专利名称：生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是高血压的主要直接并发症。据调查，在我国农村4270例高血压患者中，有心脏肥厚者占42.8％。左心室肥厚被公认为心衰的前期病变，是心衰、脑中风、冠心病和猝死的重要独立危险因素。研究表明，左室肥厚易导致心脏内血液淤滞，易引起房颤等心律失常，促进血栓形成，使缺血性脑卒中的发生危险增加2.5倍。此外，左心室肥厚使心血管疾病的总发生率平均增加2.3倍，使高血压患者及总体人群的总死亡率平均增加2.5倍。因此，控制心肌肥厚可以减少脑中风、冠心病、心衰及死亡。这对延长我国人民寿命，提高生活质量，节省医疗资源具有极为重要的意义。
虽然高血压是心脏肥厚最重要的危险因素，但是其他多种因素，如年龄、性别、生活方式、肥胖程度、药物治疗、糖尿病以及遗传因素等，都会对左室重量有影响。其中，血压水平对左室重量的影响约占25％，而遗传因素对左心室重量的影响约占所有非血压因素的60％。将左心室肥厚作为多种疾病的中间表型，寻找其中的致病基因，从分子水平揭示高血压引发的靶器官损伤的复杂发病机理，可为及早发现左心室肥厚的危险人群、干预左心室肥厚发生和发展提供有利手段。
作为本次研究的候选基因，生长分化因子15(growth-differentiation factor 15，GDF15)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成员之一。起初，人们发现GDF15参与了肿瘤的发生和发展，调控肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移。近来，研究表明GDF15还是一个重要的心血管保护因子。虽然心脏在正常情况下不表达GDF15，但是当心脏处于多种病理状态，如后负荷升高刺激、缺血/再灌注损伤时，GDF15在心肌细胞被迅速诱导高表达。成熟的GDF15蛋白被分泌到细胞外后，与心肌细胞表面TGF-β家族受体结合，激活Akt、SMAD等下游信号通路，反馈抑制心肌的损伤。在小鼠模型中，GDF15基因敲除使小鼠心脏在基线水平即显著增大，在压力后负荷升高刺激后，左室肥厚的程度更加严重。与此相反，心肌特异高表达GDF15可以显著抑制压力后负荷升高引起的左室肥厚。此外，GDF15的血浆水平在心衰、动脉粥样硬化及心肌梗死的病人中显著升高。升高的GDF15血浆水平与女性动脉粥样硬化患者的预后及非ST升高急性冠状动脉症的死亡率密切相关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途。
本发明采用的技术方案以GDF15为功能候选基因，在河南省信阳市农村社区原发性高血压人群中研究了GDF15的基因单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)对高血压继发左心室肥厚的影响。结果表明，一个位于GDF15启动子区的标签SNP(tagSNP)rs4808793与原发性高血压的左心室肥厚发生及肥厚程度紧密相关。
本发明的重要意义心肌肥厚是所有心脑疾病发生的独立危险因素，也是一个可以控制的因素。GDF15的基因多态性对高血压继发心肌肥厚的程度有良好的预测性，这就为高为高血压患者的个性化诊断提供了指导，为预后判断提供了重要参考，也为高血压继发左心室肥厚的治疗提供了潜在的药物干预靶位点。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种预测高血压继发左室肥厚的检测引物和试剂盒。
一种预测高血压继发左室肥厚的检测引物，具有序列表SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
一种预测高血压继发左室肥厚的试剂盒，成分和含量如下(50人份)，于-20℃保存50μL 10×PCR缓冲液(TaKaRa)，50μL 10mmol/L dNTP混合液(TaKaRa)，12μL(5U/uL)Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，各20μL(10umol/L)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物(北京奥科生物公司)5ml去离子双蒸水(ddH2O)，100μL 10×BsrI限制性内切酶反应缓冲液(美国New England Biolabs公司)
35μL(10U/μL)限制性内切酶BsrI(美国New England Biolabs公司)本发明的优点和创新性在于1.本发明是世界上首次将生长分化因子15的基因多态和高血压继发左室肥厚相关联，确认了GDF15基因多态在高血压继发左心室肥厚中的预测作用，研究对象为中国的原发性高血压患者的社区人群，数目大，代表性高；2.本研究发现的生长分化因子15的基因多态对高血压继发左心室肥厚的预测效果非常显著；3.标签SNP rs4808793与其周围的四个SNP紧密连锁，检测出的rs4808793这一个SNP的基因型就可以代表其余周围四个SNP的基因型。与rs4808793相比，其他四个SNP的基因型分型费用高，准确性低，使用本发明的方法很大程度上降低了检测的费用，提高了检测了可行性和可信度；4.预测高血压继发左心室肥厚的引物序列(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)为我实验室自主设计，检测的敏感性和特异性好，成本低。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制，凡是依照本发明公开内容所做出的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为GDF15基因结构及三个SNP的相对位置示意图；LD block为高度连锁不平衡区域，rs4808793代表的其他四个SNP也显示在连锁不平衡区域内。
图2为SNP-3148C/G位点的分型图谱，M为核酸标准品。
具体实施例方式
实施例1本研究为中国农村社区高血压人群左心室肥厚流行病及相关危险因素调查研究的子课题。我们采用随机整群抽样法从河南信阳的7个自然村中检测出40岁至75岁的原发性高血压患者5,421例，并对其中4,869位进行了超声心动图检查。从总共7个自然村中，我们随机挑选了3个，将所有已进行超声心动图检测的高血压患者入选本研究，排除所有患有其他影响左心室肥厚的心血管疾病(肥厚型心肌病、瓣膜性心脏病、肺动脉高压及冠状动脉病)的病人，最终产生了包含1,527名(506名男性，1021名女性)原发性高血压患者的研究人群。
一.临床指标测定1.血压水银血压计测量坐位右上肢血压，取两次平均值。高血压定义根据WHO标准，即收缩压≥140和/或舒张压≥90和/或服用降压药物。
2.超声一维和二维的超声心动图检测严格按照AHA标准执行。在M型超声心动图上，记录每个病人的左室舒张末期直径(left ventricular internal dimension atend-diastole，LVIDD)和收缩末期直径(left ventricular internal dimension atend-systole，LVISD)，舒张末期室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)和左室后壁厚度(posterior wall thicknesses，PWT)。取三个连续心动周期的平均值。相对室壁厚度(Relative wall thickness，RWT)计算公式为RWT＝100×2×PWT/LVIDD。左室重量(left ventricular mass，LVM)运用以下公式计算LVM(g)＝0.8×(1.04×(LVIDD+IVST+PWT)3-(LVIDD)3)+0.6，将LVM除以体表面积(body surface area，BSA)得到左室重量指数(LVMBSA)，左室肥厚定义为男性LVMBSA＞131g/m2，女性LVMBSA＞100g/m2。
3.生化指标所有病人均回答有关生活方式和药物史的问卷，进行详细的体征测量，并取尿和空腹12小时静脉血，检测相关的生化指标。糖尿病为空腹血糖≥7.0mmol/L，或有糖尿病病史者。体重指数(BMI)＝体重(kg)/身高(m)2。″曾经吸烟″定义为有生以来吸烟多于20包，或者持续一年每天吸烟至少一支；″曾经饮酒″定义为饮酒持续一年，平均每周至少一次。
二.基因分型1.SNP入选本研究采取标签SNP(tagSNP)结合功能候选SNP策略来挑选SNP。通过对HapMap数据库的分析并结合以前的报道，本研究共挑选了GDF15基因的三个SNP，分别为rs4808793，rs1059369，rs1058587，相对于转录起始位点的编号分别为-3148C/G，+157A/T，+2438C/G。HapMap数据库分析结果显示，-3148C/G(rs4808793)和+157A/T(rs1059369)在中国汉族人群中均为标签SNP(tagSNP)。其中-3148C/G位于转录调控区，与其他4个SNP(rs12459566，rs8101804，rs12459782，rs1059519)紧密连锁不平衡((D’＝1，r2＞0.9)，而+157A/T位于1号外显子，与另1个SNP(rs1804826)完全连锁不平衡(D’＝1，r2＝1)。位于2号外显子的+2438C/G虽然没有与其他SNP位点连锁，但是由于其可以导致GDF15成熟蛋白的第六位氨基酸由组氨酸变为精氨酸(C-G，His-Arg)，进而可能会影响GDF15成熟蛋白的功能，因此我们也将其入选。
2.基因分型2.1试剂(1)人血基因组DNA纯化试剂盒DP318-02(天根生化科技，北京，中国)(2)10％SDS10.0g SDS溶于90ml水中，调pH7.2，加水定容至100ml。
(3)TE10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA-Na2(pH 8.0)(4)50 X TAE电泳缓冲液242.0g Tris-HCl，27.5ml冰乙酸，100ml 0.5mMEDTA-Na2，终体积1升。
(5)制性内切酶均购自美国New England Biolabs公司(6)有引物均购自北京奥科生物公司2.2仪器及设备(1)PCR仪DNA ergine美国Bio-Rad公司(2)冷冻离心机RC-5C美国SORVALL公司(3)天平JA5003上海天平仪器厂(4)凝胶电泳槽北京六一仪器厂2.3实验步骤(1)使用血基因组DNA纯化试剂盒(DP318-02)从4ml外周血中提取基因组DNA，所有步骤均按照说明书进行。
(2)聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性(PCR-PFLP)法对三个SNP进行基因分型，具体如下A.PCR扩增目的片段三个SNP进行PCR扩增的引物、退火温度(Tm)及产物长度见表1。
表1GDF15基因多态位点PCR具体信息
注+157A/T的下游引物经过修饰，下划线标识的即为引入的突变
-3148G/C及+157A/T使用PCR反应系统(KT221-01，北京天根生化科技)进行扩增，体系如下Taq Mix(2X)5.0uLgDNA(100ng/uL) 1.0uLPF(5pmol/uL) 0.8uLPR(5pmol/uL) 0.8uLddH2O 2.4uL
total 10.0uL+2438C/G采用Ex Taq酶和GC bufferI(大连宝生物)相结合的反应体系PF(5pM) 0.4uLPR(5pM) 0.4uLgDNA(100ng/uL)1.0uLEx Taq(5U/uL) 0.1uLdNTP(10mM each) 0.3uLGC bufferI(2X)5.0uLddH2O 2.8uL
total 10.0uLPCR反应条件(退火温度具体见表1)step1＝94.0℃ 5分钟 step5＝72.0℃ 10分钟step6＝04.0℃B.酶切将PCR产物酶切12小时，其反应体系如下(内切酶具体见表1)PCR产物 10.0uL10X Buffer1.5uL
内切酶2.0unitddH2O 补齐到15uL
总体积15.0uLC.电泳鉴定(参见图2)①-3148C/GPCR产物长251bp，BsrI酶切后，3％琼脂糖胶电泳检测，G等位基因产生191bp和60bp两条片段，C等位基因只有一条251bp片段；②+157A/TPCR产物长209bp，BsrGI酶切后，4％琼脂糖胶电泳检测，T等位基因产生179bp和30bp两条片段，A等位基因只有一条209bp片段；③+2438C/GPCR产物长165bp，AvaII酶切后，4％琼脂糖胶电泳检测，C等位基因产生27bp，45bp和93bp三条片段，G等位基因只有两条27bp和138bp的片段。
三.统计学分析采用x2检验比较计数资料、基因型和等位基因频率差异以及SNP的Hardy-Weinberg平衡。采用非配对t检验或者单因素方差分析比较两组或多组间计量资料。SNP和计量型超声指标的关联采用多元回归分析，即将每个超声指标对影响心脏大小的传统因素(包括年龄、性别、体表面积、收缩压、舒张压、曾经饮酒、曾经吸烟、高血压治疗、糖尿病等)进行校正后再进行分析。使用简单线性回归分析检测阳性SNP对超声指标的影响是否符合“加性模式”。使用多元线性回归分析检测SNP是否为心脏大小和重量的独立预测因子。双侧尾P＜0.05被认为具有统计学差异。所有的分析均在SPSS 11.5统计软件中进行。
四.结果1.研究人群的临床特点本研究入选高血压人群的临床特点如表2所示。男性和女性在年龄构成、血脂水平、血糖等方面均有极显著差异(P＜0.01)。男性的所有超声指标均高于女性，除了相对壁厚(RWT)，其他测量值均差异极其显著。但是女性的左室肥厚比率显著高于男性，这可能与我们人群中女性收缩压显著高于男性有关(P＜0.01)。
2.GDF15基因多态性位点与临床和生化指标的关联GDF15基因结构及本实验入选的三个SNP在GDF15基因上相对位置如图1所示。三个SNP的等位基因频率均符合Hardy-Weinberg，并且两两之间没有连锁不平衡。
我们用单因素方差分析分别对三个SNP的基因型对研究人群临床和生化指标的影响进行了检测。结果发现，+157A/T和+2438C/G对上述指标没有任何影响，而-3148C/G只对舒张压有显著影响。随着-3148G的增对，舒张压显著降低(CC，CG，GG分别为100.0±12.6mmHg，98.3±11.7mmHg，97.6±11.5mmHg，P＝0.015)。简单线性回归分析表明，舒张压和-3148G之间存在显著的量效关系(P＝0.005)。
3.GDF15基因多态性位点与高血压继发心肌肥厚相关GDF15基因多态性位点在肥厚和不肥厚亚组中的基因型和等位基因分布如表3所示。从中可见，三个SNP中只有-3148C/G与左室肥厚的发生显著相关。其中，G等位基因在不肥厚亚组中频率更高(P＝0.009)，提示-3148G可能为保护性等位基因。
为了进一步分析GDF15基因多态性位点在高血压继发心肌肥厚中的作用，我们用单因素方差分析分别检验了所有的超声指标在三个SNP基因型之间的差别。结果表明，仍然只有-3148C/G对超声指标有影响，随着-3148G的增加，舒张末期左室直径、收缩末期左室直径、左室重量和左室重量指数均逐渐减小。即便在校正了各种可能影响心脏大小的因素(包括年龄、性别、体表面积、收缩压、舒张压、曾经饮酒、曾经吸烟、高血压治疗、糖尿病等)之后，这一作用依然存在，然且差异极其显著(表4)。简单线性回归分析表明，-3148G对左室重塑的作用具有量效关系，为典型的加性模式。更进一步的多元线性回归分析表明，-3148G是舒张末期左室直径、收缩末期左室直径、左室重量和左室重量指数最强的独立预测因子之一(表5)五.结论GDF15基因的-3148G等位基因对高血压继发左室肥厚具有保护作用，并且这一保护作用具有显著的量效关系。这是世界上首次将GDF15的基因多态性与高血压继发左室联系起来，为高血压继发左心室肥厚的治疗提供了可能的药物靶位点，也为个性化诊断和预后提供了重要的提示。
表2研究人群的临床特点
计量资料表示为平均值±标准差，计数资料表示为事件比例。P值为非配对t检验统计显著性。
表3 GDF15基因多态性位点与高血压继发左心室肥厚的关联
P为卡方检验的统计显著性。OR通过2×2交互表计算得到。
表4-3148C/G基因型对超声指标的影响
多元回归分析中，所有的超声指标均为校正值，校正的协变量包括年龄、性别、体表面积、收缩压、舒张压、曾经饮酒、曾经吸烟、高血压治疗、糖尿病等。
简单线性回归分析检测-3148G对超声指标的作用是否为加性作用模式，其中CC＝0，GC＝1，GG＝2。
表5超声指标多元线性回归分析中-3148G的相关参数
实施例2预测高血压继发左心室肥厚的试剂盒一.组成成分和含量如下(50人份)，于-20℃保存50μL 10×PCR缓冲液(TaKaRa)，50μL 10mmol/L dNTP混合液(TaKaRa)，12μL(5U/uL)Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，各20μL(10umol/L)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物(北京奥科生物公司)5ml去离子双蒸水(ddH2O)，100μL 10×BsrI限制性内切酶反应缓冲液(美国New England Biolabs公司)35μL(10U/μL)限制性内切酶BsrI(美国New England Biolabs公司)二.使用方法1.常规方法提取受试者基因组DNA；2.PCR反应表6
反应条件step1＝94.0℃ 5分钟 step5＝72.0℃ 10分钟step6＝04.0℃3.酶切将PCR产物酶切12小时，其反应体系如下PCR产物 10.0uL10×Buffer 1.5uL内切酶BsrI(5U/uL)0.6uLddH2O2.9uL
总体积 15.0uL4.电泳鉴定PCR产物长251bp，BsrI酶切后，3％琼脂糖胶电泳检测，G等位基因产生191bp和60bp两条片段，C等位基因只有一条251bp片段。
序列表<110>阜外心血管病医院<120>生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>1agtgagtcct tgtgtctctt ac 22<210>2<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>2gcaggctggt gtagagtc18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3ggctgcttgg ggggtgggag 20<210>4<211>29<212>DNA<213>人工合成<400>4gcaagtttct cgggaccctc agagttgta29
<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5gcagaatctt cgtccgcac 19<210>6<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>6ccagcccagg tcttccag18
权利要求
1.生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途。
2.根据权利要求1所述的生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途，其特征在于所述应用为提供高血压继发左心室肥厚的治疗药物靶位点。
3.根据权利要求1所述的生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途，其特征在于所述应用为提供个性化诊断。
4.根据权利要求1所述的生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途，其特征在于所述应用为提供预后的导性方针。
5.预测高血压继发左心室肥厚的引物序列，其特征在于具有序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.预测高血压继发左心室肥厚的试剂盒，其特征在于由下列试剂组成，成分和含量如下(50人份)，于-20℃保存50μL 10×PCR缓冲液，50μL 10mmol/L dNTP混合液，12μL(5U/uL)Taq DNA聚合酶，各20μL(10umol/L)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物，5ml去离子双蒸水(ddH2O)，100μL 10×BsrI限制性内切酶反应缓冲液，35μL(10U/μL)限制性内切酶BsrI。
全文摘要
本发明公开了生长分化因子15基因多态位点在预测高血压继发左心室肥厚中的用途，属于医学分子生物学领域。本发明的优点是确定了GDF15基因多态在高血压继发左心室肥厚中的作用，利用相关SNP为高血压继发左心室肥厚治疗提供了药物靶位点，为个性化诊断和预后提供指导性方针。
文档编号C12Q1/68GK101020928SQ200710064639
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月21日 优先权日2007年3月21日
发明者惠汝太, 王晓建, 杨旭, 孙凯, 陈敬洲, 宋晓东, 王曙霞, 王虎, 张禅那 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院