专利名称：一种用于单细胞电穿孔的纳电极和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微型细胞电转染的相关装置，特别是涉及一种用于单细胞电穿孔的纳电极和电穿孔系统。
背景技术：
基因转导是指将来自供体的遗传物质(如DNA分子)转移至受体细胞的过程。近年来，随着分子遗传学、重组DNA技术等方面的发展，迫切需要建立快速、高效的基因转导方法。目前已发展了多种基于物理、化学、生物、生物物理方法的基因导入技术，如基因枪法、显微注射法、聚乙二醇介导法、脂质体介导转化法等。其中，电击穿孔(简称电穿孔)法属于一种生物物理的方法，利用外加的高电场引起细胞质膜结构的重新分布，当跨膜电势超过质膜的击穿电压(0.2～1.5V)时，质膜上会瞬间出现可逆微孔(一般为数十纳米)，从而使正常情况下无法进入细胞的外源物质(DNA、蛋白质、氨基酸、药物、染色剂等)通过这些微孔进入细胞内部。电穿孔转导具有对受体细胞的副作用小，电穿孔的脉冲参数和过程容易控制等特点，因此是一种很有前途的基因转导方法。同时，这种方法操作简单、转化效率高、没有细胞种属的限制，已广泛应用于细胞工程和基因工程等方面，成为实现基因转导的一种常用方法。
随着生命科学的发展，特别是生物学在单细胞、亚细胞甚至更深层次上研究的逐渐深入，人们迫切需要能够对细胞体特定靶区进行超微量导入的单细胞电穿孔技术。根据电穿孔现象的原理，如果能够使细胞彼此隔离，并且能够利用超微小的电极将电场聚集在细胞膜微小区域和实现对跨膜电势的控制，就可实现对单细胞的低压、微区、可控、高效、微损的基因电转导。目前，一些学者已进行了基于微电极的单细胞电穿孔技术的研究，如1 998年，Lundqvis等，参考文献[1]J.Anders Lundqvist，Owe Orwar，Maria.A.I.Aberg，et al.Altering the biochemical state of individual cultured cells and organelles withultramicroelectrode.Proc.Natl.Acad.Sci.1998，9510356-10360.；采用直径为5微米的碳纤维微电极首先实现了单细胞电穿孔(图1为原理示意图)，他们将荧光素和Fluo-3成功地导入到rat hippocampus的原代细胞中；再如美国冷泉港实验室的H.T.Cline等人，参考文章[2]Kurt Haas，Wun-Chey Sin，Ashkan Javaherian，et al.Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.Neuron.2001，March，Vol.29583-591.；利用尖端直径为0.6～1微米的玻璃微吸管实现了对蝌蚪单个脑细胞的电穿孔，他们将绿色荧光蛋白导入并实现了在神经细胞和神经胶质中的表达。他们进行单细胞电穿孔实验的装置，包括玻璃微吸管、微操作器、显微镜、电压脉冲发生器、示波器等。
虽然利用微电极已经可以实现单细胞的电穿孔，但是当前基于微电极的单细胞基因电转导技术还存在一些问题(1)使用的是微米尺度的电极，与细胞的尺度相近，因此难以实现对单细胞指定微区进行微损、微量的基因导入；(2)微电极产生的场强仍不够集中，电穿孔电压还需进一步减小，以减小对细胞的损伤；(3)对微电极、细胞体和周围介质组成的超微电极系统的电模型还缺乏研究，无法实现对单细胞基因电转导过程的精确监控。
发明内容
本发明的目的之一是克服当前单细胞基因电转导技术使用的是微米尺度的电极，与细胞的尺度相近，因此难以实现对单细胞指定微区进行微损、微量的基因导入；(2)目的之二是克服当前单细胞基因电转导技术使用的微电极产生的场强仍不够集中，电穿孔电压不够小，而会对细胞产生损伤的缺陷；从而提供一种用于单细胞电穿孔的纳电极和电穿孔系统。
本发明的目的是这样实现的本发明提供的用于单细胞电穿孔的纳电极，由一根本体，所述的本体头部具有尖端形状部分，和在该本体的其余部分(除尖端状的部分外)覆盖的绝缘层，以及固定在所述本体另一端的一根电极引线组成；其特征在于，所述本体的尖端状部分直径为1nm-10μm×长度1nm-100μm。
本发明提供的用于单细胞电穿孔的系统，包括微操作器、电穿孔信号发生器、生物显微镜；其特征在于，还包括纳电极和微电极；所述的微电极安装在一根玻璃微吸管内，该玻璃微吸管管口直径为100nm～100μm；所述的纳电极和微电极分别安装在2个所述的微操作器上；一盛装培养液的培养皿放置在纳电极和微电极的下方，该纳电极和微电极的电极引线分别与电穿孔信号发生器电连接，在进行单细胞基因电转导过程中，其纳电极的尖端和微电极前端与培养液中的细胞接触，组成单细胞阻抗检测电路；显微镜放置在盛装培养液的培养皿下方；玻璃微吸管在微操作器的控制下可实现对单个细胞的捕捉；单细胞阻抗检测电路可实现对单细胞基因电转导过程的实时监控。
在上述的技术方案中，还包括吸引器、橡皮导管，其中所述的吸引器通过所述的橡皮导管连接到玻璃微吸管上。
在上述的技术方案中，还包括电阻抗测试仪，所述的纳电极、微电极与所述的电阻抗测试仪的输入端电连接，构成电阻抗检测电路。
在上述的技术方案中，所述的纳电极的本体可采用金属、半导体或碳纳米管、纳米线等材料制作；所述的金属包括钨、铂铱合金、金、银等。
在上述的技术方案中，所述的纳电极本体表面涂覆的绝缘材料，包括硅酮树脂、硝酸纤维或二甲基硅氧烷(PDMS)。
在上述的技术方案中，所述的玻璃微吸管中的微电极可采用Ag/AgCl、Pt、饱和甘汞或标准氢等电极。
利用电阻抗法实现对单细胞基因电转导过程的监控既可采用直流阻抗法也可采用交流阻抗法；既可采用3电极法也可采用2电极法。
本发明的优点在于本发明利用纳电极实现对单细胞的基因电转导技术，由于纳电极具有常规电极不具备的表面、小尺度等纳效应，因此该种电导入技术具有高效、微区、低电压(小于1伏)、低发热量、细胞损伤小等优点。
本发明提供的用于单细胞电穿孔的纳电极达到如下主要技术指标纳电极的尖端直径1纳米-10微米；玻璃微吸管的尖端直径100纳米-100微米；微操作器x，y，z方向的定位精度0.1微米-10微米；电穿孔信号发生器能够产生的信号幅值0.01V-100V，波形方波或指数波；电阻抗测试仪的测试范围直流-100kHz。
本发明提供的利用本发明制作的纳电极所组成的对单细胞进行电穿孔的系统，可实现直径1微米-1000微米的单细胞进行电穿孔。该系统不仅利用了纳电极超小尺寸所具有的场强集中、微区、低电压、低发热量、损伤小等特点，并且实现了对单细胞的捕捉以及利用电阻抗法对基因电转导过程的监控。该项技术可应用于基因工程学、细胞电生理学等领域。
图1(a)-(c)是已有技术采用直径为5微米的碳纤维微电极实现单细胞电穿孔的原理示意图其中图1(a)表示电穿孔前；图1(b)表示电穿孔中；图1(c)表示电穿孔后图2是本发明的基于纳电极的单细胞电穿孔装置的组成示意3是纳电极的组成示意面说明1、显微镜；2、单细胞；3、培养液；4、培养皿；5、纳电极；6、橡皮导管；7、微电极；8、玻璃微吸管；9、9’、微操作器；10、引线；11、绝缘层；12、纳电极本体13、尖端状部分14、信号发生器 15、电阻抗测试仪16、吸引器具体实施方式
下面结合实施例及附图详细对本发明进行说明实施例1参考图3，制作一个纳米钨电极。
纳米电极本体12为一根直径为0.3mm×长3mm的钨丝，配制2～5mol/L NaOH溶液，然后将直径为0.3mm的钨丝接到直流电源的阳极，将不锈钢圈接到直流电源的阴极，在5-10V的直流电压下，将钨丝的一端部腐蚀为具有纳米量级的尖端状部分，例如尖端状部分直径为10纳米、100纳米、几百纳米或1微米，以及10微米，尖端长度为1纳米-100微米；并且将本体除尖端以外的地方浸入到硝酸纤维的丙酮溶液中，然后取出，使钨本体12尖端状以外部分的表面包覆一层硝酸纤维绝缘层11，再在钨丝的另一端部焊接一根电极引线10，得到纳米钨电极5。
实施例2参考图3，在实施例1的基础上将纳米电极本体12的材料改变为银(换成另外的金属)，制作一个本发明的纳电极；其中该电极本体12的尖端直径为600纳米，尖端长度为10微米，其余部分涂敷硅酮树脂绝缘层11。
实施例3参考图3，在实施例1的基础上将纳米电极本体12的材料改变为纳米碳管，该纳米碳管直径为10纳米，其余部分涂敷二甲基硅氧烷(PDMS)绝缘层11。
实施例4参考图3，将纳米电极本体12的材料改变为铂铱合金(换成另外的金属)，然后采用拉制的方法制作一个本发明的纳电极；其中该电极本体12的尖端直径为1微米，尖端长度为10微米，其余部分涂敷二甲基硅氧烷绝缘层11。
实施例5图2为本发明的基于纳米电极的单细胞电穿孔最基本系统，利用实施例1-4制作的任一纳电极，都可以制作本发明的单细胞电穿孔系统，本实施例的纳电极5用实施例1的纳米钨电极，一根Ag/AgCl电极丝作为微电极7安装在一根玻璃微吸管8内，该玻璃微吸管8的管口直径例如为100nm、900nm、1μm、50μm或100μm；所述的纳电极5和微电极7分别安装在2个所述的微操作器(9、9’)上，一盛装培养液3的培养皿4放置在纳电极5和微电极7的下方，该纳电极5的电极引线10和微电极7分别与信号发生器14电连接，在进行单细胞基因电转导过程中，纳电极的尖端部分13和玻璃微吸管8前端与培养液3中的单细胞2接触，组成单细胞阻抗检测电路；显微镜1放置在盛装培养液的培养皿4下方；玻璃微吸管8在微操作器(9、9’)的控制下可实现对单个细胞的捕捉；所组成的单细胞阻抗检测电路可实现对单细胞基因电转导过程的实时监控。
实施例6参考图2，利用实施例1-4制作的任一纳电极，都可以制作本发明的用于单细胞电穿孔的系统，本实施例的纳电极5用实施例1的纳米钨电极，一根Ag/AgCl电极丝作为微电极7安装在一根玻璃微吸管8内，该玻璃微吸管8管口直径例如为100nm、900nm、1μm、50μm或100μm；还包括一吸引器16(可用市场上购买的吸引器或用注射器代替)、一根橡皮导管6；其中吸引器16通过橡皮导管6连接到玻璃微吸管8上。一电阻抗测试仪15(例如，利用CHI660型电化学工作站的交流阻抗测试功能)的输入端与纳电极5的电极引线和微电极电连接，构成电阻抗检测电路，所述的纳电极5和微电极7分别安装在2个所述的微操作器(9、9’)上，一盛装培养液3的培养皿4放置在纳电极5和微电极7的下方，该纳电极5的电极引线10和微电极7分别与信号发生器14电连接，在进行单细胞基因电转导过程中，纳电极的尖端部分13和玻璃微吸管8前端与培养液3中的单细胞2接触，组成单细胞阻抗检测电路；显微镜1放置在盛装培养液的培养皿4下方；玻璃微吸管8在微操作器(9、9’)的控制下可实现对单个细胞的捕捉；所组成的单细胞阻抗检测电路可实现对单细胞基因电转导过程的实时监控。
利用钨纳电极和实施例6的系统实现单细胞电穿孔的具体步骤如下培养皿中放入细胞和待转染物质(DNA、蛋白质、氨基酸、药物、染色剂等)，向带有Ag/AgCl微电极的玻璃微吸管内充注生理盐水，使生理盐水的液面高过Ag/AgCl微电极的下端。将玻璃微吸管和侧壁绝缘的纳电极安装在微操作器上，并将电极尖端浸入培养皿。在显微镜下，移动微操作器，使玻璃微吸管的尖端接近待转染的细胞表面，同时利用电阻抗测试仪监测玻璃微电极和纳电极之间的阻抗。当阻抗突然增加时，说明玻璃微电极的尖端已接触到细胞表面，可停止移动玻璃微电极。启动吸引器，利用负压将细胞固定在玻璃微吸管尖端。然后将纳电极移动到所固定细胞需要转染的部位。将电路切换至电穿孔信号发生器，选择合适的波形、峰值、占空比等参数，启动电穿孔信号发生器，当跨膜电势超过质膜的击穿电压时，质膜上会瞬间出现可逆微孔，从而使培养皿中的外源物质通过这些微孔进入细胞内部。由于质膜发生穿孔后细胞的电阻抗会减小，因此同样可采用电阻抗测试仪监测细胞膜是否发生了穿孔。
权利要求
1.一种用于单细胞电穿孔的纳电极，该纳电极由一本体，所述的本体头部具有尖端形状部分，和在该本体的其余部分覆盖的绝缘层，以及固定在所述本体另一端的一根电极引线组成；其特征在于，所述本体的尖端状部分直径为1nm-10μm×长度1nm-100μm。
2.按权利要求1所述的用于单细胞电穿孔的纳电极，其特征在于，所述的本体采用金属、半导体或碳纳米管、纳米线等材料制作；所述的金属包括钨、铂铱合金、金、银等。
3.按权利要求1所述的用于单细胞电穿孔的纳电极，其特征在于，所述的纳电极本体表面涂覆的绝缘材料，包括硅酮树脂、硝酸纤维或二甲基硅氧烷。
4.一种用于单细胞电穿孔的系统，包括微操作器、电穿孔信号发生器、生物显微镜；其特征在于，还包括纳电极和微电极；所述的微电极安装在一根玻璃微吸管内，该玻璃微吸管管口直径为100nm-100μm；所述的纳电极和微电极分别安装在2个所述的微操作器上；一盛装培养液的培养皿放置在纳电极和微电极的上方，该纳电极和微电极的电极引线分别与电穿孔信号发生器电连接，在进行单细胞基因电转导过程中，其纳电极的尖端和玻璃微吸管前端与培养液中的细胞接触，组成单细胞阻抗检测电路；显微镜放置在盛装培养液的培养皿下方。
5.按权利要求4所述的用于单细胞电穿孔的系统；其特征在于，还包括一吸引器和橡皮导管；其中所述的吸引器通过所述的橡皮导管连接到玻璃微吸管上。
6.按权利要求4所述的用于单细胞电穿孔的系统；其特征在于，还包括电阻抗测试仪，所述的纳电极、微电极与所述的电阻抗测试仪的输入端电连接，构成电阻抗检测电路。
7.按权利要求4所述的用于单细胞电穿孔的系统；其特征在于，所述的玻璃微吸管中的微电极采用Ag/AgCl、Pt、饱和甘汞或标准氢电极。
全文摘要
本发明涉及一种用于单细胞电穿孔的纳电极和系统，该纳电极由一根本体，所述的本体头部具有尖端形状，和在该本体的其余部分覆盖的绝缘层，以及固定在所述本体另一端的一根电极引线组成；其尖端状部分的直径为1nm－10μm×长度1nm－100μm。本发明的系统包括纳电极和微电极，所述的微电极安装在一根玻璃微吸管内，该玻璃微吸管管口直径为100nm－100μm；纳电极和微电极分别安装在2台微操作器上，该纳电极和微电极的电极引线分别与电穿孔信号发生器电连接，其纳电极的尖端和微电极前端与培养液中的细胞组成单细胞阻抗检测电路；玻璃微吸管在微操作器的控制下可实现对单个细胞的捕捉；单细胞阻抗检测电路可实现对单细胞基因电转导过程的实时监控。本发明提出的这种单细胞电穿孔系统具有场强集中、微区、低电压、低发热量、对细胞损伤小等特点。
文档编号C12M1/42GK101020892SQ20071006414
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月2日 优先权日2007年3月2日
发明者杨兴, 周兆英, 肖名飞, 王强, 李永安, 杨润泽, 邵臣人 申请人:清华大学