使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢障碍的方法

使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢障碍的方法
【专利摘要】提供了使用GDF15多肽治疗代谢疾病和障碍的方法。在各个实施方案中，代谢疾病或障碍是2型糖尿病、肥胖、血脂异常、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平以及糖尿病性肾病。
【专利说明】使用生长分化因子15(GDF-15)治疗或改善代谢障碍的方法
[0001]本申请要求2011年4月8日提交的美国临时申请号61 / 473，583的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
发明领域
[0002]本公开发明涉及通过对有此需要的受试者施用治疗有效量的GDF15来治疗或改善代谢障碍例如2型糖尿病、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平、血脂异常、肥胖或糖尿病性肾病。
[0003]发明背景
[0004]生长分化因子15(⑶F15)是TGF0超家族的分支成员。其也称为巨噬细胞抑制细胞因子 I(MICl) (Bootcov MR, 1997, Proc Natl AcadSci94:11514-9.)、胎盘骨形态发生因子(PLAB) (Hromas R1997, Biochim Biophys Acta.1354:40-4.)、胎盘转化生长因子β (PTGFB) (Lawton LN1997, Gene.203:17-26)、前列腺衍生因子(PDF) (Paralkar VM1998,J Biol Chem.273:13760-7)和非类固醇抗炎药物活化基因(NAG-1) (Baek SJ2001, J BiolChem.276:33384-92)。
[0005]人⑶F15基因位于染色体19pl3.2-13.1上；大鼠⑶F15基因位于染色体16上；以及小鼠⑶F15基因位于染色体8上。⑶F15开放阅读框横跨两个外显子(Bottner M1999，Gene.237:105-11和NCBI)。成熟GDF15肽与其它家族成员共有低同源性(Katoh M2006,IntJMolMed.17:951-5.)。
[0006]⑶F15被合成为大的前体蛋白质,所述蛋白质在二元切割位点(dibasic cleavagesite)上被切割以释放羧基端`成熟肽。小鼠和大鼠⑶F15前体肽原(prepro-peptide)都包含303个氨基酸。人全长前体包含308个氨基酸。啮齿类动物成熟肽在于RGRR(SEQ IDNO:13)切割位点加工后包含115个氨基酸。人成熟肽在于RGRRRAR(SEQ IDN0:14)切割位点加工后包含112个氨基酸。人成熟⑶F15肽与大鼠和小鼠成熟⑶F15肽共有66.1%和 68.1 % 的序列相似性(Bottner M1999，Gene.237:105-11 ；Bauskin AR2000，EMB0 J.19:2212-20 ；NCBI)。在成熟⑶F15肽中不存在糖基化位点。
[0007]成熟GDF15肽包含形成半胱氨酸结基元所需的7个保守半胱氨酸残基和对于TGF^超家族成员是常见的单个链间二硫键。成熟肽还包含形成第4链间二硫键的两个另外的半胱氨酸残基。生物活性GDF15是通过一个链间二硫键共价连接的成熟肽的25kD同
二聚体。
[0008]已报道⑶F15循环水平在多个病理和生理状况，最明显地怀孕(Moore AG2000.JClinEndocrinolMetab85:4781-4788)、 β-地中海贫血(Tanno Τ2007, Nat Medl3:1096-101) (Zimmermann MB,2008Am JClin Nutr88:1026-31)、先天性红细胞生成障碍性贫血(Tamary H2008,Blood.112:5241-4)中升高。在文献报道中，⑶F15还与多种生物活性关联。⑶F15敲除和转基因小鼠的研究表明⑶F15可防止局部缺血/再灌注或过载诱发的心脏损伤(Kempf T, 2006, CircRes.98:351-60) (Xu J，2006，Circ Res.98:342-50)、防止年龄相关运动神经元和感觉神经元损失(Strelau J, 2009, JNeurosc1.29:13640-8.)、适度防止肾的代谢性酸中毒，并且可引起癌症患者的恶病质(cachexia) (Johnen H2007Nat Med.11:1333-40)。许多研究小组还研究了 GDF15在细胞凋亡和增殖中的作用，并且使用不同的细胞培养物和异种移植物模型报道了有争议的结果。关于转基因小鼠的研究显示⑶F15防止致癌物或Apc突变诱导的肠和肺中的瘤形成(Baek SJ2006, Gastroenterology.131:1553-60)(Cekanova M2009, Cancer PrevRes2:450-8.)。
发明概要
[0009]提供了治疗代谢障碍的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的人GDF15多肽。在各个实施方案中，代谢障碍是2型糖尿病、血脂异常、肥胖或糖尿病性肾病。在其它实施方案中，代谢障碍包括其中受试者具有大于或等于IOOmg / dL的空腹血糖水平的病况。对其进行所述方法的受试者可以是哺乳动物，例如人。在具体的实施方案中，⑶F15蛋白包含SEQ IDN0:2、6和10之一和/或由SEQ IDNO:9的核酸序列编码。在一些实施方案中，以包含与药学上可接受的载体混合的⑶F15多肽的药物组合物的形式施用GDF15多肽。在其它实施方案中，提供的方法还包括在施用后的时间点上测定受试者的血糖水平的步骤。在其它实施方案中，所述方法还包括在施用后的时间点上测定受试者的血 清胰岛素水平的步骤。 [0010]还提供了治疗代谢障碍的另一种方法。在一个实施方案中，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的包含以下氨基酸序列的分离的人GDF15多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、6和10之一具有至少90%的序列同一性。在各个实施方案中，代谢障碍是2型糖尿病、血脂异常、肥胖或糖尿病性肾病。在其它实施方案中，代谢障碍包括其中受试者具有大于或等于IOOmg / dL的空腹血糖水平的病况。对其进行所述方法的受试者可以是哺乳动物，例如人。在具体的实施方案中，⑶F15蛋白包含SEQ ID N0:2、6和10之一和/或由SEQ ID NO:1、5和9之一编码。在一些实施方案中以包含与药学上可接受的载体混合的GDF15多肽的药物组合物的形式施用GDF15多肽。在其它实施方案中，提供的方法还包括在施用后的时间点上测定受试者的血糖水平的步骤。在其它实施方案中，方法还包括在施用后的时间点上测定受试者的血清胰岛素水平的步骤。
[0011]附图简述
[0012]图1是一系列两个条形图，显示营养状态对鼠肝脏(图1A)和鼠脂肪(图1B)的⑶F15表达的调控。
[0013]图2是一系列两个条形图。显示PPAR激动剂对鼠肝脏(图2A)和鼠3T3-L1脂肪细胞(图2B)的⑶F15表达的上调。
[0014]图3是一系列曲线图和条形图，显示在用鼠⑶F15的AAV介导的治疗后瘦素-缺陷型ob / ob小鼠的代谢特征谱的改善；测量AAV鼠GDF15注射对血糖水平(图3A)和体重(图3C)的影响，进行2个月。在AAV注射后2周(图3B)测量血浆胰岛素水平，并且在AAV注射后3周(图3D)测量平均每日食物摄入。AAV注射后2个月测量总胆固醇(图3E)、NEFA(图3F)、甘油三酯(图3G)和胰岛素水平(图3H)。
[0015]图4是一系列两个曲线图和两个条形图，显示用鼠⑶F15的ob / ob小鼠的AAV介导的治疗的降糖活性，并且显示降糖作用不依赖于减轻的体重。对饲研究(pair-feedingstudy)包括3组动物:一组用对照AVV注射并且自由接触食物，第二组用AAV⑶F15注射并且自由接触食物，以及第三组用对照AVV注射并且饲以相同量的由注射GDF15AAV的动物的组在前一天消费的食物。注射GDF15或对照AAV的小鼠中随时间过去的食物摄入与体重的比率示于图4A中；图4B显示用对照或GDF15AAV处理的随意喂饲的小鼠和用对照AAV注射的对饲小鼠的随时间过去的体重；图4(:显示对饲研究结束时的血浆葡萄糖水平；和图4D显示对饲研究结束时的体重。
[0016]图5是一系列四个曲线图和两个条形图，分别显示鼠⑶F15AAV对饲以高脂肪饮食的小鼠(图5A-5C)和饲以标准饮食(normal choffdiet)的小鼠(图OT-5F)的血浆葡萄糖水平、体重和食物摄入的影响。
[0017]图6是一系列四个曲线图，显示用鼠GDF15的AAV介导的治疗对饲以高脂肪饮食的小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性的影响；图6A和6B分别显示在AAV注射后3周在OGTT过程中测量的血浆葡萄糖和血浆胰岛素水平，并且图6C和6D显示AAV注射后2周在ITT过程中测量的血浆葡萄糖和血浆葡萄糖/基础葡萄糖水平。
[0018]图7是一系列曲线图和四个条形图，显示DIO小鼠的AAV-介导的人⑶F15治疗对葡萄糖水平(图7A);食物摄入(图7B);体重(图7C)以及DIO小鼠中表达的人GDF15的量(图7D)的影响。
[0019]图8是显示AAV介导的人⑶F15对KKAy小鼠中的葡萄糖耐受性的增进的影响的曲线图和两个条形图；图8A显示OGTT过程中血浆葡萄糖的水平；图8B显示AAV注射后3周和6周的体重；并且图8C显示AAV注射后3周和6周的胰岛素水平。
[0020]图9是一系列九个条形图，显示在3-4周时间的过程中AAV介导的人⑶F15对KKAy小鼠中的糖尿(glucosuria)的影响；图9A显示尿糖水平；图9B显示尿量；图9C显示葡萄糖排泄；图9D显不尿白蛋白；图9E显不白蛋白排泄；图9F显不水摄入；图9G显不膜岛素水平；图9H显示血浆葡萄糖水平；图91显示人⑶F15水平；图9J显示体重以及图9K显示食物摄入。
[0021]图10是一系列四个条形图，显示AAV-介导的鼠⑶F15对DIO小鼠的总身体质量(图10A);脂肪质量(图10B);脂肪质量/总身体质量(图10C);以及非脂肪质量/总身体质量(图10D)的影响。
[0022]图11是一系列两个曲线图和六个条形图，显示AAV-介导的人⑶F15对DIO小鼠的影响；图1IA显示体重；图1IB显示表达的人⑶F15的量；图1IC显示总身体质量；图1lD显示脂肪质量；图1IE显示非脂肪质量；图1IF显示骨矿物质密度(bone mineral density)；图1lG显示脂肪质量/身体质量的百分比；以及图1lH显示非脂肪质量/总身体质量的百分比。
[0023]图12是一系列二个条形图，显不重组鼠⑶F15对ob / ob小鼠的匍萄糖和食物摄入的影响；图12A显示血浆葡萄糖水平；图12B显示体重；以及图12C显示在媒介物或鼠⑶F15注射后第I和第2天的食物摄入。
[0024]图13是一系列三个条形图，显示重组人⑶F15对ob / ob小鼠中的血浆葡萄糖水平、食物摄入和体重的影 响；图13A显不血衆匍萄糖水平；图13B显不食物摄入；以及图13C
显示体重。
[0025]图14是一系列曲线图和两个条形图，显示重组人⑶F15在DIO小鼠中的作用；图14A显示在蛋白质注射后3天在OGTT过程中测量的血浆葡萄糖水平；图14B显示食物摄入；以及图14C显示体重。
[0026]图15是曲线图和条形图，显示在口服脂质激发后重组人⑶F15对B6D2F1雄性小鼠中的脂质代谢的影响；图15A显示在脂质耐受测试过程中血浆甘油三酯的水平；以及图15B显示重组人⑶F15的血浆暴露。
[0027]图16是一系列四个条形图，显示在AAV-介导的鼠⑶F15施用后饲以高脂肪饮食3周的B6D21F小鼠的血液化学；图16A显示血浆胰岛素水平；图16B显示非酯化脂肪酸(NEFA)水平；图16C显示总胆固醇水平；以及图16D显示甘油三酯水平。
[0028]发明详述
[0029]本公开内容提供了通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的人GDF15多肽来治疗代谢障碍例如2型糖尿症(在本文中可互换地称为“2型糖尿病”)、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平、血脂异常或肥胖的方法。还提供了施用和递送方法。
[0030]本文中使用的包括在实施例中的重组多肽和核酸方法通常是Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)及随后版本或 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，编著，GreenPublishers Inc.and Wileyand Sonsl994)及随后版本(为了任何目的将所述两个参考资料通过引用并入本文)中所示的那些方法。
[0031]1.一般定义
[0032]按惯例，除非另外明确指出，否则如本文中所用，“一个/ 一种(a) ”和“一个/ 一种(an) ”意指“一个/ 一种或多个/多种”。
[0033]如本文中所用，术语“氨基酸”和“残基”可互换使用并且，当用于肽或多肽的情况中时，是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物、氨基酸模拟物以及在化学上与天然存在的氨基酸相似的非天然存在的氨基酸。
[0034]“天然存在的氨基酸”是由遗传密码编码的氨基酸，以及合成后被修饰的由遗传密码编码的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物可具有修饰R基团(例如，正亮氨酸)或修饰肽主链，但将保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
[0035]“氨基酸模拟物”是具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。实例包括酰胺、β _、Y-、S -氨基酸(例如哌啶-4-羧酸)等的甲丙烯酰基或丙烯酰基衍生物。
[0036]“非天然存在的氨基酸”是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，但未被翻译复合物并入正在生长的多肽链的化合物。“非天然存在的氨基酸”还包括但不限于通过天然编码的氨基酸(包括但不限于20个常用氨基酸)的修饰(例如，翻译后修饰)产生的，但它们本身不被翻译复合物天然地并入正在生长的多肽链的氨基酸。可被插入多肽序列或置换多肽序列的野生型残基的非天然存在的氨基酸的实例的非限定性列表包括β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生侧链的氨基酸。实例包括(以L-型或D-型；如括号中缩写的):瓜氨酸(CU)、高瓜氨酸(hCit)、Na-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Na-甲基高瓜氨酸(Na-MeHoCit)、鸟氨酸(Orn)、Na -甲基鸟氨酸(Na-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高赖氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酰胺(hQ)、Na-甲基精氨酸OMeR)、N a -甲基亮氨酸(N a -MeL或^eL)、N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)、N a -甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)、八氢吲哚-2-二羧酸(Oic)、3-(1_萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2_Nal)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tie)、2-茚满基甘氨酸(IgI)、对-吲哚苯丙氨酸(pI_Phe)、对-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4_胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰赖氨酸(缩写“K (N ε -glycyl) ” 或“K(glycyl) ” 或“K(gly) ” )、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe或氨基-Phe)、苄基苯丙氨酸(benzylphe)、Y-羧基谷氨酸(Y-carboxyglu)、羧脯氨酸(hydroxypro)、对羧基-苯丙氨酸(Cpa)、α -氨基己二酸(Aad)、N α -甲基缴氨酸(NMeVal)、Ν_ α -甲基亮氨酸(NMeLeu) ,Na-甲基正亮氨酸(NMeNle)、环戊基甘氨酸(Cpg)、环己基甘氨酸(Chg)、乙酰精氨酸(acetylarg)、α，β - 二氨基丙酸(Dpr) > α , y 二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、环己基丙氨酸(Cha)、4_甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β , β -二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4_苯基-苯丙氨酸(或二苯基丙氨酸；4Bip)、α -氨基-异丁酸(Aib)、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二胺基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、异锁链赖氨素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、4-羟脯氨酸(Hyp)、Y -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基赖氨酸、ε -N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-O-邻苯二甲酸(4ΑΡΑ)和其它类似氨基酸，以及明确列出的那些氨基酸的任一种的衍生形式。
[0037]术语“分离的核酸分子”是指从5’至3’端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物(例如，本文中提供的GDF15核酸序列)或其类似物，所述分离的核酸分子已与至少约50%的当从来源细胞分离总核酸时与所述分离的核酸分子一起被天然发现的多核苷酸、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其它材料分离。优选地，分离的核酸分子大体上不含任何其它污染性核酸分子或在核酸的天然环境中发现的可干扰其在多肽产生中的用途或其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其它分子。
[0038]术语“分离的`多肽”和“分离的蛋白质”可互换使用，并且是指已与至少约50、60、70、80、85、90、95、96、97、98或99%的当从来源细胞分离时与所述多肽一起被天然发现的多肽、肽、脂质、糖类、多核苷酸或其它材料分离的多肽(例如，本文中提供的GDF15多肽)。优选地，分离的多肽大体上不含任何其它污染性多肽或在其天然环境中发现的可干扰其治疗性、诊断性、预防性或研究用途的其它污染物。
[0039]术语“编码”是指编码一种或多种氨基酸的多核苷酸序列。该术语不需要起始或终止密码子。氨基酸序列可在由多核苷酸序列提供的6个不同阅读框的任一个中编码。
[0040]术语“同一的”和百分比“同一性”，在两种或更多种核酸或多肽序列的情况中，是指相同的两个或更多个序列。“百分比同一性”意指比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且基于待比较的最小分子的大小来进行计算。为了进行这些计算，比对中的空位(如果有的话)可通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一'I"生的方法包括例如ComputationalMolecular Biology, (Lesk, Α.Μ.,编著)，(1988)New York:0xford University Press ；Biocomputing Informatics and GenomePro iects, (Smith, D.ff.，编著)，1993，New York:Academic Press:Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M.,和Griffin, H.G,编著),1994, New Jersey:Humana Press ；von Heinje, G., (1987) SequenceAnalysis in Molecular Biology,New York:AcademicPress:Sequence Analysis Primer,(Gribskov, M.和 Devereux, J.,编著),1991, NewYork:M.Stockton Press ;和 Carillo 等人，(1988) SIAM J.AppliedMath.坚:1073 中描述的那些方法。
[0041]在计算百分比同一性中，以提供序列之间最大匹配的方式比对待比较的序列。用于测定百分比同一'I"生的计算机程序是GCG程序包,其包括GAP (Devereux等人，(1984) Nucl.Acid Res.1^:387 ；GeneticsComputer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。计算算法GAP用于比对将对其测定百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。将序列比对以进行它们各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配的跨度(matched span)”，如通过算法确定的)。将空位开放罚分(gapopening penalty)(其计算为3x平均对角线,其中“平均对角线”是将使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是由特定比较矩阵分配给每一个完美氨基酸匹配的评分或数目)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的I/10)，以及比较矩阵例如PAM250或BL0SUM62与算法结合使用。在某些实施方案中，标准比较矩阵(关于 PAM250 比较矩阵，参见，Dayhoff 等人，(1978) Atlas of Protein SequenceandStructure5:345-352 ;关于 BL0SUM62 比较矩阵，参见 Henikoff 等人，(1992)proc.Natl.AcaD.Sc1.U.S.A.89: 10915-10919)也通过算法使用。
[0042]用于使用GAP程序测定多肽或核苷酸序列的百分比同一性的推荐参数如下:
[0043]算法:Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48:443_453 ；
[0044]比较矩阵:来自Henikoff等人的BL0SUM62，1992，同上；
[0045]空位罚分:12(但对于末端空位不使用罚分)
[0046]空位长度罚分:4
[0047]相似性的阈值:0
[0048]用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅两个序列的短区域的匹配，并且该小的比对的区域可具有非常高的序列同一性，即使在两个全长序列之间不存在显著的关系。因此，假如这样的话，可调整选择的比对法(例如，GAP程序)以导致横跨靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。
[0049]术语“⑶F15多肽”和“⑶F15蛋白”可互换使用，并且意指在哺乳动物例如人或小鼠中表达的天然存在的野生型多肽。为了本公开内容的目的，术语“GDF15多肽”可互换使用，意指任何全长⑶F15多肽，例如，SEQ ID NO:2，其由308个氨基酸残基组成并且由核苷酸序列SEQ ID N0:1(该序列，当重组表达时，可以但不一定包含终止密码子)编码；包含多肽例如SEQ ID NO:6的活性前域(prodomain)的任何形式，其由279个氨基酸残基组成，并且由核苷酸序列SEQ IDNO:5(该序列，当重组表达时，可以但不一定包含终止密码子)编码，并且其中全长GDF15多肽的氨基末端上的29个氨基酸残基(B卩，其构成信号肽)已被除去；和包含已从其除去了前域和信号序列的活性结构域的多肽的任何形式例如SEQ ID NO:10，其由112个氨基酸残基组成并且由核苷酸序列SEQ ID NO:9 (该序列，当重组表达时，可以但不一定包含终止密码子)编码，其中信号序列和前域已被除去。GDF15多肽可以但不一定包含氨基末端甲硫氨酸，其可通过工程化或作为细菌表达过程的结果引入。
[0050]术语“⑶F15多肽”还包括其中天然存在的⑶F15多肽序列(例如，SEQ ID NO:2、6或10)已被修饰的⑶F15多肽。此类修饰包括但不限于一个或多个氨基酸的置换，包括利用非天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸类似物和氨基酸模拟物的置换。
[0051]在各个实施方案中，⑶F15多肽包含与天然存在的⑶F15多肽(例如，SEQ ID NO:2、6或10)具有至少约85%的同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，⑶F15多肽包含与天然存在的⑶F15多肽氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:2、6或10)具有至少约90%或约95、96、97、98或99%的同一性的氨基酸序列。此类⑶F15多肽优选地但不一定具有野生型GDF15多肽的至少一种活性，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减轻体重的能力；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。本发明还包括编码此类GDF15多肽序列的核酸分子。
[0052]如本文中所述，⑶F15多肽可包含信号序列(SEQ ID NO:2的残基1_29)或其可除去信号序列(倘若为SEQ ID NO:6) 0在其它实施方案中，人GDF15多肽可除去信号序列，也可在残基198上被切割，从而将前域的一级序列(SEQ ID NO:2的残基30-198)与活性结构域的一级序列分离。GDF15多肽的天然存在的生物活性形式是经加工的成熟多肽(SEQID NO:2的残基199-308)的同二聚体。在一些情况下，⑶F15多肽可用于治疗或改善受试者的代谢障碍，其为来源于与受试者相同的物种的GDF15多肽的成熟形式。
[0053]⑶F15多肽优选地具有生物活性。在各个不同的实施方案中，⑶F15多肽具有等于、大于或小于成熟GDF15蛋白的天然存在的形式的生物活性的生物活性，对于所述成熟⑶F15蛋白，已从全长⑶F15序列的N末端除去信号肽并且其中前域已被切割(但不一定从活性结构域除去)。生物活性的实例包括降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减轻体重的能力；或改善葡萄糖耐受性、脂质耐受性或胰岛素敏感性的能力；降低尿糖和蛋白质排泄的能力。
[0054]如本文中所用，术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”意指引发研究者、医生或其它临床医生寻求的组织系统、动物或人的生物学或医学反应(所述生物学或医学反应包括待治疗的疾病或障碍的症状的减轻或改善)的GDF15多肽的量，即，支持可观察水平的一个或多个期望的生物学或医学反应(例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性)的GDF15多肽的量。
[0055]I1.GDF15多狀和核酸
[0056]如本文中所公开，本公开内容中描述的GDF15多肽可使用标准分子生物学技术来工程化和/或产生。在各个实施方案中，编码⑶F15的核酸序列(其可包含SEQ ID NO ;2、6或10的全部或部分)可使用适当的寡核苷酸引物从基困组DNA或cDNA分离和/或扩增。引物可按照标准(RT)-PCR扩增技术基于本文中提供的核酸和氨基酸序列来进行设计。随后可将扩增的GDF15核酸克隆进入适当的载体并且通过DNA序列分析来表征。
[0057]在分离或扩增本文中提供的GDF15序列的全部或部分中用作探针的寡核苷酸可使用标准合成技术例如自动化DNA合成装置来设计和产生，或可从更长的DNA序列分离。
[0058]I1.A.天然存在的GDF15多肽和变体GDF15多肽及多核苷酸序列
[0059]在体内，⑶F15表达为包含信号序列、前域和活性结构域的连续氨基酸序列。
[0060]全长人⑶F15的308个氨基酸的序列是(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)):
[0061 ] (M)PGQELRTVNGSQMLLVLLVLSWLPHGGALSLAEASRASPPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHRLSPPPSQSDQLLAESSSARPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCT(SEQ ID NO:2)
[0062]并且由DNA序列(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0063](ATG)CCCGGGCAAGAACTCAGGACGGTGAATGGCTCTCAGATGCTCCTGGTGTTGCTGGTGCTCTCGTGGCTCCCGCATGGGGGCGCCCTGTCTCTGGCCGAGGCGAGCCGCGCAAGTTTCCCGGGACCCTCAGAGTTGCACTCCGAAGACTCCAGATTCCGAGAGTTGCGGAAACGCTACGAGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCCACCAGAGCTGGGAAGATTCGAACACCGACCTCGTCCCGGCCCCTGCAGTCCGGATACTCACGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGCCCTTCCCGAGGGGCTCCCCGAGGCCTCCCGCCTTCACCGGGCTCTGTTCCGGCTGTCCCCGACGGCGTCAAGGTCGTGGGACCTGACACGACCGCTGCGGCGTCAGCTCAGCCTTGCAAGACCCCAGGCGCCCGCGCTGCACCTGCGACTGTCGCCGCCGCCGTCGCAGTCGGACCAACTGCTGGCAGAATCTTCGTCCGCACGGCCCCAGCTGGAGTTGCACTTGCGGCCGCAAGCCGCCAGGGGGCGCCGCAGAGCGCGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCCTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGA[0064](SEQ ID NO:1).[0065]全长鼠⑶F15的303个氨基酸的序列是(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)):
[0066](M)APPALQAQPPGGSQLRFLLFLLLLLLLLLSWPSQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGGCPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQIEN0:4)
[0067]并且由DNA序列(经显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0068](ATG)GCCCCGCCCGCGCTCCAGGCCCAGCCTCCAGGCGGCTCTCAACTGAGGTTCCTGCTGTTCCTGCTGCTGTTGCTGCTGCTGCTGTCATGGCCATCGCAGGGGGACGCCCTGGCAATGCCTGAACAGCGACCCTCCGGCCCTGAGTCCCAACTCAACGCCGACGAGCTACGGGGTCGCTTCCAGGACCTGCTGAGCCGGCTGCATGCCAACCAGAGCCGAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAGTCCTGACCCAGCTGTCCGGATACTCAGTCCAGAGGTGAGATTGGGGTCCCACGGCCAGCTGCTACTCCGCGTCAACCGGGCGTCGCTGAGTCAGGGTCTCCCCGAAGCCTACCGCGTGCACCGAGCGCTGCTCCTGCTGACGCCGACGGCCCGCCCCTGGGACATCACTAGGCCCCTGAAGCGTGCGCTCAGCCTCCGGGGACCCCGTGCTCCCGCATTACGCCTGCGCCTGACGCCGCCTCCGGACCTGGCTATGCTGCCCTCTGGCGGCACGCAGCTGGAACTGCGCTTACGGGTAGCCGCCGCCAGGGGGCGCCGAAGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACTTGGAGACTGTGCAGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCGACTGGGTGCTGTCCCCGCGCCAGCTGCAGCTGAGCATGTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGCATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCCTGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACACCCCGGTGGTTCT
TATGCACAGGACAGACAGTGGTGTGTCACTGCAGACTTATGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA
[0069](SEQ I D NO:3).[0070]在29个残基的信号序列切割后人GDF15的氨基酸序列是(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)):
[0071 ] (M)LSLAEASRASFPGPSELHSEDSRFRELRKRYEDLLTRLRANQSWEDSNTDLVPAPAVRILTPEVRLGSGGHLHLRISRAALPEGLPEASRLHRALFRLSPTASRSWDVTRPLRRQLSLARPQAPALHLRLSPPPSQSDQLLAESSSSRPQLELHLRPQAARGRRRARARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ IDNO:6)
[0072]并且由DNA序列(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0073](ATG)CTGTCTCTGGCCGAGGCGAGCCGCGCAAGTTTCCCGGGACCCTCAGAGTTGCACTCCGAAGACTCCAGATTCCGAGAGTTGCGGAAACGCTACGAGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCAACCAGAGCTGGGAAGATTCGAACACCGACCTCGTCCCGGCCCCTGCAGTCCGGATACTCACGCCAGAAGTGCGGCTGGGATCCGGCGGCCACCTGCACCTGCGTATCTCTCGGGCCGCCCTTCCCGAGGGGCTCCCCGAGGCCTCCCGCCTTCACCGGGCTCTGTTCCGGCTGTCCCCGACGGCGTCAAGGTCGTGGGACGTGACACGACCGCTGCGGCGTCAGCTCAGCCTTGCAAGACCCCAGGCGCCCGCGCTGCACCTGCGACTGTCGCCGCCGCCGTCGCAGTCGGACCAACTGCTGGCAGAATCTTCGTCCGCACGGCCCCAGCTGGAGTTGCACTTGCGGCCGCAAGCCGCCAGGGGGCGCCGCAGAGCGCGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGGTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGGGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGA
[0074](SEQ ID NO:5).[0075]在32个残基的信号序列切割后鼠GDF15的氨基酸序列是(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)):
[0076](M)SQGDALAMPEQRPSGPESQLNADELRGRFQDLLSRLHANQSREDSNSEPSPDPAVRILSPEVRLGSHGQLLLRVNRASLSQGLPEAYRVHRALLLLTPTARPWDITRPLKRALSLRGPRAPALRLRLTPPPDLAMLPSGGTQLELRLRVAAGRGRRSAHAHPRDSCPLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQ ID NO:8)
[0077]并且由DNA序列(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0078](ATG)TCGCAGGGGGACGCCCTGGCAATGCCTGAACAGCGACCCTCCGGCCCTGAGTCCCAACTCAACGCCGACGAGCTACGGGGTCGCTTCCAGGACCTGCTGAGCCGGCTGCATGCCAACCAGAGCCGAGAGGACTCGAACTCAGAACCAAGTCCTGACCCAGCTGTCCGGATACTCAGTCCAGAGGTGAGATTGGGGTCCCACGGCCAGCTGCTACTCCGCGTCAACCGGGCGTCGCTGAGTCAGGGTCTCCCCGAAGCCTACCGCGTGCACCGAGCGCTGCTCCTGCTGACGCCGACGGCCCGCCCCTGGGACATCACTAGGCCCCTGAAGCGTGCGCTCAGCCTCCGGGGACCCCGTGCTCCCGCATTACGCCTGCGCCTGACGCCGCCTCCGGACCTGGCTATGCTGCCCTCTGGCGGCACGCAGCTGGAACTGCGCTTACGGGTTGCCGCCGGCAGGGGGCGCCGAAGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACTTGGAGACTGTGCAGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCCACTGGGTGCTGTCCCCGCGCCAGCTGCAGCTGAG
CATGTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGGATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCC
TGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACACCCCGGTGGTTCTTATGCACAGGACAGAC
AGTGGTGTGTCACTGCAGACTTAAGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA
[0079](SEQ ID NO:7).[0080]人⑶F15的重组活性形式的氨基酸序列(其包括含有9个分子间二硫键的同二聚体)(显示具有任选的N-末端甲硫氨酸残基(括号内))是:
[0081 ] (M)ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ IDNO:10)
[0082]并且由DNA序列(经显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0083](ATG)GCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATAA
[0084](SEQIDN0:9).[0085]鼠⑶F15的重组活性形式的氨基酸序列(其包括含有9个分子间二硫键的同二聚体)(显示具有任选的N-末端甲硫氨酸残基(括号内))是:
[0086](M)SAHAHPRDSC PLGPGRCCHLETVQATLEDLGWSDWVLSPRQLQLSMCVGECPHLYRSANTHAQIKARLHGLQPDKVPAPCCVPSSYTPVVLMHRTDSGVSLQTYDDLVARGCHCA(SEQID NO:12)
[0087]并且由DNA序列(显示具有任选的N末端甲硫氨酸密码子(括号内)和任选的终止密码子)编码:
[0088](ATG)AGCGCGCATGCGCACCCAAGAGACTCGTGCCCACTGGGTCCGGGGCGCTGCTGTCACCTGGA GACTGTGCGGGCAACTCTTGAAGACTTGGGCTGGAGCGACTGGCTGTTGTCCCCGCCAGGTGCAGCTGAGCAT GTGCGTGGGCGAGTGTCCCCACCTGTATCGCTCCGCGAACACGCATGCGCAGATCAAAGCACGCCTGCATGGCCTGCAGCCTGACAAGGTGCCTGCCCCGTGCTGTGTCCCCTCCAGCTACRCCCCGGTGGTTCTTATGCACAGGACAGACAGTGGTGTGTCACTGCAGACTTATGATGACCTGGTGGCCCGGGGCTGCCACTGCGCTTGA(SEQ IDNO:11).[0089]如本文中所述，术语“⑶F15多肽”是指含有人氨基酸序列SEQID NO:2、6和10的⑶F多肽。然而，术语“⑶F15多肽”还包括含有与天然存在的⑶F多肽序列例如SEQ ID NO:
2、6和10相异在于I个或多个氨基酸的氨基酸序列以使得所述序列与SEQ ID NO:2、6和10具有至少85%的同一性的多肽。⑶F多肽可通过在⑶F15多肽的特定位置引入一个或多个氨基酸置换(保守的或非保守的)和使用天然或非天然存在的氨基酸序列来产生。
[0090]“保守氨基酸置换”可包括利用非天然残基(即，在野生型FGF21多肽序列的该相同位置上发现的残基)对天然氨基酸残基(即，在野生型FGF21多肽序列的给定的位置上发现的残基)的置换，以便对该位置上的氨基酸残基的极性或电荷几乎无影响或无影响。保守氨基酸置换还包括通常通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成并入的非天然存在的氨基酸残基。这类肽包括模拟肽(peptidomimetics)以及氨基酸部分的其它保守或倒转形式。[0091]天然存在的残基可基于共同的侧链性质分成如下种类:
[0092](I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ；
[0093](2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr ；
[0094](3)酸性:Asp、Glu ;
[0095](4)碱性:Asn、Gin、His、Lys、Arg ;
[0096](5)影响链定向的残基:Gly、Pro ;和
[0097](6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。
[0098]另外组的氨基酸还可使用例如Creighton (1984) PROTEINS:STRUCTURE ANDMOLECULAR PROPERTIES(第 2 版 1993)，ff.H.Freeman and Company 中描述的原理来配制。在一些情况下，可以有用地进一步基于此类特征的两种或更多种特征来表征置换(例如，利用“小的极性”残基例如Thr残基的置换可在适当的情况中代表高度保守的置换)。
[0099]保守置换可包括这些种类之一的成员与相同种类的另一成员的交换。非保守置换可包括这些种类之一的成员与另一种类的成员的交换。
[0100]具有已知的与上述分组的物理化学性质相似的物理化学性质的合成、稀有或修饰氨基酸残基可用作序列中特定氨基酸残基的“保守”替代物。例如，D-Arg残基可用作典型的L-Arg残基的替代物。还可能出现这样的情况，可根据上述种类的两个或更多个种类描述特定的置换(例如，利用小的疏水性残基的置换，意指利用在两个上述种类中发现的残基或在本领域中已知具有与此类满足这两种定义的残基相似的物理化学性质的其它合成、稀有或修饰残基置换一个氨基酸)。
[0101]本文中提供的编码⑶F15多肽的核酸序列(包括简并成SEQ IDNO:1、5和9的那些序列)以及编码SEQ ID N0:2、6和10的多肽变体的那些核酸序列形成本公开内容的其它方面。
[0102]IL B.GDF15 载体
[0103]为了表达本文中提供的⑶F15核酸序列，可将适当的编码序列例如SEQ ID NO:1,5或9克隆进入适当的载体，并在引入适当的宿主后，可根据标准克隆和表达技术表达所述所述序列以产生编码的多肽，所述技术在本领域是已知的(例如，如Sambrook, J.,Fritsh,E.F.和Maniatis, T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 2版,编著，Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989中描述的)。本发明还涉及这类包含根据本发明的核酸序列的此类载体。
[0104]“载体”是指递送媒介物，其(a)促进多肽编码核酸序列的表达；(b)促进多肽从其产生；(C)随即促进靶细胞的转染/转化；(d)促进核酸序列的复制；(e)改善核酸的稳定性；(f)促进核酸和/或转化/转柒的细胞的检测；和/或(g)另外赋予多肽编码核酸有利的生物学和/或生理化学功能。载体可以是任何适当的载体，包括染色体、非染色体以及合成的核酸载体(包含适当的一组表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、来源于质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。
[0105]重组表达载体可被设计来用于在原核(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达GDF15蛋白。代表性宿主细胞包括通常用于克隆和表达的那些宿主，包括大肠杆菌菌株T0P10F’、T0P10、DH10B、DH5a、HBlOU W3110、BL21(DE3)和 BL21 (DE3)pLysS、BLUESCRIPT(Stratagene)、哺乳动物细胞系 CHO、CH0-K1、HEK293、293-EBNA pIN 载体(Van Heeke&Schuster, J.Biol.Chem.264:5503-5509(1989) ；pET 载体(Novagen, Madison ffis.)。或者，可以例如使用 T7启动子调控序列和Τ7聚合酶以及体外翻译系统体外转录和翻译重组表达载体。优选地，载体包含在含有编码多肽的核酸序列的克隆位点的上游的启动子。可被打开和关闭的启动子的实例包括Iac启动子、Τ7启动子、trc启动子、tac启动子trp启动子。
[0106]因此，本文中提供的是有利于重组⑶F15表达的包含编码⑶F15的核酸序列的载体。在各个实施方案中，载体包含调节⑶F15的表达的可操作地连接的核苷酸序列。载体可包含任何适当的启动子、增强子和其它表达促进元件或与所述启动子、增强子和其它表达促进元件连接。此类元件的实例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子、RSV启动子、SV40启动子、SL3-3启动子、MMTV启动子或HIV LTR启动子、EFla启动子、CAG启动子)、有效的聚腺苷酸终止序列、大肠杆菌的质粒产物的复制起始点、抗生素抗性基因(作为选择标记)和/或方便的克隆位点(例如，多接头)。相对于组成型启动子例如CMVIE，载体还可包含诱导型启动子。在一个方面，提供了与组织特异性启动子可操作地连接的包含编码⑶F15多肽的序列的核酸，所述组织特异性启动子促进序列在代谢相关组织例如肝或胰腺组织中的表达。
[0107]I1.C.宿丰细朐
[0108]在本公开内容的另一个方面，提供了包含本文中公开的⑶F15核酸和载体的宿主细胞。在各个实施方案中，将载体或核酸整合进入宿主细胞基因组，在其它实施方案中所述载体或核酸存在于染色体外。
[0109]提供了包含这样的核酸、载体或其任一或两者的组合的重组细胞例如酵母、细菌(例如，大肠杆菌)和哺乳动物细胞(例如，永生化哺乳动物细胞)。在各个实施方案中，提供了包含含有编码⑶F15多肽的表达的序列的非整合核酸例如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件的细胞。`
[0110]包含本文中提供的编码GDF15多肽的核酸序列的载体可通过转化或通过转染引入宿主细胞。利用表达载体转化细胞的方法是公知的。
[0111]⑶F15编码核酸可经病毒载体定位在宿主细胞或宿主动物中和/或递送至宿主细胞或宿主动物。任何适当的病毒载体可用于该能力。病毒载体可单独地或与一种或多种病毒蛋白质(所述蛋白质有利于本发明的核酸在期望的宿主细胞中的递送、复制和/或表达)组合地包含许多病毒多核苷酸。病毒载体可以是包含病毒基因组的全部或部分的多核苷酸、病毒蛋白质/核酸缀合物、病毒样颗粒(VLP)或包含病毒核酸和⑶F15多肽-编码核酸的完整病毒颗粒。病毒颗粒病毒载体可包括野生型病毒颗粒或修饰病毒颗粒。病毒载体可以是需要另一个载体或野生型病毒的存在以进行复制和/或表达的载体(例如，病毒载体可以是依赖于辅助病毒的病毒)，例如腺病毒载体扩增子。通常地，此类病毒载体由野生型病毒颗粒或在其蛋白质和/或核酸含量上进行了修饰以增加转基因能力或帮助核酸的转染和/或表达的病毒颗粒组成(此类载体的实例包括疱疹病毒/ AAV扩增子)。通常地，病毒载体与通常感染人的病毒相似和/或来源于所述病毒。在该方面适当的病毒载体颗粒包括例如腺病毒载体颗粒(包括腺病毒科的任何病毒或来源于腺病毒科的病毒的任何病毒)、腺伴随病毒载体颗粒(AAV载体颗粒)或其它细小病毒和微小病毒载体颗粒、乳头瘤病毒载体颗粒、黄病毒载体、甲病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)。
[0112]I1.P.GDF15 多狀的分离
[0113]如本文中所描述表达的⑶F15多肽可使用标准蛋白质纯化法来分离。⑶F15多肽可从其中其天然表达的细胞分离，或其可从已被工程化以表达GDF15的细胞，例如不天然表达⑶F15的细胞分离。
[0114]可用于分离⑶F15多肽的蛋白质纯化法以及相关材料和试剂在本领域是已知的。纯化GDF15多肽的示例性方法提供于下文中的实施例中。可用于分离GDF15多肽的其它纯化法可见于参考资料例如 Bootcov MR, 1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:11514-9，Fairlie WD, 2000, Gene254:67-76 中。
[0115]II1.包含CT)F15多肽的药物组合物
[0116]提供了包含⑶F15多肽的药物组合物。此类⑶F15多肽药物组合物可包含与被选择以适合施用模式的药学上或生理上可接受的配方试剂混合的治疗有效量的⑶F15多肽。如本文中所用，术语“药学可接受的载体”或“生理上可接受的载体”是指适合用于实现或增强GDF15多肽向人或非人受试者的身体内的递送的一种或多种配方试剂。该术语包括在生理上是相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等的一种或多种以及其组合。在一些情况下，优选在药物组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的物质例如湿润剂或少量辅助物质例如湿润或乳化剂、防腐剂或缓冲剂(所述物质增强GDF15多肽的贮存期限或效力)，还可用作载体或载体的组分。可接受的药学上可接受的载体优选在使用的剂量和浓度上对受者是无毒的。
[0117]药物组合物可包含用于修饰、维持或保持例如pH、克分子渗透压浓度(οsmoIarity)、粘性、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、组合物的溶解或释放、吸附或渗透速率的配方试剂。适当的配方试剂包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、填充剂(bulking agent)(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、环糊精或羟丙基环糊精)、充填剂、单糖、二糖和其它糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成盐的抗衡离子(例如钠)、防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或湿润剂(例如普流罗尼类；PEG;山梨糖酯；聚山梨醇酯例如聚山梨酯20或聚山梨酯80;曲拉通(Triton);氯丁三醇(tromethamine);卵磷脂；胆固醇或tyloxapal)、稳定性增强剂(例如鹿糖或山梨醇)、张力增强剂(例如碱金属卤化物-优选地氯化钠或氯化钾-或甘露醇、山梨醇)、递送媒介物、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见，例如，REMINGTON:THE SCIENCE AND PRACTICEOF PHARMACY,第 19 版，(1995) ;Berge 等人，J.Pharm.Sc1.，6661)，1-19 (1977)。其它相关原则、方法和试剂描述于例如Lieberman等人，PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS-DISPERSESYSTEMS (第 2 版，第 3卷，1998) ;AnseI 等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRUGDELIVERYSYSTEMS (第 7 版，2000) ；Martindale, THE EXTRAPHARMACOPEIA (第 31 版)，Remington’ SPHARMACEUTICALSCIENCES (第 16-20 版和随后的版本)；The Pharmacological Basis OfTherapeutics, Goodman 和 Gilman,编著(第 9 版一1996) ；ffilson 和 Gisvolds，TEXTBOOKOF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado 和 Remers，编著(第10版，1998)中。配制药学上可接受的组合物原则也描述于例如Aulton，PHARMACEUTICS:THE SCIENCE OF DOSAGE FORM DESTGN, Churchill LiVingstone(New York) (1988),EXTEMPORANEOUS ORALLIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998)，为了任何目的通过引用并入本文中)。
[0118]最佳药物组合物将由本领域技术人员取决于例如期望的施用途径、递送形式和期望的剂量来确定(参见，例如，Remington’ sPHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)。此类组合物可影响GDF15多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。
[0119] 药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是含水的或非含水的。例如，用于注射的适当媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有在用于胃肠外施用的组合物中常用的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒介物。其它示例性药物组合物包含约PH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，其还可包含山梨醇或适当的替代物(substitute)。在本发明的一个实施方案中，FGF21多肽突变体组合物可通过将选择的具有期望的纯度的组合物与任选的配方试剂(Remington’s PHARMACEUTICAL SCIENCES,同上)混合来制备，以冻干的饼状物或水溶液形式进行贮存。此外，可使用适当的赋形剂例如蔗糖将GDF15多肽产物配制为冷冻干产物(Iyophilizate)。
[0120]⑶F15多肽药物组合物可被选择用于胃肠外递送。或者，组合物可被选择用来吸入或通过消化道例如口服递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。
[0121]配方组分以对于施用部位是可接受的浓度存在。例如，使用缓冲剂来将组合物维持在生理pH或略微更低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。
[0122]当预期胃肠外施用时，用于本发明的治疗性组合物可以以在药学上可接受的媒介物中包含期望的GDF15多肽的无热原、胃肠外可接受的含水溶液的形式存在。用于胃肠外注射的特别适合的媒介物是无菌蒸馏水，将GDF15多肽在所述无菌蒸馏水中配制为适当地防腐的无菌等渗溶液。然而，另一种制备可包括利用试剂例如可注射微球体、生物蚀解颗粒、多聚体化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体配制期望的分子，所述试剂提供产物的受控或持续释放，所述产物随后可通过忙库注射(depot injection)来进行递送。还可使用透明质酸，并且该透明质酸可具有在循环中延长持续时间的作用。用于期望的分子引入的其它适当方法包括可植入的药物递送装置。
[0123]在一个实施方案中，药物组合物可被配制来用于吸入。例如，可将GDF15多肽配制为用于吸入的干粉。GDF15多肽吸入溶液还可利用喷射剂配制来用以进行气雾剂递送。在另一个实施方案中，溶液可被雾化。经肺施用进一步描述于国际公布号W094 / 20069中，所述国际公布描述了化学修饰蛋白质的经肺递送。
[0124]还预期某些制剂可通过口服施用。在本发明的一个实施方案中，以该方式施用的GDF15多肽可利用或不利用通常用于固体剂型例如片剂和胶囊的配制的那些载体来进行配制。例如，胶囊可被设计来在胃肠道的特定点释放制剂的活性部分，此时生物利用度被最大化并且系统前降解(pre-systemic degradation)被最小化。其它试剂可被包括来促进GDF15多肽的吸收。还可应用稀释剂、调味剂、低熔点石蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
[0125]另一种药物组合物可包括与适合用于片剂生产的无毒赋形剂混合的有效量的⑶F15多肽。通过将片剂溶解在无菌水或另一种适当的媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。适当的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂例如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
[0126]其它⑶F15多肽药物组合物对于本领域技术人员来说是显而易见的，包括在持续或受控递送制剂中含有GDF15多肽的制剂。用于配制多种其它持续或受控递送工具例如脂质体载体、生物蚀解微粒或多孔珠粒以及忙库型注射剂(depot injection)的技术对于本领域技术人员来说也是已知的(参见，例如，国际公布号W093 / 15722，该国际公布描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放，和Wischke&Schwendeman, 2008, Int.J.Pharm.364:298-327,以及 Freiberg&Zhu，2004，Int.J.Pharm.282:1-18，所述文献讨论了微球体/微粒的制备和使用)。如本文中所述，水凝胶是持续或受控递送制剂的实例。
[0127]持续释放制剂的其它实例包括以成形制品(shaped article)例如薄膜或微胶囊的形式存在的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(polylactide)(美国专利号3，773，919和欧洲专利号0058481)、L_谷氨酸与Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983, Biopolymers22:547-56)、聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer 等人，1981, J.Biomed.Mater.Res.15: 167-277 和 Langer, 1982, Chem.Tech.12:98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D (-) -3-羟基丁酸(欧洲专利号0133988)。持续释放组合物还可包括指质体，其可通过本领域已知的几种方法的任一种方法来制备。参见，例如，Epstein 等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:3688-92 ；和欧洲专利号 0036676,0088046 和 0143949。
[0128]待用于体内施用的⑶F15多肽药物组合物通常应当是无菌的。这可通过经由无菌滤膜过滤来实现。当将组合物进行冷冻干燥时，使用该方法的灭菌可在冻干和重建之前或之后进行。用于胃肠外施用的组合物可以以冻干的形式或以溶液贮存。此外，通常将胃肠外组合物置于具有无菌进入口的容器，例如静脉溶液包(intravenous solution bag)或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶中。
[0129]在药物组合物已配制后，可将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体或作为脱水或冻干的粉剂贮存在无菌小瓶中。可以以即用型形式或以在施用前需要复水的形式(例如，冻干的)贮存此类制剂。
[0130]在具体的实施方案中，本发明涉及用于生产单剂量施用单位的试剂盒。试剂盒可每一个包含具有干燥的蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器。还包括在本发明的范围内的是包含单室和多室预装注射器(例如，液体注射器和Iyosyringe)的试剂盒。
[0131]待治疗性使用的GDF15多肽药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员将理解，用于治疗的适当剂量水平从而将变化，这部分取决于递送的分子、将对其使用GDF15多肽的适应症、施用途径以及患者的尺寸(体重、体表面积或器官尺寸)以及状况(年龄和一般健康)。因此，临床医生可滴定剂量和改变施用途径以获得最佳治疗效果。取决于上述因素，常用剂量可在约0.1 μ g/kg多至约IOOmg / kg或更高的范围内变化。在其它实施方案中，剂量可在0.lyg/ kg多至约IOOmg / kg ;或I μ g/kg多至IOOmg /kg ;或为 5 μ g / kg、10 μ g / kg、15 μ g / kg、20 μ g / kg、25 μ g/kg、30 μ g/kg、35 μ g/kg、40 μ g / kg>45 μ g / kg>50 μ g / kg>55 μ g / kg>60 μ g / kg>65 μ g / kg>70 μ g / kg、75yg / kg多至约IOOmg / kg的范围内变化。在其它实施方案中，剂量可为50 μ g / kg、100 μ g / kg、150 μ g / kg>200 μ g / kg>250 μ g / kg、300μ g/kg、350μ g / kg>400 μ g /kg>450 μ g / kg>500 μ g / kg>550 μ g / kg>600 μ g / kg>650 μ g / kg>700 μ g / kg、750 μ g / kg、800 μ g / kg、850 μ g / kg、900 μ g / kg、950 μ g / kg、100 μ g / kg、200 μ g /kg>300 μ g / kg>400 μ g / kg>500 μ g / kg>600 μ g / kg>700 μ g / kg>800 μ g / kg、900 μ g / kg、1000 Ug / kg>2000 μ g / kg>3000 μ g / kg>4000 μ g / kg>5000 μ g / kg、6000 μ g / kg>7000 μ g / kg>8000 μ g / kg>9000 μ g / kg 或 IOmg / kg。
[0132]给药频率将取决于待使用的制剂中的GDF15多肽的药代动力学参数。通常地，临床医生将施用组合物直至剂量达到获得期望的效果。组合物从而可在一段时间内以单次剂量，以两次或更多次剂量(其可包含相同量的期望的分子或可以不包含相同量的期望的分子)施用，或通过植入装置或导管作为连续输注来施用。适当的剂量的进一步精细化由本领域技术人员来常规地进行，并且在由他们常规进行的任务的范围内。适当的剂量可通过使用适当的剂量-反应数据来确定。
[0133]药物组合物的施用途径符合已知的方法例如口服；通过经静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉内(intraportal)或病灶内途径的注射；通过持续释放系统(其还可被注射)；或通过植入装置进行的方法。当期望时，组合物可通过单次快速静脉注射(bulus injection)或通过输注连续地，或通过植入装置进行施用。
[0134]或者或另外地，组合物可通过已将期望的分子吸附至其上或包入其中的膜、海绵或其它适当的材料的植入来局部施用。当使用植入装置时，可将装置植入任何适当的组织或器官，并且期望的分子的递送可以是通过扩散、定时释放弹丸或连续施用。
[0135]为了以预定的速率递送药物例如GDF15多肽以便药物浓度可在长时期内维持在期望的治疗有效水平上，可使用多种不同的方法。在一个实例中，可使用包含聚合物例如明胶(例如，牛明胶、人明胶或来自另一来源的明胶)或天然存在的或合成产生的聚合物的水凝胶。任何百分比的聚合物(例如，明胶)可用于水凝胶，例如5、10、15或20%。适当的浓度的选择可取决于多种因素，例如期望的治疗特征谱(therapeutic profile)和治疗性分子的药代动力学特征谱(pharmacokinetic profile)。
[0136]可被掺入水凝胶的聚合物的实例包括聚乙二醇(“PEG”)、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-共聚-聚氧化丙烯、共聚-聚氧化乙烯嵌段或无规共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(氨基酸)、葡聚糖、肝素、多糖、聚醚等。
[0137]当产生水凝胶制剂时可被考虑的另一个因素是水凝胶与交联剂的交联程度。在一个实施方案中，交联可通过牵涉甲基丙烯酸酐的甲基丙烯酰化(methacrylation)反应来实现。在一些情况下，高度的交联可能是期望的，然而在其它情况下，更低程度的交联是优选的。在一些情况下，更高程度的交联提供更长的持续释放。更高程度的交联可提供较坚硬的水凝胶和更长的药物递送持续时间。[0138]聚合物与交联剂(例如，甲基丙烯酸酐)的任何比率可用于产生具有期望的性质的水凝胶。例如，聚合物与交联剂的比率可以为例如8:1,16:1,24:1或32:1。例如，当水凝胶聚合物为明胶并且交联剂为甲基丙烯酸酯时，可使用8:1U6:1,24:1或32:1的甲基丙烯酸酯:明胶的比率。
[0139]V.GDF15蛋白和核酸的治疗性用途
[0140]GDF15多肽可用于治疗、诊断或改善代谢病况或障碍。在一个实施方案中，待治疗的代谢障碍是糖尿病，例如2型糖尿症。在另一个实施方案中，代谢病况或障碍是肥胖。在其它实施方案中，代谢病况或障碍是血脂异常、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平或糖尿病性肾病。例如，可使用GDF15多肽治疗或改善的代谢病况或障碍包括其中人受试者具有 IOOmg / dL 或更高，例如 125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200或高于200 mg / dL的空腹血糖水平的状态。血糖水平可在进食或空腹状态下，或在随机状态下测定。代谢 病况或障碍还可包括其中受试者处于增加的发展代谢病况的风险中的状况。对于人受试者，此类状况包括100 mg / dL的空腹血糖水平。可使用包含⑶F15多肽的药物组合物治疗的病况还可见于相关文献例如，American DiabetesAssociation Standards of Medical Care in Diabetes Care-2011, American DiabetesAssociation, Diabetes Care 第 34 卷，增刊号 I, S11-S61, 2010,其通过引用并入本文。
[0141]在本申请中，代谢障碍或病况例如2型糖尿病、升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平、血脂异常、肥胖或糖尿病性肾病可通过向有此需要的患者施用治疗有效剂量的GDF15多肽，例如人⑶F15多肽例如SEQ ID NO:2、6或10来治疗。施用可如本文中所述，例如通过IV注射、腹膜内(IP)注射、皮下注射、肌内注射或以片剂或液态成型(liquid formation)的形式口服来进行。在一些情况下，⑶F15多肽的治疗有效剂量或优选剂量可由临床医生来确定。GDF15多肽的治疗有效剂量将取决于，除其它以外，施用方案、施用的试剂的单位剂量、是否将GDF15多肽与其它治疗剂组合施用、受者的免疫状态和健康。如本文中所用，术语“治疗有效剂量”意指引发研究者、医生或其它临床医生寻求的组织系统、动物或人类的生物学或医学反应(所述生物学或医学反应包括待治疗的疾病或病症的症状的减轻或改善)的GDF15多肽的量，即支持可观察水平的一种或多种期望的生物学或医学反应(例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性)的⑶F15多肽的量。
[0142]应指出，治疗有效剂量的⑶F15多肽还可随期望的结果而变化。因此，例如，在其中显示较低水平的血糖的情况下，⑶F15的剂量将相应地高于其中期望相较较低水平的血糖的剂量。相反地，在其中显示较高水平的血糖的情况下，GDF15的剂量将相应地低于其中期望相较较高水平的血溏的剂量。
[0143]在各个实施方案中，受试者是具有IOOmg / dL或更高的血溏水平的人，其可用⑶F15多肽进行治疗。
[0144]在一个实施方案中，本公开内容的方法包括首先测量受试者中的一种或多种代谢相关化合物例如葡萄糖、胰岛素、胆固醇、脂质的基线水平。然后向受试者施用包含GDF15多肽的药物组合物。在期望的一段时间后，再次测量受试者中的一种或多种代谢相关化合物(例如，血糖、胰岛素、胆固醇、脂质)的水平。然后将两个水平相比较以测定受试者中的代谢相关化合物的相对变化。取决于该比较的结果，可再施用一个剂量的包含GDF15分子的药物组合物，以获得期望水平的一种或多种代谢相关化合物。
[0145]应注意，可将包含⑶F15多肽的药物组合物与另一种化合物共施用。与⑶F15多肽共施用的化合物的身份和性质将取决于待治疗或改善的病况的性质。可与包含GDF15多肽的药物组合物组合施用的化合物的实例的非限定性目录包括罗西格列酮、吡咯列酮、瑞格列奈、那格列奈(nateglitinide)、二甲双胍、艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(stiagliptin)、普兰林肽、格列吡嗪、格列美脲(glimepriride)、阿卡波糖(acarbose)和米格列醇。
[0146]V1.试剂盒
[0147]还提供的是用于实施公开的方法的试剂盒。此类试剂盒可包括药物组合物例如本文中公开的那些药物组合物，包括编码本文中提供的肽或蛋白质的核酸、包含此类核酸的载体和细胞，以及包含含此类核酸的化合物的药物组合物，可在无菌容器中提供所述药物组合物。任选地，还可包括关于如何在代谢障碍的治疗中使用提供的药物组合物的说明书，或使所述说明书可为患者或医疗服务提供者所用。
[0148]在一个方面，试剂盒包括(a)包含治疗有效量的GDF15多肽的药物组合物；和(b)一个或多个用于药物组合物的容器。这样的试剂盒还可包括其使用说明书；说明书可以是针对精确的待治疗的代谢障碍定制的。说明书可描述试剂盒中提供的材料的用途和性质。在某些实施方案中，试剂盒包括患者用以进行施用以治疗代谢障碍例如升高的葡萄糖水平、升高的胰岛素水平、肥胖、2型糖尿病、血脂异常或糖尿病性肾病的说明书。
[0149]说明书可被打印在衬底例如纸或塑料等上，并且在该试剂盒的容器或其组件(例如，与包装相关的)等贴标签中，可将其作为包装说明书(package insert)提供于试剂盒中。在其它实施方案中，说明书以存在于适当的计算机可读存储介质例如CD-ROM、软盘等上的电子存储数据文件形式提供。在其它实施方案中，实际的说明书不存在于试剂盒中，但提供了用于从远程来源例如通过因特网获得说明书的工具。该实施方案的实例是包括网址的试剂盒，在所述网址上可阅览说明书和/或可从该网址下载说明书。
[0150]通常期望将试剂盒的一些或全部组分包装在适当的包装中以维持无菌性。可将试剂盒的组分包装在试剂盒容器组件中以产生单个容易操作的单元，其中试剂盒容器组件例如盒子或类似结构，可以是或可以不是气密容器，例如，以进一步保持试剂盒的一些或全部组分的无菌性。
实施例
[0151]下列实施例，包括进行的实验和得出的结果，仅仅被提供用于举例说明目的，并且不被解释为限制本发明。
[0152]实施例1
[0153]GDF15多狀的制各
[0154]将用⑶F15表达载体(用亲和标记物构建)转化的大肠杆菌生长至在600nm处的光密度为9，随后进行诱导，并在6小时后在63的光学密度下通过离心收集所述细菌。将冷冻的细胞糊解冻，利用低剪切均质器(low shear homogenizer)以15% (重量/体积)将其重悬浮于缓冲液中，直至浆体变得均匀。随后使细胞经历高剪切均化以破裂细胞并释放包含产物的包涵体。随后将所得的匀浆在5C以5，OOOx g离心I小时，来以沉淀的形式收集包涵体，将细胞质污染物留在弃去的上清液中。通过使用冷冻水和低剪切均质器将沉淀均匀地重悬浮至初始匀浆体积来从包涵体洗去残留的细胞质，随后如先前一样进行离心。随后将所得的沉淀(经洗漆的包涵体(washed inclusion body) (WIBS))于-80C冷冻。
[0155]将充足量的WIBS和盐酸胍(GnHCl)在pH8.5下用于还原-溶解(reducing-solubiIization)以得到约25mg / ml的还原产物和6M GnHCl的终浓度。随后通过搅拌进入具有碱性pH的含有氧化还原剂、离液剂(chaotrope)和共溶剂的重折叠缓冲液将溶解快速稀释25倍。将重折叠溶液轻轻搅拌，在6C下空气氧化72小时或直至溶液对于Ellman’ s试剂是阴性的。随后将重折叠溶液在5C通过深度过滤(depth filtration)澄清以允许10倍的超滤浓缩，以及随后透析过滤至pH8.5的含有50mM磷酸钠和低离液剂浓度的缓冲液中。将随后的渗余物(retentate)加温至25C，并且随后将pH降至酸性范围以引起污染物沉淀。通过在25C以5，OOOx g离心30分钟除去沉淀,并通过0.45um过滤进一步澄清所得的上清液。然后将滤出液(AP)调整至pH8.5和低盐浓度，以允许进行包括固定化金属亲和层析(imm obilized metal affinity chromatography) (IMAC)的纯化的第一步骤。
[0156]在蛋白质折叠和AP后，使用两步层析系列(two-stepchromatography train)纯化⑶F15。将调整的AP施加到用pH8.5的含有低盐浓度的缓冲离液剂平衡的IMAC柱。随后用平衡缓冲液洗涤柱直至获得基线紫外线(UV)水平。通过置换剂(displacer)浓度的逐步增加洗脱产物和污染物，收集洗脱物，随后通过考马斯染色的SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行测定，以鉴定哪个洗脱物级分包含以GDF15的预测分子量迁移的多肽。在完成IMAC后，将含有产物的混合级分在25C调整至pH7.2和5mMEDTA。通过在25C添加低浓度的酶(以切除亲和标记物)进行数小时来将产物转化成成熟长度的⑶F15。用有机改性剂调整切割反应混合物，并通过添加乙酸和有机溶剂来调整至酸性pH。这允许在25C进行由从反相柱线性梯度洗脱产物组成的终层析步骤。将来自层析的洗脱收集为级分，并随后通过SDS-PAGE进行测定，以确定混合用于均匀产物的适当的级分。将所得的混合物通过透析过滤至弱酸性缓冲液中来进行缓冲液交换，通过超滤进行浓缩，进行无菌过滤，并随后于5C贮存或进行冷冻。
[0157]实施例2
[0158]鼠CT)F15在肝和附睾组织中的调控
[0159]肝和脂肪组织是哺乳动物的主要代谢器官。为了鉴定用于代谢障碍的治疗的潜在新型治疗靶，进行微阵列研究以比较进食或禁食的野生型或肥胖ob / ob小鼠的肝和脂肪组织的基因表达模式。从自由接触食物(“进食”)或被禁食24小时(“禁食”)的年龄匹配的C57B16或ob / ob雄性小鼠(Jackson Labs)收获肝或附睾脂肪组织以进行RNA提取。将cRNA样本与定制的微阵列芯片(Agilent)杂交。分析数据以比较野生型与ob / ob小鼠之间以及进食与禁食小鼠之间的基因表达模式。鼠GDF15(SEQ ID NO:4 ；NCBI登录号BC067248.1)被鉴定为在受肝和脂肪组织中受进食/禁食调控以及在野生型和ob / ob小鼠中差异表达的靶基因。
[0160]图1A和IB分别显示⑶F15在肝和脂肪组织中的信号强度的改变。应注意，⑶F15表达水平在来自ob / ob小鼠的肝组织中比C57B1 / 6小鼠的显著更高。⑶F15表达水平被观察到在C57B1 / 6小鼠和ob / ob小鼠的肝中被禁食下调。⑶F15表达水平在来自ob /Ob小鼠的脂肪组织中比C57B1 / 6小鼠的显著更高。禁食在C57B1 / 6小鼠和ob / ob小鼠中升高⑶F15基因的表达水平。然而，倍数诱导在ob / ob小鼠中不太强劲。这些数据表明GDF15可能是新型代谢调节剂。
[0161]实施例3
[0162]PPAR激动剂对⑶F15的诱导[0163]PPARa是调节肝中的代谢的细胞核受体和代谢障碍的主要治疗性靶。PPARa据报导为在肝中介导禁食诱导的FGF21上调的主要调节剂(Inagaki T2007CellMetab5:415-25)。用PPARa激动剂氯贝丁酯(500mg / kg)处理雄性C57B16小鼠(Jackson)，并且在处理后I天收获肝组织以进行RNA提取。将cRNA样本与小鼠IOK微阵列(Motorola)杂交。分析数据以鉴定小鼠肝中的PPARci靶基因。图2A显示GDF15表达主要通过氯贝丁酯处理在小鼠肝中诱导，并且显示⑶F15在肝中是PPARa的下游靶基困。
[0164]PPARy是脂肪组织中基因表达的主要调节剂，并且PPAR Y激动剂在临床上被批准或被开发来用于糖尿病治疗。一些PPARy靶基因，例如脂连素、脂肪因子和脂肪组织中的PPARy靶基因(Maeda N2001Diabetes50 =2094-9)也被当作用于2型糖尿病治疗的治疗性靶。比较用媒介物或PPAR Y激动剂BRL49653处理的3T3-L1脂细胞中的基因表达模式，并且鼠⑶F15在脂细胞中被鉴定为靶基因诱导型PPARy激动剂处理。分化的3T3-L1脂细胞利用IOuM BRL49653处理24小时。分离RNA样本，将cRNA样本与小鼠IOK微阵列(Motorola)杂交。分析数据以鉴定3T3-L1脂肪细胞中的PPARy基因。图2B显示⑶F15表达在3T3-L1小鼠的脂肪细胞中主要由BRL49653处理诱导，并且显示⑶F15在脂肪细胞中是PPARy的下游靶基因，这表明GDF15具有为用于糖尿病治疗的治疗性靶的潜能。
[0165]实施例4
[0166]鼠CT)F15减少0b / Ob小鼠的食物摄入、体重增加、血液胰岛素水平、血糖水平和血月旨水平
[0167]由于⑶F15受代谢改变或活化调节代谢的主要途径的药物治疗强劲调控，因此我们检查GDF15在体内的过表达是否可引起肥胖和糖尿病ob / ob小鼠的代谢表型(ColemanDL1973Diabetologia 9:287-93)。为了两个主要有利方面，将腺伴随病毒(AAV)用于实现体内过表达。首先，与转基因不同，AAV可被用于成年动物并且不干扰胎儿发育。其次，与其它类型用于体内基因过表达的病毒不同，用无辅助病毒系统产生的AAV是复制缺陷型的并且不是病原性的(Matsushita T1998Gene Therapy5:938-45)。将 mu⑶F15 全长 cDNA (SEQID N0:3)克隆进入具有EFla启动子和bGH聚腺苷酸的AAV载体。用无辅助病毒系统产生AAV,并通过层析和梯度离心进行纯化。用8xl012个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒经尾静脉注射7周龄雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)。
[0168]在第10、17、24和63天检查葡萄糖水平和体重(分别地，图3A和3C)。从第3天至第24天每周测量食物摄(图3D)。也在第17天测量血液胰岛素(图3B)。在第63天测量总胆固醇(图3E)、游离脂肪酸(图3F)、甘油三酯(图3G)和胰岛素水平(图3H)。
[0169]相较于对照病毒处理的组，AAV-mu⑶F15组中下降的体重、食物摄入、血糖、胰岛素、甘油三酯和胆固醇水平证明AAV介导的mu⑶F15的体内过表达大大修正了 ob / ob小鼠中的代谢异常，包括摄食过度、肥胖、高血糖症、高胰岛素血症和血脂异常。该数据确证了我们的假说:GDF15调节身体代谢并且可以是用于代谢障碍例如肥胖、糖尿病和血脂异常的治疗的潜在治疗性靶。
[0170]实施例5
[0171]鼠OF15改善Ob / Pb小鼠的高血糖症而不依赖于食物摄入的减少并且无体重增血
[0172]⑶F15显著减少ob / ob小鼠的过度食物摄入和体重增加，从而产生高血糖症的改善是否继发于减少的食物摄入和减少的体重增加的问题。进行对饲研究以确定GDF15是否可改善高血糖症而不依赖于减少的食物摄入并且无体重增加。如实施例4中所述，用8xl012个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒经尾静脉注射7周龄雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)。
[0173]一组对照病毒注射的小鼠(对饲组)具有有限的食物接触。给予对饲组的食物的量(克食物摄入/克体重)经计算等于在针对体重标准化后，由AAV-mu⑶F15注射的小鼠前一天消费的食物的量(克食物摄入/克体重)。每天监测体重和食物摄入，并且GDF15对这些参数的影响分别示于图4A和4B中。在研究结束时测量葡萄糖水平和体重，并且⑶F15对这些参数的影响分别示于图4C和4D中。
[0174]在17天的对饲研究过程中，⑶F15组相较于对照病毒组具有减少的食物摄入和体重增加，并且对饲组维持与⑶F15组相似的体重(图4A和4B)。然而，⑶F15组具有比对照组和对饲组显著更低的葡萄糖水平，这表明⑶F15可不依赖于食物摄入或体重来改善高血糖ob / ob小鼠的葡萄糖管理。
[0175]实施例6
[0176]鼠O) F15的效力`在高脂肪饮食诱导的肥胖(DIO)模型中比在lH常饲料喂养的模型中更强劲
[0177]我们随后在B6D2F1小鼠(检查糖尿病治疗剂的效力的另一个啮齿类动物模型(Karasawa H2009MetabClin Exp58:296-33))中检查AAV介导的⑶F15过表达对高脂肪饮食的效力。为了进行比较，还在研究中包括饲以正常饲料的小鼠。对4周龄雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪饮食或正常饲料，进行3周。随后如实施例4中所述，用8xl012个基因组拷贝/ ms AAV-mu⑶F15或对照病毒经尾静脉注射它们。
[0178]在第7、13和28天通过血糖仪测量葡萄糖水平和体重；结果分别示于图5A和5B中。每周测量食物摄入，进行4周，并且结果示于图5C中。饲以正常饲料的对照动物的结果示于图5D-5F中。AAV-mu⑶F15大大降低了饲以高脂肪饮食的小鼠的血糖水平和体重。相反地，在饲以常规饲料的具有正常血糖水平的小鼠中，作用非常弱。
[0179]这些结果表明⑶F15是在疾病模型中选择性生效并且与一些糖尿病疗法不同，不可能引发低血糖症的代谢调节剂。
[0180]实施例7
[0181]鼠GDF15改善DIO小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性
[0182]糖尿病是胰岛素抗性和胰岛素不足的代谢疾病。为了进一步理解GDF15用于糖尿病治疗的潜能，我们测试饲以高脂肪饮食的小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，所述小鼠已用AAV-mu⑶F15或对照病毒施用处理。雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)饲以60%的高脂肪饮食，进行3周，并且随后如实施例4中所述，经尾静脉注射SxlO12个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒。[0183]在AAV注射后3周进行葡萄糖耐量测试(GTT)。如下进行GTT:将动物禁食4小时。随后测量体重和葡萄糖水平(通过血糖仪)，随后放血以用于胰岛素测量，以IOml / kg 口服施用20%的葡萄糖水溶液。通过血糖仪测量葡萄糖给药后第15、30、60、120分钟的葡萄糖水平。在第15、30、60分钟收集血液样本以测量血清胰岛素水平。图6A和6B分别显示GTT过程中的葡萄糖曲线和胰岛素曲线。在GTT研究中，⑶F15组在所有时间点上相较于对照组具有更低的葡萄糖水平(图6A)，表明GDF15处理的动物具有改善的葡萄糖耐受性。葡萄糖诱导的胰岛素分泌(GSIS)在所有时间点上也较低(图6B)，表明在口服葡萄糖加载后需要更少的胰岛素来进行葡萄糖代谢，这表明GDF15处理改善了这些小鼠的胰岛素敏感性。[0184]为了直接测试这些小鼠的胰岛素敏感性，在对4小时禁食的小鼠进行AAV注射后2周，进行胰岛素敏感性测试(1ST);使用0.5u / kg胰岛素的腹膜内给药。如下进行胰岛素敏感性测试(1ST):将动物禁食4小时。在测量体重和通过血糖仪测量葡萄糖水平后，用IOml / kg的0.5u / IOml Novolin溶液给动物进行腹膜内给药。通过血糖仪测量葡萄糖给药后第15、30、60、120分钟的葡萄糖水平。图6C显示1ST过程中的葡萄糖曲线。⑶F15处理组在所有时间点上相较于对照组具有更低的葡萄糖。图6D显示针对基线葡萄糖标准化的葡萄糖水平，并且⑶F15处理组在第30、60、90分钟相较于对照组具有更低的葡萄糖/基线葡萄糖比率，强烈地表明GDF15处理的动物中改善的胰岛素敏感性。
[0185]实施例8
[0186]人CT)F15改善DIO小鼠的葡萄糖耐受性
[0187]小鼠⑶F15成熟肽和人⑶F15成熟肽共有68.7%的同源性。为了检查人⑶F15在小鼠模型中是否具有功能，在用AAV-hu⑶F15或对照病毒处理的B6D2F1D10小鼠中测试葡萄糖耐受性。对雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪饮食，进行5个月，随后如实施例4中所述，经尾静脉注射SxlO12个基因组拷贝/动物AAV-hu⑶F15或对照病毒。
[0188]在AAV注射后2周，用4小时禁食的小鼠，如实施例7中所述进行葡萄糖耐量测试；使用2g/kg的口服葡萄糖激发。图7A描述了 GTT的结果。每3天测量一次食物摄入，进行12天。图7B显示在12天的时期中食物摄入测量的结果。
[0189]在2周的时间点上，在进行葡萄糖耐量测试之前测量体重。图7C描述了在2周的时间点上体重测量的结果。
[0190]最后，通过hu⑶F15ELISA (R&D系统)测量2周的时间点上的血浆⑶F15水平。图7D显示检测到的hu⑶F15的量。由于缺乏检测法，因此啮齿类动物的循环⑶F15水平不清楚。在正常人中，循环⑶F15水平据报道为数百pg/ml (Moore AG, 2000J ClinEndocrinolMetab85:4784-8)。我们的数据显示AAV_h⑶F15处理组在循环中具有数纳克的hu⑶F15(图 7D)。
[0191]综上所述，该数据显示了与小鼠GDF15类似，人GDF15在小鼠模型中是有效的并且功能在两种同源物之间是非常保守的，即使它们仅共有68.7%的序列同源性。
[0192]实施例9
[0193]人CT)F15阻止KK-Ay小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性的恶化
[0194]我们进一步测试⑶F15在KK-Ay小鼠(具有与ob / ob和DIO小鼠不同的病因学和症状的肥胖糖尿病啮齿类动物模型(Iwatsuka H 1970EndocrinolJpnl7:23-35))中的效力。如实施例4中所述，用8xl012个基因组拷贝/动物AAV-hu⑶F15或对照病毒经尾静脉注射17周龄雄性KK.Cg-Ay小鼠(Jackson Labs)。
[0195]在AAV注射后第3和第6周时间点上对禁食4小时的小鼠进行葡萄糖耐量测试；使用2g / kg 口服葡萄糖激发。对照组在第6周变得更具葡萄糖耐受性，因为动物变老并且疾病进展，而⑶F15组在AAV注射后6周和3周维持相似的葡萄糖耐受性(图8A)，这表明⑶F15处理阻止这些动物中的疾病进展。在葡萄糖激发之前，检查小鼠的体重和血液胰岛素水平。AAV注射对体重和血液胰岛素的影响分别示于图8B和8C中。对照组和⑶F15组在注射后3周具有轻度高胰岛素血症(图SC)。虽然对照组在第6周变得更加具高胰岛素血症，但⑶F15组显示改善的高胰岛素血症的趋势(图8C)，这表明与在B6D2F1高脂肪饮食小鼠中观察到的类似，GDF15处理通过增强的胰岛素敏感性改善了 KK-Ay小鼠的葡萄糖耐受性。
[0196]这些数据表明GDF15改善所有测试的糖尿病疾病小鼠模型的葡萄糖耐受性。
[0197]实施例10
[0198]人CDF15改善KKAy小鼠的糖尿和蛋白尿
[0199]KK-Ay小鼠的非常详尽记载的糖尿病表型是肾并发症，包括糖尿和蛋白尿(ReddiAS1988AdvExp Med Biol246:7-15)。我们还检查了⑶F15处理后KK-Ay小鼠的葡萄糖和白蛋白排泄。如实施例4中所述，用SxlO12个基因组拷贝/动物AAV-hu⑶F15或对照病毒经尾静脉注射17周龄雄性KK.Cg-Ay小鼠(Jackson Labs)。
[0200]AAV注射后3周，检查尿糖水平、尿白蛋白水平、尿量、每日水摄入、血清胰岛素水平、血糖水平、血清hu⑶F15水平、体重和食物摄入。结果示于图9A-9K(图9A显示尿糖水平,9B显示尿量,9C显示葡萄糖排泄,9D显示尿白蛋白，9E显示白蛋白排泄,9F显示水摄入，9G显示胰岛素水平,9H显示葡萄糖水平,91显示体重，以及9J显示食物摄,9K显示hu⑶F15水平。GDF15组相较于对照组具有显著改善的糖尿，通过尿糖水平(图9A)、尿量(图9B)和总葡萄糖排泄(图9C)的降低显示的。类似地，它们还具有显著改善的蛋白尿，如通过降低的尿白蛋白水平(图9D)、尿量(图9B)和总尿白蛋白排泄(图9E)显示的。GDF15组还将水摄入减少至6ml / d /动物，这与正常动物的水摄入相似，而对照组的水摄入为约19ml / d / 动物。
[0201]这些结果表明⑶F15显著地改善了尿中的葡萄糖和白蛋白排泄，并且可在糖尿病性肾病中具有另外的有益作用。
[0202]实施例U
[0203]鼠CT)F15减少DIO模型中的脂肪质暈和脂肪质暈/总身体质暈比率
[0204]由于⑶F15强劲地减少B6D2F1D10小鼠的食物摄入和体重增加，因此在AAV-mu⑶F15注射后测量B6D2F1D10小鼠的身体质量和脂肪质量以确定⑶F15是否主要减少身体脂肪质量和可用作肥胖治疗或主要减少瘦体质量(body lean mass),这是不希望的。对4周龄雄性B6D2F1小鼠(Harlan)采用60 %的高脂肪饮食或正常饲料，进行3周，随后如实施例4中所述，经尾静脉注射SxlO12个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒。
[0205]在AAV注射后5个月，通过DEXA扫描(PIXImus II，GE)测量总身体质量和脂肪质量。结果示于图1OA(总身体质量)和IOB (脂肪质量)。也计算脂肪质量/总身体质量的比率和非脂肪质量/总质量的比率(分别地，图1OC和10D)。5个月后，未暴露于外源⑶F15的饲以高脂肪饮食的小鼠(对照组)获得许多重量，并且过度肥胖，而⑶F15组维持与瘦的年轻动物相似的正常身体质量(图10A)。⑶F15组还具有低得多的身体脂肪质量(图10B)和身体脂肪质量/总质量比率(图10C)。相反地，非脂肪质量/总质量比率在GDF15组中增加(图10D)。该数据表明GDF15处理主要降低身体脂肪质量并且可被当作肥胖的治疗。
[0206]实施例12
[0207]人CT)F15减少DIO模型中的脂肪质暈和脂肪质暈/总身体质暈比率
[0208]由于与实施例12中概述的原因相似的原因，在AAV_huGDF15注射后测量B6D2F1D10小鼠中的身体质量和脂肪质量。对雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪饮食，进行5个月，随后如实施例4中所述，经尾静脉注射SxlO12个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒。
[0209] AAV注射后一年，AAV-h⑶F15处理组的体重维持在约30g(图11A)，并且hu⑶F15血浆水平维持在约5ng/ml (图11B)。通过DEXA扫描(PIXImus II，GE)测量总身体质量(图11C)、脂肪质量(图11D)和骨矿物质密度(图11E)。还计算脂肪质量/总身体质量的比率和非脂肪质量/总质量的比率(分别地，图1lG和11H)。将一组饲以正常饲料的12周龄雄性B6D2F1小鼠包括在DEXA扫描中以进行比较。
[0210]该实验显示人GDF15通过减少脂肪质量和增加非脂肪/总身体质量比率展示抗肥胖性质。
[0211]实施例13
[0212]重组鼠CT)F15蛋白改善痩素-缺陷型Ob / Ob小鼠的高血糖症和摄食过度
[0213]我们通过AAV介导的体内表达显示小鼠和人GDF15在不同的小鼠模型中的强代谢效力。随后，我们测试重组小鼠⑶F15蛋白在ob / ob小鼠中的效力。每天2次对6周龄雄性ob / obj鼠(Jackson Labs)皮下施用5mg / kg rmGDF15蛋白或媒介物。简而言之，按照食物摄入、体重和葡萄糖水平将ob / ob雄性小鼠随机分入媒介物和处理组。每天2次对动物皮下施用5mg / kg重组mu⑶F15蛋白或媒介物缓冲液,进行2天。
[0214]测量注射之前和第I天及第2天的葡萄糖、体重、食物摄入。对于所有时间点，葡萄糖水平示于图12A中，体重示于图12B中，食物摄入示于图12C中。
[0215]这些结果表明外源施用的重组小鼠⑶F15蛋白，与AAV-mu⑶F15类似，在ob / ob小鼠中是有效的。
[0216]实施例14
[0217]重组人CT)F15蛋白改善痩素-缺陷型Ob / Ob小鼠的高血糖症和摄食过度
[0218]还在ob / ob小鼠中测试了重组人⑶F15蛋白的效力。通过单次注射，对7周龄雄性ob / ob小鼠(Jackson Labs)皮下施用5、1.5、0.5、0.15mg/kg rh⑶F15蛋白质或媒介物缓冲液。如实施例13中所述,对动物进行随机化分组。
[0219]处理后16-17小时测量葡萄糖、体重、食物摄入。葡萄糖水平示于图13A中，食物摄入示于图13B中，并且体重示于图13C中。
[0220]数据显示外源施用的重组人⑶F15蛋白急剧地改善ob / ob小鼠的摄食过度和高血糖症，并且效力是剂量依赖性的。
[0221]实施例15
[0222]重组人GDF15蛋白改善DIO小鼠的葡萄糖耐受性[0223]我们还测试了重组人⑶F15蛋白在DIO模型中的效力。通过单次给药，对饲以60%的高脂肪饮食6个月的雄性B6D2F1小鼠(HarlanLabs)皮下施用5mg / kg r⑶F15蛋白或质媒介物缓冲液，如实施例13中所述对动物进行随机化分组。
[0224]在给药后3天，对禁食4小时的小鼠进行葡萄糖耐量测试(GTT);使用Ig / kg的口服葡萄糖激发。GTT的结果示于图14A。每天测量食物摄入，并且其显示于图14B中。在进行GTT之前测量体重，体重示于图14C中。
[0225]综上所述，这些结果表明重组人⑶F15蛋白在DIO小鼠模型中是有效的。
[0226]实施例16
[0227]重组人CT)F15改善脂质耐受性
[0228]发现⑶F15的另一个有趣的代谢活性是:⑶F15急剧地改善小鼠的脂质耐受性。给对以60 %的高脂肪饮食2个月的雄性B6D2F1小鼠(Harlan Labs)皮下施用5mg /kgrh⑶F15蛋白质或媒介物缓冲液。4小时后，给小鼠口服施用20ml / kg20 % intralipid?。在脂质激发后第0、60、90、120、180分钟，通过比色测定(Sigma)测量血清甘油三酯水平。测量的血清甘油三酯的水平示于图15A中。第180分钟的血清rh⑶F15水平通过hu⑶F15ELISA(R&D Systems)来测量，并且示于图15B中。
[0229]在⑶F15和媒介物处理的动物中，在口服英脱利匹特激发后第30、60、90分钟血清甘油三酯水平升高(图15A)。然而，第60和90分钟的甘油三酯水平在处理组中显著更低，这表明GDF15急剧改善这些动物的脂质耐受性(图15A)。包括高甘油三酯血症的血脂异常是心血管疾病的主要风险困子，是造成糖尿病患者的死亡率的最主要结果(HokansonJE1996J.Cardiovasc.Risk3:213-219)。⑶F15对脂质耐受性的急剧改善表明⑶F15可在糖尿病血脂异常，特别地食后血脂异常中提供有益作用。
[0230]实施例7
[0231]鼠CT)F15改善DIO模型中的胰岛素和脂质特征谱
[0232]由于⑶F15精确地改善脂质耐受性，我位还检查了⑶F15是否长期改善血脂特征谱。对B6D2F1小鼠(Harlan Labs)采用60%的高脂肪饮食，并且如实施例4中所述，经尾静脉给小鼠注射8xl012个基因组拷贝/动物AAV-mu⑶F15或对照病毒。在AAV注射后3周测量血液胰岛素、总胆固醇、NEFA和甘油三酯水平。结果示于图16中；图16A显示胰岛素水平，图16B显示NEFA水平，图16C显示总胆固醇水平，并且图16D显示甘油三酯水平。⑶F15组相较于对照组具有更低的胆固醇水平(图16C)和甘油三酯水平，这表明⑶F15长期改善脂质特征谱。该数据还表明GDF15处理可在糖尿病血脂异常中提供有益作用。
【权利要求】
1.一种治疗代谢障碍的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的分离的人⑶F15多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍是2型糖尿病。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍是血脂异常。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍是肥胖。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍是糖尿病性肾病。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢障碍包括其中所述受试者具有大于或等于100 mg/dL的空腹血糖水平的病况。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述⑶F15蛋白包括SEQID NO:2、6和10之一。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述⑶F15多肽由SEQID NO: 1、5和9之一编码。
11.根据权利要求1所述的方法，其中以包含与药学上可接受的载体混合的所述⑶F15多肽的药物组合物的形式施用所述⑶F15多肽。
12.根据权利要求 1所述的方法，其还包括在所述施用后的时间点上测定所述受试者的血糖水平的步骤。
13.根据权利要求1所述的方法，其还包括在所述施用后的时间点上测定所述受试者的血清胰岛素水平的步骤。
【文档编号】A61P3/00GK103533951SQ201280017293
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年4月5日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】Y.熊, Y.李, W-C.叶, B.单, J.Z.圣 申请人:安姆根有限公司