通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶解大豆蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及通过酶解大豆蛋白制 备大豆肽的方法。
【背景技术】
[0002] 大豆肽是大豆蛋白质经微生物发酵法分离、酸法分解或酶法酶解，并经过精制而 得到的多肽混合物，以小分子肽(分子量> 150Da且< 2000Da)为主，还含有少量大分子肽 (分子量大于2000Da)、分子量小于150Da的寡肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分，相对 分子质量在5000Da以下。大豆肽的蛋白质含量为85wt%左右(通过凯氏定氮法测定N含量 计算得出），其氨基酸组成与大豆蛋白质相同，必需氨基酸的组成平衡良好且含量丰富。大 豆肽具有无豆腥味、不会发生蛋白变性、酸性条件下不发生沉淀、加热时不凝固、易溶于水、 流动性好等良好的加工性能，是优良的保健食品素材。
[0003] 目前，工业上一般采用酶解法制备大豆肽。但是，目前的酶解法所得到的酶解产物 由于疏水基团暴露会带有较强的苦涩味，而且所述酶解还会产生较多的游离氨基酸，使得 到的产物中肽含量相对较低。一般来讲，将游离氨基酸的含量控制在10wt%之内、优选在 5wt%之内是适当的；并且根据大豆肽粉中国国家标准（GB/T22492-2008)的规定，一级大豆 肽粉中必须含有不少于80wt%的相对分子量不高于2000Da的肽段。因此，需要开发出将大 豆肽中的肽段的相对分子量尽可能控制在150-2000Da之间的新的酶解技术。
[0004] 日本专利JP2006-324372中公开了一种经过两步酶解以及植酸酶处理来获得大 豆肽混合物的方法，所述方法包括如下步骤：从豆柏提取物中得到大豆分离蛋白液，先在碱 性至中性的条件下加入内肽酶酶解,灭酶后将溶液调节至酸性,再加入外肽酶和植酸酶先 后进行酶解、杀菌、喷雾干燥，最后得到大豆肽粉末。由该方法得到的终产物在冷藏状态下 的酸溶液中也不会形成渣滓。然而，该发明中并没有大豆肽的得率和感官评价的数据。并 且，该发明所述的方法总在使用外肽酶进行酶解前，需要对溶液的PH进行调整。因此，所述 方法在操作上更加复杂，不利于工业化使用。此外，由于该方法所得大豆肽混合物的平均分 子量优选200-5000Da，也反映出了该方法所得大豆肽中的各肽段大小差异较大，而无法实 现使产物主要集中于合适的分子量范围内（如150Da-2000Da)。
[0005] 中国专利申请CN102578367A中公开了一种利用挤压膨化预处理大豆片和超声辅 助酶解所得高温豆柏来生产大豆肽的方法。该发明优选的酶解高温豆柏制备的大豆肽酶解 度为36. 88%，大豆肽得率为34. 56% (S卩，该方法中的大豆肽得率偏低)。并且，该专利申请 文献中没有感官评价及分子量分布的数据。
【发明内容】
[0006] 本发明采用内肽酶(例如，作为内肽酶使用的碱性蛋白酶与中性蛋白酶)、外肽酶 (例如，作为外肽酶使用的风味蛋白酶)联合酶解的方法。相对于现有技术而言，本发明的方 法不仅在程序上更加简单(如，在使用外肽酶进行酶解前无需调节溶液的pH、无需植酸酶处 理的过程)，而且所制备得到的大豆肽苦涩味低，且得率较高。
[0007] 在本发明的方法中，首先将大豆分离蛋白加水配制成大豆分离蛋白液，并通过pH 调节剂对该蛋白液的pH值进行调节，使之适合于后续内肽酶发挥最佳酶活性。酶的加入顺 序采用先加入内肽酶、后加入外肽酶的方式，以避免外肽酶酶解时间过长而导致游离氨基 酸含量过高。酶解结束后，将PH调节到4. 0-5. 0,将酶灭活，促使未酶解的蛋白分子聚集沉 淀，使得大豆肽产品中分子量大于2000Da的肽段含量显著降低。
[0008] 可通过如下段落[1]至段落[21]中所述的内容对本发明的技术方案加以说明：
[0009] [1].-种通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的方法，所述方法包括如下步骤：
[0010] (1)将大豆分离蛋白加水配制成4wt%-12wt%、优选6wt%-10wt%的大豆分离蛋白 液，制备大豆分离蛋白液；
[0011] (2)向步骤（1)中制备的大豆分离蛋白液中滴加酸性调节剂或碱性调节剂，调节 pH至5. 0-9. 0,调节温度至30-60°C，然后，加入作为内肽酶使用的碱性蛋白酶和中性蛋白 酶，酶解l_3h，再加入作为外肽酶使用的风味蛋白酶，酶解l-3h;
[0012] (3)酶解结束后，滴加酸性调节剂或碱性调节剂调节酶解液的pH至4. 0-5. 0,将酶 灭活，1000g-5000g离心10-30min，取上清液，置于100-18(TC、优选130-160°C的温度下杀 菌处理30-120s、优选60-90s，之后喷雾干燥得到大豆肽。
[0013] [2].如段落[1]所述的方法，其中，所述步骤（1冲的水为自来水、去离子水、双蒸 水和/或超纯水，优选去离子水。
[0014] [3].如段落[1]或[2]所述的方法，其中，所述步骤（2)中的pH为7. 0-8. 0。
[0015] [4].如段落[1]-[3]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)中的温度为 45-55。。。
[0016] [5].如段落[1]-[4]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)和步骤（3)中的碱 性调节剂为NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液，优选NaOH溶液。
[0017] [6].如段落[1]_[5]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)和步骤（3)中的酸 性调节剂为磷酸溶液、盐酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液、乙酸溶液以及它们相对应的食品 领域中常用的酸性盐，优选磷酸溶液或盐酸溶液。
[0018] [7].如段落[1]_[6]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)中的碱性蛋白酶 为碱性丝氨酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶和碱性金属蛋白酶，优选Alkalineprotease、 Alcalase2. 4LFG0
[0019] [8].如段落[1]-[7]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2冲的中性蛋白酶为 霉菌中性蛋白酶和细菌中性蛋白酶，优选Alphalase、NeutraseO. 8L。
[0020] [9].如段落[1]_[8]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2冲的风味蛋白酶为 Foodpro51FP、Flavourzyme0
[0021] [10].如段落[1]-[9]中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重而 言，所述步骤（2)中的碱性蛋白酶的添加量为0. 5wt%-5wt%、优选0. 5wt%-2wt%。
[0022] [11].如段落[1]_[10]中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重 而言，所述步骤（2)中的中性蛋白酶的添加量为0. 5wt%-5wt%、优选0. 5wt%-2wt%。
[0023] [12].如段落[1]_[11]中任一段所述的方法，其中，相对于大豆分离蛋白的干重 而言，所述步骤（2)中的风味蛋白酶的添加量为0.lwt%_3wt%、优选0. 2wt%_lwt%。
[0024] [13].如段落[1]-[12]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)中的酶解在水浴 锅、恒温箱、烘箱或恒温加热器中进行。
[0025] [14].如段落[1]_[13]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（2)进一步包括在加 入碱性蛋白酶之前或之后，向大豆分离蛋白液中加入含有Ca2+的溶液。
[0026] [15].如段落[1]-[14]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤（3)中，通过加热、 超声、微波处理或加入蛋白酶抑制剂，优选通过加热将酶灭活。
[0027] [16].如段落[15]所述的方法，其中，所述加热在75_95°C、优选85°C的温度下进 行。
[0028] [17].如段落[15]或[16]所述的方法，其中，所述加热进行10_30min、优选 20min〇
[0029] [18].如段落[1]_[17]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤（3)中，将所述 离心得到的上清液置于喷射蒸煮器中，在100-180°C、优选130_160°C的温度下进行杀菌处 理。
[0030] [19].如段落[1]-[18]中任一段所述的方法，其中，所述步骤（3)中的喷雾干燥温 度为：进口温度150-200°C，出口温度50-KKTC。
[0031] [20].如段落[19]所述的方法，其中，所述进口温度为170-190°c。
[0032] [21].如段落[19]或[20]所述的方法，其中，所述出口温度为70_90°C。
[0033] 该方法所得大豆肽苦涩味低，大豆肽得率高，其中的游离氨基酸的含量以及分子 量小于150Da或分子量大于2000Da的肽段含量均较低，分子量介于150Da和2000Da之间 的肽段含量高。
【具体实施方式】
[0034] 本发明涉及一种通过酶解大豆蛋白制备大豆肽的生产方法。该方法所得的大豆 肽苦涩味低，大豆肽得率高，其中的游离氨基酸的含量及分子量小于150Da或分子量大于 2000Da的肽段含量均较低，分子量介于150Da和2000Da之间的肽段含量高。
[0035] 本发明所述的方法包括如下步骤：
[0036] (1)将大豆分离蛋白加水配制成4wt%_12wt%、优选6wt%_10wt%的大豆分离蛋白 液，制备大豆分离蛋白液；
[0037] (2)向步骤（1)中制备的大豆分离蛋白液中滴加酸性调节剂或碱性调节剂，调节 pH至5. 0-9. 0、优选7. 0-8. 0,调节温度至30-60°C、优选45-55°C，然后，加入作为内肽酶 使用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶，酶解I_3h，再加入作为外肽酶使用的风味蛋白酶，酶解 l-3h；
[0038] (3)酶解结束后，调节酶解液的pH至4.0-5.0，将酶灭活，100(^-500(^离心 10-30min，取上清液，置于100-180°C、优选130-160°C的温度下杀菌处理30-120S、优选 60-90s，之后喷雾干燥得到大豆肽。
[0039] 本发明中的术语"碱性调节剂"是指能够在溶液中提供OH-的任意碱或其相应的 碱性盐，例如NaOH溶液、KOH溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液等。
[0040]本发明中的术语"酸性调节剂"是指能够在溶液中提供H+的任意无机酸、有机酸或 它们相应的酸性盐，例如盐酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液、柠檬酸溶液、乙酸溶液以及与它们 相对应的食品领域中常用的酸性盐等。
[0041] 本发明中所提及的碱性蛋白酶是指在碱性pH环境下(如，pH> 7.0、优选pH为 7. 0~8. 0)作用于多肽链内部的肽键从而发挥内肽酶活性的一类蛋白酶，例如碱性丝氨 酸蛋白酶、碱性天冬氨酸蛋白酶和碱性金属蛋白酶，优选Alkalineprotease(丹尼斯克)、 Alcalase2.4LFG(诺维信）。
[0042] 本发明中所提及的中性蛋白酶是指在中性pH环境下(如，pH为6.0~7. 5、优选 7. 0)作用于多肽链内部的肽键从而发挥内肽酶活性的一类蛋白酶，包括霉菌中性蛋白酶和 细菌中性蛋白酶，优选Alphalase(丹尼斯克)、NeutraseO. 8L(诺维信)。
[0043] 本发明中所提及的风味蛋白酶是指作用于多肽链氨基端或羧基端的肽键从而催 化底物形成特定食品风味的一类复合蛋白酶，例如分离自果蔬中的风味蛋白酶、米曲霉发 酵所得风味蛋白酶，优选Foodpro51FP(丹尼斯克)、Flavourzyme(诺维信)。
[0044] 其中，所述步骤（1)中的水为自来水、去离子水、双蒸水和/或超纯水等，优选去离 子水。
[0045] 所述步骤（2)和步骤（3)中的碱性调节剂优选为NaOH溶液，酸性调节剂优选为磷 酸溶液或盐酸溶液。
[0046] 所述步骤（2)中的酶解在水浴锅、恒温箱、烘箱或恒温加热器等能够提供恒定温度 (如30_60°C)的装置