专利名称：：Bt蛋白Cry4Cb2、其编码基因及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。
背景技术：
：在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14%,病害损失达12%,草害损失达11%。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，紋媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等紋媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和H3589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍釆用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌(5a"'〃wA"W"g/era^,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididalcrystalproteins,简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。自1981年Schnepf从菌株HD-lDipel中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(AdangM.Ja/，Characterizedfbll-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinof5a"'〃ws//7鹏'"g/e肌^subsp./h^toh.HD-73andtheirtoxicitytoManducasexta,Gene，1985,36(3):289-300.),人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(CrickmoreN，ZeiglerDR，FeitelsonJ，"a/.Revisionofthenomenclatureforthe5ac/〃wsA,'wg/eMs/spesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998，62:807-813;http:〃www.biols.susx.ac,uk/Home/Nei1—Crickmore/Bt/)。一般而言，Cryl，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，Beland，G.L.,Bowman,C.,a/.Fieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfrom5ac/〃wsf/z,'"g/e服's.Bio/Technology,1993,11:194-200;Perlak,F.J.,Deaton，R.Armstrong,T.A.,a/.Insectresistantcottonplants,bio/technology,1990;8:939-943;VanFrankenhuyzen,K.,Gringorten,L.,andGauhier,D.1997.Cry9Caltoxin,a5a"7/w/z,'"g7'era7iinsecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafnniferana).Appl.Environ,Microbviol.63:4132画4134;王飞，2001，苏云金芽孢杆菌特异菌株生物学特性及co;9新基因的研究，硕士论文，南开大学)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(及AwW"g/e"^subsp."rae/e服、简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于紋虫的防治(GoldbergLJ，andMargalitJ，1977.AbacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagainstJ"op/ze/esserge"mL^rawotoem'"M"gM/cw/ata,Cw/exw"/v/to加51，^ecfesaegyj7f/，andCw/ex岸e似.MosqitoNews,37:355-358;)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性,对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu,D.,Johnson,J.J.,andFederici,B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesof^Mn'wg/em^.Mol.Microbiol.13:965-972;Wirth，M.C.，Georghiou,G.P.,andFedereci,B.A.1997.CytAenablesCrylVendotoxinsof5ac/〃ws^w〃'"g7'em7'stoovercomehighlevelsofCrylVresistanceinthemosquito,Cw/ex，—Me^xsc/a/肌Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536-10540)自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今己有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群己相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey,W.H.1985.Insectresistancetothebiologicalinsecticide5acz7/ws/77鹏7g^脂、.Science.229:193-195),原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik,B.E.,Finson,N.，Groeters，F.R.，da/.1994.Reversalofresistanceto5ac/〃ws//7wr/"g/ew57.wV尸/M/e〃G(:t少/a^e〃仏Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124),上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报,39(3):238-244;Hofte，H.，VanRie，J.，Jansens,S.，VanHoutven,A.,Vanderbmggen，H.,andVaeck，M.，1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsectiddalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsectiddalcrystalproteinsof6ac〃/wsZ/2,'wg/e服.s.App1.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf,E"Crickmore，N.,VanPie，J.，etal.1998.Sacz7/z^//z鹏Vg/e舰、anditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(RegisL,Wa/.，2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem./ra份wtoOywaWoCW/z，95:207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(GeorghiouGP,andWirthMC,1997.InfluenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsofBa"7/w51f/z腦V2g/era7、subsp./5rae/ms7、ondevelopmentofresistanceinthemosquitoCWex—wgM咖sc/a加(Diptera:Culicidae).朋c/五"v/ra"舰wto/Mz'cTc>6/o/ogy,63:1095-1101.)。为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
发明内容本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种新的BT毒力蛋白资源。本发明的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。本发明的目的还在于提供上述蛋白及基因的应用。本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bac/〃w/2Mr/"g/e"w;)新菌株YWC2-8。通过对YWC2-8的毒力测试表明，YWC2-8对鞘翅目害虫、鳞翅目害虫、双翅目害虫等等，均具有极高的毒力。根据Co;4^基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在Co^类基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到Co^C6基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示，序列SEQIDNo.l的全长为3474bp，分析表明，GC含量为35.90%,编码1157个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。在softberry网站釆用bacterialsigma7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将该基因命名为co^CM。本发明进一步分析了Cry4Cb2蛋白的氨基酸组成(见表1)。表lCry4Cb2蛋白的氨基酸组成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第760位的Tyr替换为Asn。因此，本发明Bt蛋白还包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有Cry4Cb2蛋白同等活性的由Cry4Cb2衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明的基因和蛋白质可以从菌株YWC2-8中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转Or/c^基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。此外，还可以通过发酵本发明菌株YWC2-8，得到含有Cry4Cb2蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。图1显示的是co^O)2全长基因克隆，其中M，marker;1,cr;^CW基因。图2显示的是重组质粒pET-4Cb的酶切鉴定图谱，其中1重组质粒pET-4Cb;2,用7VJeI+五coiI双酶切pET-30a;3,7WfeI+￡co7I双酶切pET-4Cb;4，插入的DNA;Ml、M2为Marker。图3显示的是在五.co/z'BL21(DE3)中表达Cry4Cb2的SDS-PAGE检测，其中M为蛋白marker;1.阴性对照(co/iBL21(DE3)(pET-30a));2.裂解上清；3.Cry4Cb2包涵体。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例l0押C762基因的克隆本发明从四川省成都平原土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(5ac/〃船AwW"g/e";^)新菌株，该菌株已于2009年1月12曰在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京巿朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(5""'〃船//m〃'"g/e"^:y)，保藏号为CGMCCNo.2亂本例通过如下方法克隆得到Co^O>2基因的全长序列。采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株HS18-1的总DNA。设计引物序列如下P1:5，ATGTCTAATCGTTATCAACGGTACCC3'P2:5，TCACTCGTTCATACAAATCAACTCGA3'PCR反应体系10xbuffer2.5(ilMgCl2(25阔1.5|i9dNTPs(2.5mM)2|Lll5(il25jal最终反应体积热循环反应94。C预变性5min;94。C变性lmin,52。C退火，72'C延伸2min,30个循环；72。C延伸5min;4。C停止反应。扩增反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图l所示，通过扩增得到了约为3.5kb的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，与目的序列一致。实施例2Co^^^基因的表达及杀虫活性测定根据co^CM基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异性引物cry4F:5'-GCGCATATG,DATGTCTAATCGTTATCAACGGTACCC-3':cry4R:5'-CGGAATTC(￡coRI)TCACTCGTTCATACAAATCAACTCGA-3',分另'J在5'端引物iVAI和五coRI酶切位点。以BtMC28质粒为模板进行扩增，扩增的产物釆用7Vc/el和五coRI进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-30a(+)连接，转化Eco/z'DH5a感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的后(图2),再转入受体菌￡.co//.BL21(DE3)。将重组质粒命名为pET-4Cb，含重组质粒的重组子命名为Eco".BL21(4Cb)。SDS-PAGE分析表明cO^CW基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3),分子量约为130kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。co^CW基因表达产物分别对甜菜夜蛾，棉铃虫及伊紋的生测结果表明表达产物对这三种虫都具有较好的杀虫活性。对棉铃虫杀虫活性最高，丄C^为15.06吗/mL;对伊紋的Z^。为17.41jig/mL;对甜菜夜蛾杀虫活性最低，丄C^为20.29|Lig/mL。蛋白对鳞翅目杀虫活性的的测定方法参见(SongFP,ZhangJ,GuAX,etal.，2003.Identificationofcr_y〃-typegenesfrom5ac/〃z^^wn'wg7'e"w^strainsandcharacterizationofanovelcr少77-typegene.Appl.Environ.Microbiol69:5207-5211),蛋白对双翅目杀虫活性的的测定方法参见(IbarraJE，delRinc6nMC,SergioOrdiiz:etal.，2003.DiversityofSac/〃w^2MnVg/em.^StrainsfromLatinAmericawithInsecticidalActivityagainstDifferentMosquitoSpecies.ApplEnvironMicrobiol69:5269-5274)。序列表<110〉四川农业大学<120>Bt蛋白Cry4Cb2、其编码基因及应用〈130>KHP09112226.2<160〉6<170>Patentlnversion3.5<210〉1<211>3411<212>DNA<213>BacillusthuringiensisYWC2-8〈220><221>CDS〈222>(1)..(3411)<400〉1atgtctaatcgttatcaacggtacccaetagcacataatccacaaact48MetSerAsnArgTyrGinArgTyrProLeuAlaHisAsnProGinThr151015tctatacaaactacgaattataaggattggctgaaaatgtgtcaaaat96SerlieGinThrThrAsnTyrLysAspTrpLeuLysMetCysGinAsn202530cctcatcaaaatcccttagacatggaagggtatgatagtaatteagtc144ProHisGinAsnProLeuAspMetGluGlyTyrAspSerAsnSerVal354045gttgtggtaagtacaggtttgattgttgttggtactttaattagtatt192ValValValSerThrGlyLeulieValValGlyThrLeulieSerlie505560ttgagtgcgggattgggatctatacctataatttatggtactttattg240LeuSerAlaGlyLeuGlySerlieProlielieTyrGlyThrLeuLeu65707580cctgttetatggaacgatccaaacaatccgcaaaaaacttggcatgaa288ProValLeuTrpAsnAspProAsnAsnProGinLysThrTrpHisGlu859095tttatgagtcatggtgaaacacttttgaaccaaacaatateaacagtt336PheMetSerHisGlyGluThrLeuLeuAsnGinThrlieSerThrVal100105110gagaggaatagagcagcagectatttggagggatacacaacagcagta384GluArgAsnArgAlaAlaAlaTyrLeuG]uGlyTyrThrThrAlaVal115120125aaaaaatgtgaagaagcattaaatgtgtggetcaaaactccaaatcaa432LysLysCysGluGluAlaLeuAsnValTrpLeuLysThrProAsnGin130135140getaatgcacgaacagtagcagattta_tacaaggacactgatttttta480AlaAsnAlaArgThrValAlaAspLeuTyrLysAspThrAspPheLeu145150155160ttttttacaactttgccccaccttaaacttcgtggctatgagacatta528PhePheThrThrLeuProHisLeuLysLeuArgGlyTyrGluThrLeu165170175cttctgagttcttatacacaagetgcaaatatgcatttaatattatta576LeuLeuSerSerTyrThrGinAlaAlaAsnMetHisLeulieLeuLeu180185190aagcaagetteaaaatacgetgatcaatggaatgetcaactttctgtc624LysGinAlaSerLysTyrAlaAspGinTrpAsnAlaGinLeuSerVal195200205tatgttcagaaaacagcaaacgattattgtactgatttagtaaaactg672TyrValGinLysThrAlaAsnAspTyrCysThrAspLeuValLysLeu210215220ataggagaatatacagattattgtattgca_acttacagattaggctta720lieGlyGluTyrThrAspTyrCyslieAlaThrTyrArgLeuGlyLeu225230235240actacaattaaatctagagetactteatggaacatatecaatatgtat768ThrThrlieLysSerArgAlaThrSerTrpAsnlieTyrAs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