专利名称：一种苏云金芽孢杆菌工程菌uv173a及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程菌，特别是涉及一种广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌工程菌及其制备方法。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。在形成芽孢的同时，能产生由一种或几种杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体(parasporalcrystal)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。
迄今为止已有人从不同的Bt菌株中克隆了378种杀虫晶体蛋白基因，根据杀虫晶体蛋白氨基酸的同源性，可将他们分为53大类，分属160种模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。其中，cry1类基因的表达产物对鳞翅目昆虫有特异的杀虫活性，其蛋白分子量为130～140kD，用胰蛋白酶处理可生成60kD的毒性核心片段(Whiteley，H.R.And Schnepf，H.E.，The molecular biology of parasporal crystalbody formation in B.thuringiensis，Annu.Rev.Microbiol.，1986，40549)，Cry1Ba蛋白对小菜蛾具高毒力。cry3A基因对鞘翅目昆虫具有特异毒性，该基因编码65kD的蛋白，可不依赖于芽孢萌发形成晶体，在昆虫中肠液的作用下，被降解为55kD的毒性多肽(Krieg A，HugerAM，Langenbruch G A，et al.1983 Bacillus thuringiensis var.tenebrionisein neuer gegenuberlarven von Coleopteren wirksamer pathotyp.Z.Ang.Entomol.，96500-508)。
国内外已有人利用生物工程的方法，构建了一些苏云金芽孢杆菌工程菌。如美国Ecogen公司首次利用质粒结合转移等细胞工程手段构建了含有cry3B和cry1Ca基因、对鳞翅目和鞘翅目害虫有活性的Bt工程菌(Sick，A.et al.1990.Nucleotide sequence of acoleopteran-active toxin from a new isolate of B.t.subsp.tolworth.Nucl Acids Res.18；Entwistle，P.F.，1993.An Environmental BiopesticideTheory and Practice.Wiley Chichester Press.U.K.125-146.)。美国Mycogen(Frank.H.Gaertner.et al.Bacillus thuringiensis isolate.US Patent，NO.4910016.Mar.20，19907.)公司和Sandoz(Dimitri-Karamata.et al.Insecticidal hybrid bacteriafrom B.t.subsp.kustaki and B.t.subsp.tenebrionis.US Patent NO.4797279.Jan 10，1989.)公司用上述同样的方法研制出MT104和B-18013，分别用于粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和马铃薯甲虫的防治。
目前世界上防治鳞翅目和鞘翅目害虫所使用的Bt制剂杀虫谱较窄、品种单一、害虫易于产生抗性，而且已经发现在田间小菜蛾对商品化的Bt制剂产生了抗性，因此延缓害虫抗性的产生、拓宽Bt制剂的杀虫谱逐渐成为人们的研究重点(Tabashnik B E，1994.evaluationof resistance to Bacillus thuringiensis.Annu.Rev.Entomol..，3947-79.)。
野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17是本实验室分离的一株对鳞翅目害虫小菜蛾高的毒力Bt菌株，同时对鞘翅目害虫也表现出一定的毒杀活性。通过基因型鉴定发现，其含有cry1Ba3基因。Van Rie等在室内小菜蛾抗性筛选中，发现Cry1Ba与Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry1Ja等杀虫晶体蛋白之间没有产生交叉抗性(Van Rie J，FerréJ.Insect resistance toBacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins.InCharles F J，Decécluse A，Nielsen-leRouxC.eds.Entomopathogenic bacteriafrom laboratory to field application.DordrechtKluwerAcademic Publication，2000)。2004年本研究组发现Cry1Ba与Cry3Aa组合对鞘翅目害虫具有显著的增效作用(张杰，宋福平，黄大昉。对鳞翅目与鞘翅目昆虫高毒力的Bt基因、表达载体和工程，2004，ZL 01124164.0)因此，通过基因重组技术将野生UV17菌株用于鳞翅目小菜蛾和鞘翅目叶甲科害虫的治理，有助于扩宽杀虫谱，具有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明针对目前世界上防治鳞翅目和鞘翅目害虫所使用的Bt制剂杀虫谱较窄、品种单一、害虫易于产生抗性的目的，本发明通过基因工程手段提高苏云金芽孢杆菌野生菌株的毒力，拓宽工程菌制剂(即Bt产品)的杀虫谱，延缓害虫对其产生的抗药性。
一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A，保藏号是CGMCC No.1891。
所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A，含有cry3Aa7和cry1Ba3两个基因。
所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A的制备方法，是将重组表达载体pSTK-3A导入野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17中得到，所述的载体pSTK-3A含有cry3Aa7基因，野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17含有cry1Ba3基因。
所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A在杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫中的应用。
所述的应用是将苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A制成各种制剂用于杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫。
所述的应用是提取苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A中cry3Aa7基因蛋白和cry1Ba3基因蛋白用于杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫。
本发明中为了实现发明的目的，将含有cry3A7基因的重组表达载体pSTK-3A导入对鳞翅目害虫小菜蛾高毒力的野生菌株UV17中(保藏号CGMCC No.1890，该菌株只含有cry1Ba3基因，对鳞翅目和鞘翅目害虫均有毒杀作用)，得到苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A(保藏号CGMCC No.1891，该工程菌具有双价基因cry1Ba3和cry3Aa7的高效、广谱的杀虫特性，特别是对鞘翅目害虫的增小作用显著)。
因为菌株UV17对鳞翅目害虫小菜蛾有较高毒力，对鞘翅目害虫具有一定的活性。因此所构建的工程菌UV173A对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫同时具有高毒力。本发明中，通过实验，将新的工程菌UV173A制成粉剂在室内外对常见的主要危害作物蔬菜的小菜蛾，榆蓝叶甲，马铃薯甲，黄条跳甲等鳞翅目和鞘翅目害虫进行防治检测，结果表明能很有效的杀灭此类害虫。
菌种保藏信息菌种名称UV17，Bacillus thuringiensis保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏日期2006年12月18日保藏编号CGMCC No.1890菌种名称UV173A，Bacillus thuringiensis保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏日期2006年12月18日保藏编号CGMCC No.189
图1UV173A中cry3Aa7基因的PCR鉴定1λ/Eco130I Marker 2UV173A/SC3A5，SC3A3PCR扩增产物3阳性对照+(Bt22/SC3A5，SC3A3PCR扩增产物)4阴性对照图2来源于UV173A的pSTK-3A质粒酶切图谱1λ/Eco130I Marker 2pSTK-3A(UV173A)/BamH I，Sal I酶切结果图3工程菌株中表达蛋白的SDS-PAGE检测结果1Bt22 2UV17 3UV173A 4Protein Marker图4不同培养时间UV173A中cry3Aa7基因的表达情况
1Protein Marker；224hrs；326hrs；428hrs；530hrs；632hrs；734hfs；836hrs；940hrs；1048hrs.
图5UV173A中Cry3Aa蛋白的Western Blotting检测ASDS-PAGE.Lane 1Protein Marker；Lane 2UV173A；Lane 3Bt22；Lane 4UV17.
BWestern bloting corresponding to the SDS-PAGE.Lane 5Protein Marker；Lane 6UV173A；Lane 7Bt22；Lane 8UV17.
图6扫描电子显微镜下观察到的晶体形态A野生菌株UV17；B工程菌株UV173A；C野生菌株Bt22(含有cry3Aa7基因).
图7工程菌UV173A与对照菌株UV17的生长曲线比较具体实施方式
以下是本发明的实施例，这些实施例只对本发明举例说明。实际上，可使用本发明所描述的野生型菌株UV17，使用本发明所描述的cry3Aa7基因与cry1Ba3基因的组合。此外，使用本发明构建的广宿主载体pSTK，以本领域的普通技术人员所掌握的任何一种方法导入任何微生物、植物或其它组织、细胞中，以及由此所获得具有任何抗虫活性的微生物、植物，以及该类植物后代的种子、杂交和转育后代，均包括在本发明之内。
实施例1苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A的制备1.1大肠杆菌SCS110电感受态的制备挑取单菌落于5ml LB震荡37℃培养过夜。按1％接种量接种于100ml LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2hrs(OD600＝0.5)。4℃，4000rpm离心6min。弃上清，加入预冷的超纯水冲洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞。4℃，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入10％甘油1-2ml重新悬浮细胞，分装，-70℃保存备用。
1.2Bt电击感受态的制备挑取单菌落于5ml LB震荡30℃培养过夜。按1％接种量接种于100ml BH液体培养基中，37℃，230rpm培养3-4hr(OD600＝2.0)。4℃，9000rpm离心6min。弃上清，加入预冷的超纯水洗两次。加入预冷的超纯水悬浮细胞，4℃，9000rpm离心6min，回收细胞。加入预冷的超纯水洗两次，加入40％PEG重悬细胞，分装，-70℃保存备用。
1.3Bt质粒DNA提取接菌于5mL液体LB培养基试管中30℃，230rpm活化。按1％接菌量接菌于三角瓶中37℃，230rpm震荡培养4h左右(OD600＝2.0)。5,000rpm，5min离心收集菌体。每100mL菌液加1.5mLSI(10％蔗糖，50mM Tris·Cl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)Lysozyme 20mg/ml，(用时现配)，混匀，37℃放置2-4h。每100mL菌液加13.5mL SII(10mM Tris·Cl，1mM EDTA，0.085MNaOH，1.1％SDS用时现配)，轻轻混匀，放置10min。每100mL菌液加7.5mL SIII(5M KAc，用冰乙酸调至pH4.8)，轻轻混匀，0℃放置4h上。12,000rpm离心5min，取上清，加入等体积异丙醇，-20℃放置30min以上。12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀用70％乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用3mL超纯水溶解。加入50μl RNase，37℃作用2h，除去RNA。酚、氯仿抽提后，补水至10mL，加入1/103M NaAC和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2h。12,000rpm离心5min，弃上清，沉淀用70％乙醇漂洗。将沉淀在真空干燥器中干燥后用lmL超纯水溶解。
1.4大肠杆菌热击感受态细胞制备及转化挑取单菌落于5mlLB震荡培养过夜；按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD600＝0.5-0.6)；4℃，4000rpm离心10min；弃上清，加入预冷的0.1M CaCl250ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞，分装成200μL/0.5mL离心管中，于4℃保存，一周内用完。
E.coli的转化将200μL感受态细胞与要转质粒混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基37℃培养60min，取200μL涂板，37℃培养。
1.5大肠杆菌质粒DNA提取离心收集菌体，用200μL SI悬浮，冰浴10min；加入SII400μL，翻转混匀，冰浴5min；加入SIII300μL，迅速混匀，冰浴5min；12000rpm离心8min，取上清用等体积的异丙醇沉淀；12000rpm离心8min，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀，干燥，溶解；用RNase 2μl除RNA，用苯酚、氯仿异戊醇分别抽提溶液；加入1/10V的3M NaAc(pH5.2)，加入2V的无水乙醇沉淀，-20℃10min；12,000rpm离心8min，70％乙醇洗沉淀，干燥，适量的水溶解；1.6cry3Aa7基因在Bt中的表达用含有cry3Aa7基因的重组质粒转化大肠杆菌SCS110，用卡那霉素进行筛选，得到转化子，从中提取重组质粒，然后电击转化Bt自然菌株UV17(电击条件2.5kV，400Ω，25μF，30℃，100rpm 2h)，利用卡那霉素抗性筛选转化子，得到工程菌UV173A。将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm，30℃培养。从第24小时开始，每隔4小时取一次样，将样品进行处理后，进行SDS-PAGE检测，观察工程菌中cry3Aa7基因表达变化情况。样品处理方法将所取样品离心，收集菌体，菌体沉淀中加入100μl超纯水和50μl 3×Sample Buffer混匀，煮沸5分钟，进行SDS-PAGE。
1.7工程菌的分子检测PCR检测和酶切检测用SC3A5和SC3A3(序列如下)为引物，以得到的Bt转化子为模板，进行PCR扩增，结果表明工程菌可以扩增出1.9kb的DNA条带，证明其中含有cry3Aa7基因，图1为PCR鉴定结果；同时从转化子中提取质粒DNA，将提取的质粒通过热击转化方法重新导入大肠杆菌JM110中；得到转化子后，从中提取质粒，用BamH I和Sal I进行双酶切检测，结果表明得到的质粒可以被酶切为8.4kb和1.9kb的DNA条带，证明表达载体pSTK-3A已经成功导入UV17中，图2为酶切鉴定结果。Bt菌株质粒DNA的提取参见文献(Narva K E，Payne J M，Schwab G E，Hickle L A，Galasan T，Sick A J.European Patent Office no.EP 0462721.1991.)。
引物序列(用于扩增全长的cry3Aa7基因片段)SC3A55`-CGCGGATCCGATGAAACTAAAGAATCCAG-3`SC3A35`-ACGCGTCGACGGCATGTTACGCTCAATATGG-3`注划线部分为酶切位点，GGATCC为BamH1酶切位点，GTCGAC为Sal1酶切位点。
SDS-PAGE检测将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm，30℃培养。从第24小时开始，每隔4小时取一次样，将样品进行处理后，进行SDS-PAGE检测，观察工程菌中cry3Aa7基因表达变化情况(图3、图4)。样品处理方法将所取样品离心，收集菌体，菌体沉淀中加入100μl超纯水和50μl 3×Sample Buffer混匀，煮沸5分钟，备用。SDS-PAGE方法参见分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992)。结果表明Bt22菌株(对照菌株)(张杰宋福平等，对鞘翅目害虫高毒力Bt基因cry3Aa7的分离克隆及表达研究，中国农业科学，2002，35(6)，650-653)中只表达65kDa的Cry3Aa蛋白，UV17只表达约140kDa的蛋白带；而在工程菌株UV173A中，除含有原受体菌中所表达的蛋白外，还同时表达了约65kDa的Cry3Aa蛋白带，表明外源的Cry3Aa蛋白在受体菌株中可以正常表达，形成晶体(图6)。分别于第32、36、38、40、42、44小时取样，离心收集沉淀，SDS-PAGE分析不同时间内cry3Aa7基因的表达情况。结果表明，cry3Aa7基因可以在出发菌株中稳定表达65kDa的蛋白(图7)。
Western-blotting检测抗体制备Cry3Aa蛋白的抗体由中科院遗传所动物中心制备；将蛋白样品进行SDS-PAGE；转膜电泳后将载有蛋白的凝胶用转移缓冲液漂洗，按照金冬雁等(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南(第二版)(金冬雁等).北京科学出版社，1992。)的方法用湿式转膜仪将蛋白从聚丙烯凝胶转移至PVDF膜；封闭将膜放入TBST缓冲液中漂洗，然后转入封闭液中室温封闭2小时；第一抗体反应按1000∶1的比例在封闭液中加入Cry3Aa蛋白/小鼠抗血清(一抗)，室温结合1-2小时，洗膜三次，每次15分钟；第二抗体反应按500∶1的比例在TBST加入羊抗鼠IgG-AP(二抗)，室温结合1小时，洗膜三次，每次15分钟；显色将PVDF膜置于含有NBT和BCIP的显色液中显色至条带清晰，将膜放入蒸馏水中漂洗终止反应。将膜取出凉干，拍照。Western-Blotting杂交结果进一步证明cry3Aa7基因在工程菌株中可以形成65kDa的蛋白(图5)。
扫描电镜检测将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm、30℃培养；约36小时后，离心，弃上清，将沉淀重悬于无菌水中；同时将盖玻片粘在载物台上，然后将孢晶混合物涂在盖玻片上，用无水乙醇逐级脱水、干燥，锇酸固定，喷金；扫描电子显微镜下观察晶体的形态。结果证明在UV173A中同时可以形成菱形晶体和方形晶体。图6为扫描电镜下的观察结果。
生长情况观察将得到的工程菌菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，230rpm、30℃培养，每2小时取样，在紫外分光光度计下测定OD600值，观察细胞生长变化。比较了UV17和UV173A的生长曲线，发现表达载体pSTK-3A导入野生菌株UV17中，对它的生长速率没有显著的影响。
图7为它们的生长曲线。
1.8工程菌的遗传稳定性采用连续培养法(Guangun Wang.Jie Zhang.Fuping Song.Jun Wu.Shuliang Feng.DafangHuang Engineered Bacillus thuringiensis GO33A with broad insecticidal activity againstlepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol(2006)72924-930)测定工程菌的遗传稳定性，将待测菌株接种在含有抗生素的LB液体培养基中30℃振荡培养过夜，以1％的接种量转接至无抗生素的LB液体培养基中，30℃连续振荡培养，于24、36、48、60、72hrs取样，按菌浓度稀释107-109倍，并分别取100ul稀释液涂布于没有选择压的LB平板上，30℃培养30-40hrs，待长出单菌落后，任意挑取100个单菌落转移至有选择压的平板上，30℃培养30-40hrs，统计有选择压的平板上的菌落数，以下式计算抗性菌落百分数 实验结果表明，在无抗性的培养基中培养72小时后工程菌遗传稳定性仍可达到85％(表1)。
证明工程菌中含有外源cry3Aa7基因的质粒可以稳定遗传。
表1工程菌中pSTK-3A质粒的遗传稳定性
实验例1工程菌杀虫活性对比将工程菌UV173A、出发菌株UV17以及对照菌株Bt22进行牛肉膏蛋白胨培养基摇瓶培养，然后将培养液进行离心，收集菌体，菌体经过低温干燥制成粉剂。检测粉剂中活孢子的数量为107/mg，SDS-PAGE电泳检测粉剂中晶体蛋白的含量为UV17中130kD的蛋白为15.07％，UV173A中130kD和65kD的蛋白分别为4.89％、13.04％。将粉剂稀释成不同的浓度，采用浸叶法，在室内来测定工程菌株对鳞翅目害虫小菜蛾以及鞘翅目害虫榆蓝叶甲的活性。72小时后调查工程菌对小菜蛾的杀虫效果(见表2)，120小时后调查工程菌对榆蓝叶甲的杀虫结果(见表3)。生测结果表明受体菌株UV17只对小菜蛾具有较高的杀虫活性，LC50为18.21μg/ml，而工程菌株UV173A不仅对鳞翅目害虫小菜蛾具有很高的毒力，同时对鞘翅目害虫榆蓝叶甲的具有较高的毒力，LC50分别为18.03μg/ml、1.47mg/ml。
对重要的检疫害虫—马铃薯甲虫室内防治效果为0.31mg/mL；田间防治效果高达92％以上，远远强于出发菌株Bt22(表4，表5)。对叶甲科害虫黄条跳甲田间防效达到87.28％(表6)；表2工程菌UV173A在室内对小菜蛾的杀虫活性
NAno activity表3工程菌UV173A在室内对榆蓝叶甲的杀虫活性
表4工程菌UV173A对马铃薯甲虫的生测结果
NDnot determined表5工程菌UV173A田间对马铃薯甲虫的防治效果
表6工程菌UV173A对鞘翅目黄条跳甲的防治效果
结论从实验例可以看出，本发明的工程菌杀虫活性强，杀虫的范围宽，防治效率高。
权利要求
1.一种的苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A，保藏号是CGMCC No.1891。
2.根据权利要求1所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A，含有cry3Aa7和cry1Ba3两个基因。
3.根据权利要求1或2所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A的制备方法，是将重组表达载体pSTK-3A导入野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17中得到，所述的载体pSTK-3A含有cry3Aa7基因，野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17含有cry1Ba3基因。
4.权利要求1或2所述的一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A在杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用是将苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A制成各种剂型用于杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫。
6.根据权利要求4所述的应用是提取苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A中cry3Aa7基因蛋白和cry1Ba3基因蛋白用于杀灭鞘翅目和鳞翅目害虫。
全文摘要
本发明“一种苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A及其制备方法和应用”，提供了一种通过基因组合构建广谱杀虫活性的苏云金芽孢杆菌工程菌UV173A，其保藏编号是CGMCC No.1891，并且提供了获得该工程菌的方法是将重组表达载体pSTK－3A导入野生苏云金芽孢杆菌菌株UV17中得到。该工程菌UV173A具有对杀虫谱较宽，对鞘翅目和鳞翅目害虫均有高效，且杀虫是生物制剂，害虫不易产生抗药性。
文档编号C12R1/07GK101050449SQ20071006449
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月16日 优先权日2007年3月16日
发明者张 杰, 王广君, 宋福平, 黄大昉, 李国勋 申请人:中国农业科学院植物保护研究所