分离大豆蛋白及其生产方法

专利名称：分离大豆蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种从含有大豆蛋白的溶液中生产富含7S球蛋白级分和富含11S球蛋白级分的方法，以及由该方法制得的大豆蛋白。
背景技术：
大豆贮藏蛋白在大约pH4.5时发生沉淀，且可以相对容易的与非蛋白组分分离。这种沉淀蛋白是指大豆分离出的蛋白质，这种形式的大豆蛋白通常应用在食品工业中。根据超速离心分析法的沉降常数，大豆贮藏蛋白进一步的分为2S、7S、11S和15S球蛋白。其中，7S球蛋白和11S球蛋白是球蛋白级分的主要成分(注7S球蛋白和11S球蛋白是根据沉降方法标定的名称，实质上，分别对应于免疫学命名系统的β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)，并且它们具有不同的性质，例如粘度、凝结力、表面活性等。因此，把大豆蛋白分离成富含7S球蛋白的级分和富含11S球蛋白的级分，就能够开始应用两种蛋白质的性质，借此可扩大蛋白质的工业应用。
7S球蛋白和11S球蛋白由几个亚基构成。7S球蛋白由3个亚基，即α、α’和β亚基组成。11S球蛋白由一对酸性多肽(A)和碱性多肽(B)组成，它们都有几个亚基。在常规的大豆蛋白中的这些亚基的组成比例为7S球蛋白比11S球蛋白的比例约1∶2，其由通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的迁移谱带的光密度面积比所确定。7S球蛋白和11S球蛋白的分子量和电荷状态性质相似。特别是两种蛋白不同在于其亚基的组成不同，从而在一定程度上它们的性质相互重叠。因此，相互混杂很少的有效分离这些球蛋白是非常不容易的。
已知的分离方法如下所述。也就是说，这些方法包括利用等电离点不同的分离方法在11S球蛋白的等电离点附近时只有7S球蛋白被提取(JP55-124457A)；利用与钙盐反应能力不同的分离方法通过在提纯中加入小量的钙来提取富含7S球蛋白的级分(JP-A-48-56843A)；利用在特定的pH值和离子强度下的溶解度不同的分离方法通过在pH约为1.2-4.0时氯化钠或氯化钾存在的条件下除去不溶的级分来制备7S球蛋白(JP49-31843A)，通过调节经过等电离点沉淀之后的浆液的pH值到5.0-5.6，同时调节氯化钠的浓度到0.01-0.2M来分离7S球蛋白和11S球蛋白(JP58-36345A)，通过调节含有蛋白质的溶液的离子强度到0.2-0.3和pH值到4.8-5.2来去除不溶解级分，然后调节离子强度到小于0.2和pH到4.6-5.0来分离7S球蛋白(JP5-43597A)；和利用冷沉淀现象和还原剂等的方法这利用了在低温下11S球蛋白的溶解度降低现象(意指冷沉淀现象)，在水体系pH为6.5或更高在亚硫酸化合物、谷胱甘肽化合物或半胱氨酸存在的条件下处理大豆蛋白原料，接着调节pH到5.5-7.0和温度为22℃或更低来分离成溶解的富含7S球蛋白的级分和不溶解的富含11S球蛋白的级分(JP61-187755A)。
这些已知的分离方法巧妙地利用了由于pH、离子强度、特定盐的存在、温度等造成的7S球蛋白和11S球蛋白的溶解度不同。但是，这些已知的方法不适作工业规模的分离方法的问题在于，例如，完全分离需要高离心力。因此，实践中仍有问题。例如，在JP61-187755的方法中，冷沉淀现象很大程度上取决于温度，并且将反应混合物降温至约5℃，这导致的实际问题在于要利用工业用的低离心力就要把大量的亚硫酸化合物等加到分离层中，同时还导致分离精确性的问题，也就是少量的11S球蛋白掺杂在可溶的级分中。
为了获得富含7S球蛋白的蛋白质，研究了从缺损11S球蛋白的大豆中分离蛋白，例如通过育种制备富含7S球蛋白的种子(BreedingScience，46，11，1996)，还可以发现它的使用(Breeding Science，50，101，2000)和专利(US6,171,640B1)。
如上所述，已经研究和开发了用于分离富含7S球蛋白的级分和11S球蛋白的级分的方法，通过该方法可溶解级分与不溶解级分之间的相互混杂降低，通过该方法可以便利地实现工业规模的生产。
另一方面，Samoto等人报道了在源于大豆的蛋白中，有一种与作为细胞质薄膜和蛋白体或油体薄膜(油体结合蛋白)组分的极性脂类具有高亲和力的蛋白质成分，其量高达工业生产大豆蛋白分离物的大约35％(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。油体结合蛋白是主要由膜蛋白构成的蛋白质组分的通用术语，特别是那些由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量主要地为34kDa、24kDa和18kDa，并且含有大约10-12％重量的极性脂类的，其可用氯仿乙醇以2∶1混合的极性溶剂混合物提取。
常规的分离方法只关注7S和11S球蛋白，而在一般情况下没有注意到污染各个级分的油体结合蛋白，因为当使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析时，油体结合蛋白不能像7S和11S球蛋白那样确实地被确定而常常被忽视。换句话说，只用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定纯度通常要比实际纯度高。为了获得真正高纯度的7S或11S球蛋白，应该考虑到油体结合蛋白的作用。因此，常规的分离成7S球蛋白/11S球蛋白两个级分的分离方法，仅作为7S球蛋白和11S球蛋白之间的比例来处理级分的纯度。然而，各级分与油体结合蛋白都相关，并且在许多情况下，实际的情况是纯度稍低的相对粗制的级分，其蛋白组成的特点在于含有大量的油体结合蛋白。
而本发明的发明人提供了一种只需通过酸性条件下热处理实现工业规模的7S球蛋白和11S球蛋白的分离的方法(WO02/28198A1)，作为深入研究的结果，已发现通过结合调节离子强度与在酸性条件下含有大豆蛋白溶液的热处理，可以降低分离含有7S球蛋白的可溶解级分和含有11S球蛋白的不溶解级分的pH，从而进一步促进可溶解级分与不溶解级分的分离。
本发明提供了一种分离7S球蛋白和11S球蛋白的新的分离方法，特别是，本发明的目的之一是一种高度精确有效的分离方法，其可以以工业规模实现。本发明的另一目的是提供具有较少油体结合蛋白污染和高纯度的7S球蛋白和11S球蛋白的特点的蛋白分级。
专利文献1JP55-124457A专利文献2JP48-56843A专利文献3JP49-31843A专利文献4JP58-36345A专利文献5JP5-43597A专利文献6JP61-187755A专利文献7US6,171,640B1专利文献8WO02/28198A1非专利文献1K.Yagasaki等，Breeding Science，46，11，1996非专利文献2K.Yagasaki等，Breeding Science，50，101，2000非专利文献3M.Samoto等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940，1998发明详述本发明涉及(1)生产大豆蛋白的方法，其包括在酸性条件下热处理含有大豆蛋白的溶液，然后在离子强度为0.02或更高和pH为4.5或更高但低于5.6的条件下将其分为可溶解级分和不可溶级分；(2)根据(1)的方法，其中含有大豆蛋白的溶液是脱脂大豆蛋白的水浆液、从该浆液获得的脱脂大豆豆浆、酸沉大豆蛋白的浆液或大豆蛋白分离物的溶液；(3)根据(1)的方法，其中酸性条件为pH3.8-6.8；(4)根据(1)的方法，其中热处理在30-75℃进行；(5)根据(1)的方法，其进一步包括从通过方法(1)中的分离获得的可溶解级分中分离出7S球蛋白，其中所述7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值为0.5或更高，并且所述7S球蛋白的固体内容物中用氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的极性脂类的含量为1％重量或更低；(6)通过方法(5)获得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固体内容物中肌醇六磷酸的含量为1.2％重量或更低；(7)根据方法(1)的方法，其还包括从通过方法(1)中的分离获得的不溶解级分中分离出11S球蛋白，其中所述11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值为0.7或更高，并且所述11S球蛋白的固体内容物中用氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)在所述的11S球蛋白成分中提取的极性脂类的含量为2％重量或更低；(8)通过方法(7)获得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固体内容物中肌醇六磷酸的含量为1.2％重量或更低；实施本发明的最佳方式与仅通过在酸性条件的热处理实现7S球蛋白和11S球蛋白的工业化分离的方法(WO02/28198A1)相比，本发明方法的特点在于用于分离开含有7S球蛋白的可溶解级分和含有11S球蛋白的不溶解级分的pH可以通过结合调节离子强度与在酸性条件下含有大豆蛋白溶液的热处理降低，从而进一步促进可溶解级分与不溶解级分的分离。上述的酸性条件优选在pH3.8-6.8，热处理温度优选为30-75℃，离子强度优选为0.02或更高，并且可溶解级分和不可溶级分的分离优选在pH为4.5或更高但低于5.6的条件下进行。由此可以获得含有更少油体结合蛋白的富含7S球蛋白的可溶解级分。能够通过在大约中性的pH(pH6.5-7.5)的水溶液中的上述的不溶解级分上施加弱的剪应力来选择性的溶解和分离11S球蛋白并保持油体结合蛋白不溶，从而溶解或提取不溶解级分中的11S球蛋白来获得含有更少油体结合蛋白的富含11S球蛋白的不溶解级分。
另外，在本发明中，具有肌醇六磷酸占蛋白质为1.2％或更低的低含量的肌醇六磷酸的蛋白质级分可以通过在生产过程中用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸来获得。分离效率可以通过在可溶解级分和不溶解级分分离之前的实施肌醇六磷酸酶处理得到进一步提高。
通过上述生产方法获得的可溶解级分具有的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值为0.5或更高，上述比值为0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高纯化的7S球蛋白就可以容易地通过适当地选择分离可溶解级分和不溶解级分的pH来获得。另一级分，例如，不溶解的级分，具有的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值为0.7或更高，并且上述比值为0.8或更高、0.85或更高，或0.9或更高的高纯化的7S球蛋白就可以容易地通过适当地选择分离可溶解级分和不溶解级分的pH来获得。
其中，7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)或11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值可以从通过依据光密度分析法用SDS-聚丙烯酰胺电泳测量迁移谱带所获得的相对应的级分的面积比来确定。
在酸沉的蛋白质中的油体结合蛋白的比例为大约30-35％，当蛋白质正是用硫酸钠从酸沉的蛋白质获得的时候，其几乎没有变性(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998))。考虑到用氯仿和甲醇的比为2∶1(体积比)的混合溶剂提取的极性脂类在酸沉蛋白的成分中的固体含量为3-4％重量和在油体结合蛋白中的含量为10-12％重量，上述的极性脂类(在下文中有时简写为氯仿-甲醇可提的油份)不均衡地分布在酸沉蛋白的油体结合蛋白中，并且油体结合蛋白的量可计为氯仿-甲醇可提的油份重量的10倍。然而，这种计算适用于通过己烷等脱脂制备的主要物质，至于没有经过己烷提取的主要物质，该计算首先适用于经过己烷脱脂的。
本发明中获得的富含7S球蛋白的可溶解级分含有1％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油体结合蛋白的含量估计为10％或更低。从不溶解级分提取的富含7S球蛋白的级分含有2％或更低的氯仿-甲醇可提的油份，而油体结合蛋白的含量估计为20％或更低。
本发明所使用的分析方法如下所述。
*粗蛋白质通过Kjaldahl方法确定氮含量，并把它乘以系数6.25转换为粗蛋白质的含量。
*不溶解级分的分离沉淀速率使用由L.U.M.Co.制造的分离特性分析仪LUMiFuge114。含有不溶解级分的样品溶液(0.5ml)被放入聚苯乙烯方形空格中，该空格在100G离心分离，并且透光度为20％的界面移动的速率定义为分离沉淀速率。
*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳根据Laemmli的方法(Nature，227，680(1970))，使用凝胶浓度为10％-20％的梯度凝胶分析蛋白质。所测试的蛋白质的固体含量为6μg，，并且该凝胶用Coomassie BrilliantBlue R-250染色。
*肌醇六磷酸肌醇六磷酸的量根据Alii Mohamed方法化验(Cereal Chemistry 63，475-478(1986))。
*氯仿-甲醇可提的油份干燥的样品中加入大约50倍体积的氯仿和甲醇的混合溶液(体积比，2∶1)，回流溶剂提取的固体成分的重量比确定为氯仿-甲醇可提的油份。
*纯度(SPE标准)用光密度计测量通过上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的迁移谱带。所期望的组分相对于该谱带总面积的面积比值定义为纯度(SPE标准)。7S球蛋白的含量是指α、α’和β亚基的总含量，而11S球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和碱性多肽(B)的总含量。
*校正纯度考虑到其中掺杂的油体结合蛋白，从上面获得的纯度(SPE标准)计算校正纯度。也就是，由于样品中除了含有7S球蛋白和11S球蛋白外，还含有对应于氯仿-甲醇可提的油份10倍重量的油体结合蛋白，假设A(％)代表纯度(SPE标准)，计算对应于包括7S球蛋白、11S球蛋白和油体结合蛋白的总蛋白的校正纯度校正纯度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100*离子强度用电导计(2％/℃，具有温度转换功能)计量溶液的导电率，对应于所测的导电率的NaCl的摩尔浓度定义为离子强度。
本发明优选的实施例如下所述。
任何市售或通过育种或基因工程生产的缺损特定级分蛋白的大豆都可以用作本发明的原料大豆。而含有大豆蛋白的溶液可为任何脱脂大豆的水相浆液(以下称为脱脂大豆浆液)、从该浆液获得的脱脂豆浆、大豆蛋白的酸沉浆液(以下称为凝乳)或大豆蛋白分离物的溶液。特别优选脱脂大豆的水相浆液，由于其可溶解级分和不溶级分易于分离。为了分离成富含7S球蛋白级分和富含11S球蛋白的级分，优选非变性或几乎没有变性的大豆蛋白的溶液。
酸性条件下含有大豆蛋白溶液的热处理进行在pH3.8-6.8，更优选pH4.0-6.6，进一步优选pH4.2-6.2，其温度为30-75℃，更优选35-65℃，进一步优选40-60℃。0.02或更高的离子强度促进可溶解级分和不溶解级分的分离。然而，由于为了在分离之后从可溶解级分等电沉淀7S球蛋白，离子强度应调节到小于0.2，而分离时所用的离子强度为0.2或更高，因此为了避免复杂的分离过程0.02或更高但小于0.2的离子强度被建议使用。当在pH4.5或更高但小于5.6的条件下从不溶解级分分离出可溶解级分时，可以获得富含7S球蛋白的可溶解级分和富含11S球蛋白的不溶解级分。可以通过在生产过程中用肌醇六磷酸酶分解包含在大豆蛋白中的肌醇六磷酸进一步促进富含7S球蛋白的级分和富含11S球蛋白的级分的分离，特别是在可溶解级分和不溶解级分分离之前的任何步骤中。肌醇六磷酸酶处理可以被简化和推动，当该过程与酸性条件下的热处理同时进行时。肌醇六磷酸酶处理最优化的条件通常是在pH3.5-9.0，20-70℃的温度下5分钟-3小时，每克蛋白质大约0.1-100个单位的肌醇六磷酸酶，尽管该条件会根据肌醇六磷酸酶的来源有些变化。1个单位的肌醇六磷酸酶的活性用从作为底物的肌醇六磷酸在pH5.5和37℃下的酶促反应的起始状态一分钟内释放出1μmol磷酸所需的酶的量来定义。
不同于上述热处理的pH和温度，热处理时间长短对分离方法中的所经历的困难没有明显的影响，因此不够重要。热处理过程中pH超出3.8-6.8的范围，或温度超出30℃-75℃的范围会导致7S球蛋白和11S球蛋白分离困难。
热处理之后，可在同样的温度下进行分离，尽管优选确保低温以控制微生物。可以使用已知的分离操作(例如过滤和离心)来完成分离，特别是用连续离心机(例如倾析器)也可以完成简单的分离。当然不排除使用非连续离心机例如间歇式离心机。
本发明的分离为富含7S球蛋白的可溶解级分和富含11S球蛋白的不溶解级分的精确性可以依据通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳获得的谱带(纯度基于SPE标准)进行评价。
然而，因为基于SPE标准的纯度由于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中油体结合蛋白的低可染性会被低估，通过上述等式校正纯度(％)＝(100(％)-氯仿-甲醇可提的油份含量(％)×10)×A(％)/100获得的校正纯度被认为更接近真实的纯度。
分离之后，可溶解级分就可用作富含7S球蛋白的级分或者再经过浓缩、中和、灭菌或干燥。可以通过例如调节pH4.0-5.0调节其离子强度小于0.2来分离并收集所得的不溶解级分。通常，用水进一步稀释可溶解级分，中和，热灭菌并干燥。可以采用已知的如HTST、UHT处理方法进行热灭菌。当然，根据特定的目的，该级分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶进行处理。
为了从不溶解的油体结合蛋白[包括“okara(源自豆浆或豆腐生产中的不溶残渣)”组分，当不溶解级分含有它时]中分离出11S球蛋白，在分离之后可以使用适当地中性水溶液(pH6.5-7.5)从不溶解级分溶解或提取11S球蛋白。此时，为了在防止油体结合蛋白的溶解的同时选择性的溶解或提取11S球蛋白，优选使用尽可能弱的剪应力来溶解或提取11S球蛋白。优选离心力在大约4,000G或更高的高G离心分离机，更优选大约5,000G或更高的高G离心分离机顺利地用于从油体结合蛋白分离提纯或溶解11S球蛋白，从而可以在保持11S球蛋白相对于11S球蛋白和7S球蛋白总量的比例为0.7或更高的同时，可以获得固体成分中氯仿-甲醇可提油分的含量为2％或更低的蛋白质。
被适当地中性水溶液溶解或提取并且含有2％或更低的氯仿-甲醇可提的油份成分的富含11S球蛋白的级分就可被用作富含11S球蛋白的级分或经过浓缩、中和、灭菌或干燥。例如可以通过调节可溶解级分的pH为4.5或更高但低于5.6来分离并收集所得的不溶解级分来进行浓缩。该不溶解级分通常用水进一步稀释、中和和热灭菌之后的干燥。可以采用已知的如HTST、UHT处理方法进行热灭菌。当然，根据特定的目的，不溶解级分可以用例如溶液形式的蛋白酶的酶进行处理。
下面的实施例将进一步说明本发明，但不是用于限制本发明的技术范围。
实施例1通过压榨大豆并用萃取剂，正己烷，提取其中的油来分离并除去油获得的几乎没有变性的脱脂大豆(1重量份，氮溶解指数(NSI)91)加入抽提水(10重量份，离子交换水)。在22℃用均质混匀机搅拌混合物。通过加入20％的氢氧化钠保持pH7.5提取40分钟。然后，抽取物用滤布过滤，接着5,000G离心10分钟除去不溶解级分，从而获得脱脂豆浆。用35％的盐酸调节该豆浆的pH到4.5，接着4,000G离心10分钟来获得酸沉蛋白质。离子交换水加到酸沉蛋白质中使得蛋白质成分的干重为5％，接着该溶液用Polytron(由KINEMATICA AG制造)均化(以下称为凝乳)。该凝乳的离子强度用氯化钠调至0.14，并在22℃搅拌30分钟，接着用20％的氢氧化钠水溶液调节该凝乳的pH到5.3，随后在22℃搅拌20分钟。然后加热该凝乳至50℃，并在50℃搅拌10分钟之后，立刻冷却该凝乳至22℃。从加热开始到冷却至22℃所需的时间为25分钟。在进一步在22℃搅拌15分钟之后，用LUMiFuge114测定不溶解级分的分离沉淀速率。同时，把通过5,000G离心分离5分钟获得的溶解级分和不溶解级分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行化验，确定7S球蛋白和11S球蛋白的比率(通过用光密度计测量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的谱带获得的各级分的面积比)。
不溶解级分的分离沉淀速率如表1所示，可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
对比实施例1按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳的离子强度用氯化钠调节至0.14。在22℃搅拌30分钟该凝乳，用20％的氢氧化钠水溶液调节pH到5.3，然后在22℃搅拌60分钟。按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率，接着把通过5,000G离心分离5分钟获得的溶解级分和不溶解级分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行化验来确定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
不溶解级分的分离沉淀速率如表1所示，可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表2所示。
表1不溶解级分的分离沉淀速率

表27S球蛋白和11S球蛋白的比率

从实施例1和对比实施例1的结果可知，含有高纯度7S球蛋白的可溶解级分和含有高纯度11S球蛋白的不溶解级分的分离可以通过酸性条件下加热该凝乳得到进一步的促进。
实施例2按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳的离子强度用氯化钠调节至0.14。不用调节pH(pH大约4.5)，在22℃搅拌30分钟，加热至50℃，接着立刻冷却至22℃。从加热开始到冷却至22℃所需的时间为15分钟。冷却后，用20％的氢氧化钠水溶液调节该凝乳的pH到5.5，接着搅拌15分钟。按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率，并确定可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解级分的分离沉淀速率如表4所示。
对比实施例2按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳经过与实施例2(pH未调节；该凝乳在22℃搅拌30分钟，加热至50℃，接着立刻冷却至22℃。)相同的热处理，没有调节离子强度(离子强度0.013)。然后，凝乳的pH用20％的氢氧化钠水溶液调节至5.9(不能获得具有相似7S球蛋白和11S球蛋白的比率的级分，除非当离子强度低时提高用于分离可溶解级分和不溶解级分的pH)。搅拌15分钟之后，按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率，并测量可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表3所示，不溶解级分的分离沉淀速率如表4所示。
表37S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S11S)

表4不溶解级分的分离沉淀速率

从实施例2和对比实施例2的结果可知，从含有11S球蛋白的不溶解级分分离出含有7S球蛋白的可溶解级分可以通过提高离子强度和降低分离pH得到进一步的促进。
从以上实施例和对比实施例的结果可知，与仅仅在酸性条件下的热处理或仅仅调节离子强度相比，含有7S球蛋白的可溶解级分和含有11S球蛋白的不溶解级分的分离可以通过酸性条件下含有大豆蛋白溶液的热处理与调节离子的结合得到进一步的促进。
实施例3按照与实施例1相同方法脱脂的几乎没有变性的脱脂大豆1个重量份加入抽提水(离子交换水，10个重量份，22℃)(以下称为脱脂大豆浆液)。离子强度用氯化钠提调节至0.17，并且没有调节pH在22℃搅拌器搅拌凝乳30分钟。然后，pH用35％的盐酸调节至5.3，并将该粗制的凝乳加热至50℃，搅拌器搅拌10分钟，接着立即冷却至22℃。加热至50℃所需时间为10分钟，而冷却至22℃所需时间为5分钟。冷却后，用35％的盐酸调节该粗制的凝乳的pH至4.8，在22℃额外搅拌10分钟，按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率。进一步的，至于通过5,000G离心5分钟所得的可溶解级分，按照与实施例1相同方法确定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。另一方面，水(7倍于脱脂大豆重量)加到不溶解级分中，并且在22℃通过均质机搅拌30分钟提取蛋白质，同时其pH通过加入20％氢氧化钠水溶液保持在7.2，并且通过5,000G离心5分钟所得的可溶解级分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳化验来确定7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
对比实施例3按照与实施例3相同方法制备的脱脂大豆浆液的离子强度用氯化钠调节至0.17，并且在22℃搅拌浆液30分钟。然后，脱脂大豆浆液的pH用35％的盐酸调节至5.3，接着在22℃搅拌25分钟。然后，该浆液的pH用20％的氢氧化钠溶液调节至4.8，并在22℃搅拌10分钟，测量不溶解级分的分离沉淀速率，并按照与实施例1相同方法测量可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表5所示，不溶解级分的分离沉淀速率如表6所示。
表57S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)

表6不溶解级分的分离沉淀速率

从实施例3和对比实施例3的结果可知，当使用脱脂大豆浆液时可溶解级分和不溶解级分的分离也可以通过调节酸性条件下的热处理温度和离子强度得到促进。
实施例4按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳的离子强度用氯化钠调节至0.17。在按照与实施例1相同方法加热该凝乳之后。(不用调节pH用搅拌器在22℃搅拌30分钟，pH调节至5.3，并将该凝乳搅拌器搅拌加热至50℃，接着立刻冷却至22℃)。然后，用20％的氢氧化钠水溶液调节pH到5.4(用于分离凝乳的pH应比此值高，因为为了获得具有同样7S球蛋白和11S球蛋白比率的级分从脱脂大豆豆浆和凝乳中分离脱脂大豆豆浆，此时脱脂大豆豆浆的离子强度与凝乳的相同)，接着在22℃额外搅拌10分钟。按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率。
可溶解级分和不溶解级分中7S球蛋白和11S球蛋白的比率如表7所示，不溶解级分的分离沉淀速率如表8所示。
表77S球蛋白和11S球蛋白的比率(7S∶11S)

表8不溶解级分的分离沉淀速率

从实施例3和实施例4的结果可知，如果在含有大豆蛋白的溶液中使用脱脂的大豆浆液，使用较高的不溶解级分的分离沉淀速率更促进分离。
实施例5按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳的离子强度用氯化钠调节至0.14，pH未调节(pH大约4.5)在22℃搅拌该浆液30分钟，接着加热至50℃。升温至50℃所需的时间为10分钟。温度升到50℃之后，浆液的pH用20％的氢氧化钠水溶液调节至5.3，并额外加热该浆液20分钟，接着冷却至22℃。冷却所需的时间为5分钟。冷却后，5,000G离心分离该浆液10分钟来获得可溶解级分和不溶解级分。
所得可溶解的级分用35％的盐酸调节至pH4.5，3,000G离心10分钟来获得沉淀级分。然后，该沉淀级分加入水，用20％的氢氧化钠水溶液中和该混合物，并且冻干来获得富含7S球蛋白级分。
另一方面，5倍重量的离子交换水加到由5,000G离心10分钟来获得的不溶解级分，用搅拌器在22℃搅拌30分钟萃取该混合物，同时该混合物的pH用20％氢氧化钠水溶液保持在6.8。然后，该混合物在5,000G离心10分钟，并且所得的上层溶液的pH用35％的盐酸调节至4.5，接着在3,000G离心10分钟来获得沉淀级分。然后，该沉淀级分加入水，并且该混合物用20％氢氧化钠水溶液中和，且冻干来获得富含11S球蛋白级分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定各级分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白级分中7S球蛋白的纯度(SPE标准)和富含11S球蛋白级分中11S球蛋白的纯度(SPE标准)、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正纯度、11S球蛋白的校正纯度和各级分中肌醇六磷酸的含量如表9所示。表10显示了按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率。
表9各级分的组成(单位％)

表10不溶解级分的分离沉淀速率

从以上结果可知，含有微量的氯仿-甲醇级分，或含有微量的油体结合蛋白的高纯化的7S和11S球蛋白级分可以通过本发明的方法获得。
从实施例1的结果其中样品溶液立即冷却未经热处理之后的保持温度和从实施例5的结果其中热处理之后保持温度20分钟，证明热处理后保持温度可以提高分离沉淀速率。
实施例6按照与实施例1相同方法制备的5％的凝乳的离子强度用氯化钠调节至0.14，pH未调节(pH大约4.5)在22℃搅拌该浆液30分钟，接着加热至50℃。加热所需的时间为10分钟。当温度升到50℃时，浆液的pH用20％的氢氧化钠水溶液调节至5.3。然后，肌醇六磷酸酶(Sumizyme PHY，Shin Nihon Chemical Co.Ltd.生产)基于脱脂大豆的重量计以0.2％重量比加入，并且该浆液用搅拌器额外搅拌20分钟。然后，该浆液冷却至22℃。冷却所需的时间为5分钟。冷却之后，该浆液在5,000G离心10分钟来获得可溶解级分和不溶解级分。所得的可溶解级分用35％的盐酸调节至pH4.5，3,000G离心10分钟来获得沉淀级分。然后，该沉淀级分加入水，用20％的氢氧化钠水溶液中和该混合物，并且冻干来获得富含7S球蛋白级分。
另一方面，5倍重量的离子交换水加到经5,000G离心10分钟之后获得的不溶解级分，用搅拌器在22℃搅拌该混合物，并被萃取30分钟，同时该混合物的pH用20％氢氧化钠水溶液保持在6.8。然后，该混合物在5,000G离心10分钟，所得的上层溶液的pH用35％的盐酸调节至4.5，接着在3,000G离心10分钟来获得沉淀级分。然后，该沉淀级分加入水，并且该混合物用20％氢氧化钠水溶液中和，且冻干来获得富含11S球蛋白级分。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定各级分中7S∶11S的比率、富含7S球蛋白级分中7S球蛋白的纯度(SPE标准)和富含11S球蛋白级分中11S球蛋白的纯度(SPE标准)、氯仿-甲醇可提的油份的量、7S球蛋白的校正纯度、11S球蛋白的校正纯度和各级分中肌醇六磷酸的含量如表11所示。表12显示了按照与实施例1相同方法测量不溶解级分的分离沉淀速率。
表11各级分的组成(单位％)

表12不溶解级分的分离沉淀速率

从实施例5和实施例6的结果可知，用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸的伴随使用促进了可溶解级分和不溶解级分的分离，从而可能获得富含7S球蛋白的级分和富含11S球蛋白的级分，其都含有更少的肌醇六磷酸。
工业实用性如上所述，依据本发明，富含7S球蛋白的可溶级分和富含11S球蛋白的不溶级分可以简单容易地通过结合调节含有大豆蛋白的溶液的离子强度和酸性条件下的热处理实现工业化规模的分离。
权利要求
1.一种生产大豆蛋白的方法，其包括在酸性条件下加热含有大豆蛋白的溶液，然后在离子强度为0.02或更高并且pH为4.5或更高但低于5.6的条件下将其分成可溶解级分和不溶解级分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中含有大豆蛋白的溶液为脱脂大豆的水浆液、从该浆液获得的脱脂大豆豆浆、酸沉大豆蛋白浆液或大豆蛋白分离物的溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中的酸性条件为pH3.8-6.8。
4.根据权利要求1所述的方法，其中的加热在30-75℃进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其还包括从由权利要求1的分离获得的可溶解级分中分离出7S球蛋白，其中所述的7S球蛋白的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值为0.5或更高，并且所述7S球蛋白的固体内容物中用氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的极性脂类的含量为1重量％或更低。
6.根据权利要求5所述的方法获得的7S球蛋白，其中7S球蛋白的固体内容物中肌醇六磷酸的含量为1.2重量％或更低。
7.根据权利要求1所述的方法，其还包括从由权利要求1的分离获得的不溶解级分中分离出11S球蛋白，其中所述的11S球蛋白的11S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)比值为0.7或更高，并且所述11S球蛋白的固体内容物中用氯仿和甲醇的混合溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)提取的极性脂类的含量为2重量％或更低。
8.根据权利要求7所述的方法获得的11S球蛋白，其中11S球蛋白的固体内容物中肌醇六磷酸的含量为1.2重量％或更低。
全文摘要
本发明的目的在于开发一种分离7S球蛋白和11S球蛋白的新方法，特别是，可以以工业规模实施的高精确度和效率的分离方法。还意欲获得含有很少脂类结合蛋白，并且显示固有的高纯度7S球蛋白和11S球蛋白的特征的蛋白级分。一种用于生产大豆蛋白的方法，其特征在于包括在pH 3.8－6.8酸性条件下加热含有大豆蛋白的溶液到30－75℃，然后在离子强度为0.02或更高并且pH为4.5或更高但低于5.6的条件下将其分成可溶解级分和不溶解级分。
文档编号A23J1/14GK1738540SQ20038010867
公开日2006年2月22日 申请日期2003年10月23日 优先权日2002年11月12日
发明者石川正广, 广塚元彦 申请人:不二制油株式会社