专利名称：一种生产l－苯丙氨酸基因工程菌及构建方法和其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于氨基酸制备技术领域，具体涉及利用组成型启动的基因工程菌制备L-苯丙氨酸的方法。
背景技术：
L-苯丙氨酸(英文名L-phenylalanine)是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人体和动物不能合成的必需氨基酸之一，广泛应用于医药例如L-苯丙氨酸是某些氨基酸类抗癌药物的中间体，如苯丙氨苄、甲酸溶肉瘤素等(王多仁.化工中间体2004，1(2)12～20)。又可以以氨基酸为载体，把抗癌药物分子或基团载入肿瘤区，达到既能抑制肿瘤生长，又能降低肿瘤药物毒性的目的(Janet T Powell等，Eur.J Biochem.1978，(87)391～400)。L-苯丙氨酸还是复配氨基酸输液的重要成份，也是生产肾上腺素和甲状腺素的原料。也广泛用于食品添加剂行业，特别是作为阿斯巴甜(Aspartame)和尼尔甜(Neotame)的生产原料，市场需求量很大。
L-苯丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法和微生物酶法转化法。
微生物发酵法是借助生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的诱变等处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻碍，达到过量合成L-苯丙氨酸的目的。国际上美国的Monsanto等公司已用此法进行生产。但国内尚未见有高活力的菌株报道。
基因工程菌发酵法制备L-苯丙氨酸基因工程技术在L-苯丙氨酸生产菌选育方面的应用在发酵法方面较多，酶法制备L-苯丙氨酸方面应用较少。基因工程在发酵法制备L-苯丙氨酸生产菌选育上的应用主要是通过基因工程的方法改变代谢调控选育L-苯丙氨酸高产菌，研究较多的有E.coli；Brevibacteriums；C.glutamicum等三类菌(贾红华等，生物加工过程.2004，2(2)9～12)。其中以基因工程改造E.coli发酵制备L-苯丙氨酸的研究最受关注，例如，Sugimoto等将L-苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到温控启动子的质粒上，导人E.coli，通过温度变化调节代谢产酸，L-苯丙氨酸最高产量达到28.5g/L(Sugimoto S，等.FermentBioeng.1990，70(6)376～380。)。美国的Monsanto公司借着基因工程技术改良大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸，产酸率高达45g/L。并已经大规模投产，是目前世界上最大的L-苯丙氨酸生产企业(杨顺楷.精细与专用化学品.2001，(2)18～17)。1998，复旦大学范长胜等从一株黄色短杆菌3621出发构建新的苯丙氨酸生产菌，发酵后的苯丙氨酸产量比出发菌高出1倍，最高达26.26g/L。但国内发酵产率底，无产业化报道。
酶法合成L-苯丙氨酸方面，起决定作用的步骤是由关键酶催化的。1986年英国Fothering.ham等率先测序鉴定了大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转氨酶的tyrB基因和编码天冬氨酸转氨酶aspC基因的DNA序列；1986年美国的WaLbr将高表达天冬氨酸转氨酶的大肠杆菌工程菌固定于明胶中用于催化苯丙酮酸。1991年日本Tsutomu Takagi等克隆了天冬氨酸转氨酶的基因并用其构建了苯丙氨酸生产菌；1994药科大学史燕东等构建基因工程菌CTB2，催化苯丙酮酸转化为L-苯丙氨酸的转化率为81％，生成L-苯丙氨酸为14.4g/L；Yun-PengChao等构建了一株基因工程菌同时表达转氨酶和天冬氨酸酶耦合体系生产L-苯丙氨酸，还构建了另一株基因工程菌同时表达转氨酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，提高了底物摩尔转化率；(Yun-Peng Chao等，Biotechnol.Prog.1999，(15)453～458；Enzyme and MicrobialTechnology.2000，(27)19～25)。转化20g/L苯丙酮酸生成18.6g/L L-苯丙氨酸，摩尔转化率达93％。但以上表达体系，根据文献报道，需昂贵有毒的诱导物IPTG及昂贵的辅酶辅酶磷酸吡哆醛PLP，不利于大规模工业化生产。
目前，国外已有构建生物工程菌采用葡萄糖发酵法制备L-苯丙氨酸并有成功产业化的报道。而苯丙氨酸制备方面国内研究工作相对落后，高效且发酵成本低廉的工程菌至今尚未见报道。
微生物酶法转化法有三类型(1)以苯丙酮酸为前体经天冬氨酸转氨酶制备L-苯丙氨酸由前体物质苯丙酮酸经天冬氨酸转氨酶催化转氨生成L-苯丙氨酸，L-天冬氨酸为氨基供体时，转氨后的产物草酰乙酸不稳定，可进一步脱羧生成丙酮酸，进而使反应不断向生成L-苯丙氨酸的方向进行。该方法中的底物苯丙酮酸可由亚苄基海因水解制备，L-天冬氨酸可由富马酸加氨制备。本发明人已较好地解决了原料苯丙酮酸生产工艺。使得该苯丙氨酸合成工艺路线的突破成为可能，而催化苯丙酮酸(PPA)制备L-苯丙氨酸的高产生产菌的选育则是该工艺路线急需突破的另一瓶颈。
(2)以肉桂酸为前体经苯丙氨酸解氨酶催化制备L-苯丙氨酸苯丙氨酸解氨酶能够催化L-苯丙氨酸分解为肉桂酸和氨，因而可借助其逆反应，在适当的条件下由肉桂酸和氨合成L-苯丙氨酸。因底物肉桂酸对苯丙氨酸解氨酶的抑制作用，因而较难实现L-苯丙氨酸的高浓度生产。中国科学院成都生物研究所杨顺楷等，经多年菌种选育，该方法已有试投产的报道。
(3)酶法拆分化学合成消旋中间体(如N-乙酰DL-苯丙氨酸)的基础上采用酶法选择性降解制备L-苯丙氨酸，此法成本高，无产业化报道。
发明内容
本发明在于提供一种高效表达、具有良好辅酶再生体系，组成型启动子与天冬氨酸转氨酶的基因连接的基因工程菌，其发酵可以省去IPTG诱导步骤并达到高效启动，利于大规模发酵，易于实现产业化。
本发明还在于提供一种具有组成型启动子与天冬氨酸转氨酶的基因连接的并具有多酶偶合串联的基因工程菌，发酵不仅可以省去IPTG诱导步骤并达到高效启动，利于大规模发酵，还可以使用更价廉的原料和促进反应进程，易于实现产业化。
本发明还在于提供一种制备具有组成型启动子与天冬氨酸转氨酶的基因连接的，更进一步具有多酶偶合串联的基因工程菌的方法，该方法操作简便，工艺稳定，重复性好。
本发明还在于提供一种利用本发明的工程菌生产L-苯丙氨酸的培养发酵方法，可以稳定、价廉地生产，有利于规模化生产。
本发明的目的是这样实现的首先是工程菌的构建工程菌的构建方案一选择从天冬氨酸转氨酶的基因aspC或或芳香族转氨酶基因tyrB的一种，与自行构建的组成型启动子连接，插入载体，构建出组成型表达的重组质粒，并在不同的宿主菌中进行转化，得到带有组成型启动子的转氨酶基因工程菌。利用该工程菌在合适的培养基中、合适的条件下进行发酵得到发酵液，利用该发酵液发酵生产L-苯丙氨酸。其技术路线可以附图1表示。
其中的重组质粒的构建可按一般通用的方法进行构建，例如设计引文钓取大肠杆菌K12的天冬氨酸转氨酶基因aspC，与自行构建的组成型启动子相连，导入T载体。利用T载体的HindIII和EcoR I双酶切位点，分别插入到相同酶切后的载体。例如pUC19，pSE380，pET22b为较好的载体，构建获得质粒如例获得pUC/aspC；pET/aspC；pSE/aspC质粒。再分别导入不同的宿主中获得各种基因工程菌。宿主可选择常用的菌，并可以根据发酵培养后取发酵液测定酶活进行选择。较好的宿主例如大肠杆菌宿主JM109、DH-5α、BL21、TOP10F、Sure、XL1-blue，其中E.coli BL21更好。载体选择pET，宿主选择E.coli BL21获得的E.coliBL21-pET/aspC的表达酶活较高。利用这种工程菌进行发酵，不需要使用昂贵且毒性大的IPTG诱导步骤，并能高效启动，利于工业生产。
其中的组成型启动子，可以用通常的方法进行构建，只要利于与转氨酶基因连接适合导入所选载体。方便地可以利用乳糖启动子改造，例如把乳糖操纵子的转录起始部位的+5至+17间的几处的碱基进行突变，可将其变为组成型的启动子，可突变碱基如下，可突变碱基部位有下划线。
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGT又例如在乳糖操纵予中也可进行插入诱变改造为组成型的启动子(BautistaDS等；Gene1990；87(1)155)。
也可以直接采用大肠杆菌K12的天冬氨酸转氨酶的自带启动子。
工程菌的构建方案二进一步，在方案一中，根据需要进行选择合适的宿主菌，例如选择高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303作为宿主(徐虹等，南京化工大学学报，1996；18(1)70-73)，将构建的重组质粒例如pET/aspC插入，得到基因工程菌如例获得E.coli ATCC11303-pET/aspC工程菌。由于天然菌E.coli ATCC11303中的高活性天冬氨酸酶(aspA)与天冬氨酸转氨酶相偶联，其中的高活性天冬氨酸酶(aspA)可以用富马酸、氨产生天冬氨酸，因此该工程菌可以以富马酸和氨为原料生产L-苯丙氨酸，有效地降低生产成本。本。其技术路线可以附图2表示。
工程菌的构建方案三在方案一中，更进一步，在构建重组质粒时，将分解草酰乙酸的酶，例如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)，与氨基转移酶，例如aspC或tyrB进行串联，构建共表达重组质粒，这样按方案一进行转化而获得工程菌，例如载体选择pET，宿主选择E.coli BL21获得E.coli BL21-pET/aspC·pck工程菌。由于分解草酰乙酸的酶例如在该例中的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)能够分解以苯丙酮酸、天冬氨酸为原料经天冬氨酸转氨酶转化制备L-苯丙氨酸、转化反应的另一产物草酰乙酸，进一步分解生成丙酮酸，随着草酰乙酸分解可促进转化反应平衡向L-苯丙氨酸生成的方向进行，因此可以进一步提高L-苯丙氨酸的产率。技术路线可以附图3表示。
工程菌的构建方案四在方案一，二和三的基础上，方案三的重组质粒分解草酰乙酸的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pekA)与氨基转移酶进行串联共表达的重组质粒，导入方案二的宿主菌即例如高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303中转化，构建如例获得的基因工程菌是E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA，在这样的工程菌中，如例中，偶联了天冬氨酸酶(aspA)、天冬氨酸转氨酶(aspC，tyrB)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)三中酶，利用该种工程菌，可以以富马酸、氨、苯丙酮酸为底物，高产率直接合成L-苯丙氨酸，即降低了成本又可提高L-苯丙氨酸的转化率。其技术路线可以用附图4表示。
其中，天冬氨酸转氨酶酶活测定按常规方法进行即可，典型的测定方法可以根据底物苯丙酮酸与Fe3+发生络合反应显色的原理测定。步骤为取1ml发酵液，加入0.1ml CTAB(1％)，在恒温振荡器(37℃，180rpm)中反应5min，加入1ml底物(PPA0.1mol/L，L-Asp 0.11mol/L，氨水调PH8.5)，反应1h(37℃，180rpm)，冰浴终止反应。取20μl反应液到5ml显色液(DMSD600ml，冰醋酸20ml，FeCl30.5g，双蒸水定容至1L)中，反应后用分光光度计在640nm波长处测其OD值。一个酶比活单位“μ”定义为每小时每毫升发酵液所消耗的μmolPPA的量，即μmolPPA·h-1·ml-1。酶活计算公式E＝334*(C0-OD640)，C0是将体系中的1ml发酵液换成水后的测定值。
质粒检测可以按一般方法进行，也可按文献方法进行(林涛等，中国生物工程杂志.2005(增)313～315[18])，L-苯丙氨酸和苯丙酮酸的含量采用高效毛细管电泳(HPCE)法测定(唐方等，北京化工大学学报.2003，30(5)21～23)。
其次，基因工程菌的发酵依据构建工程菌方案一或二或三获得的菌例如E.coli BL21-pET/aspC(或E.coliBL21-pET/aspC·pck)在进行发酵时，其培养基可以用常用培养基LB培养基按通常的剂量进行，获得的酶活在50～100u/mL，(典型的LB液体培养基(g/L)为酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，PH7.0；LB液体培养基(g/L)为酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，PH7.0；LB固体培养基(g/L)为酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉18，pH7.2；)也可以采用以玉米浆为主要营养组分的廉价高效的发酵培养基，作为碳源，一般不必特别限定，可用可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖等，添量为0～10g/L；作为有机氮可以用玉米浆、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、鱼粉，添量为0～20g/L，玉米浆为更好。该培养基有利于发酵过程中的质粒稳定，可提高外源基因的表达，玉米浆含有水份，添量为0～60ml/L，较好为30～50ml/L。在以玉米浆为主碳氮源的培养基中因含各种金属离子和无机盐，可不添加其他的镁、铁离子及磷酸盐等。也可加入少量的氯化钠等盐类。发酵培养基的初始为pH6.5～7.5。这样获得的天冬氨酸转氨酶比活在120～260u/mL。发酵过程中不需要加入基因工程菌常用的诱导物IPTG。
以含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303为宿主，构建的基因工程菌即根据构建方案二或四构建的工程菌例如E.coli ATCC11303-pET/aspC发酵时，培养基中适当入少量富马酸进行天冬氨酸酶的诱导，富马酸添加量以发酵液体积计每升发酵液添加1～20克。这样，可以使用富马酸和氨水生成天冬氨酸、生产L-苯丙氨酸，大大降低生产成本。
在进行发酵时，菌种的接种量按一般常识选择，不必特别限定。菌种接种量按体积百分比计一般为1～10％，更好为3～6％，在150～300rpm转速搅动下，保持温度在30～45℃，发酵时间一般为4～20小时，发酵6～12小时较好。发酵为好氧发酵。
第三，利用工程菌生产L-苯丙氨酸。
按构建方案一或三构建的工程菌，例如基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC，发酵后可收集菌体，也可直接使用发酵液作为酶液，底物为苯丙酮酸与天冬氨酸，也可用亚苄基海因的水解物(含苯丙酮酸)直接代替苯丙酮酸。直接使用发酵液作为酶液时，酶液的添加量以体积计酶液体积与底物体积比为1∶1～1∶6，较好为1∶2～1∶4。发酵液中苯丙酮酸的含量为10～90g/L，更好为30～60g/L。直接使用水解液时苯丙酮酸的含量为10～70g/L，更好为30～50g/L。转化液中可添加少量破壁剂(如CTAB-十六烷基三甲基溴化铵)，也可不添加破壁剂直接转化，添加量以体积百分比计为0-0.3％。苯丙酮酸与天冬氨酸的比例为1∶1～1∶2，较好为1∶1.1～1.3。转化液的pH为7.5～9.0。转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛。转化温度为30～40℃。此时，转化时间一般为2～15小时，更好为3～7小时，经HPLC检测计算，每升转化液的L-苯丙氨酸含量在12～50克，产率可达60～96％。
按构建方案二或四构建的工程菌即以含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coliATCC11303为宿主的基因工程菌，例如E.coli ATCC11303-pET/aspC，发酵后可收集菌体，也可直接使用发酵液作为酶液，底物是可以使用苯丙酮酸与天冬氨酸，为进一步降低成本，底物也可以用苯丙酮酸、富马酸和氨，也可用亚苄基海因的水解物、即含苯丙酮酸的反应液、直接代替苯丙酮酸。直接使用发酵液作为酶液时，酶液的添加量以体积计为酶液体积与底物体积比为1∶1～1∶6，较好为1∶1.5～1∶4。发酵液中苯丙酮酸的含量为10～90g/L，更好为30-60g/L。直接使用水解液时苯丙酮酸的含量为10～70g/L，更好为30～50g/L。转化液中可添加少量破壁剂(如CTAB-十六烷基三甲基溴化铵)，也可不添加破壁剂直接转化，添加量以体积百分比计为0-0.3％。苯丙酮酸与富马酸的比例为1∶1～1∶2，更好为1∶1.1～1∶1.5。转化液的pH为7.5～9.0。转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛。转化温度为30～40℃。此时，转化时间一般为2～20小时，更好为4～9小时，经HPLC检测计算，每升转化液的L-苯丙氨酸含量在12-45克，产率可达60-85％。
采用氨基转移酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)串联共表达的基因工程例如菌E.coliBL21-pET/aspC·pck，苯丙酮酸转化为L-苯丙氨酸的摩尔转化率可进一步提高，达到75～96％。
采用以天然菌E.coli ATCC11303为宿主的基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC，底物可用富马酸和氨来代替天冬氨酸，转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛，可进一步降低成本。
同时，菌体的培养条件比较简单，易于得到活性稳定的菌体，因此利于产业化大规模生产。
图1生产L-苯丙氨酸的技术路线示意2生产L-苯丙氨酸的技术路线示意3生产L-苯丙氨酸的技术路线示意4生产L-苯丙氨酸的技术路线示意图具体实施方式
实施例1 基因工程菌E.coli BL21-pUC/aspC的构建天冬氨酸转氨酶aspC基因调自大肠杆菌K12(标准菌株)。由NCBI检索，根据报道的大肠杆菌K12(标准菌株)aspC序列经VectorNTI8.0软件设计引物如下正向引物15’ATGTTTGAGAACATTACCGC 3’反向引物25’GTTTGTCATCAGTCTCAGCC 3’。
采用PCR钓取大肠杆菌K12的天冬氨酸转氨酶基因aspC，与下述的组成型启动子(记为P-121)相连，(该启动子的改变碱基部位见下划线)，TGTTGTGTGGAATTGTGAGTGGCTAACAATTTCACACA
ACAACACACCTTAACACTCACCGATTGTTAAAGTGTGT并将P121-aspC插入至TaKaRa公司pMD-18T载体中，对钓取的aspC基因进行了测序鉴定。利用T载体的HindIII和EcoR I位点，双酶切得到新的带有酶切位点的片断P121-aspC。插入到相同酶切后的载体pUC18中。获得重组质粒pUC/aspC。制备E.coli BL21感受态细胞，将重组质粒pUC/aspC导入E.coli BL21中，选择重组子E.coli BL21-pUC/aspC。
实施例2基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC天冬氨酸转氨酶基因aspC与下述组成型启动子(记为P123)相连，(该启动子的改变碱基部位见下划线)，获取P123-aspC。
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATTGCAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTAACGTTAAAGTGTGTP将P123-aspC插入至TaKaRa公司pMD-18T载体中，对钓取的aspC基因进行了测序鉴定。利用T载体的HindIII和EcoR I位点双酶切得到新的带有酶切位点的片断P123-aspC。插入到相同酶切后的载体pET22b中。获得重组质粒pET/aspC。制备E.coli BL21感受态细胞，将重组质粒pET/aspC导入E.coli BL21中，选择重组子E.coli BL21-pET/aspC。
实施例3 基因工程菌E.coli ATCC11303-pUC/aspC的构建制备含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受态细胞，将实施例1中构建的重组质粒pUC/aspC导入E.coli ATCC11303中，选择重组子E.coliATCC11303-pUC/aspC。
实施例4基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC的构建制备含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受态细胞，将实施例2中构建的重组质粒pET/aspC导入E.coli ATCC11303中，选择重组子E.coliATCC11303-pET/aspC。
实施例5基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA的构建采用PCR钓取大肠杆菌K12的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(pckA)，与组成型启动子P121相连，并将P121-pckA插入至TaKaRa公司pMD-18T载体中，对钓取的pckA结构基因进行了测序鉴定。再将P121-aspC与P121-pckA连接，插入到载体pET22b中。获得重组质粒pET/aspC·pckA。制备E.coli BL21感受态细胞，将重组质粒pET/aspC·pckA导入E.coli BL21中，选择重组子E.coli BL21-pET/aspC·pckA。
实施例6基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA的构建制备含高活性天冬氨酸酶(aspA)的天然菌E.coli ATCC11303的感受态细胞，将实施例5中构建的重组质粒pET/aspC·pckA导入E.coli ATCC11303中，选择重组子E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA。
实施例7基因工程菌发酵液1基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC(基因工程菌E.coli BL21-pUC/aspC或E.coliBL21-pET/aspC·pckA)的发酵按以下重量比例配制发酵液玉米浆30ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，NaCl 1g/L，调节pH值7.0。灭菌后接种量为3％(种子培养基相同、培养时间为8小时)，在温度为37℃和转速为180rpm搅拌下，发酵10小时。
实施例8基因工程菌发酵液2基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC(或E.coli ATCC11303-pET/aspC·pckA)的发酵按以下重量比例配制发酵液玉米浆25ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，富马酸5g/L，NaCl1g/L，调节pH值7.0。灭菌后接种量为3％(种子培养基相同、培养时间为8小时)，在温度为37℃和转速为180rpm搅拌下，发酵10小时。
实施例9基因工程菌发酵液3基因工程菌E.coli JM109-pET/aspC(或E.coli JM109-pET/aspC·pckA)的发酵按以下重量比例配制发酵液玉米浆30ml/L，酵母膏3g/L，淀粉2g/L，NaCl 1g/L，调节pH值7.0。灭菌后接种量为3％(种子培养基相同、培养时间为8小时)，在温度为37℃和转速为180rpm搅拌下，发酵10小时。
实施例10转化实验1基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC发酵液(基因工程菌发酵液1)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，苯丙酮酸与天冬氨酸的摩尔比例为1∶1.2，转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛。36℃振荡反应(或搅拌反应)8小时，可得23.6g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约79％。L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为72.8％。
实施例11转化实验2
基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA发酵液(基因工程菌发酵液1)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，转化液的pH为8.5，苯丙酮酸与天冬氨酸的摩尔比例为1∶1.2，36℃振荡反应(或搅拌反应)8小时，可得26.3g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约88％。L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为79.6％。
实施例12转化实验3基因工程菌E.coli BL21-pET/aspC·pckA发酵液(基因工程菌发酵液1)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，转化液的pH为8.5，苯丙酮酸与天冬氨酸的摩尔比例为1∶1.2，转化前充氮气保护苯丙酮酸免受氧化分解，36℃振荡反应(或搅拌反应)8小时，可得28.1g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约94％，L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为85.7％。
实施例13转化实验3基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC的发酵液(基因工程菌发酵液2)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，用富马酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸与富马酸的摩尔比例为1∶1.2，转化液的pH为8.5，转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛。36℃振荡反应(或搅拌反应)12小时，可得21.4g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约71％，L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为65.1％。
实施例14转化实验4基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pck的发酵液(基因工程菌发酵液2)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，用富马酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸与富马酸的摩尔比例为1∶1.2，36℃振荡反应(或搅拌反应)12小时，可得26.1g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约87％。L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为79.4％。
实施例15转化实验5基因工程菌E.coli ATCC11303-pET/aspC·pck的发酵液(基因工程菌发酵液2)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，用富马酸和氨替代天冬氨酸，苯丙酮酸与富马酸的摩尔比例为1∶1.2，转化前充氮气保护苯丙酮酸免受氧化分解，36℃振荡反应(或搅拌反应)12小时，可得27.3g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约91％，L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为83.5％。
实施例16转化实验6基因工程菌E.coli JM109-pET/aspC发酵液(基因工程菌发酵液3)直接作为酶液，与亚苄基海因的水解物(含40g/L的苯丙酮酸)以1∶3的比例混合。转化液中苯丙酮酸的含量为30g/L，苯丙酮酸与天冬氨酸的摩尔比例为1∶1.2，转化液中不必添加辅酶磷酸吡哆醛。36℃振荡反应(或搅拌反应)8小时，可得22.5g/L的L-苯丙氨酸，苯丙酮酸的摩尔转化率约76％。L-苯丙氨酸对亚苄基海因的摩尔转化率为70.2％。
权利要求
1.一种用于制备L-苯丙氨酸的基因工程菌，由表达质粒在宿主菌中转化而得，其特征在于其表达质粒是用天冬氨酸转氨酶基因aspC或芳香族转氨酶基因tyrB中的一种与组成型启动子连接，插入载体构建成的组成型表达质粒。
2.一种根据权利要求1的用于制备L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的载体选自pUC18、pET22b或pSE380中的一种，其中的宿主菌选自大肠杆菌宿主JM109、DH-5α、BL21、TOP10F、Sure或XL1-blue的一种。
3.一种根据权利要求1的用于制备L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的宿主菌为具有高活性天冬氨酸酶aspA的天然菌E.coli ATCC11303。
4.一种根据权利要求1的用于制备L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的表达质粒中还连接了由分解草酰乙酸的酶与组成型启动子的连接。
5.一种根据权利要求4的用于制备L-苯丙氨酸的基因工程，其特征在于其中的分解草酰乙酸的酶是烯醇式丙酮酸羧激酶pck。
6.一种根据权利要求4的生产L-苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于其中的宿主为高活性天冬氨酸酶aspA的天然菌E.coli ATCC11303。
7.一种利用权利要求1或4的基因工程菌制备L-苯丙氨酸的方法，以培养基培养基因工程菌得到发酵液，将发酵液加入含有苯丙酮酸和天冬氨酸的溶液中进行转化反应。
8.一种利用权利要求3或6的基因工程菌生产L-苯丙氨酸的方法，以培养基培养基因工程菌得到发酵液，将发酵液加入含有富马酸、氨和苯丙酮酸溶液中进行转化反应，在培养基中添加少量富马酸为辅助碳源，富马酸的添加量以培养基体积计为1-20g/L。
9.一种利用权利要求7的基因工程菌生产L-苯丙氨酸的方法，其中培养基选自LB培养基或玉米桨为主要碳氮源的培养基，玉米桨培养基的添加量为10-60ml/L。
10.一种利用权利要求8的基因工程菌生产L-苯丙氨酸的方法，其中培养基选自LB培养基或玉米桨为主要碳氮源的培养基，玉米桨培养基的添加量为10-60ml/L。
全文摘要
本发明公开了一种制备L－苯丙氨酸的基因工程菌及构建方法和生产应用。该菌种由转氨酶基因与组成型启动子连接，插入载体而构建的组成型表达质粒，在合适的宿主菌中转化而得。采用表达高活性天冬氨酸转氨酶的基因工程菌转化苯丙酮酸制备L－苯丙氨酸，摩尔转化率可达65－85％。采用表达高活性天冬氨酸转氨酶和烯醇式磷酸丙酮酸羧激酶的基因工程菌转化苯丙酮酸制备L－苯丙氨酸，摩尔转化率可达80－95％。菌体培养条件简单，活性稳定，不需要诱导物IPTG及辅酶磷酸吡哆醛，利于产业化大规模生产。
文档编号C12N15/70GK1757737SQ20051004080
公开日2006年4月12日 申请日期2005年6月28日 优先权日2005年6月28日
发明者何冰芳, 欧阳平凯, 李霜, 宫长斌, 姜岷, 周华, 韦萍 申请人:南京工业大学