一种水蛭素磷脂复合物及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种水蛭素磷脂复合物及其制备方法与应用，所述水蛭素磷脂复合物由水蛭素和磷脂组成，所述水蛭素和磷脂的摩尔比为1:1（以平均分子量计），制备方法为（1）将水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液；（2）将磷脂以非质子溶剂溶解，得到第二溶液：（3）搅拌条件下将第一溶液与第二溶液充分混合，除去有机溶剂，加入甘露醇水溶液，溶解，过滤，冷冻干燥即得；所述水蛭素磷脂复合物的亲脂性和稳定性大大提高，在肾组织中的生物利用度明显提高，可用于治疗早期糖尿病肾病。
【专利说明】一种水蛭素磷脂复合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种复合物及其制备方法与应用，尤其是一种水蛭素复合物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]水蛭素是从水蛭头部提取的一种单链环肽化合物，分子量为7000道尔顿，由65个氨基酸残基组成。水蛭素是水蛭中含有的一种重要有效成分，具有很强的抗凝血和抗血栓活性。随着分子生物学和基因工程技术的发展，与天然水蛭素结构和药理活性基本相同的重组水蛭素已经被成功合成，推动了水蛭素的临床应用。例如，在治疗糖尿病及并发症方面，水蛭素有改善2型糖尿病胰岛素抵抗的作用(浙江中医学院学报，2005年第29卷第4期)，水蛭素可降低尿中微量白蛋白、改善高凝状况，对糖尿病肾病和高血压肾病患者的肾脏有较好的保护作用(临床合理用药，2010年第3卷第22期)。
[0003]水蛭素为水溶性生物大分子，脂溶性差，进入体内后主要分布于细胞外液，不易透过血脑屏障，易降解，不与血浆蛋白结合(中草药，2003年第34卷第8期)。这些特性使水蛭素较难通过胃肠黏膜有效吸收，因此其给药途径主要为注射给药。但水蛭素在血浆中的消除半衰期不到1小时，这对需要长期抗凝的患者带来很大不便。采用脂质体包封水蛭素是一种改善水蛭素生物利用度的有效手段(中国中药杂志，2007年第32卷第9期)，但由于包封率、粒径等问题，目前水蛭素脂质体多用于黏膜给药途径。因此，研发一种确有疗效、可注射给药、药效持久的水蛭素药物组合物成为本领域技术人员不懈追求的目标。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种水蛭素磷脂复合物。
[0005]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述水蛭素磷脂复合物的制备方法。
[0006]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述水蛭素磷脂复合物的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0008]一种水蛭素磷脂复合物，由水蛭素和磷脂组成，所述水蛭素和磷脂的摩尔比为1:1(以平均分子量计)，所述水蛭素磷脂复合物是由下述方法制备得到的:
[0009](1)将水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比为1:5-30 (g/mL)；
[0010](2)将磷脂以非质子溶剂溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非质子溶剂的用量比为1:10-200 (g/mL)，所述非质子溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六环中任一种、或几种的任意浓度的任意组合:
[0011](3)搅拌条件下将第一溶液与第二溶液充分混合，除去有机溶剂，加入甘露醇水溶液，溶解，过滤，冷冻干燥即得。
[0012]上述水蛭素磷脂复合物，所述水蛭素可以是以各种方法分离提取得到的天然水蛭素，也可以是以生物技术合成的重组水蛭素。[0013]上述水蛭素磷脂复合物，所述磷脂可以是供注射用的大豆磷脂，也可以是供注射用的蛋黄卵磷脂。
[0014]优选的，上述水蛭素磷脂复合物，所述乙醇为体积浓度70-90% (v/v)的乙醇水溶液。
[0015]一种水蛭素磷脂复合物的制备方法，具体步骤如下:
[0016](I)将水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比为1:5-30 (g/mL)；
[0017](2)将磷脂以非质子溶剂溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非质子溶剂的用量比为1:10-200 (g/mL)，所述非质子溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六环中任一种、或几种的任意浓度的任意组合:
[0018](3)搅拌条件下将第一溶液与第二溶液充分混合，其中，所述水蛭素和磷脂的摩尔比为1:1 (以平均分子量计)，除去有机溶剂，加入甘露醇水溶液，溶解，过滤，冷冻干燥即得。
[0019]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(1)中乙醇的体积浓度为70-90% (v/v)。
[0020]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中第一溶液与第二溶液充分混合的反应温度为室温至水蛭素溶液和磷脂溶液的混合液的沸腾温度，以实现加热回流。
[0021]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中第一溶液与第二溶液充分混合的反应时间为5min-2h。
[0022]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中除去有机溶剂的方法为减压蒸馏法或常压蒸馏法。
[0023]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中甘露醇水溶液的用量(以HiL计)为水蛭素和磷脂质量总和(以g计)值的5倍-20倍。
[0024]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中甘露醇水溶液中甘露醇的浓度为1-20% (g/mL)。
[0025]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中过滤为过滤精度为
0.22 μ m以上的除菌过滤。
[0026]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，所述步骤(3)中冷冻干燥为以除水为目的的冷冻干燥。
[0027]优选的，上述水蛭素磷脂复合物的制备方法，具体步骤如下:
[0028](I)将水蛭素溶于80% (v/v)乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比为 1:15 (g/mL)；
[0029](2)将蛋黄卵磷脂以三氯甲烷溶解，得到第二溶液，其中，所述蛋黄卵磷脂和三氯甲烷的用量比为1:50 (g/mL)，所述非质子溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六环中任一种、或几种的任意浓度的任意组合:
[0030] (3)搅拌条件下，将第二溶液滴加至第一溶液中，加热回流，反应30min，水浴加热挥散溶剂，加入2%甘露醇溶液复溶，其中，甘露醇水溶液的用量(以mL计)为水蛭素和磷脂质量总和(以g计)的5倍，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得浅黄色水蛭素磷脂复合物。[0031 ] 上述水蛭素磷脂复合物在制备用于治疗早期糖尿病肾病的药物方面的应用。
[0032]上述水蛭素磷脂复合物以注射用水复溶，配成一定浓度，即可用于治疗早期糖尿病肾病。
[0033]本发明的有益效果是:
[0034]上述水蛭素磷脂复合物，是通过特定的方法制备而成，磷脂是细胞膜的基本组成物质，与细胞膜的亲和力强，当水蛭素与卵磷脂以特定用量及特定复合方式形成磷脂复合物后，通过分子间力形成的生物大分子，使水蛭素的亲脂性和稳定性大大提高，磷脂作为药物载体能促进水蛭素更好地从血液转移至各器官组织，进入细胞，在静脉注射给药后，水蛭素在肾组织中的生物利用度明显提高，对改善早期糖尿病肾病病人的肾功能，具有重要的临床应用价值；其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是水蛭素的红外光谱图；
[0036]图2是大豆磷脂的红外光谱图；
[0037]图3是水蛭素大豆磷脂复合物的红外光谱图；
[0038]图4是水蛭素和水蛭素磷脂复合物大鼠尾静脉注射给药肾组织透析液中水蛭素药时曲线；
[0039]图5是糖尿病肾病大鼠肾组织病理切片；
[0040]图6是糖尿病肾病大鼠肾组织TGF- β免疫组化切片；
[0041 ] 图7是糖尿病肾病大鼠肾组织VEGF免疫组化切片。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0043]实施例1
[0044]称取0.7g水蛭素,溶于3.5mL90%乙醇。另取0.08g大豆磷脂,溶于16mL甲醇。搅拌下，将水蛭素的乙醇溶液滴加至大豆磷脂的甲醇溶液中，加热回流，反应2h，减压除去溶剂，加入4mL20%甘露醇水溶液复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得类白色水蛭素磷脂复合物1.02g,收率64%。
[0045]实施例2
[0046]称取2g水蛭素，溶于60mL70%乙醇。另取0.23g大豆磷脂，溶于2.3mL四氢呋喃。搅拌下，将大豆磷脂的四氢呋喃溶液滴加至水蛭素的乙醇溶液中，加热回流，反应5min，减压除去溶剂，加入44.6mLl%甘露醇溶液复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得浅黄色水蛭素磷脂复合物2.42g，收率90%。
[0047]实施例3
[0048]称取1.2g水蛭素，溶于18mL80%乙醇。另取0.14g蛋黄卵磷脂，溶于7mL三氯甲烷。搅拌下，将蛋黄卵磷脂的三氯甲烷溶液滴加至水蛭素的乙醇溶液中，加热回流，反应30min，水浴加热挥散溶剂，加入6.7mL2%甘露醇溶液复溶，0.22 um微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得浅黄色水蛭素磷脂复合物1.37g，收率93%。
[0049] 实施例4[0050]称取1.4g重组水蛭素，溶于14mL85%乙醇。另取0.16g蛋黄卵磷脂，溶于16mL乙醚。搅拌下，将重组水蛭素的乙醇溶液滴加至蛋黄卵磷脂的乙醚溶液中，室温反应lh，水浴加热挥散溶剂，加入15.6mL4%甘露醇溶液复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得类白色重组水蛭素磷脂复合物2.13g，收率84%。
[0051]实施例5
[0052]称取4.2g重组水蛭素，溶于80mL75%乙醇。另取0.48g蛋黄卵磷脂，溶于25mL 二氧六环。搅拌下，将蛋黄卵磷脂的二氧六环溶液滴加至重组水蛭素的乙醇溶液中，室温反应1.5h，减压蒸除溶剂，加入70mL10%甘露醇溶液复溶，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得类白色重组水蛭素磷脂复合物7.58g,收率65%。
[0053]实施例6
[0054]分别取0.1g水蛭素、0.1大豆磷脂和相当于0.1g水蛭素的实施例3所述水蛭素磷脂复合物，与适量溴化钾混合压片，置于红外光谱仪中，于400-4000(3!^1扫描。如图1、图2和图3所示，对比水蛭素与水蛭素磷脂复合物的红外光谱图可知，1439cm-1的碳氮伸缩振动峰在复合物中的峰强明显强于水蛭素中的峰强，且峰变宽，可能由于磷脂中磷脂酰胆碱结构中的季铵氮的强吸电诱导效应致使原来C-N键上的共轭电子数增加，从而导致C-N键的吸收增强，并引起C-N键的吸收峰蓝移(3CHT1)，由此说明，水蛭素磷脂酰胆碱复合物已形成，同时，由于水蛭素蛋白中的酰胺I带(1629(3!^1)和酰胺II带(1558(3!^1)在复合前后的峰强和峰位均未发生变化，表明水蛭素蛋白的一级α -螺旋结构及维持和稳定空间构象的二硫键、氢键均未被破坏，表明水蛭素的活性在复合之后应该未受影响。
[0055]实施例7
[0056]分别称取约IOmg水蛭素与实施例3所述相当于IOmg水蛭素的水蛭素磷脂复合物，溶于ΡΗ6.86磷酸盐缓冲液中，置于50、55、60、65°C恒温水浴中，于60、120、180、240分钟取样，以异丙醇稀释至约50 μ g/mL，依下述高效液相色谱条件测定不同温度下溶液中水蛭素的浓度变化，根据经典恒温加速实验法阿伦尼乌斯方程计算得水蛭素的半衰期为0.96h，水蛭素磷脂复合物的半衰期为16.62小时。与磷脂复合后，水蛭素的半衰期增加了 17倍。
[0057]色谱条件:色谱柱KromasiI C18 (250 X 4.6mm，5 μ m)，流动相:乙腈-甲醇-水-甲酸(20:55:24:1),柱温 300C，流速 lmL/min,检测波长 276nm。
[0058]实施例8
[0059]健康雄性Wistar大鼠8只，随机分成2组，每组4只。大鼠禁食12h后，水合氯醛麻醉，沿左侧肋下纵切开肾前皮肤，切口约1cm，从背部向前挤压，令左肾从切口处游离至皮外，以充满肝素的线状透析针(截留分子量10万)在肾皮质部位穿刺，保持针距肾表皮约1mm，透析液为超纯水，流速为200yL/h。平衡Ih后，尾静脉注射给药:水蛭素组尾静脉注射0.5mL水蛭素生理盐水溶液(含水蛭素0.lmg/mL)，复合物组尾静脉注射0.5mL实施例3所述水蛭素磷脂复合物生理盐水溶液(以水蛭素计0.lmg/mL)。每0.5h收集的透析液以ELISA法测定水蛭素含量。将测得的肾脏组织透析液中的水蛭素含量以PK Solverf.0软件处理，得药时曲线如图4所示,药代动力学参数如表1所示。
[0060]表1水蛭素和水蛭素磷脂复合物大鼠尾静脉注射给药
[0061] 肾组织透析液中水蛭素的药代动力学参数
【权利要求】
1.一种水蛭素磷脂复合物，其特征在于:由水蛭素和磷脂组成，所述水蛭素和磷脂的摩尔比以平均分子量计为1:1，所述水蛭素磷脂复合物是由下述方法制备得到的: (1)将水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL计为 1:5-30 ； (2)将磷脂以非质子溶剂溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非质子溶剂的用量比按g/mL计为1:10-200，所述非质子溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六环中任一种、或几种的任意浓度的任意组合； (3)搅拌条件下将第一溶液与第二溶液充分混合，除去有机溶剂，加入甘露醇水溶液，溶解，过滤，冷冻干燥即得。
2.权利要求1所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)将水蛭素溶于乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL计为 1:5-30 ； (2)将磷脂以非质子溶剂溶解，得到第二溶液，其中，所述磷脂和非质子溶剂的用量比按g/mL计为1:10-200，所述非质子溶剂为四氢呋喃、三氯甲烷、甲醇、乙醚或二氧六环中任一种、或几种的任意浓度的任意组合: (3)搅拌条件下将第一溶液与第二溶液充分混合，其中，所述水蛭素和磷脂的摩尔比以平均分子量计为1:1，除去有机溶剂，加入甘露醇水溶液，溶解，过滤，冷冻干燥即得。
3.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:所述步骤(1)中乙醇的体积浓度为70-90% (v/v)0
4.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中第一溶液与第二溶液充分混合的反应时间为5min-2h。
5.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中甘露醇水溶液的用量以毫升计为水蛭素和磷脂质量总和值以克计的5-20倍。
6.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中甘露醇水溶液中甘露醇的浓度按g/mL计为1-20%。
7.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中过滤为过滤精度为0.22 μ m以上的除菌过滤。
8.根据权利要求2所述的水蛭素磷脂复合物的制备方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)将水蛭素溶于80%(v/v)乙醇中，得到第一溶液，其中，所述水蛭素和乙醇的用量比按g/mL计为1:15 ; (2)将蛋黄卵磷脂以三氯甲烷溶解，得到第二溶液，其中，所述蛋黄卵磷脂和三氯甲烷的用量比按g/mL计为1:50 ； (3)搅拌条件下，将第二溶液滴加至第一溶液中，加热回流，反应30min，水浴加热挥散溶剂，加入2%甘露醇溶液复溶，其中，甘露醇水溶液的用量以毫升计为水蛭素和磷脂质量总和值以克计的5倍，0.22 μ m微孔滤膜过滤，滤液冷冻干燥，得浅黄色水蛭素磷脂复合物。
9.权利要求1所述的水蛭素磷脂复合物在制备用于治疗早期糖尿病肾病的药物方面的应用。
【文档编号】A61P13/12GK103908678SQ201410157962
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】王洪武, 国大亮, 孟静岩, 边育红, 王玉兴, 杨锦惠, 郑纺, 田露, 张贺翔 申请人:天津中医药大学