专利名称：一种用于去除致病抗体及其复合物的蛋白a免疫吸附材料及其合成方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于血液净化治疗的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法，它能够选择性地去除患者血浆中的致病抗体，尤其是免疫复合形式的致病抗体。
背景技术：
免疫吸附是近十多年发展起来的一种新技术，用于治疗一些传统方法难以奏效的疾病。它将抗原、抗体或某些具有特定物理化学亲和力的物质作为配体与载体结合，制成吸附柱，利用其高特异性吸附性能，选择性或特异性地去除患者血液中致病因子，从而达到净化血液、缓解症状的目的。目前临床上应用免疫吸附能够通过特异性地去除自身抗体，治疗自身免疫性疾病和器官移植排斥反应，以及通过吸附低密度脂蛋白治疗高胆固醇血症及其并发症。这项技术与血浆置换相比，能迅速有效选择性去除多种自身抗体，具有治疗剂量大，不丢失血浆有用成分，不需置换血浆，可避免传播疾病的可能等优点，而且治疗效果显著。同时由于配体和抗体之间专一而可逆的结合，免疫吸附材料能反复洗脱重复使用，降低了治疗成本。2001年，在英国伦敦召开了欧洲第一届免疫吸附研讨会，来自17个国家的200多位专家学者参加了会议，重点讨论了免疫吸附在风湿病、肾脏病、神经系统疾病、血液病和心血管疾病中应用的经验，免疫吸附治疗已逐渐成为血液净化技术的一个重要分支，日益受到医学界的广泛关注。
最近二三十年来，研究合成出来的免疫吸附材料虽然不少，但主要都还是用于体外分离和纯化，应用于临床治疗疾病的并不多，实际疗效相对肯定且已被患者广泛接受的仅有蛋白A免疫吸附柱。这主要是因为用于血液净化的免疫吸附产品要求非常高，它必需符合如下要求才能进入人体治疗(1)安全性连接上去的配体牢固不易脱落进入血液，无毒性、无菌、无热源等；(2)有效性因为人体内要被吸附去除的物质含量大，要通过吸附降到一定的水平才能达到治疗效果；(3)较高的选择性，即非特异吸附要小，以减少其治疗的副作用；(4)良好的生物相容性即无毒、不溶解、不激活补体和凝血系统、不致敏等；(5)稳定性好，便于反复再生、储存和消毒；(6)成本不能太高因为是应用于临床治疗，而且用量大，患者必须能承受该治疗的费用，因此成本要低，最好能重复使用以降低成本等。目前，临床上使用的商品化的蛋白A免疫吸附柱(瑞典Excorim公司)采用的载体是Sepharose CL-4B琼脂糖凝胶，与蛋白A通过溴化氰活化偶联。由于溴化氰是剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；另外，用溴化氰方法偶联的蛋白A基团容易脱落进入人体，对病人产生较大的副作用，因而这一合成工艺不甚理想。夏列波等人发明了一种蛋白A-琼脂糖免疫吸附材料的新方法，他们采用环氧氯丙烷(申请号01103114.X，公开号CN1365853A)作为偶联试剂活化琼脂糖载体后与氨水反应。由于氨水分子较小，得到的免疫吸附材料间隔臂不够长，另外我们在实验中发现氨水反应活性低，偶联蛋白A少，合成得到的蛋白A免疫吸附材料对抗体的吸附效率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从血浆中去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附剂，它能够安全、高效和高选择性地去除患者血浆中的致病抗体，尤其是免疫复合形式的致病抗体。
本发明的另一目的是提供上述蛋白A免疫吸附剂的制备方法，该方法无毒、无害，制备得到的吸附剂对抗体的吸附效率高。
本发明的第三个目的是提供上述吸附材料在血液净化中的应用。
本发明的技术方案是 一种用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与SPA偶联的高分子材料，具有如下化学结构
其中
代表琼脂糖凝胶 X代表
n＝1～3，SPA代表葡萄球菌蛋白A。
琼脂糖凝胶是一种天然多糖，含有丰富的羟基，它可参与多种化学反应转化为活性基团，然后与蛋白A反应固定在琼脂糖凝胶载体上。本发明的基本构想是选用环氧溴丙烷作为活化琼脂糖凝胶的试剂，较环氧氯丙烷而言，环氧溴丙烷具有更高的反应活性；经环氧溴丙烷活化后得到带环氧基团的琼脂糖凝胶，连接不同多胺类物质后与戊二醛进行反应，键合SPA，最后封端、还原双键。其合成的具体过程如下 (1)、环氧溴丙烷活化琼脂糖凝胶，反应体系中琼脂糖凝胶占25％～40％的体积比(v/v)，环氧溴丙烷占9％～17％的体积比(v/v)，1～3M NaOH溶液占40％～60％的体积比(v/v)，且每毫升NaOH溶液中加入2毫克硼氢化钠，反应温度20～40℃，反应时间2～6小时； (2)、用多胺类试剂对步骤(1)所得带有活性环氧基团的琼脂糖凝胶进行开环反应；反应温度40～70℃，反应时间2～6小时，多胺类试剂充分过量； (3)、用戊二醛与步骤(2)带有活性氨基的琼脂糖凝胶反应，加入的戊二醛摩尔数为琼脂糖凝胶活性氨基摩尔数的40～60倍，用硼酸盐作缓冲液控制体系的pH值在8左右，反应温度20～40℃，反应时间2～4小时； (4)、SPA与步骤(3)的反应产物反应合成免疫吸附材料，反应体系中蛋白A浓度为400～1000μg/mL，使SPA在反应体系中过量，用硼酸盐缓冲溶液控制体系pH值在8～10，反应温度20～25℃，反应时间15～30小时； (5)、步骤(4)所得产物进行端基封闭反应，同时多次加入硼氢化钠还原双键，封端试剂的浓度为0.1～0.2mol/L，pH值为7.5～8.5。
反应方程式如下
其中，H-X-NH2代表多胺类试剂， X代表
其中n＝1～3，
为琼脂糖凝胶，SPA为葡萄球菌蛋白A。
具体的多胺类试剂为乙二胺、二乙三胺和三乙四胺中的任一种。
SPA是一个分子量约42kD的大分子，与其特异性结合的抗体及其免疫复合物分子更大，其分子量是几十万到上百万，SPA要保持其吸附能力，需要保证与琼脂糖键合后，其空间立体结构不变形。同时，大分子抗体及其免疫复合物与SPA的接触也需要足够的空间，SPA免疫吸附材料的微环境对其吸附能力影响很大。SPA的免疫球蛋白结合位点只有充分裸露在琼脂糖凝胶载体外面，被吸附的抗体及其免疫复合物才能尽可能地无空间障碍地与SPA接触，充分发挥SPA的吸附能力。如果在材料表面与SPA之间有一定长度的间隔臂，使SPA与材料表面保持一定的距离，将保证其空间结构不变，同时抗体及其免疫复合物能不受空间障碍地与蛋白A尽可能接触，提高材料上SPA的吸附效率。传统上用的间隔臂为1，6-己二胺和1，8-辛二胺等二胺类长链试剂，但这类物质碳链较长，疏水性较大，会导致吸附材料的非特异性吸附，影响了免疫吸附材料的性能。本发明采用多胺类物质为间隔臂，由于多胺类物质有多个氮原子，因而亲水性较强，当碳链增长时不会影响免疫吸附剂的吸附性能。本发明选择多胺类试剂和戊二醛作为琼脂糖载体和SPA之间的间隔臂，能得到不同间隔臂长的SPA吸附材料，材料具有较高的吸附性能，固载效率和牢固度也较高。
由于空间的障碍，大分子的SPA与醛基琼脂糖载体反应后，将还有一些未反应完的醛基。另外，在反应过程中产生碳氮双键，这些基团是产生非特异性吸附的潜在因素，必须将其惰性化。本发明选用三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸乙酯盐酸盐或乙醇胺其中的一种作为封端试剂，除去未反应的醛基，同时选用硼氢化钠(NaBH4)还原产生的双键。
本发明还包括所述的蛋白A免疫吸附材料在血液净化中的应用。
基于以上叙述，本发明的显著优势和效果是 1、选用环氧溴丙烷为活化试剂，其化学活性较环氧氯丙烷强，能得到较高的环氧含量，这样就能固载较高含量的SPA，提高材料的吸附性能。
2、通过多胺类试剂和戊二醛引入了间隔臂，为SPA与抗体及抗体复合物的结合创造了足够的空间，改善了材料的微环境，从而提高了SPA对抗体及其免疫复合物的结合效率，减少了吸附剂的用量，降低了生产成本。
3、选用亲水性较好的多胺类物质为间隔臂，合成制备的蛋白A免疫吸附材料特异性吸附好，不会吸附血浆中的其它有益蛋白成分。
4、吸附材料的吸附效率高，再生性能好。
以上的优势在临床治疗上表现为提高了临床治疗效果、安全性和可靠性。体外血浆吸附试验数据表明，本发明的蛋白A免疫吸附材料对人体血浆抗体IgG具有特异性吸附。
图1是蛋白A免疫吸附剂对人体血浆抗体(IgG)的吸附效率对比图。
(a)是本发明的一种蛋白A免疫吸附剂；(b)按照夏列波等人(CN1365853A)用氨水作间隔臂合成的免疫吸附剂。
具体实施例方式 以下详述本发明的实施例。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例一 含有环氧基的活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶的合成 在5L的反应器中加入1升商品名为Sepharose 6FF琼脂糖凝胶，1500毫升2.5mol/L的NaOH水溶液，3克硼氢化钠，混合均匀，加入300mL左右的环氧溴丙烷后，置于恒温摇床中，在30℃下反应4小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至中性。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸钠法检测用这种方法活化的凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有50μmol的环氧活性基团。
实施例二 含有氨基的活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶的合成 1.环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶与二乙三胺的反应 在5L的反应器中加入例一中合成的环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶1升，0.1mol/L的硼酸盐缓冲液1.5L，pH值控制在7.0～9.0范围内，加入200mL二乙三胺，在50℃恒温反应2小时。反应停止后，用1mol/L氯化钠溶液和消毒水大量冲洗，除去残留的二乙三胺，得到含有氨基的活性琼脂糖凝胶。
2.环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶与乙二胺的反应 在5L的反应器中加入“实施例一”中合成的环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶1升，0.1mol/L的硼酸盐缓冲液1.5L，pH值控制在7.0～9.0范围内，加入160mL乙二胺，在55℃恒温反应3小时。反应停止后，用1mol/L氯化钠溶液和消毒水大量冲洗，除去残留的乙二胺，得到含有氨基的活性琼脂糖凝胶。
3.环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶与三乙四胺的反应 在5L的反应器中加入例一中合成的环氧活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶1升，0.1mol/L的硼酸盐缓冲液1.5L，pH值控制在7.0～9.0范围内，加入220mL三乙四胺，在45℃恒温反应4小时。反应停止后，用1mol/L氯化钠溶液和消毒水大量冲洗，除去残留的三乙四胺，得到含有氨基的活性琼脂糖凝胶。
实施例三 含有醛基的活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶的合成 在5L的反应器中加入“实施例二”(1、2或3)中合成的氨基活性Sepharose 6FF琼脂糖凝胶1升，0.1mol/L硼酸盐缓冲溶液1.2mL，控制体系pH值在8左右，加入200mL戊二醛，在30℃恒温反应3小时。反应停止后用大量的水冲洗掉残留的戊二醛，得到含有醛基的琼脂糖凝胶。
实施例四 蛋白A免疫吸附材料的合成 在5L的反应器中加入“实施例三”中合成的醛基琼脂糖凝胶1升，0.1mol/L的硼酸盐缓冲液1.5L，控制体系pH值在8～9.5，加入7g蛋白A，在20℃恒温反应20小时，停止反应，回收未反应的蛋白A。用0.2mol/L的乙醇氨封闭未反应的醛基，在20℃反应5小时。最后分多次加入40g硼氢化钠还原产生的双键，在20℃反应10小时。反应完成后分别用大量蒸馏水和含1mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，最后将其保存在加有防腐剂的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)中。用紫外分光光度计法检测蛋白A的偶联含量约为5.5-6.5mg/ml。
实施例五 蛋白A免疫吸附材料对血浆抗体吸附效率对比 分别将“实施例四”中合成的蛋白A免疫吸附材料和按照夏列波等人用氨水作间隔臂合成的蛋白A免疫吸附材料各2ml放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时，分别装于Φ0.8×5 mm的柱中，用生理盐水充分冲洗柱子。将10ml人体血浆以4ml/min的速度过柱，使抗体IgG吸附在吸附材料上。用含有8.5％NaCl，pH＝2.8的0.01M柠檬酸-Na2HPO4缓冲液作为洗脱剂将吸附在吸附材料上人体免疫球蛋白IgG洗脱下来，收集洗脱液。SDS-PEAG电泳检测洗脱物，电泳结果表明，洗脱液中吸附物主要为抗体IgG。用蛋白检测仪在线检测整个“吸附-洗脱”过程流出液体中的总蛋白含量，吸收谱图如图1所示。第一个吸收峰显示血浆中总蛋白浓度信号，第二个吸收峰显示洗脱下来的抗体IgG浓度信号，峰面积大小与蛋白质的浓度成正比。图1中本发明蛋白A免疫吸附剂(简称a)的第二个吸收峰面积明显大于按照夏列波等人用氨水作间隔臂合成的蛋白A免疫吸附剂(简称b)的面积，a的面积约为b的面积的1.6倍，表明本发明的蛋白A免疫吸附剂对血浆中抗体IgG的吸附效率有显著提高。
实施例六 蛋白A免疫吸附材料的动物试验 将“实施例四”中合成的蛋白A免疫吸附剂60ml，放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时，再分别装于两根Φ25×50mm的吸附柱中，每根柱子吸附剂为30ml，用生理盐水充分冲洗柱子。以动物狗为试验对象，将狗麻醉后，建立体外循环。启动A泵，从狗的股动脉中以60-100ml/min的速度引出血液，经过血浆分离器分离出血浆，经B泵驱动以20-30ml/min的速度进入柱1系统(关闭柱2)进行吸附，运行10min，柱1饱和，关闭柱1系统入口，开启柱2系统进行吸附。将柱1内的血浆用约20mL生理盐水冲出，与血细胞混合一同泵入狗的股静脉中。关闭柱1系统出口，柱1用含有8.5％NaCl，pH＝2.8的0.01M柠檬酸-Na2HPO4缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。用0.1M磷酸盐150mL平衡柱子，再用200mL生理盐水冲洗，再生过程完毕。重复以上操作，每柱反复切换3次。SDS-PEAG电泳检测洗脱物，电泳结果表明，洗脱液中吸附物主要为抗体IgG，紫外检测洗脱下的抗体总量为2.8-3.5g。试验动物狗在免疫吸附后当天恢复正常生理活动，实验后一周未发现异常症状。
实施例七 蛋白A免疫吸附材料的再生性能 将“实施例四”中合成的蛋白A免疫吸附材料50ml放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时再装于Φ40×50mm的柱中，用生理盐水充分冲洗柱子。将人体血浆以30ml/min的速度过柱10分钟，使抗体IgG吸附在吸附材料上。用含有8.5％NaCl，pH＝2.8的0.01M柠檬酸-Na2HPO4缓冲液作为洗脱剂将吸附在吸附材料上人体免疫球蛋白IgG洗脱下来，收集洗脱液，用紫外法检测吸附的抗体IgG含量。洗脱完毕后，用生理盐水将柱中的洗脱剂置换出来再生，再将人体血浆过柱10分钟。重复以上“吸附-洗脱-中和-吸附”操作200次，每次都检测吸附的抗体IgG的量，吸附效率未发现显著变化，表明制备的蛋白A免疫吸附材料具有良好的再生性能。
权利要求
1.一种用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料，是将葡萄球菌蛋白A共价键合于琼脂糖凝胶载体上的高分子材料，它具有如下的化学结构
其中
代表琼脂糖凝胶；X代表
其中，n＝1～3；SPA代表葡萄球菌蛋白A。
2.权利要求1所述的用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料制备方法，其特征在于合成过程如下
(1)用环氧溴丙烷活化琼脂糖凝胶，反应体系中琼脂糖凝胶占25％～40％的体积比，环氧溴丙烷占9％～17％的体积比，1～3MNaOH溶液占40％～60％的体积比，且每毫升NaOH溶液中加入2毫克硼氢化钠，反应温度20～40℃，反应时间2～6小时；
(2)用多胺类试剂对步骤(1)所得带有活性环氧基团的琼脂糖凝胶进行开环反应；反应温度40～70℃，反应时间2～6小时，多胺类试剂充分过量；
(3)用戊二醛与步骤(2)带有活性氨基的琼脂糖凝胶反应，加入的戊二醛摩尔数为琼脂糖凝胶活性氨基摩尔数的40～60倍，用硼酸盐作缓冲液控制体系的pH值在8左右，反应温度20～40℃，反应时间2～4小时；
(4)SPA与步骤(3)的反应产物反应合成免疫吸附材料，反应体系中SPA浓度为400～1000μg/mL，使SPA在反应体系中过量，用硼酸盐缓冲溶液控制体系pH值在8～10，反应温度20～25℃，反应时间15～30小时；
(5)步骤(4)所得产物进行端基封闭反应，同时多次加入硼氢化钠还原双键，封端试剂的浓度为0.1～0.2mol/L，pH值为7.5～8.5。
3.权利要求2所述的用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于多胺类试剂为乙二胺、二乙三胺或三乙四胺中的一种。
4.权利要求2所述的用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征还在于端基封闭反应是用三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸乙酯盐酸盐或乙醇胺与产物中未反应完的醛基反应封端。
5.权利要求1所述的用于去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料在血液净化中的应用。
全文摘要
本发明提供一种从血浆中去除致病抗体及其复合物的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。公开了琼脂糖凝胶与葡萄球菌蛋白A(SPA)偶联的高分子材料，该材料以琼脂糖凝胶为载体基质，经环氧溴丙烷活化后，用多胺类试剂作为间隔臂，接与戊二醛反应，最后与蛋白A进行偶联，封端、还原双键而得到。该产品具有高度的安全性，利用它能够有效而且选择性地去除患者血浆中的致病抗体，尤其是免疫复合形式的致病抗体，可应用于临床上免疫吸附治疗。
文档编号B01J20/22GK101185878SQ20061012370
公开日2008年5月28日 申请日期2006年11月17日 优先权日2006年11月17日
发明者陈校园, 张旭锋, 汪志刚, 李光吉, 许春生 申请人:广州康盛生物科技有限公司, 华南理工大学