包括d-普萘洛尔和其类似物的磷脂酸磷酸水解酶（pap）的抑制剂，单独或与地昔帕明组合 ...的制作方法
【专利摘要】本发明描述了可抑制磷脂酸磷酸水解酶（PAP）的化合物及它们的组合用于配制可用于治疗癌症的药物的用途；PAP抑制剂可以用于阻断依赖于表皮生长因子受体（EGFR）、其致癌变体和ErbB家族的其他成员的癌症的发展，这是通过诱导其胞吞作用并因此使得它们不能接触可促进癌症存活和发展的刺激而进行；作为本发明一部分的PAP抑制剂包括这样的药物：其目前用于其他临床目的，并且除了是阳离子两亲性分子外，它们是不相关的；这些包括普萘洛尔、地昔帕明和氯丙嗪，用于其他临床目的的药物；本发明包括所有PAP抑制剂，包括鞘氨醇和溴烯醇内酯以及任何在未来可能发现的新抑制剂。
【专利说明】包括D-普萘洛尔和其类似物的磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的抑制剂，单独或与地昔帕明组合用于治疗依赖于表皮生长因子受体(EGFR)、其致癌变体和ERBB/HER家族其他成员的癌症
[0001]本发明描述了抑制磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的化合物及其组合用于配制用于癌症治疗的药物的用途。
[0002]本发明提出使用PAP抑制剂以阻断癌症的发展，所述癌症依赖于表皮生长因子受体(EGFR)、其致癌变体和ErbB家族的其他成员，通过诱导它们的胞吞作用，从而使得它们不能接触可促进癌症维持和发展的细胞外刺激。
[0003]作为本发明一部分的PAP抑制剂是当前在临床上用于其他目的的药物，除了都对应于两亲性阳离子分子以外，它们是不相关的。这些包括普萘洛尔(propranolol)、地昔帕明(desipramine)和氯丙嗪，当前用于其他临床目的的药物。本发明包括了所有已知的PAP抑制剂，包括鞘氨醇和溴烯醇内酯。
[0004]本发明的一个具体实例对应于D-普萘洛尔，单独使用或与地昔帕明组合使用。D-普萘洛尔是用于治疗高血压和其他病状的与L-普萘洛尔的外消旋混合物的一部分。但是，仅L-普萘洛尔具有作为β -肾上腺素能受体的阻断剂(β -阻断剂)的活性，其产生抗高血压作用。本发明中包括的D-普萘洛尔没有β-阻断剂活性。
[0005]本发明证明了，D-普萘洛尔与地昔帕明的组合可用于抑制依赖于EGFR或其致癌变体(例如EGFRvIII)的癌症的发展。
[0006]因此，本发明提供了用于其他临床目的的已知药物的第二用途，还包括任何其他种类的PAP抑制剂，例如 缺乏β_阻断剂活性的普萘洛尔的类似物。PAP的任何抑制剂可以单独使用，或者与其他PAP抑制剂或具有不同作用机制的抗肿瘤药物(包括激素、抗体和用于化疗的药物)组合使用。
[0007]本发明的PAP抑制剂还可与其他种类的治疗(包括外科手术和放射疗法)组合使用，同时地或在其之后。这些化合物不仅作为化疗或直接定向阻断EGFR及其致癌变体的药物的补充剂，还可在癌细胞已经产生对当前用于抗EGFR的药物的抗性时作为唯一可用的治疗。
[0008]本发明开辟了治疗癌症的新的可能性，所述癌症例如头颈癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和和胶质母细胞瘤，其中经常发现EGFR的致癌性改变(过表达或突变)或其家族成员ErbB2/Neu。
【技术领域】
[0009]本发明包括如下领域:
[0010]I)癌细胞生物学，其在癌症的致病性中是决定性的，经常涉及EGFR及其酪氨酸激酶受体(ErbB/HER)家族的成员的致癌信号传导功能。这种改变增强了肿瘤细胞的进攻性和恶性并且对于它们的生长、生存和发展也是关键的，从而为设计新的抗癌策略提供了有效的靶点，如本发明所提出的；[0011]2)胞吞运输的调节，其在EGFR及其ErbB/HERl-4家族的其他成员的正常和致病功能中起关键作用；
[0012]3)PA/PKA (磷脂酸/蛋白激酶A)信号传导途径的功能，其几乎是未知的，直到出现本发明的论证，其涉及调节EGFR对外部刺激的可及性。PA/PKA信号传导途径的这种新功能组成本发明的基础。
[0013]4)PAP抑制剂用于治疗癌症的用途。这在以前没有提出过。
[0014]5)已知的并且已经基于不用于PAP抑制的作用机制用于其他临床目的的药物的第二用途。例如，普萘洛尔是L-普萘洛尔和D-普萘洛尔的外消旋混合物，其中仅L-普萘洛尔是β_肾上腺素能受体的非选择性阻断剂并具有治疗高血压、心律失常等的效果。另一个实例是地昔帕明，其当前用作去甲肾上腺素重捕获的阻断剂和毒蕈碱胆碱能受体的抑制剂，被开处方用于抗抑郁治疗。
[0015]本发明的基础在于所有这些领域的相互关系，并归因于最近的发现，所述最近的发现是关于ΡΑ/ΡΚΑ信号传导途径的新功能以及EGFR的细胞表面水平的新调节机制，其对用于诱导EGFR胞吞作用的药理操作是敏感的，从而使所述受体不能被其外部刺激激活。
[0016]因此本发明在于，PAP抑制剂(例如D-普萘洛尔和地昔帕明，原来不是设计用于所述目的的药物)可潜在地用于设计新的抗癌治疗。这种策略之前没有用过。
[0017]本发明的优点
[0018]本发明提出了一种与当前用于干涉EGFR依赖性癌症的发展的那些策略不同的策略。当前使用的药物和那些处在设计阶段的药物都是针对EGFR分子，试图阻断其与外部配体的相互作用或其细胞内的酪氨酸激酶结构域，其为致癌信号的产生者。相比之下，本发明提出的化合物并不使用EGF R分子为直接靶点，而是以调节其细胞表面可及性的分子为靶点。
[0019]这适合当前靶向治疗的趋势，所述靶向治疗主要涉及消除癌细胞中改变的多种信号传导途径。本发明提出阻断PAP活性，以此作为通过诱导胞吞作用从细胞表面除去EGFR的策略。
[0020]另一个优点是具有PAP抑制能力的已知结构的几种分子的可用性，因此其可作为模型用于产生新的抗癌类似物家族，引入之前未用于该目的的作用机制的。
[0021]一个另外的重要优点是对不同类型癌症的治疗的选择性，其中本发明使用了涉及以EGFR的致癌功能作为靶点的特定方法。这提供了根据肿瘤中存在的分子损害来使所述治疗个性化的机会，对所述分子损害的分析是已知的并可使得人们能够优化本发明的化合物在癌症中的应用以具有更高的反应概率。将应用限制到呈现出EGFR的致癌性改变的癌症，具有明显的经济优势。
[0022]最后，本发明的化合物作用于不直接参与致癌作用的分子的事实，可延迟或避免形成对所述治疗的抗性——这对于直接靶向致癌激酶的药物是很常见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:普萘洛尔和地昔帕明在所培养的肿瘤细胞中诱导EGFR的胞吞作用。该图像示出了 HeLa对照细胞中EGFR的免疫荧光图案，以及给予75 μ M普萘洛尔或75 μ M地昔帕明、50 μ M美托洛尔(metoprolol)和50 μ M噻吗洛尔(timolol)时的图案。[0024]图2:对映异构体L-和D-普萘洛尔以及地昔帕明降低了 EGFR的细胞表面可及性(通过放射性配体结合评估)。A.L-和D-普萘洛尔；B.地昔帕明；C.不同浓度的D-普萘洛尔(上面刻度)与地昔帕明(下面刻度)的组合；D.D-普萘洛尔和地昔帕明的EC5tl的组合。
[0025]图3:胶质母细胞瘤细胞U87以及被转染以过表达致癌突变体EGFRvIII的U87(U87-EGFRvIII)作为具有不同增殖速率的肿瘤模型。
[0026]图4:作为不连续治疗加入的D-普萘洛尔和地昔帕明对胶质母细胞瘤细胞U87和U87-EGFRvIII以及非肿瘤上皮细胞MDCK的生存力的作用。
[0027]图5:在过表达EGFR的胶质母细胞瘤(GBMl)的原代培养物中，使用低浓度的D-普萘洛尔(Prop)和地昔帕明(Des)的连续治疗选择性地抑制U87-EGFRvIII和肿瘤细胞的过度增殖(D-普萘洛尔(Prop)、地昔帕明(Des)或这两种药物的组合)。
[0028]图6:在来自患有过表达EGFR的胶质母细胞瘤(GBM1)的患者的原代培养物中，使用两种浓度(10和30 μ Μ，与心律失常的患者血液中发现的接近)的D-普萘洛尔(单独使用或与I μ M地昔帕明组合使用)进行的连续治疗，选择性地抑制不同癌细胞系和肿瘤细胞的增殖(D-普萘洛尔(Prop)、地昔帕明(Des)或这两种药物的组合)。
[0029]图7:用于EGFR-依赖性癌症的新治疗策略，其基于D-普萘洛尔和地昔帕明的作用。
【背景技术】
[0030]作为健康问题的癌症
[0031]癌症包括一组由异常细胞的不受控制的侵袭性生长造成的疾病，在没有有效的治疗的情况下其可以在相对短时间内导致患者死亡(〈12个月或在最恶性的病例中甚至在5-9个月内)。因此，癌症因其频率和死亡率成为世界上严重的公共卫生问题。
[0032]女性最常见的癌症为乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌和肺癌，而男性中最常见的癌症为肺癌、前列腺癌、胃癌和结肠直肠癌(1、2)。作为一种死亡原因,癌症在世界上占据心血管疾病和传染病之后的第三位，但仅考虑发达国家时其通常为第二大死亡原因(1、2)。在2002年当年患有某种癌症的2460万患病病例中，有1090万新病例和670万例死亡(3796000例男性，2928000例女性)(I)。其中导致最多死亡的癌症为肺癌(1179000例死亡)、胃癌(700000 )、肝癌(598000 )和结肠直肠癌(528000 )，5年存活率低于20%的恶性程度最闻的癌症为肺癌、食管癌、胃癌、肝癌和胶质母细胞瘤(1-3)。
[0033]在智利癌症患者的发病率和存活率无法准确知道。每年有近350000例住院并发生约140万例癌症死亡。在过去的40年里，死亡率已经从每100000名居民中86例增加至123例(截至2000年)，估计每年有36500例新病例(MINSAL, 2005; (4)。
[0034]当前治疗通常不能有效对抗高度恶性的晚期癌症
[0035]癌症治疗包括切除手术、辐射、化疗、激素疗法、生物疗法和靶向疗法，靶向疗法产生了治疗高致死率癌症的新的期望，并且对化疗的反应相对较低。癌症是全世界一个主要死亡原因，反映了现有治疗对恶性及较晚期的病例效能较低。每年诊断出多于1000万病例并且约600万人死于此病。由于人口增加、预期寿命延长(暗示着老龄化)和更多地暴露于风险因素，这些数字在未来会逐渐地增加。估计在接下来20年中新病例的数目甚至可增加50%，到2020年达到1500万。在工业化国家中四分之一的人会死于癌症(2、5)。[0036]新的抗癌药物可以增加一些癌症中的反应率和总体存活率，但是仍然有多种癌症维持高水平的恶性和死亡率。癌症例如肺癌、胃癌和胶质母细胞瘤，其5年存活率低于20%且在诊断后9个月内具有较高死亡率，明显需要新的治疗策略。
[0037]肺癌
[0038]全部癌症死亡中的约30%是由于肺癌——世界范围内癌症死亡的主要原因(6)。约90%的肺癌是由于影响世界上约13亿人的吸烟，其每年杀死约500万年龄为30岁以上的人(7)。在智利，肺癌在男性(100000名居民中25.3对比17)和女性(100000名居民中
13.8对比7.4)中的发病率均低于胃癌，并且在女性中低于胆道癌(100000名居民中17.1对比 7.4) (4)。
[0039]非小细胞肺癌(NSCLC)是具有高死亡风险的晚期恶性肿瘤之一。如果不进行治疗，患有NSCLC和有转移灶的患者的中位生存期为4-5个月。仅10%的患者能活过I年。对于晚期或转移的NSCLC,标准的第一线治疗是基于化疗与二钼复合物(platinum-duplex)的组合，其使中位生存期增加至8-11个月，一年生存率增加至约30%，两年生存率增加至约14-20% (8)。
[0040]胃癌
[0041]胃癌是最常见的上皮衍生癌症之一(9)。其发病率在过去的50年里一直在下降，但其发病频率仍然位居第四，作为死亡原因之一排在肺癌后位居第二，并且在性别和种群之间有显著差异。每年诊断出约100万新病例，并且有约800000人死于该原因。在智利，胃癌发病率在男性中排名第一 ，比例为每100000名居民中25.3 ;在女性中排在胶质母细胞瘤之后位居第二，比例为每100000名居民13.8(4，10)。在最近这些年，智利每年的胃癌死亡率保持稳定，在2003年达到3115例死亡(11)。具有原位癌(localized cancer)的患者的5年存活率接近60%，然而具有转移灶的患者的仅为2% (12)。在晚期疾病的情况中，如果不进行治疗，中位生存期低于12个月(经常仅5.4个月)。新的化疗方式已经不能使中位生存期更低，所述中位生存期在过去的10-20年里基本没有改变。对于这种癌症没有已确立的化学疗法(13-15)。
[0042]胶质母细胞瘤:
[0043]“胶质瘤”包括所有被假定具有神经胶质细胞起源的肿瘤，并且它们是中枢神经系统中最常见的肿瘤。III级(间变性星形细胞瘤)和IV级(胶质母细胞瘤)被认为是恶性胶质瘤(3)。胶质母细胞瘤具有每年3/100，000人的频率，它们属于所有人类癌症中最致命的肿瘤。胶质母细胞瘤的中位生存期在数十年中一直维持在约9-12个月。65岁以上的患者仅2%并且45岁以下患者中30%可以生存2年，然而约75%在诊断后18个月死亡(16、17)。侵袭性特征和对标准治疗(包括放疗和化疗)的弱反应造成了差的预后(18)。目前的放疗并同时给予替莫唑胺(temozolomide),然后给予辅药替莫唑胺的治疗,使12.1个月的中位生存期增加至仅14.6个月(19)。在智利，Lorenzoni et al (20)证明了患者的存活率与在其他具有更尖端的诊断和外科系统以及最好的现代技术的国家中报告的存活率没有不同。因此，获得更好的治疗结果的可能性不依赖于诊断或外科能力。
[0044]使用特定分子靶点的癌症治疗
[0045]细胞和分子水平上对癌症的知识的增加开辟了新的治疗预期，其定位于特定分子靶点并根据致癌病变将所述方法个性化。[0046]癌细胞源自遗传损伤，获得了偏离正常细胞行为的新性质。通常，三种类型基因的变化可导致肿瘤发生:(i)致癌基因，(ii)肿瘤抑制基因；和(iii)涉及遗传稳定性的基因(21、22)。这些基因中的改变导致获得恶性表型，所述恶性表型的特征在于以下异常性质:1)增殖信号的自给自足；2)对抗增殖信号不敏感；3)避免程序性细胞死亡(细胞凋亡)；4)无限的复制潜能；5)持续的血管发生；6)组织侵入和转移(22)。
[0047]尽管有所有这些异常性质，癌细胞确实“依赖”于特定的内部信号网络的高活性。幸运的是，这可用于使用药物对抗其恶性，所述药物被特别设计以抑制对应的高活性网络(23-26)。可以最小的继发效应获得最大的益处，只要每种肿瘤中支持所述高活性信号网络的改变的基因易于被鉴定(27)。对于某些关键信号传导途径来说，遗传病变的鉴定是相对先进的，因此允许个性化对特定靶点的药物使用，无论是作为第一线还是与化疗组合(28)。
[0048]现在的趋势和广泛共识是需要基于对关键遗传病变，以及将癌细胞与正常细胞区分开的经常改变的分子和生化过程的知识，使癌症治疗个性化(21) (22)。
[0049]激酶作为直接治疗的通常靶点
[0050]大多数的治疗是靶向在信号转导系统中起关键作用的蛋白激酶。
[0051]因其在肿瘤细胞的增殖、生存、迁移和转移过程中的重要性而被识别的获得最多研究的分子当然是具有使丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶活性的酶。这些酶及其直接的调节子是导致肿瘤的基因(癌基因)或抑制肿瘤的基因(抗癌基因)，所述基因在大多数癌症中经常被突变(29)。实例包括致癌基因分子PI3KCA、EGFR和B-RAF;激活PI3K和Raf的Ras致癌基因家族；以及抑制PI3K信号传导的肿瘤抑制子PTEN (29)。
[0052]激酶抑制剂已经改善了对所选择组的癌症的治疗，但是抗激酶药物尚未显示出对致死率癌症的预期效能(29)。此外，开始时受益亚组通常会在相对较短的时间内复发。肿瘤细胞由于使其具有抗性的分子靶中的消除突变而逃脱激酶抑制剂的作用。因此需要寻找其他的不同于直接抑制所述酶本身的策略。
[0053]EGFR 激酶
[0054]EGFR是控制着在恶性肿瘤表型的形成和维持中起关键作用的细胞过程的酪氨酸激酶的范例。
[0055]EGFR 是由 HERl/EGFR/ErBBl/、HER2/Neu/ErBB2、HER3/ErBB3 和 HER4/ErBB4 组成的受体酪氨酸激酶家族的成员。这些受体跨膜一次，并因此展示出与配体相互作用的细胞外结构域和载有酪氨酸激酶结构域的细胞内结构域(30)。其主要位于质膜内，在此其在与特异性配体刺激物相互作用时被激活，这首先导致其二聚化，然后是其细胞内酪氨酸激酶的激活。
[0056]因此起始了调节细胞增殖、生存和迁移过程的信号传导途径，这些途径全部涉及肿瘤发生。EGFR是这些过程的最普遍的受体调节剂之一，并可被至少七个不同配体(包括EGF、HB-EGF和经常由肿瘤细胞分泌的肿瘤生长因子a (TGF-α ))激活(31 )。EGFR还被多种其他受体(特别是与GTP酶偶联的受体)的刺激物反式激活(trans-activated) (32)。本发明人的实验室已经揭示，一个由包括ATP的核苷酸组成的非常普遍存在的调节系统，和P2Y1受体能够反式激活EGFR (33)。
[0057]因此，EGFR功能必须处在严格的控制系统之下，这些系统失效或所述受体自身改变可确定夸大的信号并且导致或伴随有可产生并支持癌细胞的细胞致癌性转化(23，30)。[0058]这些受体主要发现于细胞表面，在此它们接受并编译(interpret)调节增殖、迁移和细胞生存过程的刺激；所有这些在癌症的发病机制中都是关键的。因此，能够诱发从细胞表面向细胞内小室的受体内摄的药物将通过改变其位置阻止其与外界刺激的相互作用以及致癌信号传导。在这些条件下，来源自活化EGFR的信号会被改变，并且对肿瘤细胞具有毒性。
[0059]EGFR功能的改变
[0060]EGFR的功能改变是频繁的并且在多种实体癌的发病机制中起关键作用。
[0061]考虑到许多实体癌中该EGFR受体有改变的且致癌的功能，EGFR已经是作为新一代的抗癌药物靶点而被研究最多且最有前景的分子之一(34) (27) (35)。最频繁的改变包括过表达(36、37)或源自基因重排或特定氨基酸的替换的突变(38-40)。当EGFR的功能因过表达或激活的突变而被改变时，向细胞内发出的信号被夸大，导致肿瘤细胞的形成、维持和侵袭(34)。
[0062]差不多40-50%的实体瘤依赖于由遗传改变决定的EGFR酪氨酸激酶的活性剧增。EGFR遗传改变的详细列举包括:(i)导致所述蛋白过表达的EGFR基因拷贝数目的增加。胶质瘤和肺肿瘤经常显示出这种基因扩增(36、37)。但是如在胃癌中观察到的，存在其他没有基因扩增的未知的EGFR过表达机制(13、14)。EGFR过表达通常与较高的恶性有关；(ii)产生高活性EGFR的突变；a)通过删除产生的EGFRvIII突变体缺少符合所述配体结合结构域的细胞外区域，这在胶质母细胞瘤中是最重要的(40) ；b)其中亮氨酸858被替换为精氨酸的EGFR185*?突变体以及除去了保守性序列LREA的缺失了外显子19的EGFRme746_A75°突变体，两种突变都影响所述受体的酪氨酸激酶结构域(EGFRTKDmut)，并可见于10-15%的非小细胞肺癌(NSCLC)中(38、39)。
[0063]认为肿瘤细胞确实依赖于由EGFR发出的夸大的信号(致癌性的)。通过抑制这种活性，癌细胞受到比正常细胞更多的损害。因此干扰EGFR的这种致癌功能已经成为开发直接针对特定靶点的新的药物和抗肿瘤治疗策略的范例(24、41)。通过相对简单的分析来检测EGFR中的致癌变化，可以个性化这些治疗。其可以优化治疗反应。
[0064]当前使用的针对EGFR的用于治疗某些癌症的药物
[0065]在20世纪80年代开发的被FDA批准的首批抗EGFR药物包括两种类型的拮抗剂
(35): (i)抑制配体结合的针对EGFR细胞外区域的单克隆抗体(西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab))。西妥昔单抗(erbitux ;Merk KGaA, Darmstad, Germany ；W02009099649)是以高亲和力结合EGFR并竞争性阻断配体结合的人源化单克隆抗体。其还诱导EGFR的胞吞作用和负调控。其主要用于治疗表达EGFR的晚期结肠直肠癌(42、43) ；(ii)抑制EGFR的酪氨酸激酶的小分子，例如埃罗替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefitinib) (35) (W003103676和W02005117887)。这些药物与ATP竞争结合到酪氨酸激酶结构域，从而抑制EGFR底物的磷酸化，所述磷酸化对于起始促进过度增殖的信号级联是至关重要的。酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗转移性的NSCLC和结肠癌、头颈癌以及胰腺癌(28、35)。
[0066]抑制EGFR功能的抗肿瘤药物的其他专利包括W003097855、US5795898。
[0067]EGFR作为个性化治疗的靶点
[0068]因为EGFR是控制恶性细胞生长的细胞内信号传导途径的组成部分(23、30)，其已经成为用于个性化的和定向的癌症治疗的研究最多且最优选的靶点之一(35)。具有阳性结果的基于遗传病变的个性化治疗中两个最显著的实例为NSCLC和结肠癌，其中对EGFR致癌突变的分析帮助决定是否可便利地使用酪氨酸激酶抑制剂(44-46)。
[0069]在NSCLC中，仅10-20%的患者对埃罗替尼或吉非替尼有反应，显著改善了总体存活率、无进展生存期、症状和生活质量(47、48)。抗EGFR抗体西妥昔单抗不太有效(49)。对埃罗替尼或吉非替尼有反应的患者亚群所患有的肿瘤在EGFR的酪氨酸激酶结构域中带有突变，所述突变不仅提供了致癌性质还使所述受体对所述药物敏感(39、50、51)。对埃罗替尼和吉非替尼治疗敏感的酪氨酸激酶结构域突变(EGFR?mut)中接近90%具有第858位的亮氨酸被替换为精氨酸的置换α858Κ;Ε6Ρ#858Κ)，或具有消除了保守序列LREA的外显子19中的缺失(delE746-A750;EGFRDel) (39)。这些突变似乎组成型地激活EGFR的酪氨酸激酶结构域，并增加其对埃罗替尼和吉非替尼的亲和力，这可以解释为对所述治疗有超敏感性
(39)。这些患者具有接近80-90%的反应率、约80%的一年存活率和可达28个月的中位生存期(44、45、52-54)。因此这些EGFRTKI)mut突变的典型化(typification)使得能够进行有效的个性化治疗。
[0070]可用的抗EGFR药物的限制
[0071]目前对抗EGFR的致癌功能的药物的主要限制是相对低的效能(因为很大比例不反应)和开始时敏感的肿瘤产生抗性。
[0072]已有证据显示EGFR是有前景的抗肿瘤祀点，但是使用当前使用的药物时有严重的限制性，这激励着研究用于干扰其功能的新的和补充性的策略(27、28)。
[0073]例如，对于那些患有不带对埃罗替尼或吉非替尼敏感的EGFR突变的NSCLC的患者(占了病例的差不多85-90%)，没有什么可为他们提供的。这也适用于其他对这类抑制剂不反应的癌症。此外，经常 观察到，甚至在那些开始时对埃罗替尼或吉非替尼有反应的敏感患者中，肿瘤生长会在6个月到2年的时间内恢复。几乎50%的这些耐药肿瘤展示出第二突变——将酪氨酸激酶结构域中的甲硫氨酸790替换为苏氨酸，这阻断了所述药物与ATP结合位点的相互作用。最近的研究报道了新的药物，其目前抑制EGFR T790M突变体(55)。但是，对所述新药物产生抗性的可能性仍然存在，因为这是激酶抑制剂的常见问题(29)。另一方面，仍有另50%的病例产生了抗性但是没有所述T790M突变，其中的机制仍然未知(56-58)。
[0074]总之，所述证据使得可以这样推断，EGFR是设计抗肿瘤药物的好的靶点，但必须找到不同于已经在用的那些机制的替代机制以阻断其致癌功能，这依靠配体结合或酪氨酸激酶活性的阻断剂(35)。
[0075]EGFR功能中的胞吞作用途径及作为抗肿瘤药物的靶点
[0076]胞吞作用途径在控制EGFR功能的多种机制中占有大的优势。配体结合诱导EGFR的快速胞吞。一旦被内化(internalized)，激活的受体可以再循环或进入溶酶体降解途径，从而在降解前有可变的和受控的信号传导时间(59、60)。因此，胞吞作用为减弱并隔开EGFR信号传导提供了受控的机制。因为这种重要作用，胞吞作用为旨在设计新的癌症疗法的针对EGFR功能的药物介入提供了好机会。事实上，基于单克隆抗体的治疗的抗肿瘤效果中的至少一部分被认为是依赖于对EGFR胞吞作用的诱导(61 )。但是，导致EGFR被从细胞表面除去的对EGFR胞吞作用的诱导之前没有被用作替代抗体小分子药物(small drug)的抗肿瘤策略，抗体经常在接触肿瘤内的癌细胞方面受到限制(61)。
[0077]本发明人最近描述了控制EGFR胞吞作用的新机制，其包括下调蛋白激酶A的磷脂酸磷酸水解酶(PAP)酶活性的信号传导途径(PA/PKA途径)。该机制可被对PAP的药理性抑制所触发，因为该酶将PA水解为甘油二酯。由对降解cAMP的磷酸二酯酶的PA依赖性激活所导致的PKA活性降低，是在利用PAP的小分子药物抑制剂诱导EGFR胞吞作用时的关键步骤。
【具体实施方式】
[0078]本发明描述了使用D-普萘洛尔(单独地或与地昔帕明组合地)抑制PAP作为新的策略，以阻断依赖于EGFR或其致癌变体的癌细胞的生长，这是通过诱导胞吞作用来介导的。
[0079]虽然文献中有普萘洛尔在癌症中的作用的研究，但是它们都是基于其β -阻断剂活性，并且基于这样的假设和相当有争议的观点，即应激促进表达β -肾上腺素能受体的癌细胞中的肿瘤发生。普萘洛尔(其表示D和L-普萘洛尔的外消旋混合物)已被用作β-阻断剂(即注重于其有效成分为L-普萘洛尔而不是D-普萘洛尔)，用于实验性地弱化表达β-肾上腺素能受体的癌细胞的肿瘤生长和转移。在这些实验中，普萘洛尔仅阻止β_肾上腺素能刺激，所述刺激被假定可促进在模仿应激状态下的肿瘤发生，这是相当有争议的观点(62、63)。国际公开文本W02006/017185描述了几种在体外展示出抗增殖作用的化合物，其中提到了地昔帕明。但是，该公开文本没有提到任何利用地昔帕明使所述作用最佳化的机制。另一方面，国际公开文本W02008/112297描述了酸性鞘磷脂酶的抑制剂，其中地昔帕明似乎作为类似的化合物，预测其可能具有抗癌效果，但是没有报道具体结果。
[0080]本发明的发明人已经公开了，作为L-和D-普萘洛尔的外消旋混合物的普萘洛尔诱导EGFR的胞吞作用，示出了包括ΡΑΡ抑制、ΡΑ增加和随后的4型磷酸二酯酶(PDE4)活性增加的机制，其导致cAMP水平降低和PKA活性降低(64)。这种新的控制系统给出了以下可能性:使用PA/PKA途径的不同酶(包括PAP)作为新的靶点以诱导EGFR胞吞作用并降低其恶性依赖于致癌性EGFR功能的肿瘤的生长。
[0081]本发明还基于以下额外的观察结果:1)D_普萘洛尔活性的对映异构体和地昔帕明均没有β_阻断剂活性，两者都被用作PAP的抑制剂以诱导EGFR胞吞作用；2)D-普萘洛尔和地昔帕明抑制表达EGFR的致癌性改变(包括EGFR过表达和EGFRvIII突变体)的癌细胞的增殖。这些药物的作用是选择性针对恶性细胞的，相对地不影响或很弱地影响非肿瘤细胞。它们的组合明显好于单独使用每种药物。
[0082]没有β -阻断剂活性的D-普萘洛尔及其类似物(单独地或与地昔帕明组合)可被用于补充基于化疗或EGFR抑制剂(例如西妥昔单抗、埃罗替尼和吉非替尼)的治疗，也可在已经对目前的抗EGFR治疗产生抗性时用作单独的治疗。
[0083]本发明开辟了治疗其恶性常常依赖于EGFR的致癌性改变(过表达和突变)或ErbB2的癌症的新的可能性，所述癌症包括结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、头颈癌、肝癌和和胶质母细胞瘤。
[0084]本发明的发明人之前已经证明，PKA抑制诱导了 EGFR的内化(internalization)
(65)。最近，他们证明了，通过抑制PAP酶活性(其将PA水解为甘油二酯)而实现的磷脂酸的增加，再现了 PKA抑制作用，在没有配体情况下也导致了 EGFR的内化。该机制包括，PA介导的4型磷酸二酯酶(PDE4)的激活，导致cAMP水平和PKA活性降低(64)。该PA/PDE4/cAMP/PKA信号传导途径之前已有记载，但是其功能仍然是未知的(66)。本发明人的结果表明，该PA/PDE4/cAMP/PKA信号传导途径可调节作用于所述受体胞吞作用和再循环的EGFR的细胞表面水平(64)。
[0085]可诱导EGFR胞吞作用的PA/PKA途径(64)可被作为PAP抑制剂的普萘洛尔或地昔帕明激活(66)，这是与这些药物的通常临床用途不同的用途。普萘洛尔临床上被用作β-肾上腺素能受体的非选择性阻断剂，用于治疗高血压。地昔帕明被用于阻断去甲肾上腺素的重捕获，并被开处方用于治疗抑郁。与其他两亲性阳离子化合物(包括氯丙嗪和鞘氨醇)类似，普萘洛尔和地昔帕明已被记载用于抑制ΡΑΡ活性(66-68)。该作用发生在较高浓度下(10-70 μ Μ)，远高于用于治疗高血压(普萘洛尔)或抑郁(地昔帕明)时它们的血液浓度。普萘洛尔因其ΡΑΡ抑制作用而被广泛用于研究许多细胞过程中的ΡΑ和DAG功能，所述细胞过程包括信号传导途径、蛋白运输或细胞骨架功能(69 )。 [0086]在ΡΑ参与的多种信号传导途径中，PDE4的激活被研究的较少。ΡΑ对TOE4的激活导致cAMP水平降低并因此导致PKA的活性降低——由普萘洛尔诱发的不依赖于其β -阻断剂作用的作用，以及由地昔帕明诱发的不依赖于其对去甲肾上腺素重捕获的作用的作用(66、67)。
[0087]实施例
[0088]实施例1:ΡΑΡ抑制剂例如普萘洛尔和地昔帕明诱导EGFR的胞吞作用
[0089]图1的间接免疫荧光显示，使用普萘洛尔(L和D外消旋混合物)进行的治疗诱导了 EGFR从细胞表面向细胞内(主要是核周围的)位置的重新分布，已通过EGFR与转铁蛋白的共定位将其鉴别为再循环内体，所述转铁蛋白是这类内体的标记物(64)。这种作用不是由于β -阻断剂活性，因为其不能由其他β -阻断剂例如美托洛尔和噻吗洛尔再现。对ΡΑΡ活性也有抑制作用的地昔帕明(66、67)模仿了普萘洛尔的胞吞效应(图1)。
[0090]到目前为止，所有已知的ΡΑΡ抑制剂都引发与普洛萘尔和地昔帕明相同的效应，因此本发明的范围扩展至任何的ΡΑΡ抑制剂。本文示出的结果仅是示例，其不约束或限制本发明的范围。
[0091]本发明人之前已经描述了，如通过125I_EGF结合减少所反映的，L和D普萘洛尔的外消旋混合物仅在30分钟内就降低了细胞表面的EGFR水平，在最高剂量时(300mM)降低达到 80% (64)。
[0092]这些结果证明了本发明的基础之一，即通过胞吞作用重定位诱导从细胞表面向细胞内小室的EGFR移除，因此使得所述受体不能与细胞外配体接触，从而减少其致癌作用。
[0093]实施例2:通过对125I_EGF结合进行测量来比较评价L-、D-普萘洛尔和地昔帕明对EGFR内化的作用
[0094]由本发明提出的，普萘洛尔作为PAP抑制剂用于阻断EGFR致癌作用的作用，需要的浓度高于其在体外作为β_肾上腺素能阻断剂时的浓度(62、63)。L-普萘洛尔的β-肾上腺素能阻断剂效能几乎是D-普萘洛尔的100倍。但是，本发明人的结果证明，L-普萘洛尔和D-普萘洛尔在减少细胞表面EGFR的能力方面是等同的(图2，Α)。它们的50%有效浓度(EC5Q)都为约75μΜ。[0095]用于临床的普萘洛尔(外消旋的L和D混合物)的β -阻断作用仅依赖于L-普萘洛尔的作用(70 )。D-普萘洛尔还是一种有过报告的ΡΑΡ抑制剂(67 )，可以以较高剂量用于临床中。
[0096]地昔帕明还有效地诱导125I_EGF结合的降低，EC50为约20 μ Μ (图2Β)。如通过1251-EGF结合测定所评估的，地昔帕明(20 μ Μ)和普萘洛尔(75 μ Μ)的EC5(I的组合减少了细胞表面上75-80%的EGFR (图2C和D)。
[0097]因此，D-普萘洛尔和地昔帕明的组合可以比单独使用每种药物时更有效地用于治疗以下癌症，所述癌症依赖于EGFR或其致癌突变体的致癌性刺激。
[0098]实施例3:依赖于EGFR及其致癌变体EGFRvIII的具有不同增殖速率的肿瘤细胞模型
[0099]所述来自人胶质母细胞瘤的细胞系U87表达低水平的EGFR (数据未示出)，并且当被转染以过表达所述突变体EGFRvIII时，其增殖速率大大增加(图3)。这些细胞提供了用于测试所述药物的适当的研究模型。
[0100]所使用的其他模型系统来自多形性胶质母细胞瘤细胞，所述细胞直接来自患者(GBM1)，其表达高水平的EGFR而不是EGFRvIII (数据未示出)。
[0101]实施例4:D-普萘洛尔和地昔帕明的不连续治疗对所培养的胶质母细胞瘤的抗肿瘤作用。
[0102]在所培养的胶质母细胞瘤细胞中证明了 D-普萘洛尔和地昔帕明作为依赖于EGFR的肿瘤细胞的增殖和生存力的抑制剂的效能。
[0103]每天两次(持续60分钟)给予所述细胞培养物D-普萘洛尔(60 μ Μ)(单独的或与地昔帕明(2 μ Μ)组合的)，抑制了 U87细胞和U87-EGFRvIII细胞的增殖和生存力(图4)。
[0104]在U87-EGFRvIII细胞中，对D-普萘洛尔和地昔帕明的组合的敏感性较高。作为选择性的对照，所述实验显示MDCK细胞——一种表达低水平EGFR并且不是恶性的犬肾细胞系(33)没受到单独的所述药物的影响，并且在使用组合治疗时其生存力降低20%。这些结果表明了在胶质母细胞瘤细胞中的治疗选择性因表达致癌变体EGFRvIII而增加。
[0105]实施例5:D-普萘洛尔和地昔帕明的低剂量连续治疗对所培养的胶质母细胞瘤的抗肿瘤作用
[0106]为了抑制增殖和细胞生存力，还可以在更长时期的治疗中使用低得多的浓度。浓度低至2 μ Μ的普萘洛尔(仅是所记载的以普萘洛尔治疗高血压的患者血浆中浓度的两倍)与0.6 μ Μ地昔帕明(所记载的血浆中浓度的一半)在U87-EGFRVIII细胞中达到了显著的效果，而没有明显影响不表达这种致癌突变体的细胞(图5)。
[0107]两种药物的组合的这种令人惊奇的作用使得可以对表达EGFRvIII的癌症使用临床上可接受的剂量。
[0108]总之，D-普萘洛尔(和没有β -阻断剂活性的类似物)和地昔帕明(单独地或组合地)可用于治疗其恶性依赖于EGFR的致癌性改变的癌症，所述EGFR的致癌性改变是通过过表达(例如ΒΜΒ1)或通过突变(例如EGFRvIII)产生。
[0109]本发明的范围扩展至表达其他致癌性EGFR变体(例如肺癌中记载的那些)或者甚至其他家族成员(例如ErbB2/Neu)的癌症，以及其他PAP抑制剂(鞘氨醇和氯丙嗪)。
[0110]附图详细说明[0111]图1:普萘洛尔和地昔帕明在所培养的肿瘤细胞中诱导EGFR的胞吞作用:所述免疫荧光图像示出了 HeLa对照细胞和用所示出的药物处理30分钟的细胞中EGFR的分布。普洛萘尔(75 μ Μ)和地昔帕明(75 μ Μ)都诱导了所述受体从细胞表面(对照，由细胞边界染色指示)向细胞内小室(由小泡和核周染色指示)的分布改变。其他的β_肾上腺素能阻断剂——美托洛尔(50 μ Μ)和噻吗洛尔(50 μ Μ)，没有作用。
[0112]图2:通过放射性配体结合确定的，对映异构体L-和D-普萘洛尔以及地昔帕明降低了细胞表面上EGFR的可及性:将已预先除去血清4小时的Hela细胞用所示剂量的不同药物处理30分钟，然后通过将所述细胞与20ng/ml1251-EGF在4°C下孵育1小时进行放射性配体结合测定，以检测细胞表面上的EGFR。A.L-和D-普萘洛尔导致125I_EGF结合的下降，反映了为75 μ Μ浓度(EC5Q)下细胞表面的EGFR减少约50%，以及在250 μ Μ下减少80%。L_和D-普萘洛尔的作用是不能区分的；Β.地昔帕明也诱导了放射性配体结合水平的下降，EC50为约20-25 μ M ；C.不同浓度的D-普萘洛尔(上面刻度)和地昔帕明(下面刻度)的组合；D.以其各自的EC5Q使用的D-普萘洛尔(75 μ Μ)和地昔帕明(25 μ Μ)的组合导致了 125I_EGF结合减少约75%。
[0113]图3:胶质母细胞瘤细胞U87以及被转染以过表达致癌突变体EGFRvIII的U87(U87-EGFRvIII)作为具有不同增殖速率的肿瘤模型。将10000个细胞接种在24孔板中补充有10%FBS和抗生素(青霉素100 U/ml和链霉素100mg/ml)的MEM培养基中。用质粒pcDNA3-EGFRvII1-myc永久转染的U87细胞(U87_EGFRvIII)显示出比U87细胞更高的增殖。
[0114]图4:D_普萘洛尔和地昔帕明的不连续处理对肿瘤性胶质母细胞瘤U87、U87-EGFRvIII和正常的上皮MDCK细胞的生存力的作用。
[0115]将5000个细胞(U87、U87_EGFRvIII和MDCK)接种在96孔板的每个孔中，所述孔中含有补充有10%FBS和抗生素(青霉素100U/ml和链霉素100mg/ml)的DMEM培养基。在三天中每天两次用60 μ M D-普萘洛尔(Prop)、2yM地昔帕明(Des)或其组合处理1小时。结晶紫比色测定评估的细胞生存力表示为未处理细胞(对照)的百分数％。每种药物使U87和U87-EGFRvIII细胞的生存力降低了约60%，但是没有降低MDCK细胞的生存力。所述两种药物的组合可显著更有效地对抗U87-EGFRvIII细胞，杀死95%以上的U87-EGFRvIII细胞，而MDCK细胞仅减少20%。
[0116]图5:低浓度D-普萘洛尔和地昔帕明的连续处理选择性抑制过表达EGFR的U87-EGFRvIII和胶质母细胞瘤GBM1细胞的过度增殖。在每孔接种2000个细胞(U87、U87-EGFRvII1、MDCK和GBM1)并在与图3所述相同条件下培养24小时后，将所述培养基替换为不含所示药物(对照)或含所示药物的培养基，所述药物为:2μΜ D-普萘洛尔(Prop)或0.6 μ Μ地昔帕明(Des)或其两者的组合，每24小时更换所述培养基，连续6天。使用结晶紫测定评估生存力并且表示为相对于未处理的对照的百分数％。D-普萘洛尔和地昔帕明的组合降低了 U87-EGFRvIII细胞的生存力达几乎5倍，降低GBM1细胞的生存力达一半，而U87细胞仅降低10%，MDCK没有受到影响。
[0117]图6:基于D-普萘洛尔和地昔帕明的作用来治疗EGFR-依赖的癌症的新策略:与目前直接靶向EGFR分子，试图抑制配体结合或酪氨酸激酶活性的策略不同，本发明提出了诱导由药物介导的所述受体的胞吞作用，所述药物抑制PAP并激活PA/PKA信号传导途径的，从而诱导EGFR从细胞表面向内体的重新定位。
[0118]技术描述
[0119]试剂和抗体
[0120]重组人EGF购自Invitrogen (Carlsbad, CA),蛋白A_琼脂糖凝胶、普萘洛尔和高葡萄糖DMEM购自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)，胎牛血清购自HycloneLaboratories (Logan, UT)，细胞培养试剂购自 Invitrogen 和 Sigma Aldrich,用于组织培养的塑料板购自Nalge Nunc (Naperville, IL) 0购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas, VA)的杂交瘤HB8506的培养基被用作针对人EGFR的细胞外结构域的单克隆抗体的来源。针对EGFR的羧基端结构域的兔单克隆抗体购自Millipore。
[0121]用于表达EGFRvIII原癌基因的质粒的构建
[0122]在(65)中描述的克隆到pBK-CMV载体中HindllI和Smal位点之间的EGFR cDNA被用于构建用于致癌变体EGFRvIII的表达载体。首先，使用含有限制性位点(针对第一片段为ΚρηΙ和EcoRV，针对第二片段为EcoRV和Xbal)的引物获得了对应于外显子1_2和7_28的PCR片段。在连接这些片段后，获得了对应于缺少外显子2-7的EGFRvIII的新片段，然后将其克隆到pcDNA3.1和pcDNA3.lmyc载体中的ΚρηΙ和Xbal位点之间，分别获得了载体pcDNA3-EGFRvI11和pcDNA3-EGFRvII1-myc。通过测序分析这两个构建体。
[0123]细胞培养和转染
[0124]用于放射性配体结合测定和EGFR胞吞作用的HeLa细胞之前已经在本发明人的实验室中被表征(33、64、65)。将所述细胞培养至达到约80%汇合并在测试前无血清维持2小时。
[0125]培养购自ATCC的U87人杂交瘤细胞并用pcDNA3.l-EGFRvII1-myc转染。所述转染是按照制造商说明(Invitrogen)使用脂质体转染(lipofectamine)法进行。将100000个U87细胞接种在15mm板中，在接种48小时后用1 μ g的质粒pcDNA3-EGFRvII1-myc转染细胞。在转染后48小时，加入补充有抗生素(100IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素)和0.8mg/ml遗传霉素(Geneticin) (G418，Sigma)的选择培养基(DMEM，10%胎牛血清(FBS))。在选择培养基中培养2周后，获得永久转染的细胞(U87-EGFRvIII)并使用抗EGFR的胞质结构域的兔单克隆抗体(Millipore)通过间接免疫突光进行分析。
[0126]从被诊断患有多形性胶质母细胞瘤的患者的活组织检查样本获得GBM1细胞。所述肿瘤的活组织检查样本为约1cm。将其用PBS洗涤4次，切片并在含有0.125%胰蛋白酶、5mM EDTA的PBS中在37°C下孵育15分钟，同时连续地搅动。在用巴斯德吸管机械破碎后，将细胞在台式离心机中以1200rpm离心10分钟。将所得沉淀物重悬于含有卵类粘蛋白抑制剂(lmg/ml)和DNA酶I (lmg/ml)的2ml PBS中，然后再次以1200rpm离心10分钟。将所得细胞重悬于PH7.2的NH4C1/Tris中并在37°C下孵育5分钟(5ml到5千万细胞)，并通过以1200rpm离心10分钟加以沉淀，最后重悬并培养在含10%FBS的DMEM中。将这些细胞维持至少10次传代。
[0127]所培养的肿瘤细胞体外增殖和生存力以及用D-普萘洛尔和地昔帕明进行的处理的评价 [0128]将U87细胞、U87-EGFRvII1、MDCK和GMB1细胞以每孔2000-10000个细胞的密度
(如在相应的图中所示)接种在96孔板中，并培养在补充有10%FBS和抗生素(青霉素100U/ml和链霉素100mg/ml)的DMEM中。在24小时更换培养基并以连续或不连续方式进行处理。通过在三天中每天两次将所述细胞与单独的60 μ M D-普萘洛尔(Prop)或与单独的2 μ Μ地昔帕明，或与60 μ M D-Prop和2μΜ Des的组合孵育1小时，来进行不连续的处理。连续的处理是将所述细胞与2-30 μ M D-Prop、0.6-1 μ Μ Des或这两种药物的组合一起孵育，每24小时更换培养基。各对照仅接受培养基。通过结晶紫比色测定以550nm处的光密度评估细胞生存力，所述550nm处的光密度的强度与贴壁到所述板上的细胞数成比例，或者在自动计数器中直接计数细胞评估细胞生存力。在这两种情况下，100%对应于在未处理细胞(对照)中测量的光密度。
[0129]间接免疫荧光和共定位分析
[0130]将生长在玻璃盖玻片上的HeLa细胞用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次并在无血清的DMEM-HEPES培养基中在37°C下孵育2小时，以在细胞表面上积累EGFR。然后将所述细胞用PBS洗涤并在室温下用溶于补充有0.1mM CaCl2和ImM MgCl2的PBS(PBS-CM)中的4% 低聚甲醛固定 30 分钟。用含 0.2% 明胶的 PBS (300Bloom, Sigma Aldrich, PBS-CM-G)洗涤三次(每次5分钟)后，将细胞用0.2%Triton X-100在室温下透化处理10分钟，然后与抗EGFR的单克隆抗体(mAb) HB8506 (在PBS-CM-G中1/100)在室温下孵育1小时。在PBS-CM-G中洗涤至少6次后，将细胞与偶联Alexa488的二抗抗小鼠IgG (稀释度1/1000)在室温下孵育1小时。如(64)所述，在装有油浸物镜Plan-Apochromat63X/l.4和ZeissAxiocam摄像机的Zeiss Axiophot显微镜上获得了突光数字图像，并将所述图像在运行成像软件AxioVision (Zeiss, Thorn-wood, NY)的计算机工作站上转化为14位。
[0131 ] 配体结合测定和胞吞速率常数
[0132]通过如(71)所述的氯胺T方法制备放射性配体1251_人EGF，得到50000-70000cpm/ng的比放射性(specific activity)。如(65)所述,在含有20mM HEPES和0.1%牛血清白蛋白(BSA)的Hanks溶液中在4°C下进行结合测定2小时。将已除去血清4小时的HeLa细胞用所示剂量的多种药物处理30分钟，然后与20ng/ml1251-EGF在4°C下于结合培养基(MEM-Hank，s，25mM HEPES,0.2%BSA RIA级)中孵育，剧烈搅拌1小时。将所得细胞用1NNaOH在室温下裂解2小时，在y计数器中确定每个样品(一式三份)的每分钟计数，包括通过用过量(500倍)冷配体孵育获得的非特异性结合点，其值被从每个样品中减去。在饱和条件中的放射性配体结合提供了细胞表面上EGFR量的估值。
[0133]本发明新的癌症治疗策略的综述
[0134]表皮生长因子受体(EGFR)属于包含四个成员(ErbBl_4或HER1-4)的酪氨酸激酶受体家族ErbB/HER。EGFR被至少六种不同的特异性配体激活以传播细胞内信号，所述细胞内信号根据细胞环境可以促进细胞增殖、分化、生存、迁移和细胞凋亡过程。所有这些过程在癌症发生期间均被改变，并常常与通过EGFR过表达或高活性突变确定的致癌性功能障碍有关。肿瘤细胞完全依赖于这些改变的EGFR所发出的致癌信号，这反映在它们对EGFR抑制剂的敏感性高于正常细胞。因此，EGFR是用于开发定向和个性化抗肿瘤治疗的新药物和策略以及主要靶点(25) (41)。治疗可通过用于确定EGFR中致癌性改变的肿瘤分析来加以个性化和优化。到目前为止，所述策略集中于使药物定向到EGFR分子自身，试图用抗体抑制配体结合或用小分子抑制受体酪氨酸激酶活性。临床使用的药物包括阻断配体结合的人源化单克隆抗体(例如西妥昔单抗)以及与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激酶的活性位点而抑制其活性的药物(吉非替尼和埃罗替尼)。虽然临床数据支持了 EGFR是定向和个性化抗肿瘤治疗的良好靶点的观点，但是这类药物的效能仍然有限，通常限于敏感患者的小的亚群(subgrup) (35)。另外，激酶抑制剂的一般问题是相对频繁地出现赋予针对所述治疗的抗性的突变。因此有必要获得作用机制与当前使用的那些药物不同且互补的新的药物。
[0135]本发明提出了创新性的策略，其是使用小分子药物来药理性诱发通过内吞作用(endocytic internalization)进行的从细胞表面除去EGFR,从而降低了其对细胞外激活刺激的可及性，同时改变了已经活化的受体的信号传播的细胞位置。这两种替代方案对于其恶性基于细胞表面上过高的EGFR信号传导活性的肿瘤细胞都是有害的。可诱导EGFR胞吞作用的小分子药物可以抑制EGFR依赖性肿瘤恶性细胞的增殖和生存力。这种策略(示于图5)是新颖的。其在以前没有被用过，因为其是基于在本发明人实验室中获得的实验数据。
[0136]胞吞作用在EGFR的功能中起到重要作用。当EGFR在细胞表面结合于其配体时，其首先被激活然后被胞吞，保持活性达不同的时间并被再循环至细胞表面以最终被送至终止其信号传导的降解通路(59)。本发明人已经证明用作磷脂酸磷酸水解酶(PAP)活性抑制剂的普萘洛尔(L和D普萘洛尔的外消旋混合物)可诱导EGFR的胞吞作用和细胞内积累，而不依赖于配体(64)。本发明人还证明，这种作用依赖于包括磷脂酸(PA)增加的信号传导途径，其可激活4型磷酸二酯酶，导致cAMP减少并因此导致PKA活性降低。本发明人后来已经证明EGFR胞吞作用还可由D-普萘洛尔以及由地昔帕明触发。在通过PAP抑制来激活PA/PKA信号传导途径后，EGFR被内化并因此不能接触外部的有丝分裂刺激。这些观察结果开辟了使用该PA/PKA信号传导途径来设计新的药物制剂以对抗大部分癌症的恶性的可能性，所述癌症依赖于EGFR的致癌性改变，包括过表达和激活突变。
[0137]这种策略的可行性被本发明人的另外的结果所证明。本发明人已经观察到，均被用作PAP抑制剂的D-普萘洛尔(几乎没有β -阻断剂活性)和地昔帕明不仅诱导EGFR胞吞作用，还抑制过表达EGFR (源自患者的胶质母细胞瘤细胞GBM1)或致癌变体EGFRvIII (转染EGFRvIII的U87细胞)的 肿瘤癌细胞的增殖并降低其生存力。D-普萘洛尔和地昔帕明的组合被证明更有效。
[0138]本发明扩展至表达EGFR的其他致癌变体或ErbB/HER家族的其他成员(例如ErbB2/Neu)的癌症。其还扩展至对PAP有抑制作用的其他化合物，无论是已知化合物(例如鞘氨醇和氯丙嗪)还是任何可能在将来出现的其他新化合物。本发明提出的PAP抑制剂可用于治疗多种癌症，包括头颈癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤。本发明提出的治疗可以补充其他的治疗或者在已经产生对化疗或EGFR抑制药物的抗性时作为唯一的治疗。
[0139]参考文献:
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【权利要求】
1.磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的抑制剂的用途，其特征在于其可用于制备用于治疗癌症的药剂。
2.权利要求1的PAP抑制剂的用途，其特征在于所述癌症依赖于表皮生长因子受体(EGFR)0
3.权利要求1的PAP抑制剂的用途，其特征在于所述EGFR包括了所有致癌变体和其他ErbB家族成员/HER。
4.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂选自普萘洛尔、地昔帕明、氯丙嗪、鞘氨醇和溴烯醇内酯。
5.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂为普萘洛尔。
6.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂选自普萘洛尔的外消旋混合物。
7.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂为D-普萘洛尔。
8.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂单独使用或与另外的PAP抑制剂组合使用。
9.权利要求8的用途，其特征在于选择所述PAP抑制剂普萘洛尔与地昔帕明组合。
10.权利要求9的用途，其特征在于所述PAP抑制剂选自D-普萘洛尔与地昔帕明的组合。
11.权利要求1的用途，其特征在于所述表皮生长因子受体(EGFR)依赖的癌症选自头颈癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和/或胶质母细胞瘤。
12.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂单独使用或与通过不同于PAP抑制的途径抑制EGFR的药物组合使用。
13.权利要求1的用途，其特征在于所述PAP抑制剂单独使用或与其他方法例如放射治疗或外科手术组合使用。
【文档编号】A61K31/55GK103635186SQ201280017339
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年2月6日 优先权日:2011年2月8日
【发明者】A·冈萨雷斯, A·苏佐, C·梅斯 申请人:智利天主教教皇大学