大豆蛋白组合物。
[0120] 除了以上所述，所述分离的胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白本身可以是被变性的 以提供变性的TI蛋白。适当地，可以通过在压力下加热到90°C-150°C的温度，诸如 100°C-130°C、诸如100°C-120°C，变性所述的TI蛋白。可替代地一或与热处理组合一可以 应用酶促蛋白水解来失活TI。
[0121] 在另外的步骤中，可以将所述变性的TI蛋白与（i)在此获得的第二种大豆蛋白组 合物和/或（ii)在此获得的变性的第二种大豆蛋白组合物组合以提供各种组合的大豆蛋 白广品。
[0122] 特别地，可以将所述变性的TI蛋白与在此获得的第二种大豆蛋白组合物（去除了 所述第一种类型的蛋白）组合以提供第一种组合的大豆蛋白产品。
[0123] 另外，在此获得的所述变性的TI蛋白可以与在此获得的所述变性的第二种大豆 蛋白组合物组合以提供第二种组合的大豆蛋白产品。
[0124] 此外，上述的第一种组合的大豆蛋白产品可以例如通过于50°C_100°C的温度加 热来变性，以形成第三种组合的大豆蛋白产品。
[0125] 因此可以通过本发明方法获得各种组合的目的大豆蛋白产品：
[0126] ?通过本发明方法获得的、第一种类型的大豆蛋白去除了的第二种大豆蛋白组合 物。优选地，由于第一种类型的大豆蛋白是TI蛋白，该第二种大豆蛋白组合物是去除了TI 蛋白的。
[0127] ?通过在此描述的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合物。
[0128] ?通过上述方法获得的第一种组合的大豆蛋白产品。
[0129] ?通过上述方法获得的第二种组合的大豆蛋白产品。
[0130] ?通过变性上述第二种组合的大豆蛋白产品获得的第三种组合的大豆蛋白产品。
[0131] 优选地，通过将所述的第二种组合大豆蛋白产品加热到50°C-100°C，诸如 50°C_90°C，诸如50°C_80°C，诸如55°C_80°C，诸如60°C_80°C，所述的第二种组合大豆蛋 白产品。可替代地一或与热处理组合一可以应用酶促蛋白水解来失活任何不需要的蛋白 质，诸如脂氧合酶、凝集素和过敏性抗原。
[0132] 本发明的具体实施方案
[0133] 具体实施方案1.分离大豆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
[0134] i.提供大豆蛋白的水性提取物或大豆蛋白溶液，所述大豆蛋白提取物或溶液包含 至少两种类型的大豆蛋白；
[0135] ii.使所述大豆蛋白水性提取物或溶液通过至少一个膨胀床吸附过程，其中所述 膨胀床吸附过程包括使所述大豆蛋白水性提取物或溶液与至少一种吸附树脂接触，所述吸 附树脂选择性地吸附至少第一类型的大豆蛋白以提供非结合蛋白组分和结合蛋白组分，所 述的吸附树脂包含：
[0136]至少一种配体（L1)，所述至少一种配体（L1)包含芳族或杂芳族环系统和一个或 多个酸性基团，或
[0137] 至少一种配体（L2)，所述至少一种配体（L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在 配体（L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被选自下列的一个或多个基团所取代的 胺：
[0138]a.芳基、苄基或杂芳基；
[0139]b.具有4-16碳原子的直链、支链或环状烷基，
[0140] 或它们的组合；
[0141] iii.通过洗脱非结合蛋白组分或者洗脱结合蛋白组分从所述吸附树脂分离所述 第一种类型的大豆蛋白，以及
[0142]iv.从所述吸附树脂分离第二种类型的大豆蛋白以提供所述第一种类型的大豆蛋 白被去除了的第二种大豆蛋白组合物。
[0143] 具体实施方案2.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中，当所述第一种类型 的大豆蛋白从所述的吸附树脂上被洗脱，所述第二种类型的大豆蛋白保持吸附在所述树脂 上。
[0144] 具体实施方案3.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中所述的第一种和第 二种类型的大豆蛋白在起始时都吸附在所述的吸附树脂上，然后所述第一种类型的大豆蛋 白从所述的吸附树脂洗脱。
[0145] 具体实施方案4.根据具体实施方案3的方法，其中通过提高洗脱剂的pH将所述 第一种类型的大豆蛋白从所述的吸附树脂洗脱。
[0146] 具体实施方案5.根据任一前述的具体实施方案的方法，进一步包含将所述的第 二种大豆蛋白组合物变性的步骤，以提供变性的第二种大豆蛋白组合物。
[0147] 具体实施方案6.根据具体实施方案5的方法，其中通过加热到50°C_100°C的温 度使所述第二种大豆蛋白组合物发生变性。
[0148] 具体实施方案7.根据任一前述的具体实施方案的方法，其中所述第一种类型的 蛋白是伴大豆球蛋白。
[0149] 具体实施方案8.根据具体实施方案2的方法，其中0-伴大豆球蛋白作为非结合 蛋白组分被洗脱。
[0150] 具体实施方案9.根据具体实施方案2的方法，其中0-伴大豆球蛋白作为结合蛋 白组分被洗脱。
[0151] 具体实施方案10.根据具体实施方案1-6的任一方法，其中所述第一种类型的蛋 白是胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白。
[0152] 具体实施方案11.根据具体实施方案10的方法，其中胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白 作为非结合蛋白组分被洗脱。
[0153] 具体实施方案12.根据具体实施方案10的方法，其中胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白 作为结合蛋白组分被洗脱。
[0154] 具体实施方案13.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述第一种类型的蛋 白包含胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白和伴大豆球蛋白。
[0155] 具体实施方案14.根据具体实施方案10-13的任一方法，进一步包含使分离的胰 蛋白酶抑制剂（TI)蛋白变性的步骤，以提供变性的TI蛋白，例如通过加热到50-150°C的温 度，优选地75-120°C?
[0156] 具体实施方案15.根据具体实施方案14的方法，进一步包含将所述变性的TI蛋 白与从具体实施方案5获得的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以提供第一种组合的大 ii蛋白广品。
[0157] 具体实施方案16.根据具体实施方案14的方法，进一步包含将所述的变性的TI 蛋白和从具体实施方案5获得的变性的第二种大豆蛋白组合物组合的步骤，以提供第二种 组合的大豆蛋白产品。
[0158] 具体实施方案17.根据具体实施方案15的方法，其中所述第一种组合的大豆蛋白 产品例如通过在50°C-KKTC的温度下加热进行变性，以形成第三种大豆蛋白产品。
[0159] 具体实施方案18.根据任一前述具体实施方案的方法，其中包含芳族或杂芳族环 系统和/或一个或多个酸性基团的配体（L1)具有至多2000道尔顿、诸如至多1000道尔顿、 诸如至多500道尔顿的分子量。
[0160] 具体实施方案19.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体（L1)包含芳 族环系统，优选苯基或萘基。
[0161] 具体实施方案20.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体（L1)包含杂 芳族环系统，其可以选自单环杂芳基（选自噻吩、呋喃、吡喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异 噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪基）；和双环杂芳基（选自吲哚、嘌呤、喹啉、苯并呋喃、苯并咪 唑、苯并噻唑和苯并噁唑基）。
[0162] 具体实施方案21.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体（L1)包含酸 性基团，其选自羧酸基（-COOH)、磺酸基（_S020H)、亚磺酸基（-S(O)OH)、次膦酸基（-PH(O) (0H))、膦酸单酯基（_P(0) (OH) (OR))和膦酸基（_P(0) (0H)2)，优选羧酸基（-C00H)。
[0163] 具体实施方案22.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述配体（L1)选自亚 甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸， 如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基-苯甲 酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯基-1-四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。
[0164] 具体实施方案23.根据任一前述具体实施方案的方法，其中一在所述配体（L1) 中一所述的一种或多种的芳香族或杂芳族环系统被所述的一个或多个酸性基团所取代。
[0165] 具体实施方案24.根据具体实施方案1-17中的任一方法，其中在配体（L2)中的 所述烷基胺或烷基芳基胺包括被选自下列的一个或多个基团所取代的胺：具有4-16个碳 原子的可以是直链、支链或环状的烷基，例如，丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛 基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或萘烷基；
[0166]具体实施方案25.根据具体实施方案24的方法，其中所述配体（L2)选自丁胺、己 胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1，3-二-氨基丙烷、1，3-二氨基丙烷、1，6-二 氨基己烧、1，6-二氨基己烧、1，8-氨基辛烧、1，9-二氨基壬烧、1，12-氨基十二烧、2-氨基节 胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2, 4-二-氨基-6-羟基嘧啶或苄胺。
[0167] 具体实施方案26.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述的吸附树脂包含 聚合物基质（polymericbasematrix)，其支撑配体（L1或L2)〇
[0168] 具体实施方案27.根据任一前述具体实施方案的方法，其中所述的聚合物基质是 天然或合成的有机聚合物，选自i)天然和合成多糖和其他基于碳水化合物的聚合物，包括 琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆胶、阿拉伯胶、胶盖提、黄蓍胶、卡拉亚树胶、刺槐豆胶、黄 原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、右旋糖酐、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、 羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物和能形 成聚合物的单体，包括丙烯酸系聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合 物、聚烯径，及它们的取代衍生物，以及包含一种以上所述聚合物的功能性共聚物和它们的 取代衍生物；以及iii)它们的混合物。
[0169] 具体实施方案28.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述的吸附树脂是 颗粒的形式。
[0170] 具体实施方案29.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述大豆蛋白水性 提取物是通过用PH6. 5-7. 5的水提取大豆或大豆产品而获得。
[0171] 具体实施方案30.根据任一上述的具体实施方案的方法，其中所述大豆蛋白水性 提取物是通过用大约PH9. 0的水提取大豆或大豆产品而获得。
[0172] 具体实施方案31.根据任一上述具体实施方案的方法，其中在步骤（ii)前对所述 大豆蛋白水性提取物进行pH调整，优选调整至pH2. 0-9. 0的范围内。
[0173] 具体实施方案32.根据具体实施方案31的方法，其中所述的调整了pH的大豆蛋 白提取物在步骤（ii)之前通过离心或过滤去除不溶性物质。
[0174] 具体实施方案33.通过具体实施方案1的方法获得的所述第一种类型的大豆蛋白 被去除了的第二种大豆蛋白组合物。
[0175] 具体实施方案34.通过具体实施方案5的方法获得的变性的第二种大豆蛋白组合 物。
[0176] 具体实施方案35.通过具体实施方案15的方法获得的第一种组合的大豆蛋白产 品。
[0177] 具体实施方案36.通过具体实施方案16的方法获得的第二种组合的大豆蛋白产 品。
[0178] 具体实施方案37.通过具体实施方案17的方法获得的第三种组合的大豆蛋白产 品。 实施例
[0179] 实施例1
[0180] 1A)琼脂糖珠的活化
[0181] 将珠子大小为20-350ym的各种高密度琼脂糖珠（UpfrontChromatographyA/S 制造，具有3-8%的琼脂糖浓度，含有10%的碳化钨作为高密度滤器）样品交联，并用表氯 环氧丙烷（Aldrich目录号：E105-5)进行活化。确定所得的环氧基团的浓度为20-100mmol/ L珠子。
[0182] 1B)偶联配体到活化的珠子
[0183] 使用下面的通用方法将配体偶联到实施例1A所述的活化的珠子上。
[0184] 1)在吸滤器上用200ml的去离子水洗涤50ml的环氧-活化的珠子，并排掉水分。 将排掉水分的吸附剂转移到250ml的塑料瓶中。
[0185] 2)将配体（2. 5g)溶解或悬浮于50ml去离子水中，并用2M的NaOH将pH调节到 10. 5-12. 5,获得完全溶解的配体溶液。
[0186] 3)将所述配体溶液与排掉水分的吸附剂在旋转混合器中室温下温育18小时。
[0187] 4)用5升的去离子水洗涤吸附剂。
[0188] 对于在水中溶解性差的配体，将配体溶解或悬浮于50%的乙醇中，并用2MNaOH 调节pH到10. 5-12. 5。在配体溶液与吸干的吸附剂温育后，用1升的50%的乙醇，然后用 4升去离子水洗涤吸附剂。
[0189] 用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。
[0190] 以下的化合物通过上述的通用方法偶联到表氯环氧丙烷活化的琼脂糖珠上：
[0191] 4-氨基苯甲酸、4-巯基苯甲酸、4-氨基水杨酸、丁胺、己胺、辛胺、苄胺、二氨基丙 烷、1. 6-二氨基己烷（4%和6 %琼脂糖）、二氨基辛烷、1，9-二氨基壬烷、二-氨基十二 烧、2-氨基节胺、特戊胺、二丁胺、戊胺、N,N-二甲基-二-氨基丙烷、2-氨基苯并咪挫、 2, 4-二-氨基-6-羟基嘧啶、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑。
[0192] 1C)偶联配体氯甲基苯甲酸到实施例1A所描述的活化的珠子上
[0193] 1)用800ml去离子水在吸滤器上洗涤200ml的环氧-活化的珠子并排干水分。将 排干水分的吸附剂转移到500ml的塑料烧瓶中。
[0194] 2)加入224ml的去离子水。用机械混合器混合所述的溶液。
[0195] 3)加入32. 5 %的氢氧化钠，使pH达到13. 5 (25ml起始）
[0196] 4)加入6. 7g氯甲基苯甲酸。
[0197] 5)每15分钟检查pH，加入32. 5 %NaOH保持pH在13.5。
[0198]6)每小时加入6.7g氯甲基苯甲酸。
[0199]7)混合8小时后，用5升的去离子水洗涤吸附剂。
[0200] 用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。
[0201] 1D)偶联配体2-乙基氨基-乙基氯化物（DEAE)到实施例1A描述的活化的珠子上
[0202] 1)用800ml去离子水在吸滤器上洗涤200ml的环氧-活化的珠子并排干水分。然 后用600ml的85%的N-甲基吡咯烷酮溶液洗涤。将排干水分的吸附剂转移到1000ml的塑 料烧瓶中。
[0203] 2)加入200ml85%N-甲基吡咯烷酮溶液。用机械混合器混合所述的溶液。
[0204] 3)在溶液中加入12g的DEAE。
[0205] 4)在溶液中加入50. 8gNaOH。
[0206] 5) 2小时后，用5升的去离子水洗涤吸附剂。
[0207] 用酸碱滴定偶联配体中特征性功能基团来确定配体的浓度。
[0208] 实施例2
[0209] 该实施例描述用于以下实施例的大豆提取物的制备。
[0210] 将干大豆（目录号：3002,UnifoodImportA/S，丹麦）磨制成大豆粉。
[0211] 使用两种提取方法：
[0212] 1.在接近中性pH下提取
[0213] 2.在pH9. 0 下提取
[0214] 在接近中性pH下提取
[0215] 将250g大豆粉与1250ml的去离子水混合。混合悬浮液1小时，然后用100ym的 尼龙滤