专利名称：一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值的转基因方法
技术领域：
本发明----一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值(11S/7S比值)的转基因方法，属于大豆转基因育种方法。
二、技术背景大豆起源于我国，由于高含蛋白质(平均40％)，数千年来一直是城乡百姓蛋白质营养的重要来源。在大豆种子蛋白中，90％属于盐溶性球蛋白(globulin)其余10％为水溶性清蛋白(albumin)。球蛋白经密度梯度离心后可以分为2S、7S、11S和15S四个组份，其中7S和11S是最主要的贮藏蛋白(占种子蛋白的70％)，分别称为伴大豆球蛋白(conglycinin)和大豆球蛋白(glycinin)。SDS-PAGE电泳分析发现，7S组份主要含有三种亚基(α，α′和β)，而11S组成比较复杂，是由大小两类亚基组成的复合物。大亚基是40KD左右的酸性A蛋白，小亚基是20KD左右的碱性B蛋白。这些亚基的氨基酸组成不同，形成的大小亚基组成的复合物在甲硫氨酸的含量上也不一样，有些含有7-8个甲硫氨酸(如A2B1a)，而有些仅有1个(如A4B3)(Liu，1999)。
从营养角度而言，大豆含有的人体必需氨基酸较齐全，但含硫氨基酸很少，平均2.4％，低于FAO规定的指标(3％)。其中甲硫氨酸更少，仅有0.7％，也低于FAO规定的指标(1.9％)(金东淳等，1994)。由于11S蛋白所含的含硫氨基酸比7S多3-4倍，因此，提高含硫氨基酸的一个有效途径是增加11S蛋白的含量。或者，设法减少7S蛋白的含量，鉴于11S组份和7S组份在含量上能相互补偿(Kitamura，1995)，因此提高11S/7S比值即可增加含硫氨基酸含量。
培育高11S/7S比值的大豆品种有以下两种途径一是应用传统技术。即从现有大豆资源(包括应用物理或化学诱变技术获得的新资源)中广泛筛选，获得高11S/7S比值的材料，并用杂交、回交等技术进行转育，从而培育新品种。可是传统育种技术在培育高11S/7S比值的大豆方面速度慢、效率不高，不能满足生产、加工和消费的需求。
二是利用基因工程技术。定向培育11S/7S比值高、综合性状优的品种(系)，但是国内外均未发现有开展这样研究的报道。分析其缘由，很可能是由于缺乏有关基因以及大豆遗传转化相对困难所致。因此，为了提高改进11S/7S比值的育种效率、满足大豆生产、加工和消费的需求，增强农业高新技术在品种改良中的作用，应用基因工程技术培育相应优良品种(系)非常必要。当前，众多国内外研究和开发单位争相开展基因工程改进大豆油脂品质，但对大豆种子重要蛋白质品质性状11S/7S比值的基因工程改良尚未涉及。
发明内容
技术问题本发明的目的是一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值(11S/7S比值)的转基因方法，通过基因工程技术引入外源基因，快速培育高11S/7S比值的大豆新品系(种)，增加我国大豆及其产品的附加值、满足大豆生产、加工和消费的需求，提高大豆的市场竞争力。
技术方案本发明----一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值(11S/7S比值)的转基因方法，包括1)以包含有非洲菊花器官发育调节基因gagal的农杆菌TAT613，利用花粉管通道法转化大豆N2899。
2)从T1代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将抗卡那植株进一步做PCR鉴定，PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl，PCR扩增反应条件预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃ 59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min，选择PCR鉴定结果为阳性的材料；3)T3代开始对转基因后代种子贮藏蛋白进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果显示与未转化对照相比较，出现有7S组分中α和α’亚基含量减少甚至缺失的转基因后代，即为转基因获得的提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值的材料，经用1D Elite 4.0软件分析计算，即测得11S/7S比值。
有益效果与传统的技术相比较，本发明所提供的一种提高大豆11S/7S比值的转基因方法，具有如下优点本发明提供的方法选育了11S/7S比值达3.6的转基因大豆材料，而对照仅为1.7。利用本方法可显著提高改进11S/7S比值的育种效率。
四
图1转基因大豆T2代的NPTII基因PCR扩增图M标准分子量；1阳性对照；2阴性对照；2-10转基因植株图2转基因大豆T2代的gagal基因PCR扩增图M标准分子量；1阳性对照；2阴性对照；2-10转基因植株图3转基因大豆T3代种子蛋白的SDS-PAGE电泳图
CK对照；M标准分子量；1-8转基因大豆T3代株系图4对照(N2899)种子蛋白的SDS-PAGE电泳扫描图1-37S组份的α’，α和β亚基；4、5、911S组份的A3、A1，2，4和B亚基；6、7和811S组份的多肽图5转基因大豆(株系1)种子蛋白的SDS-PAGE电泳扫描图1-37S组份的α’，α和 β亚基；4、5、911S组份的A3、A1，2，4和B亚基；6、7和811S组份的多肽五具体实施方式
1)以包含有非洲菊花器官发育调节基因gagal的农杆菌TAT613(Yu DY等，1999，Plant Journal，17(1)pp51-62)，利用花粉管通道法转化大豆N2899(喻德跃等，2003，大豆科学，22(2)pp79-82)。
2)从T2代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，对抗卡那霉素植株进一步做PCR鉴定。(图1～2)3)T3代开始对转基因后代种子贮藏蛋白进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE)分析(图3)，结果显示与未转化对照相比较，有7S组分中α和α’亚基含量减少甚至缺失的转基因后代(株系1和株系4)，经用1D Elite 4.0软件分析计算，其11S/7S比值可达3.6(图5)，而对照仅为1.7(图4)。
具体方法如下1.花粉管通道法转化大豆在7-8月份大豆盛花期，早晨6时左右选择植株中上部未开放的花蕾(此时花冠颜色较鲜亮，花冠与花萼等高或花冠高于花萼1mm)，将写好的纸牌挂到花梗部，并将同一位置多余的花去掉。下午3:00以后进行花粉管通道导入。左手夹住花柄靠花的底端(不去花瓣)，并用右手中的剪刀轻轻地划开龙骨瓣，将大豆花的柱头适量的剪掉，既保证花粉管存在，又保证随后的液滴能顺花粉管进入子房。用微量注射器对准剪去的柱头，注射质粒DNA溶液(冰盒存放)，待第一次滴的缓冲液挥发干后(约10分钟)，再滴第二次，每次注射10μl左右。
2.苗床筛选苗期初步筛选用卡那霉素抗性鉴定。方法是将脱脂棉撕成小条沾取400ppm的卡那霉素溶液，粘附于大豆两片真叶上，采用同受体材料相同的空白对照，进行涂抹。3天后所有沾有卡那霉素溶液的不含有外源基因的大豆叶片均出现明显的黄色斑块，而转入外源基因的叶片仍为正常绿色，无任何症状。经苗床初步筛选后获得卡那抗性的大豆苗，挂牌重点观察记录，常规大田正常生产管理。并进行PCR分子标记检测。
3.大豆DNA的提取及纯化CTAB法提取大豆DNA1)将1g冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。磨好的叶片倒入50ml离心管中，加入CTAB的提取液[缓冲液的组成CTAB2％(W/V)，Tris-HCl 0.1M，EDTA(pH8.0)0.05M，NaCl 1.0M]，每10min搅拌一次，8000rpm/min离心，将上清转移到新管。
2)加入等体积的氯仿抽提，低温在摇床上摇动一个小时，并将上清转移至新管，用等体积的异丙醇沉淀DNA，在室温下放置10-20min。
3)将DNA用小棒挑出，在70％酒精中洗涤1小时，离心，弃酒精，并在干净的超净工作台上吹干。用10ml HS-TE溶液溶解沉淀，加适量10mg/ml RNase过夜。
4)用PH7.0饱和酚抽提一次、氯仿抽提两次，将上清用2V纯酒精沉淀，摇匀后-20℃放置30min，将DNA用小棒挑出，在70％酒精中洗涤1小时，离心，弃酒精，并在干净的超净工作台上吹干。用适量的TE缓冲溶液溶解沉淀，溶解后的DNA经紫外光谱测定A260/230与A260/280，符合DNA扩增要求后分装保存。
4.质粒DNA的大量提取及纯化质粒DNA的大量提取及纯化参照Sambrook等(1989)，具体如下1)配制1000mlLB培养基(Tryptone10g，Yeast extract5g，Nacl10g，用10M NaOH调至pH7.0，加蒸馏水至1000ml，)，每200mlLB平均分装于500ml的三角瓶中，高压自动灭菌锅灭菌。
2)等灭菌的培养基冷却后在超净工作台上加氨苄至终浓度为100ppm。然后于每瓶中加1ml含目的基因的大肠杆菌预培养物(先挑取在LB固体培养基上培养的已含目的基因大肠杆菌单菌落，于液体LB中37℃，震荡培养至对数生长期)，振荡培养(200次/min)12h。
3)将培养物转入500ml的离心瓶中，4000rpm/min，倒去上清，将沉淀在底部的菌落分装到50ml离心管中。
4)离心管中加5ml溶液I[50mM Glucose，25mM Tris-HCL(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)，高压灭菌，4℃储存备用]，重悬沉淀，充分振荡以溶解沉淀。
5)加10ml新配制的溶液II
，盖紧管盖，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内溶物，冰浴10-20min。
6)加7.5ml用冰预冷的溶液III[100ml中含3M乙酸钾，11.5ml冰乙酸]，盖紧管盖，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10-20min，这时应有白色沉淀。
7)8000rpm/min，4℃离心20min，用4层灭过菌的纱布把上清液过滤到一50ml离心管中，加0.6V的异丙醇，充分混匀，室温放置10-20min，4500rpm/min于室温离心20min回收质粒DNA。
8)小心倒掉上清，敞开管口倒置离心管使上清流尽，用70％乙醇洗涤沉淀和管壁。倒出70％乙醇，并将离心管倒置在超净工作台上的干净纸巾上，以使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。用4mlTE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM Na2-EDTA(pH8.0)]溶解沉淀，并加10mg/mlRNase至终浓度20ug/ml，过夜。
9)将上述核酸溶液用等体积的碱性饱和酚抽提一次，氯仿抽提两次。4℃，8000rpm/min离心10min，至中间分层中无白色蛋白质。将上清吸到另一只新的离心管，用2V无水乙醇和0.1V NaCl(2M)沉淀，摇匀后-20℃放置2个小时。小心倒掉上清，敞开管口倒置离心管使上清流尽，用70％乙醇洗涤沉淀和管壁。倒出乙醇，并将离心管倒置在超净工作台上的干净纸巾上，以使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。用2mlTE缓冲液溶解沉淀。1.0％琼脂糖电泳检测提取的质粒DNA的质量并估计浓度，溶解后的DNA经紫外光谱测定A260/230与A260/280，符合作为外源DNA导入要求的质量后分装保存。
5.PCR检测PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl。PCR扩增反应条件预变性95℃5min，后经95℃15s，52℃59s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min。扩增后1％EB琼脂糖凝胶电泳检测，结果在转基因大豆中能够扩增出特异条带(分子量为gagal，～750bp；NPTII，～500bp)，而对照中则没有。如图1，图2。
6.大豆球蛋白提取步骤1)将15粒左右的大豆种子在粉碎机中粉碎、研磨成粉状，一般为2min。
2)加适量乙醚或丙酮进行脱脂，一般加入量以刚溢满豆粉为准(在通风橱中进行操作)，过夜，第二天早上倒掉乙醚或丙酮，风干。
3)称取0.25克干豆粉放于分别记上编号的大离心管中，加入蛋白质提取液，每个离心管加5ml。静置提取1-3个小时。
4)经8000rpm/min离心15分钟，将上清夜倒入7ml的小离心管中。
5)用1N HCl调每个小离心管中的溶液pH值至4.5。
6)经4500rpm/min离心10min，倒掉上清夜，将沉淀物放入烘干箱中烘干，即为球蛋白。
7.大豆球蛋白十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳及11S/7S比值计算5％浓缩胶、10％分离胶，恒流15mA/gel，1小时后，电流加倍，溴酚蓝前沿指示剂距玻璃板下沿1mm处停止电泳，考马斯亮蓝染色(如图3)，结果与未转化对照相比较，其中有7S组分中α和α’亚基含量减少甚至缺失的转基因后代，即为转基因方法获得的提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值的材料。Image Master(安玛西亚公司，图像分析系统)扫描，用1D Elite 4.0(安玛西亚公司，图像分析软件)分析计算其11S/7S比值，其11S/7S比值可达3.6(图5)，而对照仅为1.7(图4)。
权利要求
1.一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值的转基因方法，包括1)应用包含有非洲菊花器官发育调节基因gagal的农杆菌TAT613，利用花粉管通道法转化大豆N2899；2)从T1代开始，对转基因植株苗期进行卡那霉素抗性鉴定，将抗性植株进一步做PCR鉴定，PCR扩增体系含0.25mM dNTP，MgCl2，1U Taq酶，0.5μM Primer，100-200ng DNA，总体积25μl，PCR扩增反应条件预变性95℃ 5min，后经95℃ 15s，52℃ 59s，72℃ 2min，30个循环，72℃延伸10min，选择PCR鉴定结果为阳性的材料；3)从T3代开始对转基因后代种子贮藏蛋白进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果与未转化对照相比较，其中有7S组分中α和α’亚基含量减少甚至缺失的转基因后代，即为转基因方法获得的提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值的材料。
全文摘要
本发明为一种提高大豆球蛋白与伴大豆球蛋白比值(11S/7S比值)的转基因方法，属于大豆转基因育种方法，是将非洲菊花器官发育调节基因gagal利用花粉管通道法转入大豆，对转基因植株苗期进行卡那霉素鉴定，筛选出抗卡那植株，进一步进行PCR鉴定，并结合大豆种子贮藏蛋白十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺(SDS－PAGE)鉴定、11S/7S测定，选育出高11S/7S比值的转基因大豆材料，其11S/7S含量高达3.6，是未转化对照(1.7)的2倍多。
文档编号C12N15/82GK1733919SQ200510040989
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月12日 优先权日2005年7月12日
发明者喻德跃, 郑蕊, 孙英, 魏国兰 申请人:南京农业大学