专利名称：从红光熊蜂蜂毒中分离的作为纤维蛋白原和纤维蛋白溶解酶的丝氨酸蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及从一种熊蜂，红光熊蜂中分离得到的丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白 酶能够激活凝血酶原并能够直接降解纤维蛋白原和纤维蛋白。
背景技术：
蜂能够使用它们体内携带的蜂毒作为有力的防御手段来保护其领地免受入 侵者，如其他昆虫和动物的的侵犯。蜂毒包括多种不同的蜂毒蛋白或肽，例如，蜂毒肽 [Gauldie et al.，Eur. J. Biochem.，61 :369-376 (1976)]、磷脂酶 A2 (PLA2) Six & Dennis, Biochim.Biophys. Acta 1488 :1-19 (2000) ] > _ 明月太[Banks et al. , Nature 282 415-417 (1979)]、透明质酸酶[Krei 1, Protein Sci.，4 1666-1669 (1995)]、丝氨酸蛋白酶 [ffinningham KM et al. J Allergy ClinImmunol 2004 ；114 :928-33]等。在东方国家，已经对蜂毒的多种成分进行了研究以寻找它们在医药领域的用途 [Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61]。特别是被用于养蜂业和授粉昆 虫的蜜蜂和熊蜂与人类的关系更为密切[Velthuis HHW et al. JApidologie2006 ；37 421-51]。相比较，蜜蜂能释放出至少五倍于熊蜂的毒液，然而熊蜂能够多次释放毒液而不 失去它的刺[Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8]。存在于熊蜂毒液中的丝 氨酸蛋白酶与磷脂酶A2 (PLA2)和bombolitin —样，是毒液的主要成分之一 [Hoffman DR et al.J Allergy Clin Immunol 2001；108 :855-60]。丝氨酸蛋白酶能在多种活生物体中发现，其具有的生物化学和结构特征在于包括 His、Asp和Ser在内的氨基酸残基是保守的。丝氨酸蛋白酶具有多种功能，在消化、免疫响 应、补体、细胞分化和止血中都有重要作用[NeurathH. et al. Science 1984 ；224 :350-7 ； Krem MM. et al. Trends Biochem Sci 2002;27:67-74]。特别是，在被视为主要毒素之一 的蛇毒中存在的丝氨酸蛋白酶已知在哺乳动物的止血和血栓形成中发挥作用[Braud S et al. (2000)Biochimie82 :851-859 ；Matsui T et al. (2000)Biochim Biophys Acta 1477 146-156 ；Kini RM(2005)Pathophysiol Haemost Thrornbo 34 :200-204 ；Swenson S et al. (2005)Toxicon 45:1021-1039]。然而，丝氨酸蛋白酶的基因和其在止血和血栓形成中 的作用尚不清楚。
发明内容
通过发现了在一种熊蜂，红光熊蜂的蜂毒中的丝氨酸蛋白酶能够激活凝血酶原并 能够直接降解纤维蛋白原和纤维蛋白，进而能够影响血液凝固过程，由此完成了本发明。因此，一个方面，本发明提供了如SEQ. ID. NO. 1所示的，从红光熊蜂中获取的丝氨 酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶能够降解血栓中的主要成分之一，纤维蛋白原和纤维蛋白。另一个方面，本发明提供了一种治疗血栓的药物组合物，所述药物组合物包含分离自红光熊蜂蜂毒的丝氨酸蛋白酶。
本发明的上述和其他特征将在典型的实施例中详细描述，因此下面给出的附图仅 是作为展示之用，而非对本发明进行限制，其中图1显示了一种熊蜂，红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的cDNA核酸序列。框 中的密码子‘ATG’和‘TAA’分别表示起始密码子和终止密码子。图2显示了由Bi-VSP的cDNA推出的氨基酸序列。(*空心三角(▽>分隔作为信号 序列的自由肽和包括切割域的前肽(切割域有六个严格保守的半胱氨酸残基，形成三对二 硫键)，而实心三角(▼)分隔包括切割域的前肽和丝氨酸蛋白酶域)图3a、3b显示了 Bi-VSP的基因组DNA核酸序列。图4显示了提取自红光熊蜂工蜂的脂肪体、中肠、肌肉和毒腺的RNA，使用Bi-VSP 的cDNA作为探针，进行RNA印迹分析结果。图5显示了纯化的重组Bi-proVSP的结果。从感染杆状病毒的昆虫细胞中纯化的 重组Bi-proVSP的SDS-PAGE (左)和蛋白印迹(右)。抗Bi-proVSP抗体在注射了重组的 Bi-proVSP的鼠中生产。图6显示了获取自红光熊蜂工蜂的毒腺、毒囊和分泌的毒液的蛋白使用 SDS-PAGE(左)和蛋白印迹(右)进行分析的结果。显示了 Bi-proVSP和Bi-VSP。左边的 箭头显示了 Bi-proVSP的位置(*Bi-proVSP表示未成熟的(即，未激活的)蜂毒丝氨酸蛋 白酶，而Bi-VSP表示成熟的(即，激活的)红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶)。图7显示了 SDS-PAGE上，从毒液中纯化的Bi-VSP的糖蛋白染色结果。(*辣根过 氧化物酶是一种糖基化蛋白，用作阳性对照。大豆胰蛋白酶抑制剂是一种未糖基化的蛋白， 用作阴性对照)。图8显示了 Bi-VSP与已知的蛇毒丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列比对。(*SP区域保 守的催化三联体残基[His (H)、Asp (D)和Ser (S)]使用星号标识)。图9显示了 Bi-VSP激活人凝血酶原的SDS-PAGE分析结果。数字显示了依照实施 例4描述的时间推移，凝血酶源与Bi-VSP —起温育的时间(min)。图10显示了 Bi-VSP水解纤维蛋白原的SDS-PAGE分析结果。数字显示了依照实 施例5描述的时间推移，纤维蛋白原与Bi-VSP —起温育的时间(min)。图11显示了在纤维蛋白平板上检测Bi-VSP酶活力的图像。按照实施例6的描述， 向纤维蛋白平板上滴加不同浓度的Bi-VSP并温育不同的时间。
具体实施例方式本发明涉及存在于一种熊蜂，红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶，该酶能够激活凝 血酶原并能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。本发明的发明人首先分离了存在于红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶的基因，其特 征尚未被详细描绘。本发明的发明人于2009年2月17日在韩国提交了一件专利申请，其 涉及编码包括丝氨酸蛋白酶结构域的蜂毒丝氨酸蛋白酶的基因的核酸序列，分配的韩国专 利申请号为10-2009-0013131。存在于红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶结构域是一种成熟的(即激活的)蛋白，由SEQ. ID. NO. 1所示的247个氨基酸组成。这种蛋白在氨基酸的数 目和序列上与蛇毒中的同类蛋白有很大不同。红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶可以通过提取储存在毒囊中的毒液，而后经由快 速蛋白液相层析通过凝胶过滤色谱制得。红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶能够激活一种血 液凝固因子，凝血酶原，使其成为凝血酶，而且能够降解纤维蛋白原成为纤维蛋白，并随后 进一步降解为纤维蛋白降解产物。因此，本发明的丝氨酸蛋白酶可以被用于治疗深静脉血 栓、外周动脉疾病，并可以减少心血管手术后可能发生的各种医疗事故和血栓复发。下文中通过实施例更详细描述本发明，但实施例并非是对本发明设置的限制。实施例实施例1.克隆红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶的基因从 Dept. of Agricultural Biology in National Academy of Agricultural Science of Rural Development Administration (农业发展管理局农业科学师范研究 院农业生物部)提供的红光熊蜂工蜂的毒腺中提取总RNA，提取使用SV总RNA分离系统 试剂盒(SV total RNA Isolation System kit) (Promega, USA)。然后使用 PolyATtract mRNA ^mM Mt K ^lJ ^ (PoIyA Ttract mRNA Isolation System kit) (Promega, USA) 从所述总RNA中提取poly (A) +mRNA。最后，使用poly (A) +mRNA以及Uni-ZAP XP载 体和 Gigapack III 金填充提取试剂盒(Gigapack III Gold Packing Extract kit) (Stratagene, USA)构建cDNA文库，并分析表达序列标签(ESTs)。使用Wizard微制 备试剂盒(Wizard mini-pr印arationkit) (Promega, USA)提取 DNA，使用自动 DNA 序 列分析仪(Applied Biosystems, USA)读取其序列。核酸序列使用NCBI的BLAST程 序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比对。结果是，克隆了红光熊蜂蜂毒中的丝 氨酸蛋白酶(Bi-VSP)基因的cDNA，所述cDNA具有SEQ. ID. NO. 2的序列(图1)。分析 由红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)cDNA推出的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 3 (图2)， 揭示了其与 Holotrichia diomphalia PPAF-I (GenBankNo. BAA34642), H. diomphalia PPAF-III(GenBank No. BAC15604)、Bombyxmori PPAF-3 (GenBank No. AAL31707)、 Drosophila melanogasterMPl(GenBank No. NP_649560)>D. melanogaster easter(GenBank No. NP_524362)和 Manduca sexta PAP-I (GenBank No. AAX18636)，这样一组取自昆虫的 PAP 酶有序列同源性，还揭示了半胱氨酸(C)残基在分割域中保守，而组氨酸(H)、天冬氨酸(D) 和丝氨酸( 残基在丝氨酸蛋白酶区域内保守。进一步的，上述分析也确认了红光熊蜂蜂 毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)包括一个由沈个氨基酸组成的作为信号序列的前肽区域，一个 包含由87个氨基酸组成的切割域的前肽区域，以及由247个氨基酸组成的作为成熟蛋白的 丝氨酸蛋白区域。此外，下面表1中所示的引物是基于红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)制备的，红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的基因组DNA使用引物 通过PCR进行合成。表1
引物核酸序列.位置正向引物1S'-ATCi M30 GGC TCC AAG ^TQ €T TTC-3' tSiQ.ID.N0.4)1-24, 反向引物1 ^5,-TAC AGG TGG CTT ACC ACC GAC CAC-3' (SEQ. ID.NO. 5)363-340正向引物2 *5,-GTG GTC GGT GGT AAG CCA GCT GTA-3' (SEQ. ID. NO. 6)340-363反向引物2 ‘5'-TTATTG CAT CGC TGG GAG AAT AAA-3' (SEQ. ID. NO. 7)1083-1060红光熊蜂的基因组DNA使用Wizard基因组纯化试剂盒(Wizard GenomicPurification kit) (Promega, USA)提取，然后使用上面的引物和 PCR premix 试 剂盒(PCR premix kit) (Bioneer Corp.，Korea)扩增含有红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)基因的基因组DNA。PCR反应进行35个循环，其中每个循环在95°C变性5分钟， 60°C退火1分钟，而后72°C下聚合3分钟。扩增得到的DNA使用自动DNA序列分析仪进行 分析。结果显示红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的基因组DNA由6个外显子和5个 内含子组成，上述基因组DNA从起始密码子到终止密码子的总长为4505bp (图3a、3b)。实施例2.红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的毒腺特异性表达、剪 切和0-糖基化使用总RNA 分离试剂盒(Total RNA Isolation kit) (Promega, USA)从红光熊蜂 的脂肪体、中肠、肌肉和毒腺中提取RNA。每孔加入5 μ g提取到的RNA之后，在1 %的甲醛琼 脂糖凝胶中电泳，将胶转移到尼龙印迹膜上(Schleicher & khuell，Germany)，并在42°C 下与[a-32P]dCTP(AmerSham，USA)标记的红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP) 的cDNA探针杂交。结果，发现红光熊蜂蜂毒中存在的丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的mRNA只特 异性的存在于毒腺中。为了制备抗红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)抗体，将红光熊蜂蜂毒丝氨酸 蛋白酶(Bi-VSP)cDNA插入昆虫苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角体病毒转染 载体 pBACl (Clontech，USA)的 BamH I-Xho I 区，随后使用脂质体转染(Clontech，USA)将 其与IOOng转染载体以及500ng bAcGOZA病毒DNA共转染到Sf9昆虫细胞系(Spodoptera frugiperda 9)中[Je et al. , Biotechnol. Lett. , 23 :575-582 (2001) ] 5 天后，收集得 到的培养物，制得表达重组红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)的重组苜蓿尺蠖核型 多角体病毒。重组苜蓿尺蠖核型多角体病毒在Sf9细胞系中生长，使用组氨酸亲和层析 柱(HisTrap column) (Amersham Bioscience, USA)分离重组红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶 (Bi-proVSP)。将分离到的重组红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)注射入Balb/c鼠 内以制备多克隆抗体[Choo et al. Mol. Cell. Neurisci. 38 :224-235 (2008) ] 使用分离的 红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)和上述抗体进行蛋白印迹[图5]。从毒腺、毒囊和排出的毒液中提取蜂毒蛋白样品，在15% SDS-PAGE凝胶中电 泳，并使用上述抗体进行蛋白印迹。结果，发现红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶未激活的形式 (Bi-proVSP)和激活的形式(Bi-VSP)均存在于毒腺中，然而，在毒囊和排出的毒液中只观察到了红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶激活的形式(Bi-VSP)[图6]。因此，可以确认红光熊蜂 蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)在毒腺中表达、剪切成激活的形式，储存在毒囊中，然后排出。为研究在红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶的激活形式中(Bi-VSP)红光熊蜂蜂毒丝氨 酸蛋白酶(Bi-proVSP)被剪切掉的区域，34kDa的红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)被 转移到聚偏二氟乙烯，PVDF膜上(Applied Biosystems, USA)随后通过Edman降解法分析 N-末端区域。结果，可以确认如图2所示，红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)在113th 氨基酸Arg和114th氨基酸Val之间被剪切，从而转变成由247个氨基酸组成的激活形式 的蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)。即，如SEQ. ID. NO. 1所示的，由247个氨基酸组成的激活 形式的蜂毒丝氨酸蛋白酶。计算得到由247个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶的估算分子量为 27kDa。然而，由于含有约20%的糖，其在SDS-PAGE胶中分子量为34kDa。红光熊蜂蜂毒丝 氨酸蛋白酶没有N-糖基化区域但有一个0-糖基化区域。为了证实这一点，使用凝胶/编 码糖蛋白染色试剂盒(Gel/Codeglycoprotein staining kit) (Pierce，USA)对激活形式的 红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶进行糖蛋白染色，结果，证实了激活形式的红光熊蜂蜂毒丝氨 酸蛋白酶是一种0-糖基化的糖蛋白(图7)。实施例3.比较红光熊蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶和蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的氨基 酸序列使用NCBI 的 BLAST 程序(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)比对红光熊 蜂蜂毒中的丝氨酸蛋白酶和蛇毒中的丝氨酸蛋白酶的核酸序列。当比对上述两种丝氨 酸蛋白酶的氨基酸序列时，发现红光熊蜂丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)与在血液凝固机制中 作为凝血酶原激活剂的Oscutarin C(GenBank No. AY940204)；具有与凝血酶相似活性 的 Batroxobin (GenBank No. AAA48553)；激活纤维蛋白溶解酶前体的 TSV-PA (GenBank No.Q91516) ；PA-BJ(GenBank No.P81824) ；Halytase(GenBank No.P81176)禾口 RVV-V(GenBank No. P18964)有一定程度的同源性，而且丝氨酸蛋白酶区域中组氨酸，天门 冬氨酸和丝氨酸残基高度保守(图8)。实施例4.红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶作为凝血酶原激活剂的作用为了检验红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的功能，其是否激活在血液凝固 中起关键作用的凝血酶的前体，凝血酶原，从而进行了以下实验。2 μ g人血液凝固因子凝血酶原(Sigma)和2ng从红光熊蜂毒囊中纯化的丝氨酸蛋 白酶溶解在含有IOOmM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，在37°C反 应，得到的混合物在14%的SDS-PAGE中电泳，观察随时间推移的结果[Speijer H et al. J Biol Chem 1986 ；261 :13258-67]。结果，发现反应5分钟后，凝血酶原开始向激活形式的凝 血酶转变，反应60分钟后，完全转变为凝血酶(图9)。这与血液凝固机制中的一种凝血因 子，Xa因子的过程相似。实施例5.红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶作为纤维蛋白原溶解酶的作用10 μ g 人纤维蛋白前体纤维蛋白原(MP Biomedicals, Solon, OH, USA)和 0· 25 μ g 从红光熊蜂毒囊中纯化的丝氨酸蛋白酶溶解在50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)中，在 37°C反应，混合物在14%的SDS-PAGE中电泳，观察随时间推移的结果[Matsui T et al. Eur J Biochem 1998 ；252 :569-75]。结果，发现红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)没有显示 出任何纤维蛋白凝块，而是将纤维蛋白原链Aa、Ββ、γ水解。Aa链在反应后的5分钟内被完全水解，而Ββ链和γ链在60分钟内被完全水解。这表明红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)有类似凝血酶的活性，能够水解纤维蛋白原。进一步的，发现在60分钟到720分 钟之间，所有的转化自纤维蛋白原的纤维蛋白都被完全转变成了纤维蛋白降解产物(FDP)。 这进一步证实了红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)具有类似纤维蛋白溶酶(能够降解 纤维蛋白)的活性(图10)。实施例6.检验红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶作为纤维蛋白溶解酶的作用如实施例5所示，通过纤维蛋白原与红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的反 应实验，证实了红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶(Bi-VSP)不仅能特异性裂解纤维蛋白原成为 纤维蛋白，而且在SDS-PAGE胶上能将纤维蛋白转化为纤维蛋白降解产物。此外，进行了纤 维蛋白平板实验以得到红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶的纤维蛋白溶解活性的更具体更有说 服力的结果。将纤维蛋白原(0.6%/10mL)加入到硼酸缓冲液中(pH 7. 8)，在30°C溶解1 小时。然后，将IOmL得到的产物转移到平板上以备将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，40单位 的凝血酶加入其中并稀释，并在室温下反应使平板凝固[Astrup T. et al. Arch. Biochem. Biophys. (1991). 40,346-351]。分别往纤维蛋白平板上加入不同浓度的纯化的红光熊蜂蜂 毒丝氨酸蛋白酶(0、1、2、3和5 μ g)，并在37。C反应3、5、7、9小时，观察纤维蛋白溶解活性。 结果，发现依据每种不同的浓度形成了不同的纤维蛋白溶解的白色区域(图11)，因此证实 了红光熊蜂蜂毒丝氨酸蛋白酶能够有效的溶解纤维蛋白。有益效果本发明的丝氨酸蛋白酶能够激活凝血酶原并能够直接降解纤维蛋白原和纤维蛋 白，因此，可以被用于发展治疗血栓的治疗剂。本领域技术人员应当明确本发明可以以其他形式、结构、排列、规模来实施，并可 能使用其他的要素、材料、成分。因此，本发明公开的实施例的目地完全是为了展示而非限 制，本发明的保护范围不受前面描述的限制，由附带的权利要求指明。
权利要求
1.如SEQ.ID. NO. 1所示的从红光熊蜂蜂毒中分离得到的能够激活凝血酶原的丝氨酸 蛋白酶。
2.如SEQ.ID. NO. 1所示的从红光熊蜂蜂毒中分离得到的能够降解纤维蛋白原至纤维 蛋白的丝氨酸蛋白酶。
3.如SEQ.ID. NO. 1所示的从红光熊蜂蜂毒中分离得到的能够降解纤维蛋白的丝氨酸 蛋白酶。
4.治疗血栓的药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的从红光熊蜂蜂毒中分 离得到的丝氨酸蛋白酶。
全文摘要
本发明公开了从一种熊蜂，红光熊蜂中分离得到的丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶能够激活凝血酶原并能够降解纤维蛋白原和纤维蛋白。由于本发明中的丝氨酸蛋白酶能够激活凝血酶原并能够直接降解纤维蛋白原和纤维蛋白，因此可以被用于开发治疗血栓的治疗剂。
文档编号C12N9/64GK102146364SQ20101024171
公开日2011年8月10日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年2月8日
发明者孙兴大, 尹馨珠, 李光植, 秋英武, 诸连镐, 陈炳来 申请人:东亚大学校产学协力团