专利名称：支持HCV 1b亚基因组复制的体外细胞模型的建立的制作方法
技术领域：
本发明成功建立了支持中国人群HCV lb亚基因组复制子高效复制的体外细胞模 型，为HCV致病机制、治疗药物筛选和评价等方面的研究打下了基础。具体地说，本发明涉 及针对中国人群的HCV lb亚型亚基因复制子的细胞模型的构建工艺，包括体外转录HCV lb亚基因组复制子RNA和体外电穿孔技术将HCV lb亚基因组复制子RNA转染到Huh-7. 5. 1 细胞系中，涉及使用RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的 存在，以及通过Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。涉及该模型在未来的抗HCV药 物筛选和评价中的医学应用。
背景技术：
丙型肝炎病毒(h印atitis C virus, HCV)是丙型肝炎的致病体，丙型肝炎是世界 范围内的重要传染病之一。据估计，目前，世界上有1.7亿多人感染该病毒，占人口总数的 3 %，并呈上升趋势，每年新发丙型肝炎病例约3. 5万例[1]，我国HCV感染率达到3.2%，估计 有四千万HCV感染者。成人感染HCV后，约50% -80%发展成慢性丙型肝炎，其中约20%可 发展成肝硬化，肝硬化患者中，每年约可发展为肝癌[2]，所以丙型肝炎成为全球性 严重危害人民健康的疾病。目前对HCV的预防和治疗十分有限，迄今还没有疫苗问世。HCV 感染者最有效的治疗方法为聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，持续病毒学应答率可达54% 56%，但该疗法对基因型有很强的依赖性，即不同的基因型对治疗反应差异很大。此外，其 治疗费用颇高，且具有显著的副作用。因此，迫切需要更加有效的治疗方法。HCV发病机制的研究，抗病毒药物筛选和疫苗研制都离不开有效的体外细胞模型。 长期以来各国研究人员都在尝试建立HCV lb亚型的体外细胞复制和感染模型，对于HCV lb亚型，细胞模型的发展主要经历了人淋巴细胞模型、肝细胞培养模型、HCV复制子转染细 胞模型三个阶段。由于前两种模型普遍存在着细胞系维持时间短，病毒复制水平低等缺陷， 极大的限制了它们的应用价值。而随着分子生物学的迅猛发展，HCV复制子转染细胞模型 慢慢成为了广大科研工作者的研究重点。直到1999年，Lohmarm[3]建立了在肝癌细胞中可 以高水平自主复制的亚基因组复制模型，为HCV致病机制研究及抗病毒药物评价提供了一 个新的途径。但是其缺点是细胞的转染效率比较低。
发明内容
本发明是研究建立我国人群中居多的HCV lb亚型亚基因组复制子细胞模型，提 高HCV亚基因组复制子的转染效率。本发明克隆了中国人群中HCV感染者的亚基因组cDNA并构建了具有药物筛选标 签的质粒，采用体外转录的方法获得HCV lb亚型亚基因组复制子RNA，并通过电穿孔的方 法转染入细胞系Huh-7. 5. 1[4]中，经过G418药物筛选6周后，获得了大量高效复制HCV lb 亚型亚基因组复制子的细胞集落。在此工作基础上，为了筛选到具有稳定遗传和高效复制 的细胞单克隆，我们在获得的细胞集落中，挑去90个单克隆进行单克隆化培养，最终得到三个具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆。本发明的目的在于为未来的HCV机制研究， 抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具。本发明研究运用RT-PCR技术和Western Blot 技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并且通过Real-time PCR检测细胞中病毒的 拷贝数。证实了细胞模型中存在HCV lb亚型亚基因组复制子，并且有大量的拷贝数。与此同时，本发明采用干扰素-a处理细胞模型，确定细胞中HCV亚基因组复制子 的拷贝数明显下降。进一步证实了细胞模型中存在HCV lb亚型亚基因组复制子，并模拟了 药物筛选的过程，为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。小结本发明涉及建立我国人群中居多的HCV lb亚型亚基因组复制子细胞模型， 通过RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并且通过 Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。证实了细胞模型中存在HCV lb亚型亚基因组复 制子，并且有大量的拷贝数。并且采用干扰素_a处理细胞模型，模拟了药物筛选的过程， 为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。本发明的主要技术特征在于(1)该细胞模型是针对我国人群中居多的HCV lb亚型，具有中国的地方特色，为 研究和治疗我国丙型肝炎感染者打下基础。(2)我们转染的细胞系Huh-7. 5. 1具有很好的细胞容受性，克服了电转染效率低 的缺点，获得了大量的细胞集落。(3)我们采用干扰素-a处理细胞模型，模拟了药物筛选的过程，为未来的抗病毒 药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。
图1实验流程图A和模拟演示图B图2HCV lb亚基因组复制子示意3体外获得HCV亚基因组复制子RNA图4体外获得的支持HCV亚基因组复制子RNA复制的细胞集落图 5RT-PCR 检测 HCV NS4B图 6ffestern Blot 检测 HCV NS5B 蛋白图7Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。实施例1本发明中使用的引物序列及用途 实施例2体外转录HCV lb亚型亚基因组复制子RNA 用Sea I酶把含有HCV亚基因组的质粒(pH()线性化，体系lOOul，酶切10ug的质 粒，酶切时间4h。酶切结束后去2ul确认酶切成功。酶切成功后，把酶切体系扩大到200ul， 补充20ul NaAC(ph5. 2)和200ul的酚/氯仿/异丙醇(25 24 1)进行酚/氯仿抽提， 剧烈混勻，4度12000rpm离心15min，取出上层的水相，并加入等体积的氯仿200ul，剧烈混 勻，4度12000rpm离心15min，取出上层的水相，并加入2倍体积即400ul的无水乙醇，-20 度醇沉过夜。醇沉后4度12000rpm离心15min，弃上清，用lml 70%的乙醇洗涤沉淀，4度 12000rpm离心15min，将上清倒掉，放在超净台里开风使沉淀干燥15min，加20_30ul的dd 水使沉淀溶解，取2ul测浓度(浓度至少125ng/ul)。按照Ambion公司T7体外转录酶的实验说明，以线性化的含有HCV亚基因组的 质粒为模板进行体外转录RNA。体外转录的体系ATP 2ul，CTP 2ul, GTP 2ul，UTP 2ul， 10 X buffer 2ul, enzyme mix 2ul, template DNAlug，去离子水补充至 20ul。37°C 5. 5h。 加 lulDNase I 在 37 度孵育 30 分钟，加 115ulRNA-free 水和 15ulNH4Ac，用(ph4. o)酚 / 氯 仿150ul抽提蛋白，4度12000rpm离心15min，取出上层的水相加150ul的氯仿抽提，4度 12000rpm离心15min，取出上层的水相，用120ul的异丙醇_20度过夜沉淀，4度12000rpm 离心15min，用lml 70%的乙醇洗涤沉淀，使沉淀干燥，用30ulRNA-free水溶解沉淀，取2ul 测浓度，质量好的RNA应该是0D260/280值在2左右，且浓度不低于lug/ul。实施例3电穿孔技术把HCV lb亚型亚基因组复制子RNA转染到细胞系Huh_7. 5. 1 Huh-7. 5. 1细胞培养与10cm培养皿上，用含10% FBS的DMEM培养基于37度，5% C02培养至细胞数量达到2xl07以上，将细胞消化后放入50ml的管子中，1600rpm离心5min， 将上清倒掉，用20ml的opti-MEM(Gibio)重悬，取3个10cm培养皿，每个10cm培养皿培养 5xl06Huh-7. 5. 1 作为 feed cell。将剩余的细胞1600rpm离心5min，倒掉上清，用合适的opti_MEM重悬(比如lml 的opti-MEM(Gibio)重悬)，吹散后计数，调整浓度使细胞浓度达到1x107ml，吸取400ul 的细胞悬液放入电转杯同时加入5-10ug的RNA，电击(Bio-rad电转染仪器的设置270V， 950uf，电阻100欧，电转杯子4cm)。电击后的细胞放入5ml的完全培养基中(5. 4ml)，取出 54ul的细胞放入1/100的10cm dish中，取出5. 4ul的细胞放入1/1000的10cm dish中， 将剩余的细胞放入到一个10cm dish中。48h后加G418，使终浓度达到500mg/L。实施例4
单克隆化培养电转染后的细胞在G418的筛选压力下，经过6周，1/1000稀释的细胞会形成零星 分布的细胞集落。直到细胞培养过程中没有再出现死亡的细胞为止，就可以进行挑取单克 隆。首先在显微镜下选取集落较大，细胞状态较好的，作为挑取对象并用笔做好标记。用 PBS洗两遍，倒掉并使细胞不能太干燥。吸取5ul Trypsin对准标记好的细胞克隆慢慢反复 吸取，将细胞克隆消化，转移到96孔板中，加200ul培养基进行培养。实施例5RT-PCR 检测 HCV NS4B 6孔板中的细胞用500ulGTC溶液(含5mol/L异硫氰酸胍，100mmol/L 2-巯基乙 醇的25mmol/L枸橼酸钠缓冲液pH7. 0)裂解后，加50ul 2M PH4. ONaAC, 500ul PH4. 0酚， 200ul氯仿，混勻，4度12000rpm离心lOmin，取上清加500ul氯仿，混勻，4度12000rpm离心 lOmin，取上清加600ul异丙醇，_20度过夜沉淀。4度12000rpm离心15min，用lml 70%的 乙醇洗涤沉淀，使沉淀干燥，用30ulRNA-free水溶解沉淀，取2ul测浓度，质量好的RNA应 该是0D260/280值在2左右，且浓度不低于lug/ul。
以提取的RNA为模板，随机六聚体为引物反转录细胞的总cDNA。
RNAlug
Hexamer(10uM)2. 5ul
dNTP(lOuM)lul
DEPC water补充至 13ul
65度加热5min，放置冰上。
5xBuffer4ul
DTTlul
核糖核酸酶抑制剂lul
RT 酶lul
25 度 lOmin, 50 度 60min, 70 度 15min
PCR体系(引物设计见实施例1)
10XPCR 缓冲液2 ill
dNTP(2. 5mM)1 u 1
上游引物(lOiiM)lu 1
上游引物(lOiiM)lu 1
DNA 聚合酶(5U/ ill) 1 ill cDNA 模板1 u 1
加去离子水至总体积 20 ill 实施例6
Western Blot 检测 HCVNS5B 蛋白
细胞用RIPA溶液裂解后，加SDS煮沸5-10分钟后聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用抗体 检测NS5B蛋白的表达。实施例7Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数
1)使用的引物(序列见实施例1)引物的设计原则1.保持G-C含量在20-80%之间。2.避免同一碱基重复过多。 特别是G，不可超过4个及以上。3.用Primer Express 软件计算出来的Tm值应当在58_60°C 之间。4.在3'端的5个碱基中，G和C碱基加起来不要超过2个。2) Real-time PCR 体系配制(20ul)SYBR Green PCR 预混试剂10ul稀释的模板lul引物对(5uM)2ul无菌去离子水7ul每种引物，每种模板，各3个平行管反应。3) Real-time PCR 反应程序95°C，lmin，95°C，15s 60°C，lmin。循环重复第 2，3 步 40 次。(仪器ABI7500 型)4)结果统计学处理计算同一个样品HCV的Ct值与GAPDH的Ct值的比值，取3个 平行孔Ct比值的平均数。做图时将未经过药物处理的细胞的Ct比值的平均数设为100，计 算出所有样品的相对值后做图。参考文献[1]中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病与寄生虫病学分会.丙型肝炎防 治指南[J].中华医学杂志，2004，84 (9) 775-780.[2]庄辉.重视丙型肝炎的研究[J].中华肝病杂志，2004，12 (2) =65-66.[3]Lohmann V, Korner F, Koch J, et al. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line[J] Science,1999，285 (5424) 110-3.[4]Zhong J, Gastaminza P, Cheng G, et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(26) :9294_9.
权利要求
构建的支持中国人群HCV 1b亚型亚基因组复制子高效复制的细胞模型，采用干扰素-α处理细胞模型，确定细胞中HCV亚基因组复制子的拷贝数明显下降。进一步证实了细胞模型中存在HCV 1b亚型亚基因组复制子，并模拟了药物筛选的过程，为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。
2.一种含有权利要求1所述的含有中国人群HCV Ib亚型亚基因组复制子的真核表达 质粒，即 Pi7K-HCVlb。
3.一种由权利要求2所述的质粒体外转录得到的中国人群HCV Ib亚型亚基因组复制 子 RNA。
4.一种含有权利要求3所述的HCV Ib亚型亚基因组复制子RNA的细胞模型。
全文摘要
本发明涉及建立我国人群中居多的HCV 1b亚型亚基因组复制子细胞模型，通过RT-PCR技术和Western Blot技术验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并且通过Real-time PCR检测细胞中病毒的拷贝数。证实了细胞模型中存在HCV 1b亚型亚基因组复制子，并且有大量的拷贝数。并且采用干扰素-α处理细胞模型，模拟了药物筛选的过程，为未来的抗病毒药物的筛选和评价提供有力的工具和实验方法。因此该模型为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究打下了基础。同时本发明体外转录了中国人群中居多的HCV 1b亚型亚基因组复制子RNA，为进一步研究中国丙型肝炎感染者提供了前提。
文档编号C12N5/10GK101864397SQ200910081860
公开日2010年10月20日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者卢捷, 彭小忠, 李 瑞, 辛中帅, 阴彬, 陈慧毅, 龚燕华 申请人:中国医学科学院基础医学研究所