专利名称：稳定的蛋白质磷脂组合物及方法
技术领域：
本发明的背景知识本发明涉及蛋白质∶磷脂结构，适用于稳定能够转变成球形熔融状态的蛋白质的二级和三级结构。更具体地讲，本发明涉及稳定性提高的G-CSF∶磷脂组合物，能够用于G-CSF制剂和用于新型G-CSF转运载体。
已经证明几种蛋白质能转变成球形熔融状态(MGS)，Van derGoot，F.G.，Nature 354，408-410(1991)。球形熔融状态的蛋白质具有二级结构，这种结构类似于天然蛋白质，但缺少牢固的三级结构，Pitsyn et al.，FEBS Letters 2621，20-24(1990)。转变为这种状态有时会伴随蛋白质原来隐蔽的疏水区的暴露。重要的疏水残基暴露后，MGS可以成为蛋白质聚集和沉淀的中间体。将远UV区域的园二色性与芳香族侧链光谱(近UV区域的园二色性和荧光)相比较可检测出MGS的构象。在无远UV园二色性变化的情况下，球形熔融状态表现出芳族基团光谱变化，Bychkova et al.，FEBSLetters 238231-234(1988)，并且可能与某些蛋白质的膜渗透能力有关，Bychkova et al.，FEBS Letters 238231-234(1988)；Van der Goot，F.G.，Nature 354，408-410(1991)。
已知在聚集之前转变为MGS的两种蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。虽然这两种蛋白质在某些有限条件下可以稳定，但仍需要稳定蛋白质的二级和三级结构使这些物质的刺激功能寿命延长。
人重组G-CSF可选择性地刺激中性粒细胞，一种具有抗感染功能的白细胞。目前，Filgrastim，一种重组G-CSF可用于治疗。对于不同情况下的G-CSF的结构已经进行了深入的研究；Lu et al.，J.Biol.Chem.Vol.267，8770-8777(1992)。由于其疏水特性，延长刺激功能寿命的G-CSF很难合成。某些疏水蛋白质制剂后在长期贮存过程中由于二聚体和高度聚合物(大范围)的形成而丧失活性。贮存后也可能出现诸如脱氨基和氧化等其它化学变化。此外，G-CSF处方设备人员必需保护防止变性，尤其要注意保持蛋白质二级和三级结构的稳定性。
人的GM-CSF是一种22KDa糖蛋白，它是巨噬细胞和粒细胞的原始细胞在体外增殖所必需的，而且不能间断。GM-CSF也控制这些原始细胞不可逆的发育过程，形成粒细胞和巨噬细胞。其它生物学活性可以包括各种类型成熟细胞功能活性的调节，Gough et al.，Nature，309，763-767(1984)和对于识别的化学物源的化学趋向性增强，Williams et al.，Hematology，4th ed.(1990)。GM-CSF也能刺激单核细胞的产生，因此，可用于单核细胞性疾病的治疗，例如单核细胞减少症。
人GM-CSF可从多种来源制得并纯化。Burgess et al.，Blood，691，43-51(1987)在本发明之前就已介绍了重组人GM-CSF的生产方法。作为参考文献并于本发明的美国专利5,047,504(Boone)已经使非糖基化形式的GM-CSF作为原核宿主细胞表达产物进行商品规模大量生产。
过去处理像G-CSF和GM-CSF这样的蛋白质所尝试的一种方法是采用脂质体。脂质体是由不溶于水的极性脂(尤其是磷脂)形成的完全封闭的脂双层膜物质。脂质体载体可以有单一双层膜(单层状)，也可以有多层双层膜(多层状)。双层是由两个脂单层组成，脂层具有亲水的(极性)“头”区域和疏水的(非极性)“尾”区域，其中疏水的尾端朝向双层的中央，而亲水的头端朝向水相。磷脂成份的变化、温度的变化、含有固醇或结合了荷电的两性离子均可改变脂质体的稳定性、不变性和渗透性。脂质体的基本结构可用工艺中熟知的多种技术来构建。
在脂质体形成过程中，脂质体能在水通道中阻留水溶性溶质，并以不同的速率将其释放。由于发现脂质体能够将酶导入细胞并能改变细胞的代谢(Gregoriadis，New Engl.J.Med.295，704-710，765-770(1976))已经公认脂质体可解决靶药物转运的问题。将脂质体用作滞留在脂质体疏水层内或疏水核心内的药物、维生素和蛋白质的缓慢释放池，因此，在涉及到脂质体这种用途的制药工业中有大量的开发性研究。
脂质体作为药物载体的成功应用受到限制，因为进行这种用途尝试的研究人员遇到一些问题。例如，已知脂质体对于捕获的抗原是强效的免疫佐剂，当脂质体中捕获了酶或异种来源的其它蛋白质时必须要注意。此外，药物的扩散速率也难以控制。这是脂质体固有的不稳定性和某些血液成份的存在所起的一种作用，这些血液成份可加速某些药物的扩散。此外，从性质上来讲有些物质与脂质体结合并不牢固，因此在循环系统中迅速扩散。最后，靶向作用于肝和脾以外的任何细胞或器官已成为一个问题。关于脂质体、与脂质体结合的物质和将脂质体用作药物载体的有关问题，由Gregory Gregoriaidis撰写的“脂质体”是一篇极好的综述，该文见Drug Carriers in Biologyand Medicine，Chapter 14，287-341(Academic Press，N.Y.1979)。
尽管试图将脂质体用作药物载体的有关报道已有很多，但是通过稳定肽和/或蛋白质结构来延长治疗性肽或蛋白质的功能寿命，有关将脂质体用于这一目的的研究却没有什么发现。在题为“治疗性肽和蛋白质”的PCT/US 90/05163中Hostetler et al.发现空的脂质体可用作药用稀释剂来溶解多肽和/或蛋白质以避免多肽和/或蛋白质在气/水界面上积累并防止多肽和/或蛋白质在容器表面吸附。Hostetler et al.发现带有负电荷的磷脂可以加到最多至50摩尔％，而且磷脂酰胆碱，一种中性磷脂，是优选的脂质体。Hostetler etal.没有发明能够稳定多肽和/或蛋白质结构的稀释剂。
在题为“肿瘤坏死因子的脂质体合成的制备过程和特性分析”的PCT/US 91/07694(Hung et al.)中，介绍了连接于表面的或用脂质体包裹的亲脂性经修饰的肿瘤坏死因子(TNF)分子。据报道带有脂质体的亲脂性TNF分子能提高体内稳定性。稳定性是指TNF-脂质体连接体向体内系统渗漏降低或降低的趋势。优选的脂质体是天然脂类。Hung et al.没有发明所含赋形剂对蛋白质结构具有稳定作用的TNF组合物。
从文献中得不出任何有关这样的结论，即将蛋白质(例如G-CSF)与带有负电荷的脂载体相结合，由此直接稳定蛋白质以防止热诱导性聚集、变性、失活和二级结构展开。目前需要这样的组合物，即有利于应用在需要高温的制剂方法中以及有利于用作新型转运载体(例如pegylated G-CSF口服给药)的组合物。本发明即提供了这样的组合物。
本发明的简要说明本发明涉及将疏水赋形剂，例如溶血磷脂或其它脂质体添加到球形熔融状态蛋白质上，这样能直接稳定蛋白质的二级和三级结构，由此可保护蛋白质以防止热诱导性聚集、变性和失活。本发明尤其涉及稳定的G-CSF∶磷脂组合物。出乎意料的是，优选的G-CSF在10-95℃可以循环使用数次，经冷却后蛋白质完全恢复二级结构。在用于需要高温的制剂步骤中以及用于新型G-CSF转运载体中，该组合物具有双重优点。
在优选的实施方案中，蛋白质∶磷脂复合物含有带负电荷的脂质体，该脂质体选自二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、蛋磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、蛋磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酸(DOPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、蛋磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸。尤其优选的是DOPG，一种带有负电荷的不饱和磷脂。本发明还要求pH保持在3.0-7.5的范围内，脂与蛋白质的比率至少为10∶1。
用于本发明优选实施方案的其它成份包括在蛋白质∶磷脂复合物中采用经化学修饰的蛋白质以及采用下述一种或多种试剂等渗调节剂、缓冲剂和pH调节剂。正如具有本技术领域知识的技术人员所了解的那样，本发明包括具有这些额外成份不同组合的稳定的蛋白质∶磷脂组合物。
附图的简要说明
图1描述了DOPG载体存在(曲线1)和不存在(曲线2)时rhG-CSF的荧光发射光谱。rhG-CSF的浓度为0.2mg/ml。DOPG与rhG-CSF的比率(曲线1)为100∶1(摩尔∶摩尔)。
图2显示增大脂与蛋白质的比率对rhG-CSF荧光的影响。F。是起始荧光(无脂)，F是指加入脂达到所示的脂与rhG-CSF的摩尔比后的荧光。图2(a)表明DOPG∶rhG-CSF混合物的F/F。(n)和最大发射波长(△)。图2(b)表示DOPC∶rhG-CSF混合物的F/F。(n)和最大发射波长(△)。
图3显示在DOPG载体不存在(●)和存在(○)时用KI使rhG-CSF荧光熄灭的Stern-Volmer图。熄灭实验的进行是向rhG-CSF(0.2mg/ml)和DOPG∶rhG-CSF(100∶1摩尔)中加入等分量的KI。
图4描述了加入芘癸酸后rhG-CSF色氨酸荧光的熄灭。发射波长是327nm。DOPG与rhG-CSF的比率为100∶1(摩尔)。
图5是显示在各种脂不存在和存在时rhG-CSF的F强度变化比较图。在每一种情况下脂与蛋白质的比率均为100∶1(摩尔)。
图6是在各种脂不存在和存在时rhG-CSF的最大发射光波长变化的比较图。每一种情况下脂与蛋白质的比率均为100∶1(摩尔)。
图7显示DMPC(曲线2)、DMPG(曲线3)和DMPA(曲线4)对rhG-CSF的CD(曲线1)的影响。在每一种情况下脂与蛋白质在水中的比率均为50∶1(摩尔)，pH6.0。
图8显示温度升高对rhG-CSF(曲线1)或DOPG∶rhG-CSF(140∶1摩尔)(曲线2)的CD的影响。rhG-CSF在水中的浓度为80μg/ml，pH6.0。温度变化范围为10-90℃，变化速率为100℃/小时。
图9显示rhG-CSF(曲线1)和DOPG∶rhG-CSF(45∶1摩尔)(曲线2)的差示扫描量热学温度自记曲线。样品中rhG-CSF的浓度为1mg/ml(水中，pH7.0)。温度变化速率为90℃/小时。
图10显示温度循环变化对rhG-CSF(曲线1)和DOPG∶rhG-CSF(140∶1摩尔)(曲线2)的CD的影响。如箭头所示，样品快速加热至95℃，再冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度为80μg/ml，pH6.0。
图11显示温度循环变化对rhG-CSF(曲线1)和DMPG∶rhG-CSF(150∶1摩尔)(曲线2)的CD的影响。样品加热至95℃，再冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度为80μg/ml，pH6.0。
图12显示温度循环变化对rhG-CSF(曲线1)和DPPG∶rhG-CSF(150∶1摩尔)(曲线2)的CD的影响。样品加热至95℃，再冷却到10℃。样品中rhG-CSF浓度为80μg/ml，pH6.0。
图13是显示各种脂稳定冻干过程中的rhG-CSF的能力的图。在每一种情况下脂与蛋白质的比率均为100∶1。稳定性是以骨髓分析试验中体外活性的保持为基础的。由于单纯rhG-CSF在冻干处理后不能保持其活性，所以采用的对照是在脂不存在的条件下的未经冻干的rhG-CSF。
图14显示各种脂对rhG-CSF体内活性的影响。仓鼠皮下注射后测定活性(WBC计数)。rhG-CSF的剂量为100μg/kg，其中脂与蛋白质的比率为100∶1。
图15显示各种脂对rhG-CSF体内活性的影响。仓鼠皮下注射后测定活性(WBC计数)。rhG-CSF的剂量为100μg/kg，其中脂与蛋白质的比率为50∶1。
图16是显示在不同pH值下DOPG不存在和存在时CHO-G-CSF的F强度变化的比较图。在各种情况下脂与蛋白质比率均为100∶1(摩尔)。
图17是显示在不同pH值下DOPG不存在和存在时CHO-G-CSF的最大发射光波长变化的比较图。在各种情况下脂与蛋白质的比率均为100∶1(摩尔)。
图18显示温度循环变化对PEG-G-CSF(——)和DMPG∶PEG-G-CSF(17∶1摩尔)(……)的CD的影响。样品加热至90℃，再冷却到10℃。
图19显示(a)温度循环变化对PBS(pH7.0)中GM-CSF的CD的影响。10℃时的GM-CSF(——)与加热至90℃再冷却到10℃的GM-CSF(……)相比较；(b)温度循环变化对DPPG∶PEG-G-CSF(17∶1摩尔)的CD的影响。10℃时的DPPG∶GM-CSF(——)与加热至90℃再冷却到10℃的DPPG∶GM-CSF(……)相比较详细描述在下面的讨论中详细介绍了本发明的组合物并通过以下提供的实施例加以说明。实施例说明了本发明的各个方面并且包括不同的蛋白质∶磷脂组合物的稳定性和生物学活性结果。出乎意料的是蛋白质与脂载体的相互作用直接稳定了蛋白质的蛋白结构，因此，即使在脂不存在时可导致蛋白质变性的条件下也能发挥对蛋白质的稳定作用。
本发明实际考虑使用的是能转变成球形熔融状态的多种蛋白质。考虑使用的蛋白质的实例是细胞因子，包括各种造血因子例如上述的G-CSF、GM-CSF、M-CSF、干扰素(α、β和γ)、内白细胞因子(1-11)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子、干细胞因子、神经生长因子、BDNF、NT3、血小板合成的生长因子和肿瘤生长因子(α、β)。也可以评价其它蛋白质转变成MGS的能力。如果所研究的蛋白质能够转变为MGS，那么该蛋白质可以与带有负电荷的脂质体载体结合并评价其稳定作用。
一般来讲，用于本发明实施的G-CSF可以是从哺乳动物器官中分离纯化的天然形式，或者可以是化学合成步骤的产物，或者是由基因组或cDNA克隆或由基因合成获得的外源性DNA序列的原核细胞或真核细胞宿主表达的产物。适当的原核细胞宿主包括各种细菌(例如大肠杆菌)细胞。适当的真核细胞宿主包括酵母(例如啤酒酵母株)细胞和哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢、猴)细胞。G-CSF表达产物可以是经哺乳动物或其它真核细胞生物的碳水化合物糖基化的形式，或者也可以是非糖基化的形式，这取决于所采用的宿主。尽管重组的G-CSF，尤其是源于大肠杆菌的重组体，出于商品化生产最为实用方面的考虑是优选的，但本发明考虑采用任一种和所有这些形式的G-CSF。
用于本发明中有待化学修饰的G-CSF也可以是天然人G-CSF(nhG-CSF)或者重组核酸方法的产物，例如原核或真核宿主细胞的表达产物。一般来讲，考虑采用的化学修饰是将化学部分连接到G-CSF分子上。介绍蛋白质修饰和融合蛋白质的综述文章是Francis，Focus on Growth Factor 34-10(May 1992)(publishedby Mediscript，Mountview Court，Friern Barnet Lane，London N20 OLD，UK)。例如，参见题为“经化学修饰的粒细胞集落刺激因子”的EP 0 401 384，该文介绍了制备G-CSF的物质和方法，其中聚乙二醇分子连接到G-CSF上。连接物可以是用化学键直接连接到蛋白质上或连接到作为与活性剂相连的桥的部分。优选的是共价键，它对于连接物最为稳定。化学修饰可能有助于G-CSF的控制，持久或扩展作用。例如，它可以具有控制经化学修饰的G-CSF到达循环系统的时间长短。聚乙二醇组合物，包括其衍生物就是化学修饰剂的一个例子。
只要是给药后能产生效力的任何经化学修饰的G-CSF制剂均考虑用于本发明的实施。效力可用本领域技术人员所熟悉的已知方法来测定。pegylated G-CSF，特别是pegylated大肠杆菌合成的G-CSF，尤其是三-四pegylated大肠杆菌合成的G-CSF是优选的。
已报道G-CSF在酸性条件下最稳定，虽然pH在2.5-5.0范围内时，G-CSF出现构象变化，包括三级结构松散及c-螺旋结构增加。Narhi et al.，J.Protein Chem.10，359-367，(1991)。这种构象变化是球状熔融状态(MGS)的特征。因此，正如处方设计人员在处理能转变成MGS的其它蛋白质时那样，处理G-CSF的处方设计人员必须保护该蛋白质防止其热诱导性二级和三级结构的展开，以避免聚集和变性。
用于本发明的GM-CSF可以是从哺乳动物器官分离纯化的天然形式或者是由基因组或cDNA克隆或由基因合成获得的外源性DNA序列的原核细胞或真核细胞宿主的表达产物。适当的原核细胞宿主包括各种细菌(例如大肠杆菌)细胞。适当的真核细胞宿主包括酵母(例如啤酒酵母株)细胞和哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢，猴)细胞。GM-CSF表达产物可以是经哺乳动物或其它真核细胞碳水化合物糖基化的形式，或者也可以是非糖基化形式，这取决于所采用的宿主。本发明计划采用任一种和所有这些形式的GM-CSF，尽管出于商品生产最实用方面的考虑重组GM-CSF，尤其是大肠杆菌合成的GM-CSF是优选的。
用于本发明组合物的脂载体是那些带有负电荷的能够与所研究蛋白质相互作用的脂质体。考虑采用的具体的脂质体包括二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、蛋磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、蛋磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酸(DOPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、蛋磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸。脂质体用量可以不同，这取决于所用的具体的脂质体。
蛋白质∶磷脂组合物最好包括缓冲剂，以便将溶液的pH保持在所需的范围内。优选的缓冲剂包括醋酸钠、磷酸钠和柠檬酸钠。也可应用这些缓冲剂的混合物。用于组合物的缓冲剂的量主要取决于所用的具体缓冲剂和溶液的pH。例如，醋酸盐作为缓冲剂在pH5时要比pH6时更为有效，所以溶液在pH5时所用醋酸盐的量可能要比pH6时少，本发明组合物优选的pH范围是3.0-7.5。
本发明组合物还可以包括等渗调节剂，使溶液等渗并且更适合于注射。最优选的等渗调节剂是浓度在0-150mM范围内的氯化钠。
本发明还包括药物组合物，其中含有有效量的本发明多肽产物以及药用稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这些组合物会影响蛋白质的物理状态、稳定性和生物利用度。参见，例如Remingtons Pharmaceutical Sciences，18th Edition，1435-1712(Mack Publishing Co.，Easton，PA.，1990)，该文作为参考并入本文。在特定情况下确定蛋白质有效量的标准取决于具有专业知识的技术人员所考虑的许多因素，包括所需要的治疗效果，待治疗的病症的严重程度，患者的身体状况等等。
在采用由大肠杆菌合成的rhG-CSF的一个优选实施方案中，所用的脂质体载体是DOPG，DOPG与G-CSF的比率为50∶1，pH4.5，其中含有10mM的醋酸钠。
在采用由大肠杆菌合成的rhGM-CSF的一个优选实施方案中，所用的脂质体载体是DMPG，DMPG与GM-CSF的比率是17∶1，pH7.0，采用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。
在采用由大肠杆菌合成的并经化学修饰(pegylated)的rhG-CSF的一个优选实施方案中，rhG-CSF是三-四pegylated，所用脂质体载体是DMPG，DMPG与PEG-G-CSF的比率为17∶1，pH4.5。
虽然已经从具体的蛋白质∶脂组合物和治疗方法方面对本发明作了介绍和说明，但是对具有一般技术的专业人员来说，在本发明的范围内可能还存在许多相关组合物及治疗方法，这是显而易见的。
下面的实施例将更详细地说明本发明的各个方面。
实施例1进行初始实验以考察将重组人G-CSF(rhG-CSF)结合到脂载体中的可能性。rhG-CSF是用重组DNA技术来生产，在该技术中用美国专利No.4,810,643 to Souza所介绍的编码人G-CSF的DNA序列来转染大肠杆菌细胞。在稀HCl中将rhG-CSF制备成4mg/ml溶液，pH4.0。所有脂由Avanti Polar Lipids(Alabaster，Ala)制得，液氮中-20℃贮存，氯仿中最终浓度为100mg/ml。
G-CSF∶磷脂复合物的制备为制备用于与G-CSF相结合的脂载体，将30μmol的适当的脂置于玻璃试管中，用氮气流将其干燥成薄膜。脂膜真空脱水至少2小时以除去微量残留的氯仿。用1ml的去离子水(ddH2O)，磷酸盐缓冲的盐水，pH7.2(Gibco/BRL“D-PBS”)，或者用1ml的150mMNaCl将脂膜水合。然后在浴式超声波仪(Laboratory Supplies，Hicksville，N.Y.)中将样品进行超声处理。超声处理继续进行直至用肉眼观察变为透明(通常需10-15分钟)。样品在氮气氛下4℃贮存待用。脂的最终浓度为30mM。另一种方法是可以取300μmol的脂氮气下干燥并按上述方法干燥来制备脂载体。干燥的脂膜用10ml上述适当的水溶液水合。然后用小型乳化仪(Microfluidics Model110S，Microfluidics，Inc.Cambridge，MA)将样品微量流化，在10000psi下操作。样品在仪器中循环10次，然后将微量流化样品按上述方法4℃贮存。
将G-CSF(如上述)与特定的脂(如上述)混合来制备G-CSF∶磷脂复合物。采用涡旋、搅拌或轻微振荡进行混合。制备不同摩尔比的脂∶G-CSF以评价蛋白质的膜插入和稳定作用。例如，要制备G-CSF为0.2mg/ml脂与G-CSF的摩尔比为40∶1的3ml样品(在水中)，将150μl的G-CSF贮存液与44μl的脂(经超声波处理在水中制备的30mM贮存液)相混合，再加入水使样品的最终体积为3ml。在使用或分析样品之前建议(但并非必需)孵育5分钟，本实施例采用了孵育。
G-CSF也可以与微量流化之前的水合脂相混合。继而将混合液按上述方法进行微量流化，这样可使G-CSF结合到脂膜中。
G-CSF∶磷脂复合物的分析1.色氨酸发射光谱rhG-CSF中有两个对局部环境状况十分敏感的色氨酸残基。因此，当rhG-CSF与脂质体结合时测定rhG-CSF色氨酸荧光进行分析。荧光最大发射波长的兰色波长漂移提示色氨酸处于更疏水的环境中，因此rhG-CSF是嵌入在脂膜中。由J.Lakowicz编写的荧光显微镜学原理第11章(Plenum Press，New York，1983)是色氨酸荧光分析方面一篇极好的综述。
在280nm处激发样品并且从285nm至420nm扫描发射光，间距为1nm，速率为1nm/秒，由此测定G-CSF∶脂复合物(如上述)的色氨酸荧光。样品体积为3ml，所有样品的G-CSF最终浓度为0.2mg/ml。脂与G-CSF的比率变化。采用PTI Alphascan荧光计(SouthBrunswick，NJ)进行所有的荧光测定。所有测定均在25℃进行，这一温度是采用与循环水浴相连的水套玻璃试管架来保持的。发射光谱是采用PTI提供的数据管理软件来收集和分析。
在由DOPG组成的小的单层状载体存在和不存在时rhG-CSF的荧光光谱见图1。rhG-CSF的DOPG载体不存在时在334nm处具有发射光最大值。在DOPG存在时，脂与蛋白质的比率为100∶1，rhG-CSF色氨酸荧光表现出荧光发射最大值的兰色波长漂移至327nm处和荧光强度的显著增强。在DOPG存在时荧光发射波长短提示色氨酸所处环境要比天然蛋白质更具疏水性。如图2所示，荧光波长漂移变化取决于DOPG∶G-CSF的摩尔比，只要DOPG∶G-CSF的比率达到10∶1，则可检出膜插入。2.碘化物熄灭实验碘化物是色氨酸荧光有效的碰撞熄灭剂，但它不能穿过脂膜。因此，碘化物导致的色氨酸荧光有效熄灭说明残基暴露于大量的水溶剂，然而，当蛋白质色氨酸从水溶剂中分离出去时则出现无碘化物熄灭的保护现象。在这些实验中采用了G-CSF和DOPG∶G-CSF组合物(脂∶蛋白质的比率为100∶1)。读取并记录样品的初始读数(F。)后，增加碘化钾(KI)(5M贮存液)的加入量，再测定荧光强度。按照Lee et al，Biochem.Biophys.Acta，984174-182(1989)和Le Doan et al.，Biochem.Biophys.Acta，8581-5(1986)介绍的方法将样品和KI溶液都制备成含有1mM Na2SO3(最终浓度)。加入Na2SO3可防止I2的形成，I2能渗透到蛋白质和膜的非极性区域中。用Stern-Volmer方程(F。/F＝1＋KKI[KI])来分析数据，其中F。和F分别是KI不存在和存在时的样本荧光强度，KI浓度为[KI]，KKI是KI熄灭G-CSF色氨酸残基的Stern-Volmer熄灭常数；kehrer，S.，Biochemistry103254-3263(1979)。
数据的Stern-Volmer图见图3。在DOPG载体不存在时KI可有效地熄灭rhG-CSF荧光。在DOPG存在时数据的Stern-Volmer图是线性的，说明碘化物难以接近两个色氨酸。数据表明DOPG不存在时碘化物可接近的色氨酸残基在DOPG存在时则变为碘化物不可接近的。因此，rhG-CSF含有这种色氨酸的部分一定是嵌入在DOPG双层中。3.能量转移测定如前所示，能量转移可以出现在色氨酸供体和诸如芘癸酸这样的脂溶性荧光受体之间，因为这种探测物的激发光谱与色氨酸的发射光谱明显重迭，Friere et al.，Biochemistry 221675-1680(1983)。如果蛋白质插入脂膜中，从色氨酸到芘的能量转移将导致色氨酸荧光的熄灭。在本实验中记录了加入不同量的芘癸酸(30μg/ml在四氢呋喃中的贮存液)之前(F。)和之后(F)各种G-CSF∶脂复合物的色氨酸发射光强度。在加入芘癸酸的过程中不断搅拌样品以促进芘癸酸与样本的混合。F/F。比值与出现在G-CSF色氨酸和疏水性能量受体芘癸酸之间的能量转移的量成比例。
图4显示了在DOPG(脂∶蛋白质比率为100∶1)存在时rhG-CSF的荧光熄灭情况将随着加入的芘癸酸而变化。在芘癸酸浓度很低时(＜1摩尔％)即出现荧光熄灭，所以荧光探测物对膜结构和膜行为的影响是最小的。因为芘癸酸被认为是能迅速渗透到脂双层中，所以本例数据说明rhG-CSF是嵌入在DOPG膜中，其深度足以使能量从色氨酸到芘受体发生有效转移。通过测定rhG-CSF存在和不存在时芘癸酸标记的DOPG载体的激发光谱便可证实能量转移。
上述分析表明rhG-CSF与象DOPG这样的不饱和磷脂之间可以密切地相互作用。在DOPG载体存在时，rhG-CSF色氨酸受到保护，免受水溶性荧光熄灭剂的作用，但是对于由于能量转移到疏水性荧光探测物中而引起的荧光熄灭却很敏感。总的来讲，数据表明rhG-CSF可以插入到由DOPG组成的膜中。只要比率(脂∶G-CSF)达到10∶1便可检出膜插入，而且这数值可能代表蛋白质插入部分周围的脂的数量。实施例2在本实施例中，采用如上所述的F/F。强度与发射光最大波长的比较，测定了rhG-CSF与其它磷脂相互作用的能力。在各种情况下，脂∶rhG-CSF的摩尔比率均为100∶1。
图5显示了在各种脂不存在和存在时rhG-CSF的F/F。数据。图6显示了同一组合物的发射光最大波长数据。图5和图6的数据说明，除DOPG外，rhG-CSF能插入到DMPG和DPPG中，插入到磷脂酰乙醇胺(PE’s)和磷脂酰丝氨酸(PS’s)中的有效性较差。此外，发现N G-DOPG(DOPG样品，其中PE的头端基团的负电性更强)对于改善rhG-CSF的插入作用要比DOPG更为适用。
DOPC、DMPC和DPPC是中性脂，这些载体对于rhG-CSF的发射光最大波长或荧光强度几乎没什么影响，说明与这些磷脂并没有发生相互作用(见图5、图6和图7的曲线2)。
以上数据说明能转变成球形熔融状态的蛋白质可以插入到各种脂载体中。然而，只有采用带有负电荷的脂载体时这种rhG-CSF∶脂的相互作用才出现。在带有负电荷的脂载体中，那些负电性较强的载体似乎可产生更强的rhG-CSF∶脂的相互作用。实施例3在本实施例中测定了rhG-CSF∶DOPG相互作用的影响，因为它与蛋白质的稳定性有关。在配有Peltier型恒温细胞架和磁性搅拌器的Jasco J-720仪器上进行园二色性测定。采用rhG-CSF最终浓度80μg/ml，pH6.0测定了222nm处的园二色性。采用MicrocalMC-2量热计进行了差示扫描量热学测定。rhG-CSF(1mg/ml，水中)或DOPG∶rhG-CSF(45∶1摩尔/摩尔，水中)的样品扫描速率为90℃/小时。采用Microcal软件贮存和分析数据。
通过测定园二色性(222nm)随着升高的温度的变化，可以监测G-CSF的α-螺旋温度诱导性变化。rhG-CSF在pH6.0时的热诱导性展开见图8。曲线表明在约60-70℃时出现一个相当急剧的转变，这导致α-螺旋的消失。这一转变之后rhG-CSF从溶液中不可逆地沉淀出。展开的温度范围与图9所示的差示扫描量热法测定的rhG-CSF在pH7.0时熔融温度相似。
通过对比，DOPG∶rhG-CSF样品表现出随温度升高α-螺旋逐渐消失，与单纯rhG-CSF不同，DOPG∶rhG-CSF的温度诱导性展开似乎不呈对应关系(见图8)。如差示扫描量热法测定(图9)所示的熔融转变的缺乏也证实了这一结论。很明显，DOPG∶rhG-CSF样品加热至95℃后能恢复α-螺旋，并且能在95℃和10℃之间反复循环，冷却后可完全恢复螺旋结构(见图10)。在这些条件下，单纯rhG-CSF不可逆性展开并从溶液中沉淀出来。
也测定了DMPG和DPPG对G-CSF园二色性的影响。所用的脂∶rhG-CSF的比率为150∶1，与DOPG的情况一样，DMPG和DPPG也能稳定rhG-CSF的二级结构(图11-13)。
这些数据说明rhG-CSF与DOPG、DMPG和DPPG相互作用在单纯rhG-CSF不稳定的情况下能提高蛋白质的稳定性。相互作用可直接稳定rhG-CSF的二级和三级结构。
实施例4在本实施例中测定了rhG-CSF∶DOPG相互作用的影响，因为它与rhG-CSF的生物学活性有关。如Zsebo et al.，Immunobiology172175-184(1986)所述，rhG-CSF的体外活性测定利用小鼠骨髓细胞对[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷的G-CSF依赖性吸收。所有的活性测定均采用三份平行样品。体内活性测定采用仓鼠皮下注射(rhG-CSF剂量为100μg/kg)和白细胞(WBC)计数测定。1.体外活性A.测定了DOPG不存在和存在时rhG-CSF的特异活性。也检测了经热处理的rhG-CSF和DOPG∶rhG-CSF样品。结果总结于表1。
表1样品 特异活性(U/mg/蛋白质)rhG-CSF 0.66±0.09rhG-CSF(加热)a未检出DOPG∶rhG-CSFb0.61±0.11DOPG∶rhG-CSFb(加热)a0.52±0.08a进行测定之前样品在85℃水浴中孵育10分钟。
bDOPG∶rhG-CSF的比率为50∶1(摩尔/摩尔)。
如表1所示，DOPG双层中的插入对于rhG-CSF生物学活性并无不良影响。加热至85℃维持10分钟之后rhG-CSF的活性不能检出而且蛋白质沉淀。经相似的处理后DOPG∶rhG-CSF保留了未经加热的rhG-CSF的约85％的活性，冷却后完全恢复了二级结构。
B.也研究了在冻干过程中各种脂稳定rhG-CSF的能力。将与各种脂结合的rhG-CSF样品冻干并分析(如上述)活性。DOPG、DMPG和DPPG与rhG-CSF混合时，冻干后可以保留约100％rhG-CSF的生物活性(图14)。单纯rhG-CSF在冻干处理后不能保留其活性。2.体内活性测定了脂不存在和存在时rhG-CSF的活性(WBC计数)。皮下注射(rhG-CSF剂量为100μg/kg)后第0天测定活性。分析了5种不同的脂∶rhG-CSF复合物，在每一种情况下脂∶rhG-CSF复合物均保留了体内活性(图15和图16)。
上述研究说明带有负电荷的脂双层中的插入对于rhG-CSF的生物学活性并无不良影响。此外，脂的保护作用似乎可保护冻干过程中的rhG-CSF。
实施例5在本实施例中对于经化学修饰的G-CSF(pegylated G-CSF(PEG-G-CSF))和作为真核宿主细胞表达产物而制得的G-CSF(CHO-G-CSF)测定了它们与带有负电荷的脂载体相互作用的能力。对于CHO-G-CSF，采用F/F。强度和发射光最大波长比较的方法(如上述实施例1中所述)进行测定。在各种情况下脂∶蛋白质的摩尔比均为100∶1。对于PEG-G-CSF，其测定是以园二色性分析为基础。
所用的CHO-G-CSF是用重组DNA技术来生产的，在该技术中用美国专利No.4,810,643 to Souza所介绍的编码人G-CSF的DNA序列来转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。用PBS将CHO-G-CSF制备成0.6mg/ml的溶液，pH7.0。CHO-G-CSF被证明可与DOPG相互作用，其方式与rhG-CSF相似，每一样品表现出在DOPG存在时荧光强度增大以及在DOPG存在时发射光最大波长的兰色波长变化(图17和图18)。因此，DOPG相互作用并不是由于G-CSF的重组形式的某种特性。
在这些实施例中所用的PEG-G-CSF均为三-四pegylated大肠杆菌合成的G-CSF(采用PEG8000)。采用上述方法制备DMPG∶PEG-G-CSF(17∶1摩尔/摩尔)样品。发现DMPG∶PEG-G-CSF样品在加热后可完全恢复二级结构(图19)。尽管存在PEG分子，衍生的蛋白质仍能以与天然蛋白质相同的方式与脂相互作用。
以上数据表明与G-CSF和带有负电荷脂载体之间的相互作用有关的稳定作用仅对于作为原核宿主细胞表达产物而获得的rhG-CSF来说并非是唯一的。能够转变为MGS并与脂质体载体结合的经化学修饰的蛋白质，这里即PEG～G-CSF∶DMPG，也表现出稳定作用。实施例6在本实施例中研究了DMPG和DPPG对G M-CSF的作用。GM-CSF是美国专利No.5,047,504 to Boone中介绍的重组人GM-CSF，并且用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)制备成1mg/ml溶液，pH7.0。所用的脂∶GM-CSF比率为17∶1，采用上述的园二色性分析测定热稳定性。DMPG和DPPG可使GM-CSF具有更好的热稳定性，也就是说加热后可恢复二级结构(图20a和图20b)。
这些数据提供了一种蛋白质的另一个实例，这种蛋白质能转变成球形熔融状态并与带负电荷的脂载体相互作用使该蛋白质具有更好的热稳定性。
权利要求
1.一种含有能转变成球形熔融状态与脂质体载体结合的蛋白质的组合物，该脂质体载体带负电荷。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物的pH为3.0-7.5并且所含脂∶蛋白质的比例至少为10∶1。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述脂质体载体选自二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、蛋磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、蛋磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酸(DOPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、蛋磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
4.根据权利要求1的组合物，其中所述蛋白质是细胞因子。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述细胞因子是造血因子。
6.根据权利要求5的组合物，其中所述造血因子选自G-CSF和GM-CSF。
7.根据权利要求5的组合物，其中所述造血因子是G-CSF。
8.根据权利要求7的组合物，其中G-CSF是天然人G-CSF或者是作为原核或真核宿主细胞表达产物而制得的。
9.根据权利要求7的组合物，其中G-CSF是经化学修饰的G-CSF。
10.根据权利要求9的组合物，其中经化学修饰的G-CSF是pegylated G-CSF。
11.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物含有药用辅料。
12.根据权利要求1的组合物，其中所述蛋白质是由大肠杆菌合成的rhG-CSF，其中所述脂质体载体是DOPG，其中所述组合物中DOPG∶rhG-CSF的比率为50∶1，pH为4.5，并含有10mM醋酸钠。
13.制备一种蛋白质组合物的方法，包括将蛋白质与脂质体载体结合，其中所述蛋白质能够转变成球形熔融状态，其中所述脂质体载体带有负电荷。
14.根据权利要求12的方法，其中所述组合物的pH为3.0-7.5，并且脂∶蛋白质的比率至少为10∶1。
15.根据权利要求12的方法，其中所述脂质体载体选自二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、蛋磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、蛋磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酸(DOPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、蛋磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
16.根据权利要求12的方法，其中所述蛋白质是细胞因子。
17.根据权利要求15的方法，其中所述细胞因子是造血因子。
18.根据权利要求16的方法，其中所述造血因子选自G-CSF和GM-CSF。
19.根据权利要求17的方法，其中所述造血因子是G-CSF。
20.根据权利要求18的方法，其中G-CSF是天然人G-CSF或者是作为原核或真核宿主细胞表达产物而制得的。
21.根据权利要求18的方法，其中G-CSF是经化学修饰的G-CSF。
22.根据权利要求20的方法，其中经化学修饰的G-CSF是pegylated G-CSF。
23.根据权利要求12的方法，其中所述组合物含有药用辅料。
全文摘要
本发明涉及蛋白质的稳定组合物及有关方法，其中能转变成球形熔融状态的蛋白质与带有负电荷的脂载体相结合，由此稳定蛋白质以免热诱导性聚集、变性和失活。蛋白质磷脂复合物直接稳定蛋白质的二级和三级结构，该组合物适用于高温制剂和新型转运载体。
文档编号A61P7/00GK1117266SQ94191101
公开日1996年2月21日 申请日期1994年9月29日 优先权日1993年10月6日
发明者D·科林斯, Y·S·查 申请人:安姆根有限公司