U，则存在反应效率降低的情况，若磯脂酶D的量超 过1000U，则存在成本过度增加的情况。
[00巧] < 工序（4) >
[0076] 分离在工序（3)中形成的包含磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物。
[0077]W二层系实施工序（3)的情况下，若在反应结束后停止揽拌，则含有磯脂醜丝氨 酸的含磯脂组合物转移至有机溶剂层，因此，在回收有机溶剂层后，通过水洗来除去酶，然 后进行浓缩。然后，优选用丙丽洗涂，再进行干燥，由此能够得到包含磯脂醜丝氨酸的精制 的含磯脂组合物。
[007引另外，仅W水来实施工序（3)的情况下，在反应结束后，例如可W通过W下方式回 收该组合物；（1)相对于水100重量份，添加己焼等有机溶剂25?200重量份，充分揽拌 后，将含有磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物转移至有机溶剂层，回收有机溶剂层后，通过水洗 来除去酶，然后进行浓缩；或者（2)对从水层析出的含有磯脂醜丝氨酸的含磯脂组合物进 行过滤。回收后，优选用丙丽洗涂，再进行干燥，由此能够得到含有磯脂醜丝氨酸的精制的 含磯脂组合物。
[0079]W上，对于按照工序（1)、工序（2)、工序（3)、及工序（4)的顺序进行本发明的制 造方法的情况进行了说明。但是，本发明并不限于该顺序，根据其它方式，本发明还可W按 照工序（3)、工序（4)、工序（1)、工序（2)的顺序来实施。该种情况下，在工序（4)之后，使 PLA2作用于工序（4)中得到的磯脂，从而将键合于磯脂的2位的脂肪酸水解而得到溶血磯 脂即可。使用该溶血磯脂实施工序（1)。而且，在工序（2)中使PLA2活性降低而得到的磯 脂相当于作为目标生成物的大量包含磯脂醜丝氨酸和高度不饱和脂肪酸的含磯脂组合物。 另外，如上所述在工序（3)中，将转移有含磯脂组合物的有机溶剂层回收后，可W通过水洗 来除去酶，因此若不考虑成本增加，也可W按照工序（3)、（1)、（2)、（4)的顺序来实施本发 明的制造方法。
[0080] 按照工序（3)、工序（4)、工序（1)、工序似的顺序实施的方式中，为了在工序（1) 中抑制水解反应进行，优选在不过度抑制醋化反应的反应速度的范围内，降低工序（1)的 醋化反应的体系中所含水分量。因此，优选在减压下实施工序（1)中的醋化反应，并预先降 低原料中所含水分量。
[0081] 本发明的含磯脂组合物的制造方法能够适宜地用于制造食用、饲料用的含磯脂组 合物。为此，在制造过程中也不使用不适合食用的原料、甲苯、甲醜胺等溶剂等即可。另外， 本发明的含磯脂组合物可W适宜地用作高机能的食用或饲料用磯脂。此时，可W添加在食 品中，也可W直接摄取。
[00的]实施例
[0083]W下示出实施例，更具体地说明本发明，但本发明并不限于该些实施例。需要说明 的是，实施例中"份％ "为重量基准。
[0084] <含磯脂组合物的脂肪酸组成的分析>
[00财将实施例、比较例中得到的含磯脂组合物IOmg溶于异辛焼2mL，加入0. 2M甲醇轴 的甲醇溶液ImU边在60°C揽拌边加热10分钟。用己酸进行中和，加入水后回收上层的异 辛焼层，用气相色谱仪进行分析。此时，作为气相色谱仪，使用了安捷伦公司制"5890系列 II"。作为柱，使用安捷伦公司制"DB- 23"(长度30m、内径0. 25mm、膜厚0.25ym)，在注 入口温度；26(TC、检测温度；26(TC、炉温度；20(TC固定的条件下进行分析。
[008引（实施例1)
[0087]进行W下的工序（1)?（4)，得到含磯脂组合物。
[008引（工序（1))键合有高度不饱和脂肪酸的磯脂的制作
[0089] 向IL的玻璃制反应容器注入甘油（阪本药品公司制）；200g，向其中加入溶血磯 脂〇'3山1OilMilleCo. ,Ltd.制"5口^_'卡7U：/，，、溶血磯脂醜胆碱含量规格；18? 30 重量％) ;15g、磯脂酶A2(SanyoFineCo. ,Ltd.制"Lysonase"、活性；5 万U/g) ;6g、含 有DHA的甘油H醋（CrodaJapan"INCR0MEGADHA-J46"、DHA含量；49. 7 重量％ )、利用 常规方法碱水解的脂肪酸；6g、甘氨酸；6g、丙氨酸；6g、W及2M氯化巧水溶液；2mU边进行 揽拌边在300Pa的减压下，在5(TC反应24小时。
[0090](工序（2))降低了磯脂酶A2活性的磯脂的回收
[0091] 在工序（1)的反应结束后，加入己醇；100血、己焼；100血而形成甘油溶液层和有 机溶剂层该两层。从中回收作为上层的有机溶剂层，蒸觸除去溶剂而得到含磯脂回收物 15g。向该回收物中加入丙丽；50mL充分混合，回收在(TC冷却1小时而得到的沉淀，得到含 磯脂组合物lOg。该含磯脂组合物中残留的PLA2的活性为75U/g。另外，磯脂中的脂肪酸 组成内，DHA的含量为16. 5重量％。
[009引向甘油；50g中，加入2M氯化巧水溶液；10血、饱和氯化轴水溶液=IOmL,在300Pa的减压下，在6(TC除去水分30分钟，从而制备了甘油溶液。向该甘油溶液中，加入上述得到 的含磯脂回收物；lOg、己焼；50血及己醇；50血，在5(TC揽拌1小时。揽拌结束后，经过静 置回收上层（有机溶剂层），从该层蒸觸除去溶剂后，加入丙丽；50mL在OC静置1小时，回 收含磯脂组合物的沉淀。回收的含磯脂组合物中的PLA2残留活性示于表1。
[0093] [表1]
[0094] (PLA2活性单位；U/g、含量单位；重量％ )
[0095]

【权利要求】
1. 一种含磷脂组合物的制造方法，其是含磷脂组合物整体中含有10重量％以上的磷 脂酰丝氨酸、且构成脂肪酸整体中高度不饱和脂肪酸的含量为10?40重量％的含磷脂组 合物的制造方法，包括以下的工序（1)、⑵及工序（3)、（4)， 工序（1):通过磷脂酶A2即PLA2,进行溶血磷脂与高度不饱和脂肪酸的酯化反应，得到 憐脂； 工序⑵：在工序⑴之后，使憐脂中的PLA2活性为10U/g憐脂以下； 工序（3):在磷脂酶D即PLD的存在下，进行磷脂与丝氨酸的混合物中的碱交换反应， 形成包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物； 工序（4):将包含磷脂酰丝氨酸的含磷脂组合物分离。
2. 如权利要求1所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于， 在所述工序（2)中从磷脂中除去PLA2和/或在所述工序（2)中使磷脂中的PLA2失活。
3. 如权利要求2所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于， 在工序⑵中，在工序⑴之后，向磷脂中添加无机盐的甘油溶液、碳数4以下的醇、以 及不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂，搅拌后静置，形成包含磷脂的有机溶剂层和包含 PLA2的甘油溶液层，将该有机溶剂层从该甘油溶液层分离，由此从磷脂中除去PLA2。
4. 如权利要求2所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于， 在工序⑵中，在工序⑴之后，向磷脂中添加酸性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失活。
5. 如权利要求4所述的含磷脂组合物的制造方法，其特征在于， 用酸性蛋白酶处理磷脂后，进一步向该磷脂中添加中性蛋白酶，使磷脂中的PLA2失 活。
6. 如权利要求1?5中任一项所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 高度不饱和脂肪酸为DHA。
7. 如权利要求1?6中任一项所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 溶血磷脂为来自植物或蛋黄的溶血卵磷脂。
8. 如权利要求7所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 溶血磷脂为来自大豆的溶血卵磷脂。
9. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 无机盐的甘油溶液中的水分量为10重量％以下。
10. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 不与甘油混溶且溶解磷脂的有机溶剂是碳数为5?8的烃溶剂和/或醚。
11. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 甘油溶液中的无机盐浓度为〇. 2?40重量％。
12. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 无机盐为选自由硫酸锌、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠及氯化钙构成的组的至少1 种。
13. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 有机溶剂为己烷。
14. 如权利要求3所述的含磷脂组合物的制造方法，其中， 碳数4以下的醇为乙醇。
15. -种含磷脂组合物，其是以来自植物的磷脂、或来自植物及来自蛋黄的磷脂为原料 而合成的含磷脂组合物，其中， 含有10重量％以上的磷脂酰丝氨酸，构成脂肪酸整体中DHA的含量为10?40重量％ 且亚油酸的含量为15?40重量％。
【文档编号】C12P7/64GK104379757SQ201380031182
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2012年6月13日
【发明者】重枝麻由美, 田中立志, 井上良计 申请人:株式会社钟化