改进的嵌合糖蛋白和假型化慢病毒载体的制作方法

专利名称：：改进的嵌合糖蛋白和假型化慢病毒载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及嵌合糖蛋白和用这些糖蛋白假型化的改进的慢病毒属载体，制备这种糖蛋白和载体的方法和组合物，和利用这种载体体外和体内转导细胞的方法。改进的组合物和载体可特别用于体内基因转移应用。
背景技术：
：已知各种病毒表面糖蛋白(决定细胞嗜性)和不同类型病毒核心(决定基因组复制和整合)1大量可能的结合，在基因转移应用方面，来源于逆转录病毒的载体提供了特别灵活的特性。例如，VGV-G糖蛋白和来源于慢病毒属的病毒核心结合产生了假型病毒载体，该假型病毒载体具有广泛的嗜性，并且可以整合到非增殖性靶细胞中2。已经证明它们可以用于几种细胞类型的离体和体内转导3-7。然而，人们有相当大的兴趣探究用可替代病毒糖蛋白质假型化的慢病毒属载体特性8-15。该特征可能调节该载体的物理-化学特性，它们与宿主免疫系统的相互作用和它们宿主范围。实际上，几个研究已经表明靶细胞的转导效率取决于用于包被逆转录病毒载体的糖蛋白类型16-21。此外，一些体内基因转移应用将需要靶向特异性细胞入口的载体和/或系统施用后的基因表达22。由于VSV-G假型受体，一种质膜脂质成分的广泛分布23，VSV-G假型可以结合其接种后，到达靶细胞前所遇到的所有细胞表面。而且，通过人血清可以快速失活VSV-G假型载体24，并且这可能对VSV-G做为用于系统基因递送假型化载体的糖蛋白的用途施加限制。在几个实验室1，包括我们自己的实验室中25已经产生了来源于猴免疫缺损病毒(SIV)的慢病毒属载体。这些载体的表征已经表明，尽管在猴细胞中，SIV载体比HIV-1载体起到更好的作用，但是在非增殖性细胞中转基因的插入方面，它们与来源于人免疫缺损病毒(HIV-1)的载体相似25。
发明内容本发明涉及用于制备假型化病毒载体颗粒(pseudotypedviralvectorparticles)的嵌合和突变糖蛋白。在特定的实施方式中，嵌合糖蛋白包含来源于MLV-A的胞质尾区结构域及来源于猫内源病毒RD114的跨膜和细胞外结构域。在另外实施方式中，糖蛋白包含最小修饰，该最小修饰允许基于慢病毒属的载体的有效假型形成。具体的实施方式包括在胞质尾区结构域中包含切割位点的糖蛋白，该切割位点与将要用改变的糖蛋白假型化的逆转录病毒载体的逆转录病毒核心蛋白酶相容。在特定的实施方式中，将修饰引入到8个氨基酸的一段序列中，其包含病毒核心蛋白酶的底物，并且它的切割对于病毒糖蛋白的融合性(fusogenicity)至关重要。这些修饰可以假型化致癌逆转录病毒核心或不同的慢病毒核心。与这些实施方式相关，本发明的另一个实施方式是用于匹配嵌合和突变糖蛋白胞质尾区氨基酸序列与逆转录病毒核心蛋白酶的方法，导致在这些核心上显著改进的糖蛋白装配。本发明也包括编码这种糖蛋白的核酸构建体。在优选的实施方式中，该核酸包含SEQIDNO1序列。在另一方面，该构建体是适于表达糖蛋白的表达构建体，使得它们包含在重组病毒载体颗粒中。在另一方面，本发明包括用这种核酸构建体转染的细胞。本发明的一个实施方式包括包含嵌合糖蛋白的载体颗粒，其中该嵌合糖蛋白包含来源于MLV-A的胞质尾区结构域与来源于猫内源病毒RD114的跨膜和细胞外结构域。在另一方面，该载体颗粒是假型化载体颗粒。在另一方面，该载体颗粒还包含重组病毒载体构建体。在另一个实施方式中，该载体颗粒包含载体构建体，其中载体构建体来源于逆转录病毒或慢病毒属。在一个方面，该载体构建体来源于SIV或HIV。在另一个实施方式中，载体颗粒包含载体构建体，该载体构建体还包含转基因。在一方面，该转基因是标记或报道基因。在特定实施方式中，该转基因是绿色荧光蛋白(GFP)。在另一方面，该转基因是治疗基因。在特定实施方式中，该转基因是癌基因或原癌基因。在另一个特定实施方式中，该基因是药物敏感性基因。本发明的另一个实施方式是转导细胞的方法，该方法包括a)获得将要被转导的细胞；b)获得根据权利要求8所述的假型化载体颗粒；和c)在足以产生转导的情况下，用b)的载体颗粒接触细胞。在另一个实施方式中，该方法还包括以足以增强转导的量提供retronectin的步骤。在本方法的另一个方面，体外转导细胞，在另一方面，体内转导细胞。在进一步实施方式中，细胞是脊椎动物细胞、灵长类细胞或人类细胞。也可以考虑CD34+或PBL细胞。本方法的另一个实施方式包含通过本方法转导的细胞。另一个实施方式是产生重组假型化病毒载体颗粒的方法，该方法包括(a)用(i)至少一种载体构建体；(ii)至少一种包装构建体；和(iii)编码权利要求1嵌合糖蛋白的表达构建体；转染细胞以产生生产者细胞；(b)在培养基中培养生产者细胞；和(c)从培养基分离生产者细胞以从培养基回收重组病毒载体颗粒。另一个实施方式包括用根据本发明方法制备的载体颗粒在实现重组载体转导细胞的条件下接触细胞。具体考虑的细胞是人类细胞，其包括造血干细胞或人类CD34+细胞。在另外的实施方式中，处理细胞以刺激细胞增殖，而基本上没有干细胞多潜能性的损失。另一方面，体内或体外转导细胞。在进一步实施方式中，将转导的细胞引入到动物受实验者中。在优选实施方式中，动物受实验者是人类受实验者。本发明包括的离体基因治疗的典型例子是患有慢性肉芽肿疾病(Chronicgranulatousdisease，CGD)的患者，可以从骨髓或外周血分离其CD34+细胞，并且在移植前，用表达gp91phox基因的慢病毒载体(lentivector)离体转导该CD34+细胞。在患有重度联合免疫缺损(SCID)患者的情况下，本发明人考虑了相似的方法，利用表达患者中缺陷的基因，例如，编码白细胞介素受体共同γ链基因的本发明载体构建体。对于HIV感染的基因治疗，本发明人考虑了细胞内免疫，其中通过抗病毒基因的引入，使得细胞对HIV病毒具有抗性。在HIV细胞内免疫的实施方式中，本发明载体的靶包括造血祖细胞、外周血CD4+T细胞和单核细胞。如本领域技术人员会认识到的，相似的细胞内免疫方法也可以用于其它病毒感染。对于癌症的免疫治疗，将用本发明的慢病毒属载体改造肿瘤细胞或抗原呈递细胞诸如树突细胞。对于癌症治疗，本发明慢病毒载体构建体中可以使用的一些转基因是可以抑制癌/肿瘤细胞，和/或杀死癌/肿瘤细胞和/或阻止癌/肿瘤细胞增殖，和/或介导癌/肿瘤细胞细胞程序死亡的转基因和/或基因诸如TNF。通过直接注射到血液中或特定器官中，也可以体内使用这里所述的载体颗粒。例如，在一个实施方式中，表达胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)的慢病毒载体的大脑内注射可以用于帕金森病的治疗。在另一个例子中，设想了表达凝血因子VIII的慢病毒载体的门内注射(intraportalinjettion)用于血友病A治疗。在另一个例子中，设想了表达肌营养不良蛋白基因的本发明慢病毒载体的静脉或肌肉注射用于杜兴氏肌营养不良治疗。因此，在基因治疗方面，本领域的普通技术人员将意识到本发明载体构建体和颗粒的广泛用途。如这里申请文件或权利要求书中所用的，当与文字“包括/包含”一起使用时，文字“一个”可以意指一个或一个以上。如这里所用的“另一个/种”意指至少第二个/种或更多。从下面详细的描述中，本发明的其它目的、特征和优点都将显而易见。然而，应该理解，说明了本发明的优选实施方式的详细描述和具体实施例，仅仅是通过示例的方式给出的，因为从该详细描述中，本发明精神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员显而易见。下面的附图形成了本发明说明书的一部分，并且包含该附图以进一步说明本发明的一些方面。通过参考一个或多个附图，结合这里所给出具体实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。图1A.SIVmac251来源载体的产生。SIVmac(SIVmac251)感染性分子克隆的基因组。图1B.SIVmac251用于衍生编码包装功能(packagingfunctions)的构建体和带有转移载体的构建体。也设计了表达各种病毒糖蛋白(GP)的表达构建体。填充的盒子代表病毒基因。空盒子表示顺式作用序列。LTR，长末端重复，CMV，人巨细胞病毒立即早期启动子；PBS，引物结合位点；MSD，主要剪接供体位点；ψ，包装序列；RRE，Rev应答元件；PHMG，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)启动子；polyA，聚腺苷酸化位点；SD，剪接供体位点；SA，剪接受体位点；SV40，猴病毒40早期启动子。通过包含包装功能、病毒糖蛋白的质粒和转移载体共转染到293T细胞中产生载体颗粒。在瞬时表达期间收集转染细胞的上清液，通过超速离心浓缩，并且用于靶细胞转导。图2A.用不同病毒糖蛋白假型化的SIVmac来源载体的感染效价。用标明的逆转录病毒或非逆转录病毒(星形)来源的GPs产生带有GFP标记基因的载体。EboV，埃博拉病毒；FPV-HA，家禽瘟疫病毒血凝素；GALV，长臂猿白血病病毒；MLV-A，兼嗜性鼠白血病病毒；LCMV，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒；VSV，水泡性口炎病毒。用稀释的非浓缩载体制备物感染TE671靶细胞，并且在感染后3天测定GFP阳性细胞的百分数。感染效价计算为GFPi.u./ml。在重复试验中，用2U产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridiumperfringens)神经氨酸酶(Sigma-Aldrich，France)处理表达FPV-HA的载体生产者细胞24小时以从生产者细胞表面诱导HA假型化颗粒的释放(FPV-HA+NA)。图2B.RD114/TR嵌合GP的图示，其中用MLV-AGP的胞质结构域置换了RD114糖蛋白的胞质结构域。显示了三个拓扑结构域胞外结构域、跨膜和胞质尾区的序列。用相似的方式修饰GALV/TR嵌合GP。图2C.利用抗RD114SU和抗CA的抗体，在通过20％蔗糖垫层沉淀的SIV载体颗粒的免疫印迹中测定病毒颗粒中的RD114和RD114/TRGPs的掺入。示出了分子量标记的位置(kDa)。图3A.假型化以SIV为基础的载体原种的表征。通过超速离心浓缩用标明的GPs假型化的以SIVmac为基础的载体原种的感染效价。示出了对TE671靶细胞进行的，来源于9个单独试验的平均效价±SD。图3B.(B)利用抗SIV-CA(衣壳)的抗体，通过代表性纯化载体原种的免疫印迹进行物理颗粒的检测。图4A.人血清中假型化SIV载体病毒颗粒的稳定性。感染性假型SIV载体颗粒(在50μl悬浮液缓冲液中的50,000GFPi.u.)与50μl新鲜(虚条)或热失活(黑条)的人血清混合。做为参考，病毒颗粒与50μl热失活的胎牛血清(FCS)混合。在30℃，温育病毒颗粒/血清混合物1小时，然后用于转导TE671靶细胞。数值表示灵长类血清温育的病毒颗粒效价相对于FSC中温育的相同病毒颗粒的效价(％)。示出了用3种不同单独供体血清进行的试验结果。一式三份进行使用人血清#659的试验，并且表示为平均值±SD。图4B.猕猴血清中假型化SIV载体病毒颗粒的稳定性。感染性假型SIV载体颗粒(在50μl悬浮液缓冲液中的50,000GFPi.u.)与50μl新鲜(虚条)或热失活(黑条)的猕猴血清混合。做为参考，病毒颗粒与50μl热失活的胎牛血清(FCS)混合。在30℃，温育病毒颗粒/血清混合物1小时，然后用于转导TE671靶细胞。数值表示灵长类血清温育的病毒颗粒效价相对于FSC中温育的相同病毒颗粒的效价(％)。示出了用3种不同单独供体血清进行的试验结果。一式三份进行使用人血清#659的试验，并且表示为平均值±SD。图5A.人和猕猴CD34+细胞的转导。通过与TPO过夜温育预先刺激来源于人流动血液的CD34+细胞，并且在不同的感染复数(MOIs)与用VSV-G(三角形)，MLV-AGP(实心圆)，GALV/TRGP(空心圆)或RD114/TRGP(实心正方形)假型化的SIV载体转导16小时。对于每个CD34+细胞样品，在包被于平板上的CH-296retronectin多肽缺少或存在的情况下，进行一式两份的转导。感染后，在PBS中洗细胞，并且在Flt3-L，TPO和SCF存在的情况下培养细胞另外3天，直到估测转导效率时为止。对于相同批次的CD34+细胞示出了代表性试验的剂量-应答曲线及用来源于不同供体和假型载体原种的CD34+细胞进行的至少4个试验的最大转导效率的统计学分析。图5B.人和猕猴CD34+细胞的转导。通过与TPO过夜温育预先刺激来源于猕猴骨髓的CD34+细胞，并且在不同的感染复数(MOIs)与用VSV-G(三角形)，MLV-AGP(实心圆)，GALV/TRGP(空心圆)或RD114/TRGP(实心正方形)假型化的SIV载体转导16小时。对于每个CD34+细胞样品，在包被于平板上的CH-296retronectin多肽缺少或存在的情况下，进行一式两份的转导。感染后，在PBS中洗细胞，并且在Flt3-L，TPO和SCF存在的情况下培养细胞另外3天，直到估测转导效率时为止。对于相同批次的CD34+细胞示出了代表性试验的剂量-应答曲线及用来源于不同供体和假型载体原种的CD34+细胞进行的至少4个试验的最大转导效率的统计学分析。图6A.人外周血淋巴细胞的转导。在不同的感染复数(MOIs)，用标明的假型SIV载体转导人来源的外周血淋巴细胞(PBLs)。用可溶性抗CD3和抗CD28抗体激活人PBLs24小时。在感染前，用伴刀豆球蛋白A和rhIL2激活猕猴PBLs2天。通过用VSV-G(三角形)，MLV-AGP(实心圆)，GALV/TRGP(空心圆)或RD114/TRGP(实心正方形)假型化的SIV载体感染激活的PBLs4天。在PBS中洗感染的细胞，在PBL培养基中培养，并且感染后5天估测转导效率。显示了用来自不同供体的PBLs进行的实验的结果及用来源于不同供体和假型载体原种的PBLs进行的至少4个试验的最大转导效率的统计学分析。图6B.猕猴外周血淋巴细胞的转导。在不同的感染复数(MOIs)，用标明的假型SIV载体转导猕猴来源的外周血淋巴细胞(PBLs)。用可溶性抗CD3和抗CD28抗体激活人PBLs24小时。在感染前，用伴刀豆球蛋白A和rhIL2激活猕猴PBLs2天。通过用VSV-G(三角形)，MLV-AGP(实心圆)，GALV/TRGP(空心圆)或RD114/TRGP(实心正方形)假型化的SIV载体感染激活的PBLs4天。在PBS中洗感染的细胞，在PBL培养基中培养，并且感染后5天估测转导效率。示出了用来源于不同供体的PBLs进行的试验结果，及用来源于不同供体和假型载体原种的PBLs进行的至少4个试验的最大转导效率的统计学分析。图7A.RD114GP胞质尾区突变体的图示。RD114GP的TM亚基和类型C(MLV-A)或类型D(Mason-Pfizer猴病毒-MPMV)哺乳动物逆转录病毒Env糖蛋白TMs的比对。()表示与RD114的氨基酸相比，在MLV-A和MPMV的TMs中相同的氨基酸。突出显示了保守性氨基酸诸如I，L或V(脂肪族残基)；K或R(带正电荷残基)，和D或E(带负电荷残基)。用盒子框起不同GPs的跨膜结构域(M)。胞质尾区由两个部分组成通过病毒核心蛋白酶移除GP羧基末端(R)后，在病毒颗粒上发现的成熟GP的尾区(T)。在不同GPs中示出了蛋白酶切割位点(盒子框起的)和YXXL胞吞基序(下划线)。图7B.对每个突变体，用下划线表示RD114GP中修饰的羧基末端的序列。仅仅用盒子框起不同嵌合GPs的跨膜结构域。(*)表示插入在RDRless嵌合GP中的提前终止子的位置。(′)表示病毒核心蛋白酶介导的切割的位置。图8.合胞体测定的结果。通过计数接种在2cm2孔中转染细胞中的合胞体数量测定的GP嵌合体的细胞-细胞融合性。模拟转染的细胞(没有GP)用于测定合胞体的背景数(这里已扣除)。数据表示3个单独试验的结果。图9A.假型载体的感染性。用标明的GP突变体假型化的MLV载体的感染性，表示为GFPi.u./ml。该图表表示4个独立试验的平均值±SD。为了比较，也显示出了用MLV-AGP或用VSV-G假型化的载体获得的结果。图9B.假型载体的感染性用标明的GP突变体假型化的SIV载体的感染性，表示为GFPi.u./ml。该图表表示4个独立试验的平均值±SD。为了比较，也表示出了用MLV-AGP或用VSV-G假型化的载体获得的结果。具体实施例方式我们已经制备了编码融合到MLV-AGP胞质尾区(命名为TR)的GALV或RD114GPs细胞外和跨膜结构域的嵌合GPs。令人惊奇地，用GALV/TR和RD114/TRGP嵌合体假型化的SIV来源的载体比用亲本GPs包被的载体具有显著高的效价。此外，RD114/TR假型化载体被有效地浓缩，并且这些假型化载体抗人和猕猴血清补体诱导的失活。因此，修饰的RD114GP假型化慢病毒载体对于体内基因转移应用具有特别的价值。而且，与用其它逆转录病毒GPs或用VSV-G假型化的载体比较，RD114/TR假型化的载体显示了增加的人和猕猴原代血液淋巴细胞和CD34+细胞的转导。而且，在它们的跨膜结构域和/或胞质尾区带有改变的RD114GP突变体可以调节与MLV，SIV或HIV-1病毒核心颗粒的假型形成。我们证明了与逆转录病毒核心蛋白酶相容的切割位点必需存在于RD114GP的胞质尾区以能有效假型化。尽管切割位点和MLV蛋白酶的不相容改变假型化病毒颗粒的感染性，而不改变MLV核心上的GP结合(incorporation)，但切割位点和慢病毒蛋白酶的相容性调节了假型慢病毒核心的GP结合和感染性两者。因此，存在新的病毒装配途径，由此应该通过病毒蛋白酶除去限制其在慢病毒核心上结合的GP胞质尾区包含的决定簇(determinants)，以允许GP结合和假型病毒颗粒的感染性。1.RD114GP胞质尾区控制细胞-细胞和病毒-细胞的融合性。对于类型C和类型D哺乳动物逆转录病毒GPs，胞质尾区在调节病毒装配和融合性的过程中具有重要意义。几个证据确立了它们对糖蛋白定位、细胞表面密度、细胞-细胞融合、与异源或同源病毒核心相互作用/结合和病毒粒子感染性的作用。这些GPs胞质尾区是包含命名为R的羧基末端肽的结构基序，其包含酪氨酸胞吞信号-YXXL-(5)，并且病毒蛋白酶对其切割有力地调节GP的特性。切割前，在GP天然形式中，认为R肽与i)细胞胞吞机构的衔接蛋白复合物，ii)病毒颗粒中发现的成熟GP羧基末端(图1A中胞质尾区结构域T)和iii)病毒颗粒内部蛋白质(1，8，13，14，17，19，43)相互作用。RD114糖蛋白突变体的表征(这个报道)表明该胞质尾区带有的相关信号的存在。因此，如利用不同致癌逆转录病毒和慢病毒糖蛋白的研究所表明的(1，8，13)，其中通过点诱变破坏YXXL基序的RDΔYXXL突变体GPs最可能通过增加的细胞表面表达引起增加的细胞-细胞融合。然而，如通过RDRless，RDPrMLV，RDPrSIVRQAG，RDPrHIV和RDΔYXXL突变体GPs的表征所推论的，增加细胞-细胞融合性和/或细胞表面表达的突变可能不必然增加病毒结合和/或病毒感染性。此外，我们的数据表明假型载体的感染性取决于RD114GP修饰的胞质尾区和病毒核心类型的相容性。用其它类型C和D哺乳动物逆转录GPs获得的几个基因证据表明胞质尾区的未切割的细胞形式做为GP融合性的内在负调节物(2，14，17，30，33，43)和做为病毒颗粒装配期间基质蛋白质的伴侣(2，3)起作用。用RD114糖蛋白CT突变体获得的结果表明后者GP的融合控制被其胞质尾区以与类型C和D糖蛋白相似的方式调节。实际上，发现通过未明确的机理，胞质尾区的切割是激活几种类型C和D糖蛋白的融合潜力所必需的(2，14，30，33)。缺少CT切割产生了融合性差的糖蛋白。而且，通过在切割位置插入终止密码子获得的提前切割大大地增加了合胞体形成(2，30，33)。而且，我们的数据直接证实了RD114GP的羧基末端在病毒粒子装配期间或以后必需被切割以便可以得到感染性(图5)。另外，在形成成熟胞质尾区的区域(结构域T-图1B)或者在R肽中的突变改变了细胞-细胞融合的控制(14，17，43)，很有可能这是该胞质尾区结构和/或完整性破坏的结果。同样地，在胞质尾区具有几个突变的RD114GP突变体，例如RDPrMLV，RDPrSIVRQAG和RDPrHIV突变体，由于它们突变的胞质尾区引起的融合抑制控制的损失，可能具有增加的细胞毒性。2.慢病毒核心假型形成的新途径与慢病毒核心不同，RD114GP胞质尾区的修饰对MLV核心上RD114GP嵌合体的结合几乎没有影响(图4)。这表明对于GP结合，致癌逆转录病毒核心比慢病毒核心更具允许性，或者，可替代地，RD114GP带有的不相容性决定簇局限于慢病毒核心。然而，假型MLV载体颗粒的感染性很大程度受RD1114GP嵌合体胞质尾区中引入的切割位点类型影响(图3)。尽管用MLV切割位点置换RD114GP切割位点对感染没有影响，但慢病毒切割位点的插入显著地减少了感染。与当在MLV核心颗粒上结合时这些后者突变体的TM蛋白质胞质尾区加工缺陷一致(图5A)，这些结果表明后者假型载体感染性差是由于结合的GP嵌合体的融合潜力的缺乏。对于MLVGP，通过切割位点本身或病毒蛋白酶的突变达到的去除胞质尾区的切割产生了结合正常水平GP、但是没有感染性的突变体(33)。有趣地，用野生型RD114GP假型化的SIV载体的低感染性不能仅用其胞质尾区切割位点和慢病毒核心蛋白酶不相容来解释。实际上，我们的数据表明，与MLV-AGP相反，未修饰的RD114GP糖蛋白胞质尾区可能不允许与慢病毒核心进行最佳相互作用，阻止了后者GP的有效结合(图4)。RD114GP嵌合体特征的检测可以给该负相互作用提供分子基础。实际上，RD114GP胞质尾区用能结合的MLV-AGP胞质尾区置换引起了高达10倍增加的病毒结合(图4)，证明RD114GP胞质尾区含有与慢病毒核心不相容的决定簇。有趣地，通过在其胞质尾区切割位点的特异性中引入改变可以恢复相容性。一种可能性是这种改变可能诱导了胞质尾区的结构修饰，例如，通过减少与SIV基质蛋白质的不相容性，以致产生了与SIV核心最优的相互作用。然而，我们的数据也表明可替代的，非唯一性的可能性，即胞质尾区的切割可能与GP结合有关。RD114GP切割位点用来源于能假型化的MLV-AGP(突变体RDPrMLV)胞质尾区或来源于SIVGag蛋白质(突变体RDPrSIVRQAG)的切割位点置换引起了SIV核心颗粒上结合和病毒效价的增加，RDPrSIVARLMGP突变体除外。在最近的相关研究中，Cannon等发现未修饰的GALVGP被排除在HIV-1核心上结合(4)。R肽的截短及GALVCT或其切割位点用来源于MLV-A的相应序列置换引起了增加的GP结合和病毒效价(4)，这与我们用不同类型逆转录病毒糖蛋白获得的数据非常一致。因此，总之，这些数据表明假型化慢病毒属载体的感染性是假型糖蛋白CT和病毒核心相匹配的结果，并且通过用病毒核心蛋白酶切割它可以调节该感染性。尽管应该通过直接评定胞质尾区的切割来证实这些假设，但是我们设想了胞质尾区的切割和在非允许性核心上GP结合之间相关的可能性。尽管致癌逆转录病毒糖蛋白在质膜脂筏中定位(29)，已经表明慢病毒在这里起始出芽(25)，但是有可能这些未切割GPs的胞质尾区与基质蛋白质网络不相匹配。然后，在病毒装配位点附近的少数活性慢病毒属蛋白酶的存在可以按照依整于它们与它们CT所含切割位点的匹配性的方式来切割这些GP的胞质尾区。这将引起R肽的移除，和阻止在慢病毒核心上结合的不相匹配性决定簇的排除。然后，可能根据被动的结合机理，修剪的GPs可以结合在慢病毒属颗粒上。3.病毒载体许多类型的病毒已经形成了载体的基础。病毒感染包括病毒基因组引入宿主细胞中。该特性被用做病毒载体中基因递送的载体。所用病毒通常来源于病原体病毒物种，它们具有转染细胞的许多必要性状和能力。然而，不是所有病毒在细胞周期的所有阶段都将成功地转染所有细胞类型。因此，在病毒载体的发展过程中，常常修饰病毒基因组以增强它们引入外源基因构建体(转基因)或其它核酸的实用性和效率。同时，可以引入降低或排除它们引起疾病的能力的修饰。慢病毒属是逆转录病毒的亚群，由于逆转录病毒预整合复合物亲核特征，所以其能感染非分裂的细胞，这允许它通过核孔主动输入。因此，来源于人免疫缺陷病毒类型1(HIV-1)的慢病毒属可以体外和体内介导非有丝分裂细胞中转基因的有效递送、整合和长期表达(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。例如，在缺少细胞因子刺激的情况下，HIV为基础载体可以有效地转导人CD34+造血细胞(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等，1998；Miyoshi等，1999；Case等，1999)，并且这些细胞能长期移植在NOD/SCID小鼠中(Miyoshi等，1999)。而且，这些来源于初级受体的骨髓可以给次级小鼠移植转导细胞，证实了非常原始的造血前体，最可能是真正的干细胞的慢病毒载体介导的基因修饰。因为其它目前可用基因递送系统中没有一个具有这种能力，所以通过人干细胞(HLCs)基因修饰，慢病毒属载体为血细胞生成和相似现象的研究，及遗传和获得性疾病基因治疗提供了以前未被研究的基础。这种重要能力受到了重大生物安全性关注(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等，1998)。在慢病毒属载体原种的产生期间，能复制的重组体(RCRs)的偶然产生代表了在考虑将慢病毒载体用于人类基因治疗以前所要解决的主要问题之一。在逆转录病毒基因组中，也含有所有必需顺式作用元件的单个RNA分子带有所有编码序列。因此，载体生产系统的安全性最好通过在尽可能多的独立单元上分配编码其各种成分的序列，以最大化再次产生RCR将需要的交换数来获得。通过在宿主生产者细胞，例如293人胚胎肾细胞中共表达病毒颗粒包装元件和载体基因组产生慢病毒属载体颗粒。在HIV-1基载体情况下，病毒颗粒的核心和酶性元件来源于HIV-1，而包膜蛋白质来源于异源病毒，最通常的是VSV。HIV基因组的复杂度实际上有助于临床可接受载体系统的发展，其中编码毒力因子的一整套基因对于病理是必需的，但是对于转移病毒基因货物不是必需的。通常，多重减毒包装系统现在仅包含9种HIV-1基因中3种基因gag，编码病毒颗粒主结构蛋白质，pol，负责逆转录病毒特异性的酶，和rev，其编码转录后调节物，该调节物是有效的gag和pol表达所必需(Dull，等，1998)。从这种广泛缺失的包装系统，亲本病毒不可能被重建，因为60％其基因组已经被完全去除。在一个形式的HIV包装系统中，从4个单独DNA单元产生Gag/Pol，Rev，VSVG和载体。而且，已经将载体和辅助序列之间的重叠减少到几十个核苷酸以最小化同源重组的机会。通过在所谓的生产者细胞，例如293T人胚胎肾细胞中共表达病毒颗粒包装元件和载体基因组可以产生HIV-1类型(HIV-1)基载体颗粒。可以用大量质粒瞬时转染这些细胞。通常可以使用3到4种质粒，但是根据慢病毒属成分被分解成单独单元的程度，该数量可以更多。一般地，一种质粒编码来源于HIV-1的病毒颗粒的核心和酶性成分。该质粒称为包装质粒。另一种质粒编码包膜蛋白质，因为水泡性口炎病毒G蛋白质(VSVG)高度的稳定性和广泛的嗜性，所以最常见就是这种蛋白质。该质粒可称为包膜表达质粒。而另一种质粒编码将要被转移给靶细胞的基因组，即，载体本身，并且称为转移载体。通过该技术和其变异形式可以产生具有几百万转导单位/毫升(TU/ml)效价的重组体病毒。超速离心后，可以获得大约109TU/ml浓缩的原种。载体本身是转移给靶细胞的仅有遗传材料。它通常包含带有其衣壳化，逆转录，核输入和整合必需的顺式作用元件侧翼的转基因盒。如同以前制备的癌逆转录病毒载体，已制备“自我失活的”慢病毒属载体，因为一旦将它们转移给靶细胞，它们就失去了病毒长末端重复(LTR)的转录能力(Zufferey等，1998)。这种修饰还减少了能复制的重组体(RCR)出现的风险和避免了与启动子干扰有关的问题。4.假型化病毒载体逆转录病毒上的蛋白质结合对同源病毒糖蛋白不特异。在HIV-1病毒颗粒的外表面上已经鉴定了40多种不同宿主细胞来源的蛋白质，包括主要组织相容性复合物I(MHC-1)和MHC-II分子、粘着分子、共刺激分子和补体控制蛋白质48。此外，许多异源病毒糖蛋白可以结合到逆转录病毒颗粒中，并且介导感染性49。这种方法通称假型化，允许逆转录病毒载体转导更广泛范围的细胞和组织。用VSV-G糖蛋白改造慢病毒属载体例证了异源糖蛋白扩展载体嗜性的能力2。然而，已知糖蛋白(GPs)和异源病毒核心的共表达将不必然产生高感染的病毒颗粒8，14，15，50。env基因可以来源于任何病毒，包括逆转录病毒。逆转录病毒来源的env基因例子包括，但不限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV或MMLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)，鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV或MMTV)，长臂猿(gibbonape)白血病病毒(GALV或GALV)，人类免疫缺陷性病毒(HIV)和劳氏肉瘤病毒(RSV)。也可以使用其它env基因诸如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白质G(VSVG)，肝炎病毒和流感病毒的基因。尽管由于VSVG赋予了重组体病毒广泛的宿主范围，所以VSVG蛋白质是期望的env基因，但是VSVG对宿主细胞，例如包装细胞可能是有害的。因此，当使用基因诸如VSVG基因时，可以使用诱导型启动子系统，这样当不需要VSVG表达时，可以调节VSVG表达以最小化宿主毒性。可以使用例如，Gossen&Bujard(1992)的四环素调节的基因表达系统，以当从转移的细胞取走四环素时可以提供VSVG的诱导型表达。因此，在第一载体上存在tet/VP16反式激活蛋白，并且在另一个载体上由tet操纵基因序列控制的启动子下游克隆VSVG编码序列。提供病毒env核酸序列的载体与调节序列，例如启动子或增强子可操作地连接。调节序列可以是任何真核生物启动子或增强子，包括，例如EF1α，PGK，Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件，人巨细胞病毒增强子，痘苗P7.5启动子等等(也参见下面表1和2中列出的例子)。在一些情况下，诸如Moloney鼠白血病病毒启动子-增强子元件的情况下，该启动子-增强子元件位于LTR序列内或邻近LTR序列。优选地，调节序列是对从其构建载体的慢病毒不是内源性的调节序列。因此，如果从SIV制备载体，在SIVLTR中发现的SIV调节序列将被不是来源于SIV的调节元件置换通过包膜蛋白质和靶向特定细胞类型受体的抗体或配体相连，可以使重组体病毒定向。例如，通过将目的序列(包括调节区)和另一个基因插入到病毒载体中，载体现在是靶特异性的，其中该基因编码特异性靶细胞上受体的配体。通过插入例如糖脂或蛋白质可以将逆转录病毒载体制备为靶特异性的。通常，通过利用抗体的抗原结合部分或重组体抗体类型的分子，诸如单链抗体使逆转录载体定向，完成靶向。认为两种类型的机理引起了病毒颗粒上同源和异源病毒或细胞糖蛋白的装配。假如在病毒出芽位点假型糖蛋白足够丰富51，并且它的胞质尾区不具有与病毒装配和病毒颗粒形态学空间不匹配的决定簇49，那么GP结合的被动模型意味着假型糖蛋白和病毒核心之间非专性的相互作用。在这方面，含有短胞质尾区的异源GPs诸如FPV，LCMV和VSV的GPs(图2)可能通过被动机理结合在慢病毒属颗粒上。另一方面，在GP结合的主动模式，假型糖蛋白胞质尾区和病毒颗粒核心成分之间的相互作用规定了病毒颗粒的装配。文献中存在充足的证据支持至少对于慢病毒属52-55的病毒装配中这种相互作用的重要作用(在39，49的综述)。在最近研究中，我们提出慢病毒属核心颗粒用类型C和D哺乳动物逆转录病毒糖蛋白假型化涉及可替代的装配途径14。已经表明这些逆转录病毒中一些逆转录病毒，象GALV和RD114病毒的GPs在它们胞质尾区含有限制在慢病毒属核心上结合的决定簇8，14。约30-40个氨基酸长，类型C/D哺乳动物逆转录病毒GPs相对短的胞质尾区含有15-20个氨基酸长羧基末端肽，对于MLVs，其称为R，需要通过同源病毒核心蛋白酶对其切割以激活糖蛋白的融合潜能56-58。对于具有同源类型C/D病毒核心的假型形成，病毒蛋白酶对R肽切割的缺少改变了假型化病毒颗粒的感染性，而没有改变GP结合14，56，58。相反，切割位点和慢病毒属蛋白酶的相匹配性影响假型化慢病毒属核心颗粒的GP结合和感染性14。因此，在慢病毒属核心上这些GPs可能的结合途径可能涉及在病毒颗粒装配位点活性核心蛋白酶对R肽的切割，引起了损害假型化的胞质尾区决定簇的移除。根据这些观察结果，我们已经产生了用来源于GALV8和RD114的嵌合GPs假型化的有效的SIV来源载体(图2)。这些突变体糖蛋白，分别称为GALV/TR和RD114/TR(图2)，含有MLV-AGP胞质尾区，该胞质尾区的切割位点与HIV-1和SIV蛋白酶相匹配。可能是因为该特性，它们有效地结合在慢病毒属颗粒上(图2C)。5.灵长类血清中假型慢病毒属载体的稳定性已经证明了VSV-G假型化慢病毒属载体可用于体内或体外转导几种细胞类型3-7。然而，它们对人24和非人灵长类(图4)补体高度的敏感性可能阻止它们用于体内系统施用的用途。与VSV-G假型相反，用逆转录病毒糖蛋白产生的载体在人类和猕猴血清中是稳定的，RD114/TR假型化SIV载体恒定抗人血清，表明后面的载体可以特别适于系统基因递送(图4)。几种因素在决定补体敏感性方面起作用并且依赖于i)来源于不同个体的血清，ii)生产者细胞的类型34，36，iii)糖蛋白中α-(1-3)半乳糖糖表位的存在59-61或iv)假型化GP的类型34，36，62。人细胞产生的逆转录病毒通常在人血清中是抗性的，VSV-G假型载体除外24。然而，在最近的研究中，发现用MLVGPs包被和通过人细胞产生的致癌逆转录病毒载体以与距离人类增加的进化距离相关的方式，对来源于非人类旧大陆灵长类的血清中补体失活具有差异的敏感性63。对猕猴血清的敏感性引起了99％以上的载体降解63。因此，与用致癌逆转录病毒载体获得的这些后面的结果明显不一致的是，这里我们发现用逆转录病毒GPs假型化的慢病毒属载体在猕猴属血清中是相对稳定的(图4B)。如对HIV和SIV所进行的报道48，64，可以调节对血清应答和解释致癌逆转录病毒和慢病毒属颗粒之间差异的因素可能是CD46，CD55和CD59补体抑制分子结合到慢病毒属颗粒中。6.用假型化SIV载体转导原代细胞VSV-G假型化慢病毒属载体的广泛嗜性可能不适于将需要细胞类型特异性基因递送的特定基因转移的应用。通过利用来源于一些膜包膜病毒的糖蛋白的天然嗜性，或做为可替代方案，改造能结合的GPs(例如，MLV，GALV/TR或FPV-HA)的宿主范围可以获得更有选择性的嗜性65，66。例如，来源于引起肺感染和通过气道上皮细胞感染的病毒，象埃博拉病毒或流感病毒的表面糖蛋白的应用可以证明可用于人类气道基因治疗10。然而，应该注意，假型慢病毒属载体可能不总是保持假型化糖蛋白来源的亲本病毒的宿主范围。例如，尽管Mokola病毒，嗜神经性狂犬病病毒有效地假型化HIV-1载体12，但是该假型化载体不再现亲本病毒特异性神经性嗜性9。最近的报道已经证明用RD114GP假型化的致癌逆转录病毒载体有效地转导人和犬CD34+细胞16-18，21。转导的细胞可以采用和非转导细胞相似的效率移植到NOD/SCID小鼠和狗中和显示多谱系表达16-18。从这些研究，表明在人类CD34+细胞中，“基因递送的主要障碍在于受体水平，不是由于靶细胞的静止”18。我们尝试利用由MLV-A，GALV/TR，RD114/TR和VSV-G糖蛋白假型化的慢病毒属载体检验该假说。与以前的研究相反，我们利用了将最小化可以影响病毒/受体相互作用和/或转导的因素影响的感染条件，即，没有重复感染，retronection或基质细胞的缺少和仅仅最小的细胞因子处理。因此，在不允许MLV载体转导CD34+细胞的细胞因子处理情况下，通过单一和短时病毒/细胞暴露转导人类CD34+细胞26。因为这些次最优条件，基因递送的最大水平相对地低；然而，它们允许CD34+细胞转导中假型化GPs特定影响的可靠比较。清楚地，这些条件下最好的糖蛋白是VSV-G和GALV/TRGPs(图5A)。与VSV-G比较，通过用MLV-A和RD114/TRGPs假型化的载体达到了低得多的转导水平。这些结果可以反映对于不同GPs，在CD34+细胞上受体表达模式中的差异，看起来与以前报道的利用致癌逆转录病毒载体的结果相矛盾18。然而，RD114/TRGP和retronectin的联合应用大大地增加了人类细胞的转导，允许RD114/TR假型化的慢病毒载体超过用VSV-G假型化的载体(图5)，这与以前的研究相一致16-18。由于CH-296通过它对α4/5β整联蛋白的附着而结合细胞表面和通过高亲和性肝素II结构域而结合病毒糖蛋白的特性42，所以通过CH-296retronectin片段增加感染的机理可能涉及逆转录病毒颗粒和靶细胞的共定位43。尽管已经提出了涉及细胞程序死亡抑制和细胞分裂刺激的可替代解释，但是，因为根据用于假型化慢病毒属核心颗粒的糖蛋白类型检测了CH-296的不同作用，所以我们的结果支持前一个机理。细胞外基质的蛋白质，诸如硫酸乙酰肝素蛋白多糖在最初感染步骤中起重要作用，并且对于介导病毒/细胞附着68，其可能比病毒受体本身更重要，该病毒受体本身主要用来触发膜融合69，70。在几种包膜病毒糖蛋白中，已经鉴定出了不同地影响与细胞外基质蛋白质结合的基序71，72。在RD114糖蛋白中，它们可能特别有效，并且刺激CH-296介导的对细胞附着。在缺少rectronectin的情况下，RD114/TR假型化的SIV载体非常有效地转导人类和猕猴属PBLs(图6)。实际上，在这些细胞中，通过用VSV-G或MLV-AGP假型化的载体和用RD114/TRGP包被的载体观察到的转导效率存在显著差异。这种差异的原因可能在于这些GPs受体表达中的差异。做为可替代的方案，这些结果可能不必然涉及受体密度和/或最初病毒/受体相互作用参数的差异。几个报道已经表明转导效率与受体表达水平不相关17，73，而是确立了结合后事件的重要性，诸如受体成簇，膜融合机理，融合位点，脱壳和病毒颗粒从脱壳位点和核的迁移74，75。因此，可以推测对于用SIV载体进行的PBLs转导，RD114受体以比VSV-G或MLV-A受体更有效的方式调节结合后的事件。根据最终的应用，可以体内或体外转导细胞。甚至在人类基因治疗的范围中，诸如人类干细胞的基因治疗中，人们可以体内转导干细胞，或者做为可替代的方案，体外转导干细胞，接着将转导的干细胞输注到人受试者中。在该实施方式的一个方面，利用本领域技术人员公知的方法可以从人，例如人患者移出人干细胞，并且如上所述进行转导。然后，将转导的干细胞再引入相同或不同的人中。当通过将载体引入受试者直接处理人受试者时，通常利用载体的静脉内施用进行该处理。当离体转导细胞，例如CD34+细胞、树突细胞、外周血细胞或肿瘤细胞时，通常利用大约1到50的感染复数(MOI)剂量温育载体颗粒和细胞，该感染复数也相当于1×105到50×105个病毒载体转导单位/105个细胞。这当然包括对应于1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45和50MOI的载体量。通常，可以用Hela转导单位(TU)表示载体量。载体施用的其它途径包括动脉内、内窥镜、损伤内、经皮、皮下、肌内、鞘内、眼眶内、皮内、腹膜内、经气管、表皮下途径，通过intrastemal注射，通过吸入或鼻内喷雾，通过气管内途径等等。在涉及用本发明载体的肿瘤/癌症治疗的实施方式中，可以通过直接注射将表达载体递送到肿瘤中或递送到肿瘤血管系统中。可以相互交换地使用如这里所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”。所有这些术语也包含它们的子代，该子代是任何和所有随后的世代。应当理解，由于有意或无意突变，所有子代可以是不相同的。在表达异源核酸序列的情况中，“宿主”指原核生物或真核生物细胞，并且它包括任何可转化的生物体，该生物体能复制载体和/或表达本发明载体编码的异源核酸。宿主细胞可以并且已经用做载体的受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这指外源核酸被转移或被引入到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括初生受试者细胞和它的子代。如这里所用的术语“改造”和“重组”的细胞或宿主细胞指已经将外源核酸序列诸如，例如具有治疗基因构建体的本发明慢病毒属载体引入到其中的细胞。因此，重组细胞可以区别于天然存在的细胞，该天然存在的细胞不含有重组引入的核酸。在一些实施方式中，考虑在同一宿主细胞中共表达RNAs或蛋白质序列和其它选定的RNAs或蛋白质序列。通过用两种或多种不同重组载体共转染宿主细胞可以获得共表达。做为可替代方案，可以构建单一重组载体以包含RNAs的多个不同编码区，然后，可以在用该单一载体转染的宿主细胞中表达该RNAs的多个不同编码区。根据期望的结果是载体复制还是部分或全部载体编码的核酸序列表达，宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物。大量细胞系和培养物可以用做宿主细胞，并且可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得它们，该中心是做为活培养物和遗传材料保藏的组织。本发明中使用的一些宿主细胞的例子包括但不限于病毒包装细胞、病毒生产者细胞、293T细胞、人造血祖细胞、人造血干细胞、CD34+细胞和CD4+细胞等等。对本领域技术人员而言，不言而喻，本发明不限于任何一种特定细胞类型，并且人们可以利用本发明的慢病毒属载体和方法在许多细胞类型中表达转基因。所考虑的一些细胞类型例子包括终末分化的细胞诸如神经元、肺细胞、肌细胞、肝细胞、胰细胞、内皮细胞、心脏细胞、皮肤细胞、骨髓基质细胞、耳和眼细胞。此外，也可以考虑干细胞和祖细胞诸如胰管细胞、神经前体和中胚层干细胞。然而，最显著地，本发明较优选的慢病毒属载体具有高度期望的特征，该特征允许在人祖细胞中高水平表达转基因，同时满足人类生物安全的要求。为了产生病毒颗粒，人们可以利用与慢病毒属Gag和Pol基因表达相匹配的任何细胞，或者被改造以支持这种表达的任何细胞。例如，可以使用生产者细胞诸如293T细胞、TE671和HT1080细胞。当然，如上所述，本发明慢病毒属载体在获自骨髓，外周血或脐带血的人造血祖细胞或造血干细胞的转导中，及在CD4+T细胞、外周血细胞B或T淋巴细胞、外周血单个核细胞、树突细胞和单核细胞的转染中特别有用。特别优选的靶是CD34+细胞。组织可以包含待要用核酸递送组合物和/或另外试剂转化或接触的宿主细胞或细胞。组织可以是部分或分离自生物体。在一些实施方式中，组织和它们的组成细胞可以包含，但不限于血液(例如，造血细胞(诸如人造血祖细胞、人造血干细胞、CD34+细胞和CD4+细胞)，淋巴细胞和其它血液谱系细胞)、骨髓、大脑、干细胞、血管、肝、肺、骨骼、乳房、软骨、宫颈、结肠、角膜、胚胎、子宫内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、成纤维细胞、滤泡、神经节细胞、神经胶质细胞、杯形细胞、肾、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰脏、外周血、前列腺、皮肤、小肠、脾脏、胃和睾丸。B.生物体在一些实施方式中，宿主细胞或组织可以被包含在至少一种生物体中。在一些实施方式中，生物体可以是人类、灵长类或鼠类。在其它实施方式中，如本领域技术人员将理解的，生物体可以是任何真核生物或者甚至是原核生物(例如，真细菌，古细菌)。本发明的一些慢病毒属载体可以利用控制序列，该控制序列允许它们在原核生物和真核生物细胞中被复制和/或表达。本领域技术人员进一步将理解温育所有上述宿主细胞以维持它们和允许载体复制的条件。也可以理解和知悉的是这样的技术和条件，即该技术和条件允许本发明慢病毒属载体的大规模生产及慢病毒属载体编码的核酸和它们关联多肽、蛋白质或肽的生产，其中一些是将用于基因治疗的治疗基因或蛋白质。C.可注射的组合物和药物制剂为了利用本发明慢病毒属载体组合物实现基因治疗，通常人们将用包含治疗基因的慢病毒属载体接触有此需要的细胞。而且，细胞可以是存在于需要基因治疗的生物体诸如人中。自然地，给药途径将随着疾病的位置和特性而改变，并且包括例如静脉内、动脉内、皮内、经皮肤、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、肿瘤内、灌注和灌洗。有时也从生物体分离细胞，离体将其暴露于慢病毒属载体，此后再移植。只要表达构建体能通过注射所需特定规格的针，可以通过注射器或用于溶液注射的任何其它方法递送本发明慢病毒属核酸构建体的注射。最近已经描述了一种新的无针注射系统(US专利5,846,233)，其具有喷嘴，该喷嘴限定了用于容纳液体的安瓿室，和用于从喷嘴将溶液推压到递送位点的能量装置。已经描述了注射器系统用于基因治疗中，其允许以任何深度精确地多次注射预先确定数量的溶液(US专利5,846,225)可以在适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合的水中制备做为自由碱或药理学可接受盐的核酸的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中或油中制备分散体。在普通贮藏和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物生长。适于可注射应用的药物形式包含无菌水溶液或分散体和无菌粉末，用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备(US专利5,466,468)。在所有情况下，该种形式必需是无菌的，并且必需是流动的，该流动达到容易注射的程度。在制造和贮藏条件下，它必需是稳定的，并且必需防腐以抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，它们适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散体介质。例如，在分散体的情况下通过维持所需颗粒大小，通过利用包被诸如卵磷脂和通过利用表面活性剂可以维持适合的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌试剂，例如parabens、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等等可以防止微生物的作用。在许多种情况下，优选地包含等渗试剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如一硬脂酸铝和明胶可以引起可注射组合物的延长吸收。对于水溶液的肠胃外施用，例如，如果必要，溶液应该被适当缓冲，并且首先用足够的盐或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适于静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本发明的公开，可以使用的无菌水介质是本领域技术人员已知的。可以在1ml等渗NaCl溶液中溶解一个剂量，并且或者添加到1000ml皮下输液液体中，或者在的适合的灌注位点注射(参见，例如“Remington药物科学”15版，1035-1038页和1570-1580页)。根据待处理的受试者状态，必然会出现一些剂量的变化。在任何情况下，负责给药的人都将确定用于个体受试者的适合剂量。而且，对于人类给药，制剂应该满足FDA生物制剂标准局所要求的无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准。通过在适合溶剂中掺入需要量的活性化合物，和所需上述例举的各种其它组分，接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般地，通过向无菌载体中掺入各种灭菌的活性组分制备分散体，该无菌载体含有基本的分散体介质和来源于上述例举的那些的所需其它组分。在用于无菌可注射溶液制备的无菌粉末情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从其以前无菌过滤的溶液产生了添加有任何其它期望组分的活性组分粉末。这里公开的组合物可以以中性或盐形式配制。药物学上可接受的盐包括酸性加成盐，用无机酸诸如，例如盐酸或磷酸，或者有机酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、苯乙醇酸等等制成该加成盐。与自由羧基制成的盐也可以来源于无机碱诸如，例如氢氧化钠、钾、钙或铁和有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等。一旦制成制剂，将以与剂量制剂相匹配的方法和治疗有效的量施用该溶液。容易以各种剂量形式诸如可注射溶液、药物释放胶囊等等施用该制剂。这里所用的“载体”包含任何和所有溶剂、分散体介质、赋形剂、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延长试剂，缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等等。这种介质和试剂用于制药活性物质的用途是本领域熟知的。除了任何常规介质或试剂与活性组分不相容外，考虑它在治疗组合物中的用途。补加的活性组分也可以掺入到组合物中。短语“药物学上可接受的”或“药理学上可接受的”指当施用给人类时，不产生变应性或相似的不利反应的分子实体和组合物。本领域也熟知含有做为活性组分的蛋白质的含水组合物的制备。通常地，将这种组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制成固体形式，该固体形式适合于注射前液体中的溶解或悬浮。当应用于细胞时，这里用术语“接触”和“暴露”描述治疗性慢病毒载体递送给靶细胞的过程。为了基因治疗离散、实体、易接近的肿瘤，具体地考虑了肿瘤内注射或注射到肿瘤血管系统中。局部、区域或系统给药也是适合的。对于＞4cm的肿瘤，将要给药的体积大约是4-10ml(优选地10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用大约1-3ml的体积(优选地，3ml)。做为单剂量递送的多次注射包含约0.1到约0.5ml体积。有利地，可以通过大约1cm的间隔，施用给肿瘤多次注射来接触病毒颗粒。对于恶性血液病等疾病，优选系统给药。适合时也可以应用连续给药。优选通过注射器或导管插入术递送。在治疗开始后，这种连续灌注可以进行约1-2小时，到约2-6小时，到约6-12小时，到约12-24小时，到约1-2天，到约1-2周或更长。一般地，通过连续灌注的治疗组合物剂量将等同于单次或多次注射给出的剂量，在灌注进行期间的时间期间进行调整。治疗方案也可以变化，并且常常取决于疾病类型和疾病组织的位置，和诸如患者健康和年龄等因素。临床医生最适合根据基于本发明慢病毒属载体的治疗制剂的已知效力和毒性(如果有)做出决定。治疗可以包含各种“单位剂量”。单位剂量定义为含有预先确定量的治疗组合物，该治疗组合物含有本发明慢病毒属载体。临床领域技术人员知道给药的量，特定途径和制剂。单位剂量不需要做为单次注射给药，其也可以包括在一段时间期间的连续输注。用如通过滴定细胞系诸如Hela或293上的载体所定义的慢病毒载体转导单位(T.U)可以方便地描述本发明的单位剂量。单位剂量范围从103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013T.U至更高。8.核酸A.转基因和疾病治疗本发明的一个实施方式是转移编码基因的核酸，特别地，所述基因是给造血性和淋巴造血性疾病诸如上述遗传性或获得性疾病提供治疗的基因。在一个实施方式中，核酸编码这种基因的全长，基本全长或功能性等同形式。这些基因可称为转基因。可认为，根据应用，可以利用本发明慢病毒属载体递送人们期望的任何转基因。在递送给造血祖细胞的情况下，人们通常选择将赋予这种细胞期望功能的转基因，包括，例如珠蛋白基因、造血生长因子，其包含红细胞生成素(EPO)，白细胞介素(诸如白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)，白细胞介素-3(IL-3)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-12(IL-12)等)，和集落刺激因子(诸如粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨嗜细胞集落刺激因子或干细胞集落刺激因子)，血小板特异性整联蛋白αIIbβ，多药物抗性基因，在患有慢性肉芽肿病(CGD)患者中缺陷的gp91或gp47基因，使得细胞对病原体诸如人免疫缺陷病毒的感染具有抗性的抗病毒基因，在血友病患者中突变的编码凝血因子VIII或IX的基因，参与T细胞介导的免疫应答的配体诸如T细胞抗原受体，B细胞抗原受体(免疫球蛋白)，白细胞介素受体共同γ链，及T和B细胞抗原受体的单独联合或者与单链抗体诸如ScFv联合，肿瘤坏死因子(TNF)，IL-2，IL-12，γ干扰素，CTLA4，B7等等，在肿瘤细胞中表达的基因诸如Melana，MAGE基因(诸如MAGE-1，MAGE-3)，P198，P1A，gp100等。本发明的主要应用是提供载体，该载体因为大量可能的原因向造血细胞递送期望转基因。这可以包括，当然不限于可能由化学治疗或抑制免疫治疗或诸如AIDS等感染所引起的骨髓抑制(myelosupression)和中性白细胞减少症，遗传疾病，癌症等等的治疗。所考虑的造血细胞示例性遗传疾病包括镰状细胞贫血症、地中海贫血症、血红蛋白病(hemaglobinopathies)、Glanzmann血小板功能不全病、溶酶体贮藏疾病(诸如Fabry病，Gaucher病，Niemann-Pick病和Wiskott-Aldrich综合症)、重度联合免疫缺损综合症(SCID)及由于分泌性蛋白质例如凝聚因子VIII和/或IX系统生产缺乏引起的疾病。在这种情况下，人们期望引入转基因诸如珠蛋白基因、造血生长因子，其包含红细胞生成素(EPO)，白细胞介素(特别是白细胞介素-1，白细胞介素-2，白细胞介素-3，白细胞介素-6，白细胞介素-12等)，和集落刺激因子(诸如粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨嗜细胞集落刺激因子或干细胞集落刺激因子)，血小板特异性整联蛋白αIIbβ，多药物抗性基因，在患有慢性肉芽肿病(CGD)患者中缺陷的gp91或gp47基因，使得细胞对病原体诸如人免疫缺陷病毒的感染具有抗性的抗病毒基因，在血友病患者中突变的编码凝血因子VIII或IX的基因，参与T细胞介导的免疫应答的配体诸如T细胞抗原受体，B细胞抗原受体(免疫球蛋白)，白细胞介素受体普通γ链，及T和B细胞抗原受体的单独联合或者与单链抗体(ScFv)联合，，IL-2，IL-12，TNF，γ干扰素，CTLA4，B7等等，在肿瘤细胞中表达的基因诸如Melana，MAGE基因(诸如MAGE-1，MAGE-3)，P198，P1A，gp100等。示例性的癌症是造血来源的癌症，例如由髓样、淋巴样或红细胞谱系或其前体细胞引起的癌症。示例性的髓样疾病包括，但不限于急性前髓细胞性白血病(acutepromyeloidleukemia，APML)，急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)。可以利用本发明慢病毒属载体治疗的淋巴样恶性癌包括，但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)，其包括B-谱系ALL和T-谱系ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，幼淋巴细胞白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)和Waldenstrom巨球蛋白血症(WM)。考虑利用本发明慢病毒属载体治疗，做为候选者的其它形式恶性淋巴瘤包括，但不限于非Hodgkin淋巴瘤和其变异形式，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大粒状淋巴细胞白细胞(LGF)和Hodgkin氏疾病。因此，在本发明一些实施方式中，造血和淋巴造血疾病的治疗包括向造血来源细胞施用包含治疗核酸表达构建体的本发明慢病毒属载体。包含治疗核酸构建体的本发明慢病毒属载体用于治疗造血和淋巴造血疾病的药物制造用途也包含在本发明范围内。考虑造血细胞摄取了构建体并且表达核酸编码的治疗多肽，因此恢复了细胞正常表型。可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备核酸。合成核酸，特别是合成寡核苷酸的非限制性例子包括利用诸如EP266,032中所述的磷酸三酯，亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术，通过体外化学合成制备的核酸，或者通过如Froehler等，1986和U.S.专利序号5,705,629所述的脱氧核苷H-膦酸酯中间体制备的核酸。酶促产生核酸的非限制性例子包括在扩增反应诸如PCRTM中，通过酶产生的核酸(参见，例如U.S.专利4,683,202和U.S.专利4,682,195)或通过U.S.专利号5,645,897中所述寡核苷酸的合成产生的核酸。生物地产生核酸的非限制性例子包括活细胞中重组核酸的生产(参见，例如Sambrook等，2000)。可以在聚丙烯酰胺凝胶上，在氯化铯离心梯度上，或通过本领域技术人员已知的任何其它方法纯化核酸(参见，例如Sambrook等，2000)。术语“核酸”一般指至少一个分子或链的DNA，RNA或其衍生物或模拟物，包含至少一个核碱基诸如，例如DNA或RNA中发现的天然出现的嘌呤或嘧啶碱基，(例如，DNA中是腺嘌呤“A”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”)，(例如RNA中是A，G，尿嘧啶“U”和C)。术语“核酸”包含术语“核苷酸”和“多核苷酸”。术语“寡核苷酸”指长度在约3和约100个核碱基之间的至少一个分子。术语“多核苷酸”指长度大于约100个核碱基的至少一个分子。这些定义一般地指至少一个单链分子，但是在特定实施方式中，它们也包含至少一条另外的链，该链与所述至少一个单链分子部分，基本或全部互补。因此，核酸可以包含至少一个双链分子或至少一个三链分子，它们含有一个或多个互补链，或者含有该分子链的特定序列的“互补链”。在一些实施方式中，“基因”指被转录的核酸。这里所用的“基因片段”是基因的核酸片段。在一些方面，基因包含参与转录，或信息产生或组合的调节序列。在特定实施方式中，基因包含编码蛋白质、多肽或肽的转录的序列。在其它特定方面，基因包含核酸和/或编码多肽，或在造血和淋巴造血疾病中缺陷或突变的基因的肽编码序列。与这里所述术语保持一致，“分离的基因”可以包含转录的核酸、调节序列、编码序列等等，其实质上与其它这种序列诸如其它天然出现的基因、调节序列、多肽或肽编码序列是相分离的。在这方面，术语“基因”简单地用于指包含被转录的核苷酸序列的核酸和其互补序列。在特定方面，转录的核苷酸序列包含至少一个功能性蛋白质、多肽和/或肽编码单元。如本领域技术人员将要理解的，该功能性术语“基因”包含基因组序列，RNA或cDNA序列，或更小的改造核酸片段，它们包含基因非转录部分的核酸片段，这种核酸片段包括，但不限于基因非转录的启动子或增强子区。更小的改造的基因核酸片段可以表达或者利用核酸操作技术其可以被改造以表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白质、突变体和/或类似物。因此“截短的基因”指丢失一段邻接核酸残基的核酸序列。根据特定的核酸序列可以设计各种核酸片段，并且该核酸片段可以具有任何长度。通过给序列分配数值，例如，第一个残基是1，第二个残基是2等，可以产生定义所有核酸片段的算法n到n+y其中n是从1到序列最后一个序号的整数，y是核酸片段长度减去1，n+y不超过序列最后的序号。因此，对于10mer，核酸片段对应于碱基1到10，2到11，3到12……和/或等等。对于15mer，核酸片段对应于碱基1到15，2到16，3到17……和/或等等。对于20mer，核酸片段对应于碱基1到20，2到21，3到22……和/或等等。不管序列本身的长度，本发明核酸可以与其它核酸序列联合以产生一个或多个核酸构建体，其它序列包括，但不限于启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、编码片段等等。核酸构建体之间总长可以相当大地变化。因此，可以利用几乎任何长度的核酸片段，优选地，以在将进行的重组核酸方法中容易制备和使用来限定总长度。术语“载体”用于指其中可以插入核酸序列以向它可以复制的细胞中引入该核酸序列的载体核酸分子。本发明的载体是上述和申请文件其它部分所述的基于慢病毒属。本发明载体带有的核酸分子编码治疗基因，并且将用于进行基因治疗。本领域技术人员完全能够通过标准重组方法构建这种治疗载体(参见，例如Maniatis等，1988和Ausubel等，1994)。术语“表达载体”指任何类型的遗传构建体，其包含能被转录的编码RNA的核酸。在一些情况下，然后，RNA分子被翻译为蛋白质、多肽或肽。在其它情况下，例如，在反义分子或核酶的产生中，这些序列不被翻译。表达载体可以含有各种“控制序列”，该控制序列指对特定宿主细胞中可操作连接的编码序列的转录和可能翻译必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体可以还含有下述用做其它功能的核酸序列。B.多克隆位点本发明载体可以含有多克隆位点(MCS)，其是含有多个限制酶位点的核酸区，任何一个克隆位点都可以与标准重组技术一起使用以消化载体(参见，例如Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Ccea，1997)。“限制酶消化”指用仅在核酸分子特定位置起作用的酶催化切割核酸分子。可商购得到许多这些限制酶。本领域技术人员广泛地知道这种酶的用途。常常，利用在MCS内切割的限制酶线型化或片段化载体以能够将外源序列与载体连接。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，其可以相互邻接或可以不相互邻接。涉及限制酶和连接反应的技术是重组
技术领域：
技术人员熟知的。C.剪接位点大多数被转录的真核生物RNA分子将受到RNA剪接以从初级转录物除去内含子。含有基因组真核生物序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物正确加工(参见，例如Chandler等，1997)。D.终止信号一般地，本发明载体或构建体将包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含DNA序列，该DNA序列参与RNA聚合酶对RNA转录物的特定终止。因此，在一些实施方式中，考虑结束RNA转录物产生的终止信号。在体内，终止子可能是必需的以获得期望的信息水平。在真核生物系统中，终止子区也可以包含特异DNA序列，其允许新转录物的特异性位点切割以暴露聚腺苷酸化位点。其发出信号给专门的内源聚合酶以向转录物的3’末端添加一段约200个A残基(polyA)。用该polyA修饰的RNA分子看起来更稳定，并且被更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的其它实施方式中，优选地，终止子包含用RNA切割的信号，更优选地，终止子信号促进信息的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以用来增加信息水平和最小化从此盒子到其它序列的连读。本发明中考虑使用的终止子包括这里所述或本领域技术人员已知的任何已知转录终止子，包括，但不限于例如基因终止序列，诸如，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，诸如，例如SV40终止子。在一些实施方式中，诸如由于序列截短，终止信号可以是缺少可转录或可翻译的序列。E.聚腺苷酸化信号在真核生物基因表达中，人们通常包含聚腺苷酸化信号以实现转录物的正确聚腺苷酸化。不认为聚腺苷酸化信号的特性对本发明的成功实施是至关重要的，并且可以利用任何这种序列。一些例子包含SV40聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号，这些信号是适宜的并且已知在各种靶细胞中充分起作用。聚腺苷酸化可增加转录物的稳定性或可便于胞质转运。F.复制起点为了在宿主细胞中增殖本发明载体，它可以含有一个或多个复制起点位点(常常称为“ori”)，其是起始复制的特异性核酸序列。做为可替代方案，如果宿主细胞是酵母，可以使用自主复制序列(ARS)。G.选择性和筛选性标记在本发明一些实施方式中，通过在表达载体中包含标记，可以体外或体内鉴定用本发明慢病毒属载体转导的细胞。这种标记将给转导的细胞提供可鉴定的改变，允许容易地鉴定含有表达载体的细胞。一般地，选择性标记是赋予允许筛选的特性的标记。正选择性标记是其中该标记的存在允许其筛选的标记，而负选择性标记是其中它的存在阻止其筛选的标记。正选择性标记的例子是药物抗性标记。通常地，含有药物筛选标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、Zeocin、组氨醇抗性的基因构建体可用做选择性标记。除了赋予表型的标记外，还可以考虑其它类型标记，包括筛选性标记诸如GFP，其基础是比色计分析，其中所述表型允许根据条件的实施区分转化体。做为可替代方案，可以利用筛选性酶诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员也将知道如何利用免疫学标记，可能的话与FACS分析联合。只要标记能与编码基因产物的核酸同时被表达，并不认为所用标记是重要的。选择性和筛选性标记的其它例子是本领域技术人员熟知的。9.启动子和增强子“启动子”是控制序列，该控制序列是核酸序列区域，在该区域控制转录起始和速率。它可以包含调节蛋白质和分子诸如RNA聚合酶和其它转录因子可以结合的基因元件，以起始核酸序列的特异性转录。短语“可操作地位于”，“可操作地连接”、“处于控制之下”和“处于转录控制下”意指启动子相对于核酸序列位于正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。一般地，启动子包含起定位RNA合成起始位点作用的序列。这个的最好已知例子是TATA盒子，但是在一些启动子中缺乏TATA盒子，诸如，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因启动子和SV40晚期基因启动子，覆盖起始位点本身的离散元件有助于定位起始位置。其它启动子元件调节转录起始的频率。尽管已经表明大量启动子在起始位点下游也含有功能性元件，但是，通常地，这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp区域。为了使编码序列在启动子“控制之下”，可在选定启动子下游(即，3’)放置转录读框转录起始位点的5’末端。“上游”启动子刺激DNA转录并且促进编码的RNA的表达。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，这样当元件相互反向或移动时，保存了启动子的功能。在tk启动子的情况下，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到间隔50bp。根据启动子，看起来单独的元件可以协同地或独立地起作用以激活转录。启动子可以与“增强子”一起使用，或不与其一起使用，增强子指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5’非编码序列获得该启动子。这种启动子可以称为“内源的”。相似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于序列的下游或上游。做为可替代方案，通过编码核酸片段定位于重组或异源启动子控制下可以获得一些优点，所述启动子指与其天然环境中的核酸序列不天然相关的启动子。重组或异源增强子也指与其天然环境中核酸序列不天然相关的增强子。这种启动子或增强子可以包含其它基因的启动子或增强子，和从任何其它病毒或原核生物或真核生物细胞分离的启动子，和不“天然存在”的启动子或增强子，即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包含β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。关于这里公开的组合物，除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，可以利用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCRTM产生该序列(U.S.专利4,683,202和5,928,906)。而且，考虑也可以利用非核细胞器诸如线粒体、叶绿体等等中引导序列转录和/或表达的控制序列。包含启动子、增强子和其它基因座或转录控制/调节元件的控制序列也称为“转录盒”。自然地，利用在选定用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中有效地引导DNA片段表达的启动子和/或增强子是重要的。一般地，分子生物学领域的技术人员知道启动子、增强子和细胞类型联合对于蛋白质表达的用途(参见，例如Sambrook等，2000)。所用启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在适合条件下有用的，以引导所引入DNA片段高水平表达，诸如有利地用于基因治疗或用于诸如大规模产生重组蛋白质和/或肽等应用。启动子可以是异源的或内源的。T3，T7或SP6胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方式。如果提供了适合的细菌聚合酶，真核生物细胞可以支持从一些细菌启动子的胞质转录，其中该细菌聚合酶或者做为递送复合物的部分或者做为另外的基因表达构建体。表1列出了本发明上下文中可以使用的调节RNA表达的元件/启动子的非限制性例子。表2提供了诱导型元件的非限制性例子，其是可以被激活以应答特异性刺激的核酸序列区域。组织特异性启动子或元件的鉴定及表征它们活性的测定法是本领域技术人员已知的。这种区域的非限制性例子包括人LIMK2基因(Nomoto等，1999)，抑生长素受体2基因(Kraus等，1998)，鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre等，1999)，人CD4(Zhao-Emonet等，1998)，小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki，等，1998)，D1A多巴胺受体基因(Lee，等，1997)，胰岛素样生长因子II(Wu等，1997)和人类血小板内皮细胞粘着分子-1(Almendro等，1996)。主要地，设计本发明的慢病毒属载体以用处于调节型真核生物启动子控制下的治疗基因转化细胞。尽管优选gp91phox启动子，也可以使用上面表1和2中所述其它启动子和调节信号元件。此外，任何启动子/增强子联合(根据真核生物启动子数据库EPDB)都可以用于驱动编码目的治疗基因的结构基因的表达，其中在上下文中，该目的治疗基因与本发明慢病毒属载体使用。做为可替代方案，用于癌基因治疗或肿瘤靶向的组织特异性启动子可以与本发明慢病毒属载体使用以用于癌症、特别是血液学癌症的治疗。通常，真核生物细胞中控制蛋白质编码基因转录的启动子和增强子包含多个遗传元件。细胞机构能收集和整合每个元件传递的调节信息，使不同基因发展成不同的，常常是复杂的转录调节模式。启动子和增强子元件的激活或阻抑可以通过这些元件与适合的转录激活物或阻抑物，诸如图1B中用于gp91-phox启动子的和Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.27118203-210，Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.27123445-23451中所述的转录激活物或阻抑物接触而完成。关于gp91-phox启动子，干扰素γ在调节表达盒转录和表达中的活性是可以如何在本发明实践中使用这种启动子或增强子元件和与它们相互作用的因子的例子。增强子原始被检测为增加从启动子转录的基因元件，该启动子位于同一DNA分子上较远的位置。在原核生物转录调节的经典研究中，经过很长一段距离起作用的这种能力几乎没有先例。随后的研究表明具有增强子活性的DNA区域组织很像启动子。即，它们包含许多单独的元件，每个元件都结合一种或多种转录蛋白质。参见，例如图1B中所示的gp91-phox启动子的调节模式。本发明考虑的示例性增强子是如LienLL，LeeY，OrkinSH，(1997)“通过将酵母人工染色体克隆转移到胚胎干细胞中研究髓样细胞表达的人gp91-phox基因的调节多样化细胞表达模式的抑制需要远距离顺式元件的全部互补”MolCellBiol.17(4)2279-90所述的DNAase超敏感元件和它们同系物。在增强子元件的影响下，基因表达可以更高(由于HS增强子活性)和更少多样化(由于HS沉默子活性)。gp91-phox的HS元件类似物在其它启动子-增强子系统中是有活性的。参见，例如MayC，RivellaS，CallegariJ，HellerG，GaenslerKM，LuzzattoL，SadelainM，(2000)表达慢病毒属载体编码的人β-珠蛋白的β-珠蛋白生成障碍性贫血小鼠中治疗性血红蛋白合成.Nature406(6791)82-6，其中类似β珠蛋白HS元件被包含在β珠蛋白启动子上游慢病毒属载体中以驱动β珠蛋白cDNA的表达。在细胞中，启动子和增强子具有相同的激活转录的一般功能。它们常常重叠和邻接，常常看起来具有非常相似的模块组织。这些考虑放到一起表明增强子和启动子是同源实体，并且结合这些序列的转录激活蛋白质可以与细胞转录机构以基本相同的方式进行相互作用。增强子和启动子的基本区别是操作上的。增强子区做为整体必需能在远距离刺激转录；这对启动子区或它的成分元件不一定就成立。另一方面，启动子必需具有在特定位点和特定方向引导RNA合成起始的一个或多个元件，而增强子缺少这些特征。除了这个操作上的区别外，增强子和启动子是非常相似的实体。因此，控制转录和表达的元件构建体可以包含排列的各种元件，以提供增强的应用和操作的控制方法。可以证明有用的信号是聚腺苷酸化信号(hGH，BGH，SV40)。应用内部核糖体结合位点(IRES)元件用于产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能绕过依赖于5’-甲基化帽子翻译的核糖体扫描模式，并且在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来源于小RNA病毒家族两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)及来源于哺乳动物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以连接异源开放读框。可以一起转录多个开放读框，每个读框都被IRES分开，产生多顺反子信息。由于IRES元件，每个开放读框都可以接近核糖体用于有效翻译。利用单一启动子/增强子以转录单一信息可以有效地表达多个基因。在任何情况下，不言而喻，启动子是功能性地定位于基因上游时表达该基因的DNA元件。将要利用本发明慢病毒属载体转化的大多数转基因都是功能性定位于启动子元件下游。也可能需要特异性起始信号用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或邻接序列。也可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地确定这个并且提供必需的信号。熟知起始密码子必需与期望的编码序列读框是“符合读框的”以确保完整插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适合的转录增强子元件可以增强表达效率。10.序列表的简要描述SEQIDNO1提供了[]的核苷酸序列SEQIDNO2提供了[]的氨基酸序列SEQIDNO3提供了[]的核苷酸序列SEQIDNO4提供了[]的氨基酸序列11.实施例包括下面的实施例以示范本发明优选的实施方式。本领域技术人员应该理解下面实施例中公开的技术代表了在本发明实践中有效起作用的本发明人发现的技术，因此可以认为这些技术构成了本发明实践优选的方式。然而，根据本发明的公开，本领域技术人员应该理解可以对所公开的具体实施方式进行改变，同时仍旧获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。A.实施例1-10中使用的材料和方法学1.细胞在补加有10％胎儿牛血清(FCS)的DMEM(LifeTechnologies，France)中培养293T人胚胎肾细胞系(ATCCCRL-1573)和TE671人横纹肌肉瘤细胞系(ATCCCRL-8805)。如前述26-28，分别从流动血液和骨髓样品获得人类和猕猴(Macacafascicularis)CD34+细胞。Ficoll-Paque(Pharmacia，Sweden)梯度离心后回收CD34+细胞，并且用抗-CD34M40Dynabeads(Dynal，Norway)纯化。CD34+细胞纯度超过95％。如前所述29，利用Ficoll-Hypaque/Percoll梯度(Pharmacia，Sweden)，从健康供体的新鲜血液分离人和猕猴外周血单个核细胞(PBMCs)。在37℃，通过过夜贴壁培养，从PBMC级分富集外周血淋巴细胞(PBLs)以分离贴壁的单核细胞，并且检测CD3标记表达(75-85％是CD3+)。2.抗体抗RD114GP(ViroMedBiosafetyLabs，USA)是山羊抗血清，抗RD114gp70包膜糖蛋白(SU)，稀释到1/5,000用于Western印迹。抗SIVCA(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram，USA)是鼠单克隆抗体(2F12)，抗SIVmac251p27衣壳蛋白(CA)，稀释到1/500用于Western印迹。抗-MLVCA(ViroMedBiosafetyLabs，USA)是山羊抗血清，抗Rausher白血病病毒(RLV)p30衣壳蛋白(CA)，稀释到1/10,000用于Western印迹。3.包装和转移载体构建体pSIV-12包装质粒(图1)是pSIV825的衍生物，并且表达hCMV启动子控制下的SIVmac251gag-pol基因和其中rev两个外显子已经被融合并且置放于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG)启动子，HMG内含子I和SV40聚腺苷酸化序列控制下的HIV-1rev基因表达单元。pSIV-T1+质粒30编码能包装的SIVmac251基载体，该载体表达CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因(图1)。pSIV-T1+质粒编码能包装的SIVmac251基载体，该载体表达CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因。TransgeneSA(Strasbourg，France)友好地提供了pTG5349鼠白血病病毒(MLV)包装质粒和pTG13077质粒，其编码含有CMV-GFP内部转录单元的MLV基-载体。4.病毒糖蛋白表达构建体下面的质粒phCMV-G31，EboV-GP(V.Volchkov惠赠)，phCMV-HA32，phCMV-10A133和phCMV-GALV33分别编码水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白质，埃博拉病毒(EboV)Zaire株系的糖蛋白，家禽瘟疫病毒(FPV)H7-HA血凝素，MLV-10A1和长臂猿白血病病毒(GALV)包膜糖蛋白。所有糖蛋白都是在相同顺式作用信号CMV启动子，兔β珠蛋白内含子II和聚腺苷酸化序列控制下表达(图1)。phCMV-G用做表达来源于猫内源病毒RD114(GenbankX8782934)和兼嗜性MLV4070A株系(MLV-A35)的糖蛋白的骨架。phCMV-RD114表达载体，其表达RD114病毒包膜糖蛋白(RD114GP)，和phCMV-GALV构建体被进一步修饰以表达带有MLV-AGP胞质尾区的RD114/TR(图2B)和GALV/TR8，13，15嵌合糖蛋白。进一步修饰表达RD114病毒包膜糖蛋白(RD114GP)的phCMV-RD表达载体以产生一系列突变体，该突变体含有在RD114GP跨膜结构域(TMD)和/或胞质尾区(CT)中的修饰。通过PCR介导和寡核苷酸位点定向诱变产生随后的所有随后的构建体(根据请求可获得细节和序列)，并且在phCMV-RD质粒中克隆该构建体。突变体RD114GPs羧基末端部分的氨基酸序列如图7中所示。5.合胞体测定如前述(9)，用于融合测定的Hela细胞是HIV-1长末端重复(LTR)控制下的β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的稳定转染体，它的表达是Tat依赖型(HeLaCD4LTRLacZ细胞)，或者组成型表达HIV-1的Tat蛋白质(Hela-Tat细胞)。基本如前述(9，16)定量包膜介导的融合。在该测定中，一旦表达包膜的细胞和具有受体的指示细胞融合时，Tat蛋白质就反式激活HIV-1LTR驱动的β-半乳糖苷酶表达。转染前24小时，每12孔平板接种5×104HeLaCD4LTRLacZ细胞。根据制造商的建议，利用磷酸钙转染方法(Clontech，France)，用1μg质粒，将病毒糖蛋白表达构建体转染到上述Hela细胞中。转染后24小时，105指示Hela-Tat细胞与病毒糖蛋白呈递细胞共培养36到48小时。如前述(9，16)，在PBS(磷酸盐缓冲液)中，用0.5％(重量/体积)戊二醛固定后，测定细胞-细胞融合，用PBS冲洗，并且通过在5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃型半乳糖苷(X-gal)溶液中温育染色。计数表示呈递包膜和含有Tat的指示细胞之间融合的蓝色合胞体，不管每个合胞体细胞核的数量。6.逆转录病毒载体的产生如前述25，通过293T细胞的瞬时转染产生假型化SIV来源的载体。pSIV-T1+载体构建体(8.1μg)，pSIV-12包装构建体(8.1μg)，和病毒糖蛋白表达构建体(2.7μg)用于共转染在转染前一天接种在10cm平板中的293T细胞。转染后16小时置换培养基(12ml/平板)，并且24小时后收集上清液。通过在26ml超速离心管沉淀病毒颗粒进行载体颗粒的浓缩，该超速离心管在70TiBeckman离心机转头中，在4℃以32,000rpm旋转1小时。以1/100病毒上清液原始体积，在补加有1％牛血清白蛋白(BSA)的无血清DMEM中重悬浮病毒沉淀，等分并且贮藏在-80℃。通过pTG5349MLV包装构建体(8.1μg)，pTG13077MLV载体构建体(8.1μg)，和糖蛋白表达构建体(2.7μg)的瞬时转染，用相似的方法产生假型化MLV来源的载体。根据制造商的建议，利用磷酸钙转染方法(Clontech，France)，将质粒DNAs转染到转染前一天接种在10cm平板中的2.5×106293T细胞中。转染后16小时置换培养基(8ml/平板)，并且24小时后收集上清液，通过0.45μm大小孔膜过滤。7.糖蛋白的免疫印迹和病毒结合(incorporation)在含有1％Triton-X100，0.05％SDS(十二烷基硫酸钠)，5mg/ml去氧胆酸钠，150mMNaCl和1mMPMSF的20mMTris-HCl缓冲液(pH6.5)中裂解病毒生产者细胞。在4℃温育裂解液10分钟，在13,000xg离心5分钟以沉淀核酸。然后冷冻上清液用于进一步分析。通过在SW41Beckman转子(25,000rpm，2.5小时，4℃)中1.5ml20％蔗糖垫层，超速离心病毒上清液(8ml)获得纯化的病毒样品。在100μlPBS中悬浮病毒沉淀，在-80℃冷冻。在含有6％SDS，30％β-巯基乙醇，10％甘油和0.06％溴酚兰的375mMTris-HCl(pH6.8)缓冲液中以5∶1(体积/体积)混合样品(30μl细胞裂解液或20μl纯化的病毒)，煮沸5分钟，然后在9％SDS-PAGE上凝胶电泳。蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上以后，在有10％奶粉和0.1％TWEEN的TBS(Tris碱的盐水，pH7.4)中进行免疫染色。用相关抗体探测该印迹，利用HRPO-缀合的Ig(免疫球蛋白)和增强型化学发光试剂盒(AmershamLifeScience)显色该印迹，该HRPO-缀合的Ig抗每个初级抗体种类(DAKO，UK)。8.代谢标记和免疫沉淀用不同致癌逆转录病毒或慢病毒属载体成分转染后12小时，使病毒生产者细胞在没有半胱氨酸和甲硫氨酸的培养基中受饿1小时，并且在37℃，在3ml没有半胱氨酸和甲硫氨酸的DMEM中标记16小时，该DMEM含有100μCi35S-半胱氨酸和35S-甲硫氨酸(ICN)/ml和2％透析的胎儿牛血清。如前述(9)，裂解细胞，并且用山羊抗RD114SU血清免疫沉淀。为了分析TMGP亚基胞质尾区的加工，收集病毒生产者细胞的上清液，并且通过0.4mm孔大小的滤膜过滤。在SW41转子(Beckman)中，以30,000rpm，在2ml20％蔗糖垫层上超速离心上清液2小时。通过添加150ml裂解缓冲液(50mMTrisHCl(pH7.5)，15mMNaCl，5mMMgCl2，5mMKCl，1％TritonX-100，0.5％去氧胆酸钠)裂解沉淀。保存1/5裂解液，这样电泳以通过western印迹粗分析病毒蛋白质含量，而剩余的裂解液用于和抗RD114SU抗体进行免疫沉淀。在还原条件下，在十二烷基硫酸钠(SDS)-12％聚丙稀胺凝胶上电泳免疫沉淀物以从SU解离共沉淀的TMGP亚基。9.感染测定利用TE671做为靶细胞，如前述25，进行转导效率和感染效价的测定。如前所述36，通过在37℃，在病毒制备物和新鲜血清1∶1(体积/体积)混合物中温育后，滴定存活病毒颗粒检测人或猕猴血清中假型载体的稳定性。每个点使用大约5×104GFP感染单元假型化载体颗粒。从健康血液供体收集血清，如公开的36所述进行调节。测定病毒颗粒的稳定性为灵长类血清处理的病毒的感染性对胎儿牛血清处理的病毒的百分数。用热失活血清(56℃，1小时)做为对照。在转染前一天，在6孔板中，以每孔3×105个细胞密度接种TE637靶细胞。在6μg/mlPolybrene存在情况下，向细胞添加系列稀释的载体制备物，并且在37℃温育培养物4小时。然后用正常培养基替换含有载体的培养基，并且在37℃温育细胞72小时。在胰蛋白酶中个体化转染细胞和在PBS中重悬浮它们后，通过FACS分析检测转导效率，该转导效率测定为GFP阳性细胞百分数。用公式效价＝％inf×(3×105/100)×d计算感染效价，表示为感染单位(i.u)/ml；其中“d”是病毒上清液的稀释倍数，“％inf”是利用转导1％到5％之间GPF阳性靶细胞的病毒上清液稀释液，通过FACS分析测定的GFP阳性细胞百分数。10.原代细胞的转导在补加有抗生素(StemCellTechnologies，Meylan，France)和10ng/ml血小板生产素(TPO；PeprotechInc，London，UK)的2mlStemSpanSFEM培养基中，以2×106细胞/孔在12孔板中过夜温育纯化的CD34+细胞。然后，预先激活的CD34+细胞接种在96孔板中(104/孔)，并且在含有TPO和6μg/mlPolybrene的总体积200μlStemSpan培养基中用假型化载体转导。利用TE671靶细胞测定的可变感染复数(MOIs)应用于靶细胞，并且是在0.5到60感染性颗粒/靶细胞的范围。利用相同方法在用8μgretronectin/孔预先包被2小时的96孔板中，进行retronectin包被孔中的转导(CH-296；TakaraShuzo，Japan)。16小时后，冲洗CD34+细胞，在补加有10％胎儿牛血清(LifeTechnologies，France)，抗生素和10ng/mlFlt3-L，TPO和干细胞因子(SCF)的400μlStemSpan培养基中悬浮该细胞3天。感染后5天，通过FACS分析法分析GFP表达。如前述，通过向含有2×106人PBLs的1ml培养基添加1μg抗-CD3(HIT3a，Pharmingen)和抗CD28(CD28.2，Pharmingen)抗体29，或者通过向2×106猕猴PBLs添加5ng/ml伴刀豆球蛋白A和10ng/mlIL237，在感染前预先活化人和猕猴PBLs24小时。为了转导，在37℃，在补加有6μg/mlPolybrene的总体积1ml的PBL培养基中混合105个活化PBLs与假型化载体4小时。感染后，在PBS中洗细胞，在37℃，在补加有IL2的RPMI-1640(LifeTechnologies，France)中温育5天，一直到用FACS分析测定转导效率时为止。B.实施例1-10实施例1不同病毒糖蛋白假型化SIV载体的能力我们检测了一组病毒糖蛋白(GPs)假型化来源于猴免疫缺损病毒(SIVmac251)的慢病毒载体的能力。这些糖蛋白来源于类型C哺乳动物逆转录病毒，诸如猫内源逆转录病毒RD114，兼嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)，MLV-10A1和长臂猿白血病病毒(GALV)的EnvGPs，或来源于包膜病毒诸如家禽瘟疫病毒(FPV血凝素FPV-HA)，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，埃博拉病毒(EboV)和水泡性口炎病毒(VSV)GPs。通过在用3种质粒转染的293T细胞中瞬时表达产生假型化SIV载体(图1)，所述3种质粒编码SIV病毒核心蛋白质，含有GFP标记基因的SIV基转移载体和不同GPs。TE671人横纹肌肉瘤细胞上的感染测定表明对于用VSV，LCMV，MLV-A和MLV-10A1的GPs产生的载体，获得了高于105i.u/ml的效价(图2A)。相反，用EboV和FPV的GPs产生的载体具有小于5×103i.u/ml的低效价。用GALV和RD114的GPs产生的SIV载体具有104至5×104i.u/ml之间的中等效价。在其它靶细胞诸如293T细胞上重现了假型载体感染性的这些相对差异(未示出数据)，表明TE671细胞上感染效价的测定反映了不同GPs假型化SIV核心的能力。用FPV，GALV和RD114产生的SIV载体获得的感染效价惊人地低于用相同糖蛋白假型化的MLV载体获得的感染效价21，34，38。因为慢病毒属核心颗粒的出芽不依赖于病毒糖蛋白的表达39，这表明病毒颗粒不能有效地结合这些GPs，或者，在GP装配后，它们不能从生产者细胞出去。实际上，当用神经氨酸酶处理表达FPV-HA的载体生产者细胞时，HA假型化载体的感染性大大地增加多达100倍(图2A)。这种增加与生产者细胞上清液中病毒颗粒50倍增加的产量相关(未示出数据)。这最有可能是由神经氨酸酶介导的从细胞表面释放病毒颗粒诱导的，其中该病毒颗粒由于结合含有唾液酸的细胞表面分子而保留在细胞表面40，41。然而，病毒颗粒出去的这种缺陷不能解释用GALV和RD114GPs产生的SIV载体感染性的缺乏，因为用后者糖蛋白假型化的MLV载体效价一般是高的21，34。相反，这提示病毒核心上GP结合水平的缺陷。以前的研究已经表明哺乳动物类型C逆转录病毒胞质尾区具有控制灵长类慢病毒假型的形成和/或感染性的元件8，13-15。因为MLV-AGP有效地假型化慢病毒属载体(图2A)，我们假设它的胞质尾区应该含有慢病毒属颗粒上最优GP结合所需的所有元件。实际上，RD114(图2B)和GALVGPs胞质尾区被MLV-AGP胞质尾区的置换引起了慢病毒属核心上糖蛋白大大地增加的结合，如图2C中对RD114GP所示的和其它地方对GALVGP所示的8，13，15。这些嵌合GALV和RD114GPs，称为GALV/TR和RD114/TR，如在受体干扰测定中所评测的(未示出数据)，保留了原始糖蛋白的宿主范围，而且给SIV载体提供了25倍增加的效价(图2A)。实施例2假型化SIV基载体原种的表征我们寻求表征用修饰或未修饰病毒糖蛋白包被的载体的特征，该病毒糖蛋白有效地假型化SIV载体颗粒。通过超速离心浓缩SIV假型载体，在含有1％BSA的贮藏缓冲液中重悬浮，等分并且在感染测定前贮藏在-80℃。尽管用MLV-10A1GP包被的载体在浓缩前具有好的效价，但是在进一步分析中不使用它们，因为它们不能被有效地浓缩(未示出数据)。相反，用FPV-HA，VSV-G或用GALV/TR，RD114/TR，MLV-A和LCMV糖蛋白假型化的载体可以被非常有效地浓缩，物理颗粒100倍浓缩后可以回收平均80％以上感染颗粒(未示出数据)。因为用FPV-HA和LCMV糖蛋白假型化的载体不能诱导这里检测的原代造血细胞(即PBLs和CD34+细胞；未示出数据)，不对它们进行进一步分析。利用TE671靶细胞测定用剩余糖蛋白(即，MLV-A，GALV/TR，RD114/TR和VSV-G)假型化的载体浓缩原种的感染效价，感染效价范围是从用GALV/TRGP获得的感染性较低的假型的5×106到用VSV-G获得的感染性最高的假型的1×108i.u./ml之间(图3A)。在其它人粘着细胞系上测定了假型载体之间相似的效价差异(未示出数据)。这表明利用高允许TE671细胞进行的效价测定反映了假型化载体特异感染性的估测。重要地，感染颗粒的数量与物理颗粒的存在相关。如图3B中所示，在假型载体给定制备物中，产生最高效价的假型载体(VSV-G和MLV-A或RD114/TRGPs)检测到相似量病毒颗粒相关衣壳蛋白。用GALV/TRGPs假型化的病毒颗粒重复检测到较低数量物理颗粒，与它们较低效价一致(图3A)。然而，当比较两个单独载体制备物时，尽管它们具有可比较的感染效价，但是注意到了病毒颗粒相关衣壳蛋白质绝对数量的重要不同(未示出数据)。因此，为了最小化由于载体原种质量差异引起的人为结果，利用同时产生的假型载体进行每个随后的评估试验。而且，因为病毒颗粒相关衣壳蛋白的检测看起来不是感染颗粒的有效指标并且防碍了结果的比较，所以利用TE671细胞上确定的效价标准化假型载体原种。实施例3灵长类血清中载体假型的稳定性适于体内基因递送的载体在37℃应该是稳定的，并且应该保留在灵长类血清中的高感染性。因此，通过比较在37℃对4℃温育1小时的病毒颗粒效价测定载体假型的稳定性。用RD114/TRGP或VSV-G假型化的慢病毒属载体在37℃是稳定的，在37℃温育后，85％以上的载体颗粒保留了感染性(未示出数据)。比较起来，在37℃温育后，用MLV-A和GALV/TRGPs假型化的载体失去了75％以上的感染性(未示出数据)，表明结合到慢病毒属核心颗粒的后者GPs是温度敏感性的。估测了人和猕猴血清中假型化载体的稳定性。以50/50(v/v)比率，混合相同量的假型感染颗粒和新鲜的灵长类血清，并且在37℃温育1小时。热失活的灵长类血清及胎牛血清(FCS)用做对照。结果如图4所示，结果表示为在新鲜或热失活灵长类血清中温育后的残留感染性相对于FCS温育的病毒颗粒感染性(100％)的百分数。通过人和猕猴血清失活VSV-G假型化载体，产生了90％以上病毒颗粒的降解。尽管用逆转录病毒糖蛋白假型化的载体的抗性水平随着检测的血清样品和逆转录病毒GP类型而变化，但是它们在人血清中具有显著更高的抗性。用MLV-A糖蛋白假型化的载体在人血清中是稳定的，但是对于猕猴血清的失活相对敏感。用GALV/TRGP包被的载体在人和猕猴血清中显示了可变的稳定性水平。相反，用RD114/TRGP假型化的慢病毒属载体在所有测定的人血清中都显示了完全的稳定性(图4A)，并且在猕猴血清中显示了良好的稳定性(图4B)。实施例4人和猕猴原代造血细胞的转染接下来，我们比较了不同假型化载体转导原代造血细胞诸如CD34+细胞和PBLs细胞的能力。来源于动员血液的人CD34+细胞在补加有TPO的无血清培养基中过夜预激活，并且通过用MLV-A，GALV/TR，RD114/TR或VSV-G糖蛋白假型化的SIV载体的单击(singlehit)转导该CD34+细胞16小时。用TE671细胞上估测的感染效价测定的可变感染复数(MOIs)用于转导CD34+细胞。在CH-296retronection片段存在或不存在的情况下进行并行的转导试验42-44。感染后，在低浓度TPO，SCF和Flt3-L存在的情况下培养细胞5天。通过流式细胞仪容易测定转导细胞中的GFP表达，使我们可以估测MOIs和假型化GP对转导效率的影响(图5A)。对于不存在retronectin情况下的转导，GFP+细胞百分数最初做为MOI的正函数增加，并且在2到20之间包含的MOIs时，曲线变平，达到25％GFP+细胞的最大值。这些中等转导效率可能是由于次最佳感染的方法，具体地，是单一和短期温育靶细胞和病毒颗粒引起的。在这些试验条件中，最有效的载体是用VSV-G糖蛋白假型化的载体(平均GFP+细胞24.75％±3.23％；n＝5)，尽管，在低于2的MOIs，用GALV/TR和MLV-AGPs假型化的SIV载体显示了比VSV-G假型化载体更高的转导效率(参见图5A中的插入图)。然而，在检测的最有效MOIs，用MLV-A，GALV/TR和RD114/TR糖蛋白产生的载体获得了比VSV-G假型低5到12倍的转导效率(图5A)。用GALV/TRGP产生的载体相对低的效价(图3)不允许在高MOIs估测转导效率。当在retronectin包被的板上进行CD34+细胞感染时获得了偏离的结果。在这些条件下，与不存在retronection的情况下相比，VSV-G假型化载体保留了相同最大转导效率(24.56％±3.27％GFP+细胞；n＝5)，与其它人的结果一致45。相反，RD114/TR假型化载体显示了10倍增加的转导效率，达到多达65％GFP+细胞(平均值51.30％±8.74％；n＝5)，表明RD114/TRGP和retronectin联合使用协同地增加了感染。Retronectin也增加了用GALV/TR和MLV-AGPs假型化的载体的转导效率，但比用RD114/TRGP假型化的载体具有低得多的幅度(图5A)。然后，我们用假型载体转染了来源于骨髓的猕猴CD34+细胞。在不存在retronectin的情况下，最好的假型化GP是VSV-G，使转导达到26％GFP+细胞(21.7％±3.51％；n＝5)。用GALV/TR和MLV-AGPs假型化的SIV载体转导猕猴CD34+细胞不太有效(3％GFP+细胞的最大转导效率)。与用VSV-G假型化的载体比较，RD114/TRGP假型化载体产生了大约低2倍的转导效率(10.12％±1.26％；n＝54)。在转导期间存在retronectin的情况下没有改进VSV-G假型化载体的转导效率(图5B)。然而，以与人CD34+细胞转导相似的方式，retronectin增加了用MLV-A和RD114/TRGPs假型化的慢病毒属载体对猕猴CD34+细胞的转导。在这些条件下，用RD114/TR假型化的载体可以获得多达30％GFP+细胞的最大水平转导(24.23％±4.15％；n＝5)(图5B)。然后我们测定了人和猕猴PBLs中假型SIV载体的转导效率。在不存在retronectin的情况下，温育从新鲜血液分离的PBLs和载体4小时。如以前所报道的26，29，46，用可溶的抗-CD3和抗-CD28抗体预先激活PBLs24小时对于慢病毒属载体的转导是必要的。做为有利CD3+细胞刺激和存活的这些试验条件的结果，PBLs的转导定向于T细胞。在感染后5天测定的GFP表达(图6)表明PBLs的转导依赖于MOI。在低MOIs时，对于不同载体假型，GFP+细胞百分数稳定地增加直到达到平台期。达到这些平台期需要的MOIs随着载体假型而变化。对于用VSV-G，MLV-AGP或GALV/TRGP假型化的慢病毒属载体，在MOIs小于5感染颗粒每个细胞时，很快就达到转导的平台期(图6A)。相反，RD114/TRGP假型化病毒颗粒达到平台期需要的阈值MOI是约5-10感染颗粒每个细胞(图6A)。有趣地，最大转导水平也随着检测的假型载体而变化。VSV-G假型化载体仅转导最大值10-23％的T细胞(平均值16.87％±6.53％；n＝4)。这稍微偏低水平的转导与我们以前的结果26一致，其中用该报道中使用的SIV-T1+载体同样产生和设计的VSV-G假型化的HIV-1来源载体获得该结果。相反，用RD114/TR嵌合GP假型化的载体获得了达到50-75％的高得多的转导水平(55.04％±11.74％；n＝4)。尽管，如上所示，用GALV/TR嵌合GP包被的载体低效价不允许我们测定高于2的MOIs，但是用其它假型载体获得的最大转导效率还是低的。此外，对于一些载体制备物，当用高MOIs的MLV-AGP或GALV/TRGP假型化SIV载体转导人PBLs时，发现转导效率降低了(图6A)。如最近研究所提示的44，47，这些影响可能是由于过多缺陷颗粒或可溶GP从病毒颗粒的“流出”诱导的受体结合竞争产生的。对于猕猴PBLs转导获得了相似的结果，尽管达到感染平台期所需阈值MOI看起来高于人PBLs所需阈值MOI，且转导的最大水平低于用人PBLs获得的最大水平(图6B)。用GALV/TR或MLV-AGPs假型化载体颗粒获得的转导效率保持很低(小于4-12％GFP+细胞)，并且发现在大于1MOIs时降低。与用这些后者GPs或VSV-G(15.32％±10.06％；n＝4)假型化载体比较，RD114/TRGP假型化载体的PBL转导更容易。多达40％GFP+细胞可以被转导(26.86％±8.07％；n＝4)，尽管当利用超过这些试验中应用的MOIs时，可以明确地预期到更高水平的转导。这些结果一起表明，尽管RD114/TRGP假型化SIV载体需要retronectionCH-296片段以最优化短期刺激的CD34+细胞的转导，但是RD114/TR糖蛋白对于允许用假型SIV载体转导灵长类CD34+和PBLs特别有效。实施例5RD114GP胞质尾区突变体的设计如通过其细胞内核心颗粒的形态学所测定的，猫内源病毒RD114是类型C哺乳动物逆转录病毒(32)。然而，它的GP是猴类型D逆转录病毒的GP所典型的(28)，它们共有相同的细胞表面受体，RDR(31，38)，并且与MPMV(Mason-Pfizer猴病毒)GP，特别是TM亚基中，具有显著同源性(图7)。在以前的报道中，我们已经发现RD114猫内源病毒糖蛋白不允许与慢病毒属核心有效形成假型(35)。这里，我们寻求研究限制来源于SIV(猴免疫缺损病毒)的慢病毒属载体假型化的RD114GP决定簇。最近的研究表明哺乳动物类型C逆转录病毒的跨膜结构域和/或胞质尾区具有控制具有HIV-1载体的假型的形成和/或感染性的元件(4，34，36)。这种元件可能在不同水平影响病毒颗粒的感染性i)病毒装配必需的GP和病毒核心的细胞共定位，ii)GP与调节GP结合的病毒核心蛋白质的相互作用，和iii)在病毒颗粒出芽期间或出芽后立即通过用逆转录病毒蛋白酶切割其胞质尾区的GP融合性激活。兼嗜性MLV(MLV-A)和RD114的GPs有效地假型化MLV核心颗粒(6，39)。因此，因为MLV-AGP也有效地假型化SIV病毒核心(24，35)，我们假设与RD114GP带有的元件不同，它应该含有最佳地控制SIV假型载体装配和/或感染性的元件。因此，为了定义限制RD114GP假型化慢病毒核心颗粒能力的决定簇，我们产生了一组RD114GP突变体，在该突变体中，来源于它的跨膜结构域(TMD)和/或它的胞质尾区(CT)的亚区域被来源于MLV-AGP的它们相对物置换(图7B)。产生突变体RD/TR以说明MLVCT本身的重要性。突变体RD/MTR和RD/eMTR除了带有MLVCT，还带有MLVTMD。RDRlessGP是RD114GP的截短形式，并且它是通过在相对应于其CT推定切割位点的位置插入终止密码子产生的(参见下面)。突变体RDPrMLV含有的推定的RD114CT切割位点用MLVGP的相应位点的置换。其它突变体RDPrSIVARLM，RDPrSIVRQAG和RDPrHIV的胞质尾区含有SIVmac或HIV-1核心蛋白酶的底物，它们分别来源于在SIVmac251或HIV-1的Gag蛋白质中发现的切割位点。最后，设计突变体RDΔYXXL以估测RD114CT带有的推定的酪氨酸胞吞基序的重要性，其可能影响GP定位，细胞表面表达和/或融合性。已经很好地表征了其它逆转录病毒GPs的该基序的作用(1，13，19)。利用CMV启动子控制下的相同表达载体获得所有GP突变体的产生。293生产者细胞用编码载体颗粒成分，即病毒核心蛋白质，转移载体和任何一种GPs的质粒共转染。利用抗-RD114SU抗体，通过细胞裂解物的免疫印迹进行监测，没有检测到核心蛋白质或GPs数量的变化。实施例6RD114GP胞质尾区的修饰改变了细胞-细胞融合性GP表达细胞培养物显示了合胞体(syncytia)的形成，发现它的发生率取决于胞质尾区引入的突变类型(图8)。与野生型MLV-AGP比较，未修饰RD114GP本身的表达诱导了显著的合胞体形成。这种作用看起来是由RD114CT对GP融合性无效控制引起的，因为它被MLV-ACT的置换(突变体RD/TR，RD/MTR和RD/eMTR)显著地减少了转染细胞中合胞体的数量，达到了野生型MLV-AGP检测的水平(图8)。其它RD114嵌合GPs诱导可变水平的合胞体。注意到了RDPrHIV和RDRless突变体的最大致细胞病变效应。除了和未修饰的RD114GP相似融合性的突变体RDPrSIVARLM外，其它嵌合体(RDΔYXXL，RDPrMLV和RDPrSIVRQAG)以高于用野生型RD114GP获得水平的水平诱导合胞体形成(图8)。改变的细胞-细胞融合性本质上与RD114GP的修饰有关，并且不受与转染细胞中存在的其它病毒成分相互作用的影响。实际上，无论细胞表达还是不表达致癌逆转录病毒或慢病毒属核心蛋白质，都检测到了相同水平的合胞体(未示出数据)。因为没有发现不同RD114GP嵌合体GP表达的变化，这些结果确定了RD114GP胞质尾区在细胞-细胞融合性控制中所起的作用。该CT介导的融合控制使人想起其它哺乳动物类型C和D逆转录病毒GPs，诸如MLVs和MPMV的融合控制(2，30，33)。在MLV-AGPs时期(instar)，RD114糖蛋白胞质尾区的序列修饰最可能改变它的融合抑制特性(14，17，43)。因此，为了最小化RD114GP修饰诱导的致细胞病变效应，在转染后立即，即36小时进行生产者细胞上清液中病毒颗粒的收集，所述细胞病变效应可能无益于病毒颗粒形成。实施例7RD114GP胞质尾区的修饰调节慢病毒属或致癌逆转录病毒载体的假型化与野生型RD114GP，MLV-AGP和VSV-G比较，测定RD114GP突变体假型化SIVmac251或MLV基载体的能力。利用TE671靶细胞评测在不同GPs存在情况下产生的载体的感染性(图9)。和我们以前的结果一致，未修饰的RD114GP可以很好地假型化MLV基载体(6)，但是不能有效地假型化慢病毒基载体(35)。用RDΔYXXLGP突变体产生的SIV和MLV载体效价比用未修饰的RD114GP假型化的载体效价低3到4倍(图9)。用超融合性突变体RDRless产生的载体效价也比用野生型RD114GP产生的效价要低，然而，我们不能排除该突变体施加的特别强烈的致细胞病变效应(图8)没有阻止载体颗粒的最优形成。重要地，RD/TR和RD/MTR嵌合体GPs有效地假型化SIV基载体。在RD/TR突变体的情况下，这产生了高于106i.u./ml的感染效价；即，达到高于用野生型RD114GPs获得的效价25倍，并且，如果不是更高，也和用MLV-AGP或VSV-G假型化的SIV载体获得的感染效价在相同的范围内(图9B)。相反，用相同嵌合体GPs产生的MLV来源载体仅显示了比用野生型RD114GP假型化的载体达到2倍增加的感染性，而野生型效价已经是高的效价了(图9A)。因为胞质尾区是在引起了假型慢病毒属载体增加的感染性的这些RD114GP嵌合体中修饰的最小结构域，因此这些数据表明MLV-A的CT，而不是它的TMD含有有利于SIV载体假型形成的元件。进一步的RD114GP嵌合体的研究(图7B)确定该元件位于其胞质尾区中含有推定的切割位点的区域中。已经表明病毒蛋白酶介导的哺乳动物类型C和D逆转录病毒TM蛋白质的C-末端(对于MLV称为R肽)移除对于激活它们的融合功能是必要的(2，30，33)。在病毒颗粒出芽期间或以后发生TM蛋白质该羧基末端的加工。迄今，还没有报道RD114GP的胞质尾区切割和随后的融合性激活。我们的结果表明可能需要RD114TM的加工以便于在受体结合后促进糖蛋白充分的融合活性。实际上，通过插入提前终止密码子截短RD114GP(突变体RDRless)产生了高细胞-细胞融合活性(图8)，表型与类型C或D哺乳动物逆转录病毒R截短的GP突变体表型相似(2，10，30，33)。而且，RD114GP胞质尾区和几种类型C和类型D哺乳动物逆转录病毒GPsCTs的序列比对可以预测RD114GP胞质尾区中8个氨基酸长的序列-VHAMVLAQ-的位置，该序列最可能形成逆转录病毒蛋白酶切割位点(图7A)。有趣地，用来源于MLVCT(突变体RDPrMLV)或来源于SIVGag蛋白质(突变体RDPrSIVARLM和RDPrSIVRQAG)的切割位点置换该序列引起了SIV假型载体多达7倍增加的感染性(图9B)。同样地，来源于HIV-1Gag蛋白质(突变体RDPrHIV)的切割位点的插入选择性地增加了HIV-1基载体(未示出数据)而不是SIV来源载体(图9B)的假型形成。因此，这些结果表明该8个氨基酸的序列含有调节慢病毒属载体颗粒假型形成的必需元件。当后面的RD114GP嵌合体用于假型化MLV载体颗粒时获得了非常不同的结果(图9A)。尽管与用野生型RD114GP形成的病毒假型比较，用RDPrMLV突变体假型化的MLV载体显示了相似或稍微增加的感染性，但是含有慢病毒属切割位点的RD114嵌合体GPs(RDPrSIVARLM、RDPrSIVRQAG和RDPrHIV)急剧地降低了MLV假型化载体的感染性达到20倍(图9A)。因此，当RD114嵌合体连接慢病毒属或致癌逆转录病毒核心时，它们不同地起作用。因此，这些结果强烈地表明特定的核心/CTs相互作用以病毒类型特异性方式发生，并且可以控制GP结合和/或胞质尾区的加工。实施例8RD114GP胞质尾区的修饰改变了病毒结合然后，我们试图检测是否RD114糖蛋白的修饰可能影响它在病毒颗粒上的结合。与非修饰的RD114GP相比较，对一小组GP突变体RDPrMLV，RDPrSIVARLM，RDPrSIVRQAG和RD/TR进行这些试验，这些突变体不以太广泛的方式诱导合胞体形成(图8)。实际上，其它突变体(RDPrHIV和RDRless)高的细胞-细胞融合活性通过在生产者细胞上清液中释放细胞残渣，损害了纯化病毒颗粒制备物的质量(未示出数据)。用RD114GP嵌合体产生带有SIV或MLV核心的病毒颗粒，并且通过20％蔗糖垫层超速离心纯化该病毒颗粒。利用抗-CA或抗-RD114GP的抗体，通过纯化病毒颗粒的免疫印迹进行病毒核心蛋白质和糖蛋白的检测和定量，并且允许测定病毒颗粒上RD114GP嵌合体的密度(图4)。在来源于在病毒核心不存在的情况下只表达糖蛋白的生产者细胞的超速离心上清液沉淀中没有检测到GP(图4)，因此证明用纯化的病毒颗粒获得的信号的特异性。与野生型RD114GP比较，尽管该GP赋予增加的感染性，但是RDPrSIVARLMGP突变体同样地结合在SIV核心颗粒上(图9B)。相反，RDPrMLV，RDPrSIVRQAG和RD/TR嵌合体GPs在SIV载体颗粒上的结合增加了3到10倍(图4)，与用这些突变体GPs获得的大大地增加的效价一致(图9B)。因此，这些结果表明RD114GP嵌合体在SIV核心颗粒上的结合和假型载体的感染效价相关，尽管RDPrSIVARLMGP突变体的情况排除了绝对的相关性。相同GP嵌合体在MLV核心颗粒上的结合获得了不同的结果。RD/TRGP嵌合体的结合微弱地增加了2倍(图4)，与用该特定突变体获得的轻微增加的病毒效价一致(图9A)。然而，与未修饰的RD114GP比较，RDPrMLV，RDPrSIVARLM和RDPrSIVRQAGGP突变体在MLV颗粒上具有相似的密度(图4)，尽管后面两个GP嵌合体在假型化MLV载体上的效价大大地降低(图9A)。因此，在假型化MLV核心上，不能证明GP结合和感染性之间的相关性。实施例9RD114GP胞质尾区的修饰改变了其病毒核心依赖方式的切割然后，我们研究了是否RD114GP嵌合体的胞质尾区在假型化MLV或SIV病毒核心颗粒中被切割。用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸放射标记产生两种类型假型病毒颗粒之一的转染的细胞。病毒颗粒生产者细胞或在20％蔗糖垫层上纯化的病毒颗粒的裂解物与抗RD114SU抗体温育。糖蛋白免疫沉淀后，还原和变性样品以允许TM蛋白质从免疫沉淀的GP复合物解离，然后通过SDS-PAGE分析(图5)。如所期望的，病毒颗粒生产者细胞的裂解物显示了相似量的SU和TM糖蛋白。在凝胶上，所有突变体TM糖蛋白都有相同的电泳迁移率(图5A和B)，表明在生产者细胞中不同TM种类的大多数CTs都没有被切割。这些结果也证实了突变体RD114GPs的细胞-细胞融合性调节不依赖于它们TM蛋白质的加工(图8)，而是本质上与它们胞质尾区结构和构象改变有关。不同RD114GP嵌合体对于SU和TM亚基在纯化的MLV病毒核心上具有相似的强度(intensities)(图5A)。这些结果证实它们胞质尾区的修饰不影响它们在致癌逆转录病毒核心上的结合(图4)。然而，以依赖于RD114GP嵌合体类型的方式检测到了结合的TM糖蛋白的加工。实际上，与细胞裂解物中它们TM蛋白质大小比较，未修饰的RD114GP和嵌合RDPrMLV和RD/TR嵌合体的TM亚基大约小2kDa(图5)。这种观察直接证实了病毒核心蛋白酶对RD114GPTM加工的基因证据。相反，在含有慢病毒属蛋白酶特异性切割位点(图7B)的RDPrSIVARLM和RDPrSIVRQAGGP突变体的MLV核心上只检测到了未加工的TMs(图5)。这些结果与用后面RD114嵌合GPs假型化的MLV载体大大地降低的感染性一致(图9A)，并且证实了需要RD114GP胞质尾区的切割以允许病毒颗粒的感染。与MLV核心相反，在SIV核心颗粒上检测到了可变量的SU和TM糖蛋白(图5B)，并且与GP差异结合到病毒颗粒中的结果一致(图4)。在RDPrSIVRQAG和RD/TRGP突变体的情况下，它们的SUs容易结合在SIV颗粒上，可以观察TM蛋白质(图5B)。可以检测后面RD114GP嵌合体胞质尾区的有效加工，这与SIV假型载体感染性的结果一致(图9B)。在正常凝胶曝光的条件下，不容易检测未修饰的RD114GP，RDPrMLV和RDPrSIVARLM突变体GPs的TM蛋白质，这与结合的结果一致(图9B)。凝胶过度曝光显示，后者GPs的TM蛋白质被加工了(未示出数据)。该结果解释了用这些后面的GPs产生的SIV载体颗粒获得的低感染水平(图9B)。实施例10RD114GP胞质尾区的修饰不影响脂筏(lipidrafts)中GP定位最近的报道已经表明慢病毒属可以选择性装配和从脂筏出芽(18，25，26)。因此，解释RD114GP突变体在假型SIV颗粒上不同的结合的一种可能是由于RD114GP胞质尾区修饰，在病毒装配位点，病毒核心元件和糖蛋白共定位的变化。因此，我们研究了是否RD114GP可以定位于脂筏和是否它的胞质尾区修饰可以改变细胞定位。在低温时，脂筏抗非离子去污剂，通过蔗糖梯度离心可以从大块可溶膜物理分离它。在这些条件下，分级分离用不同GP突变体转染的细胞的膜，通过Western印迹分析法分析膜级分的GP含量(图6)。在转染细胞裂解物去污剂抗性的级分中出现了野生型RD114GP及胞质尾区突变体，表明所有GPs都靶向脂筏。根据本发明的公开，不需要过多的试验可以制备和实施这里公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经以优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员而言，显而易见可以对这里所述组合物和/或方法和方法的步骤和步骤的顺序进行变化，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见，化学和生理学相关的一些试剂可以置换这里所述的试剂，而将达到相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有这种相似置换和修饰视为落入所附权利要求所定义的本发明的精神、范围和概念内。参考文献下面的文献特别地并入这里为参考文献，达到了它们提供了示例性方法或其它细节对这里所述内容进行补充的程度。U.S.专利号4,682,195U.S.专利号4,683,202U.S.专利号5,466,468U.S.专利号5,645,897U.S.专利号5,686,279U.S.专利号5,705,629U.S.专利号5,846,225U.S.专利号5,846,233U.S.专利号5,925,565U.S.专利号5,928,906U.S.专利号5,935,819U.S.专利号5,994,136U.S.专利号6,013,516U.S.专利号6,136,597EP266,032上标编号的参考文献1.NègreD，DuisitG，MangeotP-E，MoullierP，DarlixJ-L，CossetF-L.来源于猴免疫缺损病毒(SIV)的慢病毒属载体.InTronoD，编辑.CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology.261卷；200253-742.NaldiniL，BlmerU，GallayP，OryD，MulliganR，GageFH，VermaIM，TronoD.通过慢病毒属载体的非分裂细胞体内基因递送和稳定转导.Science.1996；272263-2673.BlmerU，NaldiniL，KafriT，TronoD，VermaIM，GageFH.通过慢病毒属载体的成人神经元中高效和持续的基因转移.JVirol.1997；716641-66494.KafriT，BlmerU，PetersonDA，GageFH，VermaIM.通过慢病毒属载体直接递送给肝和肌肉的基因的持续表达.NatGenet.1997；17314-3175.NaldiniL，BlmerU，GageFH，TronoD，VermaIM.通过用慢病毒属载体注射，成年大鼠脑中转基因的有效转移、整合和持续长期表达.ProcNatlAcadSciUSA.1996；9311382-113886.ParkF.体内肝有效的慢病毒属转导需要细胞周期.NatGenet.2000；2449-527.TakahashiM，MiyoshiH，VermaIM，GageFH.通过人免疫缺损病毒载体介导的基因转移拯救rd小鼠中光感受器退化.JVirol.1999；737812-78168.ChristodoulopoulosI，CannonP.阻止其结合到慢病毒属载体的长臂猿白血病病毒包膜蛋白胞质尾区序列.JVirol.2001；754129-41389.DesmarisN，BoschA，SalaunC，PetitC，PrevostMC，TordoN，PerrinP，SchwartzO，deRocquignyH，HeardJM.用狂犬病病毒包膜糖蛋白假型化的慢病毒属载体的产生和亲神经性.MolTher.2001；4149-15610.KobingerGP，WeinerDJ，YuQC，WilsonJM.体内，线状病毒假型的慢病毒属载体可以有效地和稳定地转导气管上皮细胞.NatBiotechnol.2001；19225-23011.LewisBC，ChinnasamyN，MorganRA，VarmusHE.禽白血病肉瘤病毒亚群A假型化慢病毒属载体的进展.JVirol.2001；759339-934412.MochizukiH，SchwartzJP，TanakaK，BradyRO，ReiserJ.用于向非分裂细胞中递送基因的高效价人免疫缺损病毒类型1载体系统.J.Virol.1998；728873-888313.SalmonP，NègreD，TronoD，CossetF-L.含有MLV包膜胞质尾区的嵌合GALV-来源的包膜糖蛋白有效地假型化HIV-1载体.JGenMed.2000；2(增刊)2314.SandrinV，BosonB，CossetF-L.猫内源病毒RD114糖蛋白胞质尾区中慢病毒属蛋白酶底物的插入增加了假型化慢病毒属载体的结合和感染性.投稿准备中.200115.StitzJ，BuchholzC，EngelstadterM，UckertW，BloemerU，SchmittI，CichutekK.用来源于长臂猿白血病病毒和鼠白血病病毒10A1的包膜糖蛋白假型化的慢病毒属载体.Virology.2000；27316-2016.GatlinJ，MelkusMW，PadgettA，KellyPF，GarciaJV.通过浓缩的用猫内源逆转录病毒(RD114)包膜蛋白假型化的癌逆转录病毒载体颗粒转导的人CD34+细胞移植NOD/SCID鼠J.Virol.2001；759995-999917.GoernerM，HornPA，PetersonL，KurreP，StorbR，RaskoJE，KiemHP.在用CD34(+)髓细胞移植的狗中持续多谱系基因的持久性和表达，其中用RD114假型癌逆转录病毒载体转导该CD34(+)髓细胞.Blood2001；982065-207018.KellyP，VandergriffJ，NathwaniA，NienhuisA，VaninE.通过用猫内源逆转录病毒(RD114)包膜蛋白假型化的癌逆转录病毒载体颗粒，高效率地将基因转移到脐血非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损移植细胞中.Blood.2000；961206-121419.MarandinA，DubartA，PflumioF，CossetF-L，CordetteV，Chapel-FernandesS，CoulombelL，VainchenkerW，LouacheF.体外，逆转录病毒介导的基因转移到能重组长期培养的人CD34+/38-原始细胞中和体内转移到非肥胖糖尿病-重度联合免疫缺损小鼠中.HumanGeneTher.1998；91497-151120.MovassaghM，DesmyterC，BaillouC，Chapel-FernandesS，GuigonM，KlatzmannD，LemoineFM.利用逆转录病毒载体假型化的长臂猿白血病病毒，高水平将基因转移到脐血祖细胞和改进的临床可应用方法.HumGeneTher.1998；9225-23421.PorterCD，CollinsMKL，TailorCS，ParkerMH，CossetF-L，WeissRA，TakeuchiY.通过四种不同逆转录病毒受体，人基因治疗靶细胞感染效率的比较.HumanGeneTherapy.1996；7913-91922.PengKW，PhamL，YeH，ZuffereyR，TronoD，Co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ataaaagacag1824ValArgAspSerMetLysLysLeuLysGluLysLeuAspLysArgGln595600605ttagagcgccagaaaagccaaaactggtatgaaggatggttcaataac1872LeuGluArgGlnLysSerGlnAsnTrpTyrGluGlyTrpPheAsnAsn610615620tccccttggttcactaccctgctatcaaccatcgctgggcccctatta1920SerProTrpPheThrThrLeuLeuSerThrIleAlaGlyProLeuLeu625630635640ctcctccttctgttgctcatcctcgggccatgcatcatcaatcgatta1968LeuLeuLeuLeuLeuLeuIleLeuGlyProCysIleIleAsnArgLeu645650655gttcaatttgttaaagacaggatctcagtagtccaggctttagtcctg2016ValGlnPheValLysAspArgIleSerValValGlnAlaLeuValLeu660665670actcaacaataccaccagctaaagcctatagagtacgagcca2058ThrGlnGlnTyrHisGlnLeuLysProIleGluTyrGluPro675680685<210>4<211>686<212>PRT<213>嵌合体(Chimaerasp.)<400>4MetValLeuLeuProGlySerMetLeuLeuThrSerAsnLeuHisHis151015LeuArgHisGlnMetSerProGlySerTrpLysArgLeuIleIleLeu202530LeuSerCysValPheGlyGlyGlyGlyThrSerLeuGlnAsnLysAsn354045ProHisGlnProMetThrLeuThrTrpGlnValLeuSerGlnThrGly505560AspValValTrpAspThrLysAlaValGlnProProTrpThrTrpTrp65707580ProThrLeuLysProAspValCysAlaLeuAlaAlaSerLeuGluSer859095TrpAspIleProGlyThrAspValSerSerSerLysArgValArgPro100105110ProAspSerAspTyrThrAlaAlaTyrLysGlnIleThrTrpGlyAla115120125IleGlyCysSerTyrProArgAlaArgThrArgMetAlaSerSerThr130135140PheTyrValCysProArgAspGlyArgThrLeuSerGluAlaArgArg145150155160CysGlyGlyLeuGluSerLeuTyrCysLysGluTrpAspCysGluThr165170175ThrGlyThrGlyTyrTrpLeuSerLysSerSerLysAspLeuIleThr180185190ValLysTrpAspGlnAsnSerGluTrpThrGlnLysPheGlnGlnCys195200205HisGlnThrGlyTrpCysAsnProLeuLysIleAspPheThrAspLys210215220GlyLysLeuSerLysAspTrpIleThrGlyLysThrTrpGlyLeuArg225230235240PheTyrValSerGlyHisProGlyValGlnPheThrIleArgLeuLys245250255IleThrAsnMetProAlaValAlaValGlyProAspLeuValLeuVal260265270GluGlnGlyProProArgThrSerLeuAlaLeuProProProLeuPro275280285ProArgGluAlaProProProSerLeuProAspSerAsnSerThrAla290295300LeuAlaThrSerAlaGlnThrProThrValArgLysThrIleValThr305310315320LeuAsnThrProProProThrThrGlyAspArgLeuPheAspLeuVal325330335GlnGlyAlaPheLeuThrLeuAsnAlaThrAsnProGlyAlaThrGlu340345350SerCysTrpLeuCysLeuAlaMetGlyProProTyrTyrGluAlaIle355360365AlaSerSerGlyGluValAlaTyrSerThrAspLeuAspArgCysArg370375380TrpGlyThrGlnGlyLysLeuThrLeuThrGluValSerGlyHisGly385390395400LeuCysIleGlyLysValProPheThrHisGlnHisLeuCysAsnGln405410415ThrLeuSerIleAsnSerSerGlyAspHisGlnTyrLeuLeuProSer420425430AsnHisSerTrpTrpAlaCysSerThrGlyLeuThrProCysLeuSer435440445ThrSerValPheAsnGlnThrArgAspPheCysIleGlnValGlnLeu450455460IleProArgIleTyrTyrTyrProGluGluValLeuLeuGlnAlaTyr465470475480AspAsnSerHisProArgThrLysArgGluAlaValSerLeuThrLeu485490495AlaValLeuLeuGlyLeuGlyIleThrAlaGlyIleGlyThrGlySer500505510ThrAlaLeuIleLysGlyProIleAspLeuGlnGlnGlyLeuThrSer515520525LeuGlnIleAlaIleAspAlaAspLeuArgAlaLeuGlnAspSerVal530535540SerLysLeuGluAspSerLeuThrSerLeuSerGluValValLeuGln545550555560AsnArgArgGlyLeuAspLeuLeuPheLeuLysGluGlyGlyLeuCys565570575AlaAlaLeuLysGluGluCysCysPheTyrIleAspHisSerGlyAla580585590ValArgAspSerMetLysLysLeuLysGluLysLeuAspLysArgGln595600605LeuGluArgGlnLysSerGlnAsnTrpTyrGluGlyTrpPheAsnAsn610615620SerProTrpPheThrThrLeuLeuSerThrIleAlaGlyProLeuLeu625630635640LeuLeuLeuLeuLeuLeuIleLeuGlyProCysIleIleAsnArgLeu645650655ValGlnPheValLysAspArgIleSerValValGlnAlaLeuValLeu660665670ThrGlnGlnTyrHisGlnLeuLysProIleGluTyrGluPro67568068权利要求1.嵌合糖蛋白，其中嵌合糖蛋白包含来源于MLV-A的胞质尾区结构域和来源于猫内源病毒RD114的跨膜和细胞外结构域。2.编码权利要求1所述嵌合糖蛋白的核酸。3.如权利要求2所述的核酸，其中该核酸包含SEQIDNO1的序列。4.包含权利要求2所述核酸的表达构建体。5.被权利要求4所述构建体转染的细胞。6.包含权利要求1所述嵌合糖蛋白的载体颗粒。7.如权利要求6所述的载体颗粒，其中该颗粒是假型化载体颗粒。8.如权利要求6所述的载体颗粒，进一步包含重组病毒载体构建体。9.如权利要求8所述的载体颗粒，其中载体构建体来源于逆转录病毒或慢病毒属。10.如权利要求9所述的载体颗粒，其中该载体构建体来源于SIV。11.如权利要求9所述的载体颗粒，其中该载体构建体来源于HIV。12.如权利要求8所述的载体颗粒，其中该载体构建体还包含转基因。13.如权利要求12所述的载体颗粒，其中转基因是标记或报道基因。14.如权利要求13所述载体颗粒，其中转基因是绿色荧光蛋白质(GFP)。15.如权利要求12所述的慢病毒属载体颗粒，其中转基因是治疗基因。16.如权利要求15所述的载体颗粒，其中转基因是癌基因或原癌基因。17.如权利要求15所述的载体颗粒，其中转基因是药物敏感性基因。18.一种转导细胞的方法，该方法包括a)获得将要被转导的细胞；b)获得根据权利要求8的假型化载体颗粒；和c)在足以导致转导的条件下，用b)的载体颗粒接触细胞。19.权利要求18所述的方法，其进一步包括提供足以增加转导量的retronectin的步骤。20.如权利要求18所述的方法，其中在体外转导细胞。21.如权利要求18所述的方法，其中在体内转导细胞。22.如权利要求18所述的方法，其中细胞是脊椎动物细胞。23.如权利要求22所述的方法，其中细胞是灵长类细胞。24.如权利要求22所述的方法，其中细胞是人类细胞。25.如权利要求18所述的方法，其中细胞是CD34+或PBL细胞。26.通过权利要求18所述的方法转导的细胞。27.一种产生重组假型化病毒载体颗粒的方法，该方法包括(a)用(i)至少一种载体构建体；(ii)至少一种包装构建体；和(iii)编码权利要求1所述嵌合糖蛋白的表达构建体转染细胞，以产生生产者细胞；(b)在培养基中培养该生产者细胞；和(c)从培养基分离该生产者细胞以从培养基回收重组病毒载体颗粒。28.一种转导细胞的方法，该方法包括将细胞和根据权利要求27所制备的载体颗粒在实现重组载体转导细胞的条件下接触。29.如权利要求28所述的方法，其中细胞是人类细胞。30.如权利要求29所述的方法，其中细胞是造血干细胞。31.如权利要求30所述的方法，其中细胞是人CD34+细胞。32.如权利要求30所述的方法，其中处理细胞以刺激细胞增殖，而基本上不损失干细胞的多能性。33.如权利要求28所述的方法，其中在体内转导细胞。34.如权利要求28所述的方法，其中在体外转导细胞。35.如权利要求34所述的方法，其中转导的细胞被引入动物受试者中。36.如权利要求35所述的方法，其中受试者是人类受试者。37.根据权利要求15-17任一权利要求所述慢病毒属载体用于制造药物的用途，该药物用于造血性或淋巴-造血性疾病的治疗。全文摘要本发明提供了改进的嵌合糖蛋白(GPs)和用这些糖蛋白假型化的改进的慢病毒属载体。本发明也提供了制备这种糖蛋白和载体的方法和组合物，和利用这种载体体外和体内转导细胞的改进方法。改进的嵌合GPs编码与MLV－AGP胞质尾区融合的GALV或RD114GPs细胞外和跨膜结构域。用这些GALV/TR和RD114/TRGP嵌合体假型化的载体比用亲本GPs包被的载体具有显著高的效价。此外，RD114/TR假型化载体有效地被浓缩，并且抗人和猕猴血清补体诱导的失活。RD114GP假型化慢病毒属载体对于体内基因转移应用具有特别的用途。文档编号C07K19/00GK1659284SQ03813532公开日2005年8月24日申请日期2003年4月25日优先权日2002年4月26日发明者D·特罗诺,F－L·科塞,V·桑德兰,B·博森,D·内格尔,P·萨内蒙申请人:国家健康医学研究所,克莱顿研究院