一株根瘤菌及其应用的制作方法

专利名称：：一株根瘤菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株根瘤菌及其应用，特别涉及一株与苜蓿植物根能有效建立共生体系的根瘤菌及其应用。
背景技术：
：化学肥料在世界农业发展史上占有重要的地位，为农业的稳产、增产、挽回损失做出了重要贡献，但同时也因过量施用和滥用而导致地力衰退、环境污染、对非靶标生物影响等严重问题。尤其近年来农产品中氮肥的大量使用，导致亚硝酸盐等污染，严重威胁着人民的生活健康。随着社会文明的进步，农业可持续发展使人类对资源与环境的认识有了新的飞跃，对肥料的使用提出了安全、有效、环境友好型的要求。世界各国都在采取措施减少农用化学品的使用，并加强对农产品生产过程中农药肥料施用量和产品污染指标的严格控制，日本等国已明文规定对进口农产品中各类污染物含量进行严格限制。为了解决农产品提高产量和保证质量之间的矛盾，寻找和应用生物因子来改善植物营养环境已经越来越受到各国政府、科技工作者和民众的关注。如美洲多年来一直大力发展粮食作物与大豆轮作，以减少化学氮肥用量,取得了显著的经济和生态效益。固氮菌是一类能与植物和谐共存，促进植物生长的益生细菌。正常环境条件下固氮菌就可轻而易举地利用空气中的N2合成氨。它所固定的氮除了供自身生长需要外，绝大部分转化成作物可利用的含氮有机物供给植物体。人们将这个过程称为生物固氮。微生物的生物固氮作用，在改善植物的氮素营养、节约化学氮肥、减少化学氮肥对环境的污染和维护自然界的生态平衡等方面均有着十分重要的作用。生物固氮包括自生固氮、联合固氮和共生固氮。其中自生固氮和联合固氮能力有限，而共生固氮能能为人类提供大量氮，是人们研究的焦点。据估计，每年生物固氮为全球提供约2亿吨氮，其中75%由共生固氮生物提供，大大超过了全球的工业固氮量。根瘤菌与豆科植物是共生固氮中作用最强的体系，其固氮量占全部生物固氮量的65%，根瘤菌可将空气中游离的氮转化成化合态氮供豆科植物生长，这种共生体系是长期进化的结果。豆科植物固定的氮不仅用作自身共生体系营养，而且也可为其它非豆科植物提供氮素，因此它们对植物中维持适当的氮源起着关键的生态作3用。所以，开发利用根瘤菌的共生固氮具有深远意义。有关调査研究表明，与根瘤菌共生使豆科植物具有很强的抗逆能力，其中，根瘤菌的数量和固氮活性与豆科植物的抗逆性成正相关，一般新种植区的土壤中没有根瘤菌存在，因此，国际上公认新区种植豆科植物必须人工接种能与其够共生的根瘤菌。以紫花苜蓿为例，研究表明，接种根瘤菌可以使紫花苜蓿在生物量及植物品质方面均有显著提高。目前，随着我国农业种植结构的调整，作物品种呈现出多样化，其中具有固氮能力的苜蓿、花生及豆类蔬菜作物的种植面积急剧增加，呈现迅速发展的态势。另一方面，随着人民生活水平的提高和生活质量意识的不断加强，人们对畜产品的质量要求越来越高，优质高产的草食家畜词养业的发展已成为客观需要，随之，优质牧草的生产也成为当务之急。在农业结构调整和国内外牧草产品市场需求的拉动下，以紫花苜蓿为主的牧草产业呈现迅速发展的态势。紫花苜蓿被誉为"牧草皇后"，为豆科苜蓿属植物，它的主根可深入土壤7-9厘米或更深，含有高蛋白、矿物质和十多种维生素。目前优质高产紫花苜蓿新品种的引进、筛选及推广已被列入国家和各省重点农业使用技术推广项目。但是，目前用于苜蓿生长中的根瘤菌大多来自于非苜蓿宿主，其抗逆能力、定殖能力、竞争结瘤能力、固氮活性及与不同苜蓿品种的共生协同固氮效果等不理想，影响了紫花苜蓿的生产。因此筛选与苜蓿具有高效固氮效果的根瘤菌对于苜蓿的生产具有重要作用。
发明内容本发明的一个目的是提供一株菌，该菌株可与苜蓿植物的根形成有效共生体系。本发明所提供的菌株为根瘤菌(57/jar力izo^'鹏5"A)NX2004062，保藏编号为CGMCCNo.2883。该菌的菌落为圆形，乳白色半透明，随着培养时间增长，菌落不断扩展突起，边缘整齐，菌落表面光滑，生长在其上的细胞物质易在液体中分散。光学显微镜下菌为杆状，大多数运动，鞭毛周生，菌大小为(0.6-0.8)X3—5Wn，革兰氏染色后染色均匀，并可见菌被染成红色。该菌株的分类命名为中华根瘤菌(5^or力izo力^历邵.)，已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2883。本发明的又一个目的是提供一种培养上述根瘤菌(&'"02^^0W咖)NX2004062CGMCCNo.2883的方法。本发明所提供的培养根瘤菌(57"ar力&oZ^'w/z7印.)NX2004062CGMCCNo.2883的方法，是在25-3(TC的条件下，用YMA培养基培养所述菌；所述YMA培养基(即酵母汁甘露醇琼脂培养基)的组成为10g/L甘露醇，酵母粉3g/L，0.25g/LK2HP04，0.25g/LKH2P04，0.2g/LMgS04—H20，0.lg/LNaCl，3g/LCaC03，其余为水，pH值为7.2。所述培养方法还可进行液体摇培；所述摇培的速度可以为120-200rpm，优选为200rpm。上述培养温度优选为28。C;培养时间为36h-48h，优选48h。本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂可用于苜蓿植物中根瘤菌的接种。本发明所提供的菌剂，是将根瘤菌(57/or力izoZ^咖邵.)NX2004062(保藏编号为CGMCCNo.2883)与菌体吸附材料混匀得到的。其中，所述菌体吸附材料可以为草炭或微粉碳酸钙。所述菌剂中根瘤菌(67/ar/^oZ^'M7)NX2004062CGMCCNo.2883与所述菌体吸附材料的配比可为(1X108-5X10"cfu/g菌体吸附材料，优选为5X109cfu/g菌体吸附材料，菌剂的pH值为6.0-7.4。当菌体吸附材料为草炭时，可将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂；当菌体吸附材料为微粉碳酸钙时，可将所述菌的发酵液离心获得的菌体沉淀按1:1的质量比与微粉碳酸钙混合制得菌剂。本发明的最后一个目的是提供苜蓿属植物接种根瘤菌的方法。本发明所提供的苜蓿属植物接种根瘤菌的方法有如下两种方式第一种接种根瘤菌方法，是用根瘤菌(5777or力^c^i'鹏印.)NX2004062(保藏编号为CGMCCNo.2883)的菌悬液浸泡苜蓿属植物的种子，然后再进行播种培养。其中，所述菌悬液的浓度可以是(1X108-1X10'°)cfu/ml，优选为1X1(^cfu/ml;所述浸泡的时间可以为10-30分钟，优选为15分钟。所述播种培养的方法为将上述任一所述菌剂与培养基质混匀，用得到的混合物对所述浸泡过的种子进行培养。第二种苜蓿属植物接种根瘤菌的方法，是将上述任一所述菌剂与培养基质混匀，用得到的混合物对苜蓿属植物的种子进行培养。上述培养基质可以是由沙子、土和草炭组成，也可以只是由土壤组成，所述沙子、所述土、所述草炭的质量比为6:2:1。所述将上述任一所述菌剂与培养基质混匀的方法具体可以是将所述基质与所述菌剂按照3:1的质量比例混合。本发明的苜蓿属植物接种根瘤菌的方法中，所述种子可以为经过消毒、催芽的发芽种子。本发明的苜蓿属植物接种根瘤菌的方法中，所述苜蓿属植物具体可以为紫花苜蓿。本发明菌株NX2004062(保藏编号为CGMCCNo.2883)对苜蓿植物的生长安全，能通过与苜蓿植物建立有效共生体系，促进苜蓿根系生长，增强其光和作用，提高苜蓿地上、地下部产量，进而提高了苜蓿的产量和品质。另一方面，本发明菌株的应用减少了苜蓿生产中化肥的投入使用，进而减少了化学肥料对环境的污染。实验结果表明，用本发明菌株培养得到的苜蓿植物，与不与任何菌共培养得到的苜蓿植物相比，其地上部分干重增幅均在67%以上，最高可达284%，地下部分干重增幅均在73%以上，最高可达282%，结瘤数的增幅均在20%以上，最高可达3700%。实验结果还进一步表明，本发明菌株与中苜一号、WL232、德福、三得利、CW787和CW300等多个苜蓿品种均有良好的共生固氮效果。因此，本发明菌株具有固氮效果好、定植能力强、对苜蓿植物生长安全的特点，克服了目前苜蓿生产上接种的根瘤菌专化性不强、固氮效果较差的缺点。本发明筛选出了菌株NX2004062的最适培养基和培养条件，并制备了活菌量为5X109cfu/g的根瘤菌剂。本发明菌剂的制备具有工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存等特点，符合我国农产品安全生产标准的要求和无公害、绿色和有机农业生产基地的建设需要。本发明菌株及培养苜蓿植物的方法，为我国苜蓿产业提供了可靠的物质支撑和指导，并为最终建立根瘤菌菌株与苜蓿品种共生的特异性评价体系打下坚实的基础。本发明菌株的推广和使用，将在农业可持续发展、农业生态基地建设和区域经济的发展中发挥重要作用，具有重要的经济和社会意义。图1为扩增菌株NX2004062中NodA基因的结果电泳图。图2为扩增菌株NX2004062中NifH基因的结果电泳图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所使用的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、菌株的分离与鉴定一、菌株的分离方法从宁夏市西夏区芦花镇镇北堡的苜蓿实验地中采取地上部生长旺盛的苜蓿植株，观察其根部着生的根瘤，摘取颜色为粉红色的根瘤置于小采样瓶中，瓶子底部放入无水硫酸钠作为干燥剂。将采取的根瘤带回室内后，用无菌水清洗三次，表面使用3X次氯酸钠消毒5min，然后再用无菌水清洗一次后将根瘤转移至灭菌的吸水纸上，吸干水份。将根瘤放在灭菌的研钵中捣碎，用接种环蘸其汁液，采用细菌划线的方法将其在YMA结晶紫选择培养基上(即在YMA固体培养基的基础上加入十万分之一结晶紫)进行划线，28t:条件下恒温培养24h，选择边缘整齐，乳白色半透明的单菌落接种到YMA固体培养基上。进行生物学和生理生化性状鉴定，并将获得的一菌株命名为NX2004062。YMA固体培养基(即酵母汁甘露醇琼脂培养基)的组成为10g/L甘露醇，酵母粉3g/L，0.25g/LK2HP04，0.25g/LKH2P04，0.2g/LMgS04-H20，0,1g/LNaCl，3g/LCaC03，10g/L琼脂粉，其余为蒸馏水，pH值调至7.2。二、菌株的鉴定1、显微和超微形态观察将菌株NX2004062在YMA固体培养基上进行培养，并观察记录。培养48h后，菌落为圆形，乳白色半透明，随着培养时间增长，菌落不断扩展突起，边缘整齐，菌落表面光滑，生长在其上的细胞物质易在液体中分散。光学显微镜下观察到菌为杆状，大多数运动，鞭毛周生，菌大小为(0.6-0.8)X3—5刚，革兰氏染色后染色均匀，并可见菌被染成红色。2、生理生化鉴定将菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。表1、菌株NX2004062鉴定项目及结果检测项目NX2004062标准菌株检测项目NX2004062标准菌株革兰氏染色—酪氨酸产黑色素——运动性淀粉水解一—接触酶++马尿酸盐水解—一v-p反应柠檬酸盐水解一卵黄反应—硝酸盐还原——5%氯化钠++产生n引哚—7%氯化钠一色氨酸脱胺—10q/。氯化钠酪朊分解—葡萄糖产酸酪氨酸分解一d-木糖产酸++石蕊牛奶++阿拉伯糖产酸++明胶水解++甘露醇产酸固氮能力++葡萄糖产黑色素——结晶紫检测++注"+"表示阳性结果；"一"表示阴性结果。3、PCR扩增共生结瘤Box的nodA基因和NifH基因，进行鉴定应用根瘤菌特异性引物，对菌株NX2004062的共生结瘤Box的nodA基因和NifH基因进行PCR扩增。扩增NodA基因的引物序列如下nodA-l:5，-TGCRGTGGAARNTRNNCTGGGAAA-3'(序列1)，nodA-2:5'-GGNCCGTCRTCRAAWGTCARGTA-3'(序列2);扩增NifH基因的引物序列如下nifH-1:5，-AAGTGCGTGGAGTCCGGTGG-3，(序列3)，nifH-2:5'-GTTCGGCAAGCATCTGCTCG-3'(序列4)。以菌株NX2004062的菌液为模板，分别以上述引物进行PCR扩增，结果如图1和图2所示。图l为NodA基因的扩增结果(泳道1为菌株NX2004062的扩增结果，泳道2为marker);图2为NifH基因的扩增结果(泳道1为marker,泳道2为菌株NX2004062的扩增结果)。结果表明扩增得到的NodA基因片段的大小接近700bp8左右，与目的片断大小一致，扩增得到的NifH基因片段的大小接近700bp左右，与目的片断大小一致。图1和图2中所使用的是相同的marker。上述实验结果综合表明，该根瘤菌细胞无芽孢，通常为杆菌，不运动，好氧。革兰氏染色阴性，利用多种碳水化合物，在含碳水化合物培养基上生长时通常产生大量的胞外粘液。不利用柠檬酸盐，溶于氯仿。不生成3-酮基葡萄糖苷。缓慢液化明胶。不水解酪蛋白和洋菜。菌落白色或无色。不利用纤维素和淀粉。能以铵盐、硝酸盐、和大多数氨基酸作为氮源。接触酶反应阳性。将以上菌株NX2004062的生理生化性状检测结果与根瘤菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》和《根瘤菌属》中的检索表进行检索，确定本实验检测的菌株NX2004062的生理生化性状与根瘤菌相应性状吻合。同时NodA基因和NifH基因的扩增结果，进一步确认生化鉴定结果，鉴定菌株NX2004062为根瘤菌，其分类命名为中华根瘤菌(57/or力i加i^'鹏柳)，该菌株已于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.2883。三、菌株的培养条件的摸索将菌株NX2004062分别划线接种于LB、YMA、YEM、PDA、金氏B、BPY、523、蔗糖蛋白胨培养基(蔗糖2.0%，蛋白胨0.5%,K2HP040.05%，MgS047H200.025%，蒸馏水1000ml，琼脂17.0g)、YGM(葡萄糖2.5%，酵母膏2.0g,K2HPO40.25g，KH2P040.25g，MgS04'7H2O0.1g，MnSO40.15g，NaC10.05g，FeS04.7H200.005g，琼脂17.0g，蒸馏水1000ml)共9种培养基上，在283(TC下培养24h48h，观察菌的生长情况。结果表明，菌株NX2004062在9种培养基平板上均能生长，分别表现出溢脓状。但不同培养基上的生长情况存在差异，在YMA、YEM、523培养基上菌落扩展快，菌将菌株NX2004062分别接种于上述9种液体培养基中，在28。C下液体摇培，液体摇培的速度为200rpm，分别测定生长曲线、OD,值和pH值的变化。实验设3次重复，综合各项结果，表明YMA液体培养基较适于液体摇培，菌株NX2004062在YMA培养液中摇培至16h进入对数生长期，20h菌量已达10Scfu/ml，其菌量达到高峰的时期是36h—48h，菌量为l(^cfu/ml。YMA液体培养基(即酵母汁甘露醇琼脂培养基)的组成如下10g甘露醇，酵母粉3g，0.25gK2HP04，0.25gK跳，0.2gMgS04-H20，0.1gNaCl，3gCaCO"109g琼脂粉，1L蒸馏水，pH值7.2。实施例2、利用菌株NX2004062培养12个紫花苜蓿品种一、菌株NX2004062的菌剂的制备1、菌的培养将低温保存的菌株NX2004062划线接种在YMA培养基斜面上，于3(TC下培养48h进行菌种活化；再以1-2%接种量将菌株NX2004062接种至装有300mlYMA液体培养基的1000ml三角瓶中(即培养液YMA的装液量为30X)，进行摇床培养，其中，培养温度为28。C，起始pH为6.0，摇床速度为200rpm，摇培时间为48h，得到菌液。2、分别按照以下方法制备菌剂(1)将上述培养得到的菌液与草炭混匀，将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂，其中，菌剂中中华根瘤菌(6772ar/ho/^w历印.)NX2004062(保藏编号为CGMCCNo.2883)与草炭的配比为5Xl(fcfu/g草炭。通过平板计数检测菌剂中的有效活菌数、PH值及杂菌率。实验设3次重复，结果取平均数。测得菌剂中的活菌量等于5X109cfu/g，pH值为6.8。(2)将上述培养得到的菌液进行离心，获得菌体沉淀，然后将菌体沉淀与微粉碳酸钙(lum<d<5ym)按照质量比l:l的比例混匀，制得菌剂，其中菌剂中中华根瘤菌(5Y/7on^'2roZ^'顺印.)NX2004062(保藏编号为CGMCCNo.2883)的菌量为5X109cfu/g微粉碳酸钙。通过平板计数检测菌剂中的有效活菌数、pH值及杂菌率。实验设3次重复，结果取平均数。测得菌剂中的活菌量等于5X109cfu/g，pH值为6.8。二、利用步骤一得到的菌剂培养12个紫花苜蓿品种本实验中用到的12个紫花苜蓿品种(系)的名称如表2所示。此12个品种(均来自北京市种子管理站)均是在我国种植面积较大的有代表性的品种，均可从商业途径得到。下面以其中的一个品种"三得利"为例，说明本实验方法，其余品种的实验方法均与此相同。"三得利"种子萌发将三得利的种子在70%乙醇中浸泡305，无菌水漂洗2次，每次5min。随后将其浸泡在5%次氯酸钠溶液(NaC10)中，充分震荡3rain后，无菌水洗涤。再次将种子置于70。/。乙醇中浸泡30s，无菌水漂洗2次，每次5min。之后用无菌水浸泡种子3h，每30min换无菌水一次。由于三得利种子种皮较薄，在种子消毒处理的过程中同时也完成了种子的催芽处理，最后得到刚刚萌动的消毒的种子。"三得利"种子接菌处理(浸种的方法)选择发芽一致的苜蓿种子进行接菌。按照实验一中步骤1所述的方法，得到中华根瘤菌(5^orMzo&'咖印.)CGMCCNo.2883的菌液(菌液中菌的浓度为5X109cfu/ml);再用菌液浸泡苜蓿种子15分钟，再进行播种培养。苜蓿培养基质的配制按照沙土草炭=6:2:1(体积比)的比例，将沙子、土和草炭混匀，得到苜蓿培养基质。菌剂土壤处理和种苗培养在口径25cm的塑料组培杯中加入3/5体积的经灭菌处理的苜蓿培养基质(其中，沙子、土和草炭的质量比为6:2:1)和l/5体积的NX2004062根瘤菌菌剂(按照实验一中步骤2所述的方法制备的任何一种菌剂)，菌剂和培养基质混匀。将上述得到的接菌的种子，植入预备好的13cmxl3cmxl3cm的塑料花盆中，每杯种植15粒，之后将其放置田间自然条件下生长(温度为22°C-36°C、湿度朋=40%-70%、12小时光照和12小时黑暗交替)。待植株生长到90d后进行收获，以植株干重(即产量)为主要考核指标，结瘤数、根长等为辅助指标，用SAS统计软件和EXCEL软件分别对各个指标进行数据分析和处理，确定NX2004062根瘤菌菌株与苜蓿品种间的共生固氮效果。实验设3次重复，结果取平均数，以不接任何菌的种子作为对照。结果如表2所示。结果表明，12个供试紫花苜蓿品种接种根瘤菌NX2004062后，其地上部分干重、地下部分干重、结瘤数量均显著优于对照。表明NX2004062对苜蓿的生长比较安全，是一株具有高效固氮活性的根瘤菌，能通过与多个品种的紫花苜蓿建立有效共生体系，促进苜蓿根系生长，增强其光和作用，提高苜蓿地上、地下部产量，进而提高了苜蓿的产量和品质。表2、12个紫花苜蓿品种(系)与根瘤菌NX2004062共生结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例3、利用菌株NX2004062培养12个紫花苜蓿品种一、菌株NX2004062的菌剂的制备1、菌的培养同实施例2中所述相同。2、分别按照以下方法制备菌剂(1)将上述培养得到的菌液与草炭混匀，将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂，通过平板计数检测菌剂中的有效活菌数、pH值及杂菌率。实验设3次重复，结果取平均数。测得菌剂中的活菌量等于lX108cfu/g草炭，pH值为6.8。二、利用步骤一得到的菌剂培养12个紫花苜蓿品种本实验中用到的12个紫花苜蓿品种(系)的名称及来源与实施例2中所述相同。下面以其中的一个品种"三得利"为例，说明本实验方法，其余品种的实验方法均与此相同。"三得利"种子萌发与实施例2中所述相同。"三得利"种子接菌处理(浸种的方法)选择发芽一致的苜蓿种子进行接菌。按照实施例2中实验一中步骤1所述的方法，得到中华根瘤菌(5Y/2or力&o"咖邵.)CGMCCNo.2883的菌液(菌液中菌的浓度为1X108cfu/ml);再用菌液浸泡苜蓿种子30分钟，再进行播种培养。苜蓿培养基质的配制按照沙土草炭=6:2:1(体积比)的比例，将沙子、土和草炭混匀，得到苜蓿培养基质。菌剂土壤处理和种苗培养方法同实施例2中所述。待植株生长到90d后进行收获，以植株干重(即产量)为主要考核指标，结瘤数、根长等为辅助指标，用SAS统计软件和EXCEL软件分别对各个指标进行数据分析和处理，确定NX2004062根瘤菌菌株与苜蓿品种间的共生固氮效果。实验设3次重复，结果取平均数，以不接任何菌的种子作为对照。结果表明，12个供试紫花苜蓿品种接种根瘤菌NX2004062后，其地上部分干重、地下部分干重、结瘤数量均显著优于对照。实施例4、利用菌株NX2004062培养12个紫花苜蓿品种一、菌株NX2004062的菌剂的制备1、菌的培养13同实施例2中所述相同。2、分别按照以下方法制备菌剂(1)将上述培养得到的菌液与草炭混匀，将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂。通过平板计数检测菌剂中的有效活菌数、PH值及杂菌率。实验设3次重复，结果取平均数。观U得菌剂中的活菌量等于lX109cfu/g，pH值为7.0。二、利用步骤一得到的菌剂培养12个紫花苜蓿品种本实验中用到的12个紫花苜蓿品种(系)的名称及来源与实施例2中所述相同。下面以其中的一个品种"三得利"为例，说明本实验方法，其余品种的实验方法均与此相同。"三得利"种子萌发与实施例2中所述相同。"三得利"种子接菌处理(浸种的方法)选择发芽一致的苜蓿种子进行接菌。按照实施例2中实验一中步骤1所述的方法，得到中华根瘤菌(5Yy^乃W加Z^'鹏邵.)CGMCCNo.2883的菌液(菌液中菌的浓度为1X1(Tcfu/ml);再用菌液浸泡苜蓿种子10分钟，再进行播种培养。苜蓿培养基质的配制按照沙土草炭=6:2:1(体积比)的比例，将沙子、土和草炭混匀，得到苜蓿培养基质。菌剂土壤处理和种苗培养方法同实施例2中所述。待植株生长到90d后进行收获，以植株干重(即产量)为主要考核指标，结瘤数、根长等为辅助指标，用SAS统计软件和EXCEL软件分别对各个指标进行数据分析和处理，确定NX2004062根瘤菌菌株与苜蓿品种间的共生固氮效果。实验设3次重复，结果取平均数，以不接任何菌的种子作为对照。结果表明，12个供试紫花苜蓿品种接种根瘤菌NX2004062后，其地上部分干重、地下部分干重、结瘤数量均显著优于对照。序列表〈110〉中国农业大学〈120〉一株根瘤菌及其应用<130>CGGNAC92195〈160〉4〈210〉1<211>24<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<221>misc-feature<222〉(4，11，12，14，15，16)〈223>n=a或g或c或t，r=g或a<400〉1tgcrgtggaarntrrmctgggaaa24〈210〉2<211〉23<212〉DNA<213>人工序列〈220〉<221〉misc-feature〈222〉(3，9，12，15，20)〈223>n=a或g或c或t，r=g或a，w=a或t<400>2ggnccgtcrtcraawgtcargta23<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>权利要求1、根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)NX2004062，保藏编号为CGMCCNo.2883。2、一种培养权利要求1所述根瘤菌的方法，是在25-3(TC的条件下，用YMA培养基培养所述根瘤菌。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养的过程中进行液体摇培；所述液体摇培的速度为120-200rpm，优选为200rpm;所述培养温度优选为28°C;培养时间为36h-48h,优选为48h。4、一种菌剂，是将权利要求l所述根瘤菌与菌体吸附材料混匀得到的。5、根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于所述菌体吸附材料为草炭或微粉碳酸钙。6、根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中所述根瘤菌(57y7or力izo力i鹏邵.)NX2004062CGMCCNo.2883与所述菌体吸附材料的配比为(1X108-5X109)cfu/g菌体吸附材料，优选为5X109cfu/g菌体吸附材料；所述菌剂的pH值为6.0-7.4。7、一种苜蓿属植物接种根瘤菌的方法，是用权利要求1所述根瘤菌的菌悬液浸泡苜蓿属植物的种子，然后再进行播种培养。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述菌悬液中菌的浓度是(IX108-1X1010)cfu/ml，优选为1X10"'cfu/ml;所述浸泡的时间为10-30分钟，优选为15分钟。9、一种苜蓿属植物接种根瘤菌的方法，是将权利要求4-6中任一所述菌剂与培养基质混匀，用得到的混合物对苜蓿属植物的种子进行培养。全文摘要本发明公开了一种根瘤菌及其应用。本发明所公开的菌为根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)NX2004062，保藏编号为CGMCCNo.2883。本发明菌株NX2004062对苜蓿植物的生长安全，能通过与苜蓿植物建立有效共生体系，促进苜蓿根系生长，增强其光和作用，提高苜蓿地上、地下部产量，进而提高了苜蓿的产量和品质。另一方面，本发明菌株的应用减少了苜蓿生产中化肥的投入使用，进而减少了化学肥料对环境的污染。文档编号C12N1/20GK101519644SQ20091008117公开日2009年9月2日申请日期2009年4月3日优先权日2009年4月3日发明者刘西莉,卢志军,朱书生,李健强,李旭军,王建辉,王红梅,贾小红,郭岩彬,黄中乔申请人:中国农业大学