溶液加到吸附柱时，可优化柱子中存在的吸附剂颗粒 与原料悬液的比例以保持吸附柱的高性能，而获得高纯度的纯化的蛋白产物。在本发明 的一个优选实施方案中提供了柱子中的吸附剂相对于装载到柱子上的大豆蛋白水性提取 物的比例为至少1:3,诸如至少1:4,例如至少1:5,诸如至少1:6,例如至少1:8,诸如至少 1:10,例如至少1:12,诸如至少1:15,例如至少1:20,诸如至少1:25,例如至少1:30,诸如至 少1:30的体积/体积比。
[0068] 通过洗脱非结合的蛋白组分或洗脱结合的蛋白组分将第一种类型的大豆蛋白 (例如胰蛋白酶抑制剂（TI)蛋白或伴大豆球蛋白）从所述的吸附树脂上分离。
[0069] 所述的分离方法可以多种方式作用，现将进行说明。
[0070] 从所述的树脂分离第一种类型的大豆蛋白的步骤包括从所述的吸附树脂洗脱胰 蛋白酶抑制剂（TI)蛋白。典型地，所述第一种类型的大豆蛋白组分作为结合蛋白组分保持 吸附在树脂上，而第二种类型的大豆蛋白（非结合蛋白组分）在第一次洗脱（洗涤）步骤 中被洗脱。接着通过第二次洗脱将第一种类型的大豆蛋白（结合的蛋白组分）释放。这种 情况尤其适用配体L2的情形，因为TI蛋白质被配体L2特异性结合。
[0071] 或者，所述的第二种类型的大豆蛋白保持吸附于树脂上，而第一种类型的大豆蛋 白在第一次洗脱（洗涤）步骤中从所述的吸附树脂上洗脱。然后在一个或多个随后的洗脱 步骤中，第二种类型的大豆蛋白被释放，与第一种类型的大豆蛋白根本上分离。
[0072] -方面，实际上所有的大豆蛋白，包括第一种类型的大豆蛋白，起始时都吸附于所 述的吸附树脂，然后第一种类型的大豆蛋白质在第二个洗脱步骤（在第一个洗脱（洗涤） 步骤去除其它非结合物质之后）中从吸附树脂上洗脱下来，然后有或没有一部分的第一种 类型的大豆蛋白和剩余的第二种类型的大豆蛋白在第三或更多的随后的洗脱步骤中被洗 脱下来。
[0073] 为了获得纯化的第一种类型的大豆蛋白（例如胰蛋白酶抑制剂蛋白（TI))，可通 过现有技术中常规描述和已知的任何方法进行洗脱。可使用溶液进行吸附蛋白产品的洗 脱，所述的溶液通常选自由稀碱、稀酸、稀的缓冲液、稀盐溶液和水或他们的组合构成的组。 在优选实施方案中，用稀溶液进行洗脱和/或洗涤步骤，从而使在洗脱的产品中盐和其它 不需要的物质的含量降到最低。
[0074] 优选地，用于第一种类型的大豆蛋白组分（例如胰蛋白酶抑制剂蛋白（TI))和/ 或第二种类型的大豆蛋白产品的洗脱的稀溶液含有盐、缓冲液、酸或碱，其浓度低于200mM， 优选低于l〇〇mM，优选低于50mM，优选低于30mM，甚至更优选20mM。可以直接测定含有待分 离的蛋白的洗脱物级份来确定盐、缓冲液、酸或碱的浓度，无需另外稀释洗脱物级份。通常， 低成本和无毒的盐、缓冲液、酸和碱都适用。特别优选的盐是氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化 铵。特别优选的缓冲液是柠檬酸、乳酸、乙酸、磷酸、甲酸和碳酸盐缓冲液。特别优选的酸是 柠檬酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸、盐酸。特别优选的碱是氢氧化钠（NaOH)、氢氧化钾（K0H)、 氢氧化钙（Ca(0H)2)、氢氧化铵（NH40H)。所有这些可组合来实现最佳洗脱过程。
[0075]在本发明的实施方案中可使用包含小于5% (v/v)的有机溶剂，诸如小于3% (v/v)有机溶剂，例如小于1% (v/V)的有机溶剂，诸如〇% (v/V)的有机溶剂进行洗脱。
[0076] 吸附树脂
[0077] 在本发明的实施方案中，所述的吸附树脂包含至少一种配体（L1)。所述配体（L1) 包含芳族或杂芳族环系统和一个或多个酸性基团。
[0078] 优选地，包含芳族或杂芳族环系统和/或一个或多个酸性基团的配体（L1)的分子 量至多2000道尔顿，诸如至多1000道尔顿，诸如至多500道尔顿。
[0079] 芳环系统适当地包括苯基或萘基。
[0080] 本发明实施方案中所述杂芳族部分可以选自单环杂芳基，其选自噻吩、呋喃、吡 喃、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶和哒嗪基；和双环杂芳基，其选自吲 哚、嘌呤、喹啉、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噻唑和苯并噁唑基。
[0081] 在本发明的进一步实施方案中，所述酸性基团选自羧酸基（(-COOH)、磺酸基 (_S020H)、亚磺酸基（-S(O)OH)、次膦酸基（-PH(O) (OH))、膦酸单酯基（-P(O) (OH) (OR))和 膦酸基（_P(〇) (〇H)2)，优选羧酸基（-C00H)。
[0082]优选地，所述配体（L1)可衍生自选自亚甲基-苯甲酸、羟基-苯甲酸、氨基-苯 甲酸、巯基-苯甲酸、巯基-烟酸、巯基-四唑乙酸的化合物，诸如2-氨基-苯甲酸、3-氨 基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巯基-苯甲酸、3-巯基-苯甲酸、4-巯基-苯甲酸、5-巯 基-1-四唑乙酸、4-氨基邻苯二甲酸和5-氨基间苯二甲酸。
[0083] 适当地，在配体（L1)中，所述一种或多种芳香族或杂芳族环系统被所述的一个或 多个酸性基团所取代。配体L1可包含多种酸性基团以及其他取代基，如碱性和中性的取代 基。
[0084] 在本发明另一个实施方案中，所述吸附树脂包含至少一种配体（L2)。配体（L2)包 含烷基胺或烷基芳基胺。在配体（L2)中的烷基胺或烷基芳基胺包含被选自下列的一个或 多个基团所取代的胺：
[0085] i.芳基、苄基或杂芳基；
[0086] ii.具有4-16个碳原子的可以是直链、支链或环状的烷基，例如，丁基、异丁基、叔 丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、环戊基、环己基或萘烷基；
[0087] 或它们的组合。
[0088] 配体（L2)可选自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N，N_二甲基-1，3_二-氨 基丙烷、1，3-二氨基丙烷、1，6-二氨基己烧、1，6-二氨基己烧、1，8-氨基辛烧、1，9-二-氨 基壬烧、1，12-氨基十二烧、2-氨基节胺、2-氨基苯并咪挫、2-氨基咪挫、2, 4-二-氨 基-6-羟基嘧啶、苄胺或苯二甲胺。
[0089]特别优选的配体（L2)具有至少4、诸如至少5、诸如至少6的C/N比（定义为化学 分子式中每一氮原子对应的碳原子数）。
[0090] 在本发明的实施方案中，配体（L1或L2)的浓度为10-990ymol/g干物重吸附树 脂。
[0091] 在本发明的另一实施方案中，配体（L1或L2)的浓度为l-145ymol/ml水化的沉 淀吸附树脂。
[0092]在本发明的另一实施方案中，配体（L1或L2)的浓度为l_130ymol/g湿的但已被 吸干水分的吸附树脂。
[0093] 优选地，配体（L1和L2)的浓度为10-100ymol/g湿的但已被吸干水分的吸附树 月旨，如15-80ymol/g湿的但已被吸干水分的吸附树脂，如20-60ymol/g湿的但已被吸干水 分的吸附树脂.
[0094]除了配体（L1或L2)，吸附树脂还包含聚合物基质（polymericbasematrix)，其 构成了大部分的吸附树脂，并支撑配体（L1或L2)。
[0095]所述的聚合物基质可选自某些类型的天然或合成的有机聚合物，典型地选自i)天然和合成多糖和其他基于碳水化合物的聚合物，包括琼脂、海藻酸盐、角叉菜胶、瓜尔豆 胶、阿拉伯胶、盖提胶、黄蓍胶、卡拉亚树胶、刺槐豆胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋 白、右旋糖酐、淀粉、肝素、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙 基纤维素和羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物和能形成聚合物的单体，包括丙烯酸类 聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃，及它们的取代衍生 物，以及包含一种以上所述聚合物的功能性共聚物和它们的取代衍生物；以及iii)它们的 混合物。优选的聚合物基质基团是多糖，如琼脂糖。
[0096] 在本发明的一个实施方案中，吸附树脂是颗粒的形式。吸附树脂颗粒可至少部分 渗透到待分离的蛋白质中以确保其显著的结合能力，相比之下，不可渗透的颗粒只能在其 表面结合目的蛋白，导致相对较低的结合能力。吸附树脂颗粒可以是不同的结构、组成和形 状的颗粒群。
[0097] 所述的吸附剂可进一步是多孔纤维或多孔膜形式。
[0098] 配体L1或L2可通过已知适合该目的的任何形式的共价键附着于聚合物基质上， 或者通过配体与固相物质之间的直接化学反应或者通过使用已知能够连接基质和配体的 合适的试剂预先活化聚合物基质或配体。
[0099] 这种合适的活化试剂的例子是表氯环氧丙烷、表溴环氧丙烷、烯丙基-缩水甘油 醚；双-环氧化合物诸如丁二醇二缩水甘油醚；卤素取代的脂族化合物，例如二氯丙醇、二 乙烯砜；羰二咪唑；醛类诸如戊二醛；醌类；溴化氰；过碘酸盐诸如高碘酸钠；二亚胺；氯三 嘆类诸如三聚氯氰；磺酰氯诸如对甲苯磺酰氯和tresylchlorides;N_羟基丁二酰亚胺； 2_氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；和酰肼。其中， 活化试剂留下一与单键不同的间隔基团SP1，例如优选表氯环氧丙烷、表溴环氧丙烷、烯丙 基-缩水甘油醚；双-环氧化合物；卤素取代的脂族化合物；乙烯砜；醛类；醌类；溴化氰； 氯三嗪类；噁唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物和酰肼。
[0100] 特别令人感兴趣的活化试剂被认为是环氧化合物，如表氯环氧丙烷、烯丙基缩水 甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚。在某些情况下所述活化试剂甚至可构成将免疫球蛋白结合 到聚合物基质的功能的一部分，例如在二乙烯砜用作活化试剂的情况下。在其他情况下，与 基质的官能团反应过程中活化试剂从基质释放。使用羰二咪唑和亚胺时是这种情况。
[0101] 上面提到的可能性与定义可选的链接多聚物基质和配体L1或L2的SP1间隔的存 在相关。在本发明中，SP1间隔被认为是在基质和配体间形成连接的活化试剂的一部分。因 此，SP1间隔相应于活化试剂和所涉及的偶联反应。在某些情况下，例如，当使用羰二咪唑 时，活化试剂形成了活化形式的基质或配体试剂。偶联反应后，在配体和基质之间没有留下 活化试剂的任何部分，因此，SP1简单地就是一单键。
[0102] 在其它情况下，所述SP1间隔是影响所述结合特征的所述官能团的整体部分，即 所述配体，如果所述SP1间隔包含功能活性位点或取代基例如硫醇、胺、酸性基、砜基、硝 基、羟基、腈基或其它能够通过氢键、静电结合或排斥、电荷转移等相互作用的基团时，这将 特别明显。
[0103] 还有在其它情况下，SP1间隔可包含芳环或杂芳环，其对于所述固相基质的结合特 性发挥重要的作用。这例如是如果醌或氯三嗪用作聚合物基质或配体L1或L2的活化试剂 的情况。
[0104] 优选地，SP1间隔是单键或衍生自活化试剂的双自由基，所述活化试剂选自：表氯 环氧丙烷、烯丙基缩水甘油醚、双环氧化合物诸如丁二醇二缩水甘油醚、卤素取代的脂族化 合物，诸如1，3-二氯丙烷-2-醇、醛诸如戊二醛、二乙烯砜、醌、溴化氰、氯三嗪类诸如三聚 氯氰、2_氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸盐、马来酰亚胺，噁唑酮和酰肼。优选地，SP1间隔选 自例如化学式为-CH2-CH(OH) -CH2-(衍生自表氯环氧丙烷）、-(CH2) 3-〇-CH2-CH(OH) -CH2-(衍 生自烯丙基缩水甘油醚）或-CH2-CH(OH) -CH2-〇- (CH2) 4-〇-CH2-CH(OH) -CH2-(衍生自 丁二醇 二缩水甘油醚）的短链脂族双自由基；或单键。
[0105] 因此，所述吸附树脂颗粒可由许多化学衍生的多孔材料构成，所述材料具有必要 的密度和结合能力以适用于给定的流速。
[0106] 为了使所述方法获得高产量，所述吸附树脂颗粒的密度可以是至少1. 3g/mL，更优 选地至少1. 5g/mL，还更优选地至少1. 8g/mL，甚至更优选地至少2.Og/mL，更优选地至少 2. 3g/mL，甚至更优选地2. 5g/mL，最优选地至少2. 8g/mL。
[0107] 在本发明的优选实施方案中，所述吸附树脂颗粒的平均颗粒大小为至多500ym， 特别地至多450ym，更特别地至多400ym，甚至更特别地至多350ym，甚至更特别地至多 300ym，甚至更特别地至多250ym，诸如至多200ym。
[0108] 所述吸附树脂颗粒可在聚合物基质中含有一种或多种无孔核芯。聚合物基质的作 用是覆盖并使多个（或单个）核芯材料在一起。吸附树脂颗粒可以是如W0 92/00799所描 述的簇生物（conglomerate)类型，每个颗粒具有至少两个被多孔材料包围的无孔核芯。在 簇生物类型的吸附树脂颗粒中的无孔核芯可以是多种类型和大小，例如由琼脂糖（聚合物 基质）包围使其在一起的两种或多种高密度颗粒组成的核芯颗粒。
[0109] 所述吸附树脂颗粒还可以是薄膜型的，每一颗粒具有单个无孔核芯，周围包围着 有孔的材料，例如琼脂糖包被的高密度不锈钢珠或实心玻璃珠。
[0110] 无孔核芯典型地构成至多吸附树脂颗粒总体积的50%，诸如至多40%，优选地至 多30%。无孔核芯可杂乱地分布在聚合物基质内，不必位于吸附树脂颗粒的中心。
[0111] 适宜的无孔核芯材料的实例是无机化合物、金属、重金属、元素非金属、金属氧化 物、非金属氧化物、金属盐和金属合金等。这种核芯材料的实例是金属硅酸盐、金属硼硅酸 盐；陶瓷，包括二硼化钛、碳化钛、二硼化锆、碳化锆、碳化钨、碳化硅、氮化铝、氮化硅、氮化 钛、氧化纪、金属娃粉和二娃化钼；金属氧化物和硫化物，包括镁、铝、钛、轨、络、错、铪、猛、 铁、钴、镍、铜和银的氧化物；非金属氧化物；金属盐，包括硫酸钡；金属元素，包括钨、锆、 钛、铪、轨、络、猛、铁、钴、镍、铟、铜、银、金、钮、钼、钌、锇、铭和铱，以及金属元素的合金，诸 如在所述金属元素之间形成的合金，例如不锈钢；结晶的和无定形碳，包括石墨、炭黑和炭。 优选的无孔核芯材料为尿素鹤（tungstencarbamide)、鹤、钢和钛珠，例如不锈钢珠。
[0112] 蛋白质组合物及其制备
[0113] 本发明提供了大豆蛋白组合物的方法和组合的大豆蛋白产品。
[0114] 通过将第二种类型的大豆蛋白与吸附树脂分离来提供第一种类型的大豆蛋白被 去除了的第二种大豆蛋白组合物。在本发明的情形中，所述第二种大豆蛋白是"去除了"第 一种类型的大豆蛋白的，这意味着通过所述方法手段第一种大豆蛋白的量在第二种大豆蛋 白中被降低。然而，在一方面，所述第一种类型的大豆蛋白可能从所述第二种大豆蛋白中被 完全去除。
[0115] 优选地，将所述的第一种和第二种类型的大豆蛋白分离，从而当测量分离过程前 后的蛋白重量比时，所述第一种类型的大豆蛋白含有少于30%，诸如少于25%，诸如少于 20%，诸如少于15%，诸如少于10%，诸如少于5%的起始量的第二种类型的蛋白质。
[0116] 还优选的是，将所述的第一种和第二种类型的大豆蛋白分离，从而当测量分离过 程前后的蛋白重量比时，所述第二种类型的大豆蛋白含有少于30%，诸如少于25%，诸如 少于20%，诸如少于15%，诸如少于10%，诸如少于5%的起始量的第一种类型的蛋白质。
[0117] 在一些情况下，第一种和第二种类型的大豆蛋白优选地都被分离以获得上面提到 的两种类型的蛋白优选的分离水平。
[0118] 可以将第一种类型的大豆蛋白被去除的第二种大豆蛋白组合物变性以提供变性 的第二种大豆蛋白组合物。由于在所述第一种大豆蛋白组合物中不存在诸如TI蛋白质， 可以在低于变性TI蛋白质所需的温度下进行变性。因此可以获得变性过程的选择性。适 当地，可以加热到50°C-100°C，诸如50°C-90°C、诸如50°C-80°C、诸如55°C-80°C、诸如 60°C-80°C的温度变性所述第二种大豆蛋白组合物。可替代地一或与热处理组合一可以应 用酶促蛋白水解来失活任何不需要的蛋白质，诸如脂氧合酶（lipoxygenase)、凝集素和过 敏性抗原。
[0119] 因此，本发明涉及通过在此描述的方法获得的第二种