专利名称：运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域。具体地涉及一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传 操作方法。
背景技术：
当前突出的全球性能源危机和环境污染问题，使得利用生物技术和可再生资源 (生物质)进行燃料乙醇的工业化生产，成为包括美国、巴西、中国等在内的许多国家的重 大研发项目之一。这些国家都在尝试开发新的可用于更直接、更全面高效利用生物质资源 的燃料乙醇生产菌种和工艺。而运动发酵单胞菌乙醇发酵速度快、乙醇产率高(为理论值 的97 %，而酵母为理论值的90-92 % )，能耐受高糖浓度和高醇浓度，是目前所知产醇能力 最强的细菌之一，成为极具开发潜力的乙醇生产菌种；运动发酵单胞菌还能高产果聚糖、葡 萄糖酸、山梨醇等生物化工产品，极具工业利用价值。但运动发酵单胞菌所能利用的碳源范围太窄，仅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。扩 展它底物范围的改造工作已取得很大进展，2006年10月Dupont杜邦公司和Broin公司 联合宣布了基于运动发酵单胞菌木糖利用工程菌株的农作物秸秆产醇的工艺，并先后建 立了生物质乙醇生产示范厂和中试工厂。菌株ZM4( = ATCC31821)和NCIMB11163的全 基因组序列也分别于2005年、2009年发表公布(Seo JS, Chong H, Park HS, et al. The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4. Nature Biotechnology. 2005 ；23 :63-68. Vassili N. Kouvelis, Elizabeth Saunders, Thomas S.Brettin, et al. Complete Genome Sequence of the Ethanol Producer Zymomonas mobilis NCIMB 11163. Journal of Bacteriology, 2009,191 (22) :7140-7141.)。然而，运 动发酵单胞菌的基础科学研究和遗传改造手段现状还远远不能满足应用研究的需要。运动 发酵单胞菌遗传背景知识的相对缺乏、严格的限制修饰系统、广泛而多样的内源性质粒、广 泛的抗性谱等等因素，使得对它的遗传操作手段至今仍然有限而不成熟。目前导入外源基因和进行基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)是通过接合转移 和转化(化学法、电穿孔法)进行的。接合转移工作早在二十世纪八十年代就开展了，但接 合转移效率因菌株和质粒差别很大，总体上是低的。化学法转化报道很少，因效率低和难以 重复而极少使用。电穿孔方法则方便、简单、相对稳定，因而使用相对广泛。一些宽宿主质粒 载体和人为构建的大肠杆菌-运动发酵单胞菌穿梭质粒载体被电穿孔转化到不同的运动 发酵单胞菌菌株中，并能稳定复制存在。这些不带目的基因的质粒载体的电穿孔转化效率 与宿主菌株、质粒类型和具体的操作条件、方法均直接相关，报道的转化效率从IO1个/μ g DNA到IO6个/ μ g DNA不等，而分析其操作条件、手法，则彼此差别又很大。一般来说，质粒越大，转化效率越低。带有目的基因的可复制质粒的转化，较前述 不带目的基因的可复制质粒的转化，要困难得多，所公开的信息也少得多，目前仅有个别 的转化效率的数据报道。对运动发酵单胞菌进行基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)时常规采用的基于宿主自身recA系统、通过长同源臂的同源重组定点整合方式，或者是通过转座子元件进行 的随机转座方式，均首先需将相关质粒或DNA分子，经过电穿孔和(或)接合转移的方式， 从胞外转移至胞内；而质粒或DNA分子进入细胞后的整合、转座过程，均属于稀有事件，因 此基因组DNA修饰(或染色体遗传操作)，客观上更需要有高效、稳定、重复性好的电穿孔转 化方法。而目前这方面的信息更是十分有限的。综上所述，目前的电穿孔转化方法，都是针对特定菌株和特定质粒的特殊应用，难 以推广到其它菌株和质粒，相对缺乏通用性和稳定性、重复性，难以满足运动发酵单胞菌分 子生物学研究和进一步的改造应用研究的需要，本领域需要建立更加通用、高效、稳定的电 穿孔方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速优化、适应面广、稳定的、高 效的运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法。本发明的技术方案概述如下一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，包括下述步骤将待转化DNA通过 电穿孔转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中或用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转 化DNA共同孵育，通过电穿孔将孵育后的DNA转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中；所 述运动发酵单胞菌的感受态细胞是将运动发酵单胞菌培养至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420的 菌液浓缩100倍而制成；电穿孔操作的参数为2mm电击杯中感受态细胞体积为80 μ 1 160 μ 1 ；电场强度为11. 0 14. OkV/cm ；复苏时间为3h 24h。所述运动发酵单胞菌无细胞提取液是用下述方法制成培养运动发酵单胞菌至 OD600 = 0 . 6 1. 0的培养液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min离心收集菌体，用等体积 的冰浴预冷的提取物缓冲液HND洗涤，用培养液体积的1/20到1/10体积的冰浴预冷的提 取物缓冲液HND重悬，冰上超声破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin离心，收集上清液， 所述提取物缓冲液HND为pH = 7. 0的200mM HEPES (N-(2-羟乙基)哌嗪-N，-2磺酸)， 20mM Na2EDTA, 5mM DTT ( 二硫苏糖醇)。所述用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转化DNA共同孵育为选100 μ 1反应体 系，包括 IOOmM HEPES，pH= 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT,5mM MgCl2, ΙμΜ SAM(S_ 腺苷甲 硫氨酸)，2 10 μ g待转化DNA，50 μ 1运动发酵单胞菌无细胞提取液，在37°C、反应2 3 小时，纯化，无菌水溶解。所述运动发酵单胞菌为ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。所述2mm电击杯中感受态细胞体积为120 μ 1。所述电场强度为11. 75 13. 25kV/cm。本发明的有益效果在于1、利用运动发酵单胞菌菌株无细胞培养液处理待转化DNA，使其获得修饰，从而减 少电穿孔转化时的宿主限制修饰系统的限制，提高转化效率；2、根据不同的遗传操作类型和目的选择质粒载体，选择转化效率更高的质粒为出 发材料构建重组质粒；3、利用本发明的优化了的关键电穿孔物理参数对不同的宿主和DNA进行电穿孔，提高了运动发酵单胞菌电穿孔遗传操作的转化效率及稳定性，适应了所有通过电穿孔转化 进行的、不同构建目的的遗传操作，从而又具有通用性。通过本发明的方法可进行外源基因转化和基因组DNA修饰，从而可广泛用于运动 发酵单胞菌包括基因功能、表达调控研究在内的基础研究和相关的应用研究。
图1.图中1-1为穿梭载体拟B21 (5930bp)，l_2为穿梭载体 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)，1-3 为宽宿主载体 pBBRlMCS-2 (5144bp)，1-4 为定点整合载体 PBR328-ldhR-cml-ldhL(7447bp)的物理图谱。其中，Ec ori即大肠杆菌质粒复制子，来自 质粒pBR3^ ；Zm ori即运动发酵单胞菌质粒复制子，来自质粒pZM2 ；tet即四环素抗性基 因，cml即氯霉素抗性基因，amp即氨苄青霉素抗性基因，Plac为大肠杆菌Iac基因的启动 子，IacZ为β -半乳糖苷酶基因，kan即卡拉霉素抗性基因，mob质粒迁移相关基因，rep质 粒复制相关基因，MCS为多克隆位点，Idh为乳酸脱氢酶基因，IdhR和IdhL分别用作同源重 组的同源臂。图 2.质粒 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP (6880bp)的构建示意图。图3.不同细胞浓缩倍数下电穿孔转化pBBRlMCS_2(5144bp)到运动发酵单胞菌菌 株ZM4图4.不同细胞浓缩倍数下电穿孔转化pZB21 (5930bp)到运动发酵单胞菌菌株CP4图5.电击杯中不同感受态细胞体积下电穿孔转化pBBRlMCS_2(5144bp)到运动发 酵单胞菌菌株ZM4图6.不同电场强度下电穿孔转化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pBBRlMCS-2-Pgap-FLP(6880bp)到 ZM4图7.不同电场强度下电穿孔转化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP4图8.不同复苏时间下电穿孔转化pBBRlMCS(5144bp)、p^21 (5930bp)到ZM4图9.不同复苏时间下电穿孔转化pBBRlMCS-2 (5144bp)、pZB21 (5930bp)和 pZB21-Plac-lacZ(6375bp)到 CP具体实施例方式一般来说，影响电穿孔转化效率的三大制约因素即质粒特性、宿主自身限制修饰 系统和电穿孔物理参数。针对这些制约因素，本发明分别采取了相应的解决措施，具体地 是1、在电穿孔前用运动发酵单胞菌无细胞提取液处理待转化DNA，使待转化DNA获得宿主 的限制修饰系统的修饰，克服宿主对异源DNA进入宿主以后的限制及降解作用；2、选择转 化效率更高的质粒为出发材料构建重组质粒，再进行转化；3、选择关键的电穿孔物理参数 进行优化，对不同的宿主和DNA，选择不同的参数优化水平的组合；这些关键的电穿孔物 理参数包括用于制备电穿孔感受态细胞的菌液的生长阶段和制备的感受态细胞的密度， 电击杯里感受态细胞体积，DNA浓度，电场强度，加入复苏液后的复苏时间。由于本发明对 这些措施的综合运用，因此提供了一种快速优化的、通用的、稳定的、高效的转化方法。应当理解的是，由于用于电穿孔转化的DNA类型多样，其彼此差异极大(主要指大小、有无复制子，复制类型，选择标记类型，等等)，加上其所涉及的细胞内生物过程类型不 同，电穿孔的最佳操作条件一般是需要摸索和优化的，本发明的技术提供了针对新的菌株 和新的DNA类型时的一种快速优化操作条件的方法，因而也同时具有了通用性、稳定性。应当理解的是，由于同上的原因，针对不同菌株和不同DNA类型的电穿孔操作，其 转化效率是千差万别的，本发明所述的高效，不是简单的转化效率数值的高低，而是相对于 特定菌株和特定DNA类型(相应地有特定的细胞内生物过程)的通常的转化效率来说的； 本发明所述的高效，对于那些本身效率很低、很难实现的转化而言，也可以理解为在快速优 化的基础上实现了转化，即得到了目的转化子。本发明所选用的用于运动发酵单胞菌外源基因转化的质粒类型有1、可复制穿梭质粒，包括l)p^21 (5930bp)，pZB21的图谱见附图1，pZB21的 构建参见文献(邹少兰，高卫华，刘成等.运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭载体的构 建·南开大学学报(自然科学版)，2006，39(3) 23-28) ；2)pZB21-Plac-lacZ(6375bp), pZB21-Plac-lacZ的图谱见附图1，pZB21-Plac_lacZ的构建参见文献(张一婷，Zmobilis 中同源重组方法及诱导表达体系的研究，天津大学硕士学位论文，2007. 6)；等等；2、可复制宽宿主质粒，包括l)pBBRlMCS(5144bp)，其图谱见附图1(文献来源 Kovach, ME. , Phillips, Rff. , Elzer, PH. , et al. pBBRlMCS :a broad-host-range cloning vector,BioTechniques,1994,16(5) :800-802 ；Kovach ME,Elzer PH,Hi 11 DS,et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995 ； 166 :175-176.可求得)；2) pBBRlMCS-Pgap-FLP(6880bp)，其构建见图2 ；所涉及的引物Pl到P4见表1。表1、构建用引物
权利要求
1.一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征是包括下述步骤将待转化 DNA通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中或用运动发酵单胞菌无细胞提取液 与待转化DNA共同孵育，通过电穿孔将孵育后的DNA转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞 中；所述运动发酵单胞菌的感受态细胞是将运动发酵单胞菌培养至OD6tltlnm = 0. 375 0. 420 的菌液浓缩100倍而制成；电穿孔操作的参数为2mm电击杯中感受态细胞体积为80 μ 1 160 μ 1 ；电场强度为11. 0 14. OkV/cm ；复苏时间为3h 24h。
2.如权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征是所述运 动发酵单胞菌无细胞提取液是用下述方法制成培养运动发酵单胞菌至0D_ = 0. 6 1. 0 的培养液，在8000 12000rpm、4°C、3 6min离心收集菌体，用等体积的冰浴预冷的提取 物缓冲液HND洗涤，用培养液体积的1/20到1/10体积的冰浴预冷的提取物缓冲液HND重 悬，冰上超声破壁，14000 18000rpm、4°C、8 ianin离心，收集上清液，所述提取物缓冲液 HND 为pH = 7. 0 的 200mM HEPES,20mM Na2EDTA, 5mM DTT。
3.如权利要求1所述的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所 述用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转化DNA共同孵育为选100 μ 1反应体系，包括 IOOmMHEPES, pH = 7. 0，IOmM Na2EDTA, 2. 5mM DTT, 5mM MgCl2,1 μ M SAM, 2 10 μ g 待转化 DNA, 50 μ 1运动发酵单胞菌无细胞提取液，在37°C、反应2 3小时，纯化，无菌水溶解。
4 如权利要求1、2或3的一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所 述运动发酵单胞菌为 ZM4、CP4、ATCC10988 或 ZM4(ldh: :FRT-cml_FRT)。
5.如权利要求1所述的一种运动单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述2mm 电击杯中感受态细胞体积为120 μ 1。
6.如权利要求1所述的一种运动单胞菌的电穿孔遗传操作方法，其特征在于所述电场 强度为 11. 75 13. 25kV/cm。
全文摘要
本发明公开了一种运动发酵单胞菌的电穿孔遗传操作方法，包括下述步骤将待转化DNA通过电穿孔转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中或用运动发酵单胞菌无细胞提取液与待转化DNA共同孵育，通过电穿孔将孵育后的DNA转化到运动发酵单胞菌的感受态细胞中；本发明利用运动发酵单胞菌菌株无细胞培养液处理待转化DNA，使其获得修饰，提高转化效率；利用本发明的方法优化了的关键电穿孔物理参数对不同的宿主和DNA进行电穿孔，提高了运动发酵单胞菌电穿孔遗传操作的转化效率及稳定性，适应了所有通过电穿孔转化进行的、不同构建目的的遗传操作，从而又具有通用性。
文档编号C12N15/74GK102080097SQ201010241809
公开日2011年6月1日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者井欣, 张敏华, 张鲲, 洪解放, 邹少兰, 马媛媛 申请人:天津大学