分离大豆蛋白的方法

分离大豆蛋白的方法
【专利说明】分离大豆蛋白的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及一种分离大豆蛋白的方法，以及由所述方法获得的纯化的大豆蛋白、 0-伴大豆球蛋白（beta-Conglycinin)和胰蛋白酶抑制剂蛋白。
[0002] 发明背景
[0003] 大豆是人类和动物的一种重要的蛋白质来源，无论以其未经处理的、还是经过处 理的形式。大豆提供了低成本蛋白的良好来源，并因其广泛存在、具有独特的化学组成、良 好的营养价值、广泛的用途和有益健康的功效，已成为一种重要的世界商品。尽管低于约 5%的大豆蛋白可用于食品，但该百分比有可能增长。近几年一家主要研宄机构已经重点研 宄了各个贮藏蛋白（如大豆球蛋白，伴大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制剂），并将它们与工 业上的重要功能特性和有益健康的功效联系起来。尽管有了这种广泛的研宄，各个这些蛋 白质或其富集的部分还不能以低成本广泛可用。
[0004] 大豆蛋白（即从大豆获得的蛋白质）还含有抗营养因子，其阻止了食物中的营养 物质的吸收。特别是在许多大豆蛋白中发现的胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白，其抑制胰蛋白酶 (一种存在于消化系统中的水解蛋白质的丝氨酸蛋白酶）的活性。因此，尽管这些蛋白在其 它应用中具有有益功能，但是如果用于食品或动物饲料成分的部分，这些蛋白质会对消化 酶系统产生负面的影响，并可能导致营养不良和疾病。
[0005] 因此，为了降低大豆蛋白中天然存在的胰蛋白酶抑制剂蛋白的活性已经采取了特 别的努力。一般方法是简单地加热大豆蛋白，该方法变性/破坏了胰蛋白酶抑制剂蛋白。然 而，这种技术也破坏或变性了大豆蛋白中的其他蛋白，从而减少了他们的蛋白功能（例如 形成凝胶、结合脂肪或乳化）。含有赖氨酸的蛋白质对热尤其敏感。加热还能降低大豆蛋白 的水溶性。
[0006] 加热大豆蛋白以破坏胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白的一种替代方法是将所述胰蛋白 酶抑制剂（TI)蛋白与大豆蛋白的其余部分分离。这种技术的优点是避免了热，又能够提供 分离的胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白（其本身可成为一种有用的药用产品）。
[0007] 因此研宄努力集中在了大豆蛋白的纯化以分离其中含有的胰蛋白酶抑制剂（TI) 蛋白。Bajpai等人（Foodchemistry，89(2005)，497-501)讨论了使用固定化金属亲和层析 法结合胰蛋白酶抑制剂和大豆植物凝集素。
[0008] TO2011/082358、TO2011/082359 和TO2011/082360 全部涉及从大豆蛋白中分离和 纯化胰蛋白酶抑制剂的的各个方面。
[0009] 发明目的
[0010] 尽管迄今为止取得了一定的进展，仍然需要用于从大豆蛋白水性提取物或溶液纯 化和分离蛋白的替代方法。 发明概要
[0011] 本发明人已发现了对大豆蛋白中各种蛋白质具有选择亲和性的某些配体。
[0012] 因此，本发明的第一方面涉及分离大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：
[0013] i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含 至少两种类型的大豆蛋白；
[0014] ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个膨胀床吸附过程，其中所述 膨胀床吸附过程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸 附树脂选择性地吸附至少第一类型的大豆蛋白以提供非结合蛋白组分和结合蛋白组分，所 述的吸附树脂包含：
[0015]至少一种配体（L1)，所述至少一种配体（L1)包含芳族或杂芳族环系统和一个或 多个酸性基团，或
[0016]至少一种配体（L2)，所述至少一种配体（L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中所述 的在配体（L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自下列的一个或多个基团所取代的 胺：
[0017]a.芳基、苄基或杂芳基；
[0018]b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，
[0019] 或它们的组合；
[0020]iii.通过洗脱非结合蛋白组分或者洗脱结合蛋白组分从所述吸附树脂分离所述 第一种类型的大豆蛋白，以及
[0021] iv.从所述吸附树脂分离第二种类型的大豆蛋白以提供所述第一种类型的大豆蛋 白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。
[0022] 在下面的本发明的详细描述和所附的权利要求书中给出了该方法以及所述配体 L1和L2的进一步细节。
[0023] 本发明还提供了由本发明方法获得的大豆蛋白组合物。此外还提供了第一种组合 的大豆蛋白产品，其通过将由本发明方法获得的变性的TI蛋白与由本发明方法获得的TI 蛋白被去除了的第一种大豆蛋白组合物组合而成。通过将变性的TI蛋白与TI蛋白被去除 了的第二种大豆蛋白组合物组合获得的第二种组合的大豆蛋白产品。
【附图说明】
[0024] 图1-19阐明了本发明实施例的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)凝胶。
[0025] 发明的详细公开
[0026] 如上所述，本发明提供了分离大豆蛋白的方法，所述方法包含以下步骤：
[0027] i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含 至少两种类型的大豆蛋白；
[0028] ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个膨胀床吸附过程，其中所述 膨胀床吸附过程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸 附树脂选择性地吸附至少第一类型的大豆蛋白以提供非结合蛋白组分和结合蛋白组分，所 述的吸附树脂包含：
[0029]至少一种配体（L1)，所述至少一种配体（L1)包含芳族或杂芳族环系统和一个或 多个酸性基团，或
[0030] 至少一种配体（L2)，所述至少一种配体（L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中所述 的在配体（L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自下列的一个或多个基团所取代的 胺：
[0031] a.芳基、苄基或杂芳基；
[0032] b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，
[0033] 或它们的组合；
[0034] iii.通过洗脱非结合蛋白组分或者洗脱结合蛋白组分从所述吸附树脂分离所述 第一种类型的大豆蛋白，以及
[0035] iv.从所述吸附树脂分离第二种类型的大豆蛋白以提供所述第一种类型的大豆蛋 白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。
[0036] 所述方法适宜按顺序进行，无插入步骤。
[0037] 大豆和大豆蛋白
[0038] 大豆，即黄豆（Glycinemax)，是生长于世界许多地方的豆科作物。大豆作为食用 油、高蛋白食物、食物成分和饲料以及多种工业产品的来源具有巨大的经济意义。
[0039] 大豆蛋白是大豆中存在的蛋白质的通用术语。大豆粉含有至少50%的蛋白质，由 大豆碎片磨制而成。由于其相对高的蛋白含量，许多应用中需要大豆蛋白的组合物。除了 人和动物饲料，大豆蛋白具有形成凝胶、结合脂肪以及乳化的有用性质。
[0040] 大豆蛋白不是均一的组分。根据由超离心分析得到的其沉淀系数，大豆蛋白传统 上被分为以下四大组：2S(主要是白蛋白、酶和胰蛋白酶抑制剂），7S(主要是e-伴大豆球 蛋白），11S(主要是大豆球蛋白）和15S(主要是大豆球蛋白的二聚体）组，分别具有大约 25000、160000、350000和600000的峰值分子量。典型的商业方法通过水抽提可以产生大 约22%的2S、37%的7S、31%的11S和11%的15S蛋白，但是取决于种类、农作物年份、操 作和进行的热处理，所述的数量可明显不同。
[0041] 为了使这些蛋白彼此分离开发了复杂的实验室方法。这些技术不能实际应用于商 业规模的生产。因为步骤中的小变化会显著改变产品的最终组成，这些技术的一些也很难 重现。
[0042] 0-伴大豆球蛋白
[0043] 近来对获得纯化的0_伴大豆球蛋白组分的兴趣不断增加，主要对其有益性质的 研宄，诸如降低胆固醇和预防某些类型的癌症。伴大豆球蛋白是分子量大约180kDa的 三聚体蛋白。它由(~71kDa)、a(~67kDa)、和0 (~50kDa)三种亚基组成。
[0044] 大豆球蛋白和0-伴大豆球蛋白占了大豆中蛋白质的大约70%。已经推断可以通 过改变这些蛋白的比例来改善在食物体系中大豆蛋白成分的功能特性。以前曾经通过提高 大豆球蛋白对伴大豆球蛋白的比例来改善豆腐类大豆凝胶的产量和质量，并为了营养 目的提高含硫氨基酸的含量。每单位蛋白中大豆球蛋白比0-伴大豆球蛋白多含3到4倍 的半胱氨酸和甲硫氨酸。因此认为增加大豆球蛋白的含量并降低伴大豆球蛋白的含量 会增强蛋白质量。
[0045] 膜蛋白酶抑制剂蛋白
[0046] 大豆蛋白中也含有大量的胰蛋白酶抑制剂蛋白（TI)。已知该抑制剂为丝氨酸蛋白 酶抑制剂，其抑制胰蛋白酶，并且也经常抑制其它丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶抑制剂结合胰蛋 白酶的活性位点，从而阻碍肽键的催化断裂。可以通过标准方法确定胰蛋白酶抑制剂的存 在和含量，所述标准方法包括使用标记的胰蛋白酶特异性肽底物的竞争性实验，当分析的 样品中存在胰蛋白酶抑制剂时，所述的肽底物会以较低的速度降解。其它比较简单的实验 是基于凝胶扩散技术，其中活性胰蛋白酶分子裂解沉淀的蛋白底物，从而产生澄清的区带， 其大小取决于胰蛋白酶抑制剂的存在与否。
[0047] 胰蛋白酶，一种丝氨酸蛋白酶，负责断裂消化体系中的肽键（特别是在精氨酸或 赖氨酸处）。但是，如果胰蛋白酶抑制剂（特别是KTI)的存在会使大部分的胰蛋白酶失活， 消化的蛋白则未被降解。该胰蛋白酶抑制的影响可能包括胃部疼痛、胰腺增生（细胞增殖） 和/或肥大（细胞增大）。
[0048]Kunitz-胰蛋白酶抑制剂（KTI，也称为Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂）是一类胰 蛋白酶抑制剂蛋白，其成员具有大约170-200个氨基酸，分子量在20至25kDa之间，并主要 作用于胰蛋白酶。Kunitz-胰蛋白酶蛋白酶抑制剂大多为单链多肽，由4个半胱氨酸连接 成两个二硫桥，每个二硫桥形成的环中存在一个反应性位点。第二类抑制剂含有60-85个 氨基酸，分子量范围是6-10kDa，含有较高数目的二硫键，相对热稳定，在不同的连接位点对 胰蛋白酶和靡蛋白酶都有抑制。Bowman-Birk抑制剂（BBI)是该类抑制剂的一个实例。大 豆中存在的蛋白酶抑制剂的平均水平分别是大约1. 4%的KTI和0. 6%的BBI。值得注意的 是，如此低的水平使分离临床应用的天然蛋白酶抑制剂不切实际。
[0049] 因此，一方面，所述的蛋白酶抑制剂（TI)是指Kunitz-胰蛋白酶抑制剂（KTI)或 Bowman-Birk抑制剂（BBI)，优选KTI。
[0050] 发明方法
[0051] 本发明方法从大豆蛋白的粗水性提取物或大豆蛋白溶液开始。通常所述的大豆蛋 白的水性提取物通过用水或稀酸或碱抽提大豆或大豆制品（例如，粉碎的大豆、大豆粗粉 或脱脂的大豆粉）获得。提取优选在1-60°C温度下进行0.1-20小时。水可以是接近中性 的pH(pH6. 5-7. 5)或可以是碱性，例如pH9. 0-pH12。在某些情况下，通过加入含水碱使 提取混合物的pH在提取过程中保持恒定在优选的范围内。
[0052] 在某些情况下，大豆蛋白是通过进一步加工从粗提取物获得的大豆蛋白溶液，例 如沉淀、离心和过滤，所述的过滤包括膜过滤，例如超滤、纳米过滤和微滤。在优选的实施方 案中，所述的大豆蛋白溶液是从通过对接近中性或碱性的大豆蛋白提取物的酸化得到的蛋 白沉淀而制备的。
[0053] 优选的大豆蛋白溶液是大豆奶。大豆奶可以由完整的大豆或全脂的大豆粉制备。 根据水的温度，干燥的豆子在水中浸泡过夜或至少3个小时或以上。然后再水化的豆子在 足够的水加入下进行湿磨，得到所需固体含量的最终产品。水与豆子的重量比例应该是大 约10:1。将所得到的浆或糊煮沸，加热失活大豆胰蛋白酶抑制剂而提高其营养价值，改善其 味道并消毒所述的产品。在沸点或接近沸点的温度下持续加热一段时间，15-20分钟，然后 通过过滤除去未溶的残渣（大豆纤维或豆渣）。传统的中国豆奶和日本豆奶加工过程存在 简单但深奥的区别：中国方法是冷却过滤后煮沸滤液（豆奶），而日本方法是先煮沸豆浆， 然后热过滤所述豆浆。后一方法导致较高的豆奶产量，但是在煮沸步骤需要使用防泡沫剂 或天然除沫剂。将过滤后的豆奶煮沸避免了产生泡沫的问题。通常其颜色为不透明的、白 色或米色，与牛奶的稠度接近。特别优选的是热处理前的豆奶。
[0054]其它优选的大豆蛋白溶液可通过洗涤、再溶解和/或酶处理大豆纤维（豆渣）废 料获得。制备豆腐产生的废料也构成了优选的大豆蛋白溶液。
[0055] 为了符合分离方法中的pH，所述大豆蛋白水性提取物或溶液可在步骤（ii)前调 节pH，优选调节pH在2. 0-9. 0之间。调节pH可能导致在水性提取物中的蛋白沉淀，因此可 以对pH调节后的大豆蛋白提取物倾析、离心或过滤，在步骤（ii)前去除不溶性物质。
[0056] 大豆蛋白水性提取物或溶液至少包含两种类型的大豆蛋白一第一种类型和第二 种类型。
[0057] 将大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个分离过程，所述的分离过程包含将所 述大豆蛋白水性提取物与至少一种吸附树脂接触。
[0058] 所述的吸附树脂选择性吸附至少第一种类型的大豆蛋白，并有可能吸附其它大豆 蛋白质。因此获得了非结合的蛋白组分和结合的蛋白组分。
[0059] 所述的分离过程是固相吸附过程：膨胀床吸附（EBA)。
[0060] 膨胀床吸附（EBA)
[0061] 在近年来发展的各种工业性层析分离技术中，膨胀床（EBA)已经被成功地引用到 生物技术工业的某些领域。EBA是一种液化床吸附，其中保持最低水平的回混。与其它层析 分离技术相比，EBA因其可以直接应用非澄清原料而具有明显的优势。
[0062] 在EBA过程中，当液体流过时，吸附树脂床可以在层析柱内膨胀。床的膨胀通 常在每个末端具有网状结构的柱中进行，该网状结构遮盖了柱子的横截面，或在一些其 它有孔的装置中进行，其不会在流动中产生涡流。例如参见WO-A-9218237(Amersham PharmaciaBiotechAB，瑞典）。在使用搅拌的进入流的体系中可以发现相同的效果， W0-A-9200799(UpFrontChromatographyA/S).
[0063] 在膨胀床状态，吸附剂树脂颗粒之间的间距可以导致原料流中微粒杂质的自由通 过。相反地，传统的填充床作用就像深度过滤器，其可能堵塞，引起反向压力增加，除非原料 是完全澄清的。因为在EBA柱中没有明显的压力产生，所以使用没有大小限制的EBA是可 能的，而流速通常与填充床的柱子相关。因此，在本发明的一个优选实施方案中，吸附过程 不涉及填充床。
[0064]EBA过程的特征可能在于柱内非常有限的液体回混，与非常熟知的涡旋液化床相 反。床的回混通常以轴向扩散（'容器扩散数"）来测量，参见Levenspiel的"化学反应工 程（ChemicalReactionEngineering) "，第二版，JohnWiley&Sons(1972) 〇
[0065] 以至少3cm/min，诸如至少5cm/min，例如至少8cm/min，诸如至少10cm/min，例 如20cm/min的线性流速通过将大豆蛋白的水性提取物应用到吸附剂柱子上可有效地进行 纯化。典型地，选择所述的流速在5-50cm/min的范围内，诸如5-15cm/min的范围，例如 l〇-30cm/min范围，诸如 25-50cm/min的范围。
[0066] 大豆蛋白溶液/提取物的温度优选在1°C-90°C的范围内，诸如在5°C-18°C的范 围内，诸如在7°C-15°C的范围内，诸如在19°C-80°C的范围内，诸如在19°C-70°C的范围 内，诸如在25°C-65°C的范围内，诸如在45°C-60°C的范围内。
[0067] 当将大豆蛋白水性提取物或