一种用于糖蛋白检测的电化学方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种糖蛋白的检测方法，特别涉及一种用于糖蛋白检测的电化学方法，属于化学领域。
【背景技术】
[0002]糖蛋白是一类重要生理活性物质，参与很多生命活动过程及代谢调节，起着多种重要的作用。一些蛋白表面糖基化的变化通常关联和预示着一些疾病的发生，例如一些与癌症有关的糖蛋白近年来就发现可能具有一定的关联性，通过分析和检测糖蛋白有助于生命科学的研究和发展。为此在业界也在积极寻找和开拓高效、低成本糖蛋白检测方法，近年来电化学传感器检测方法发展迅速，在糖蛋白检测方面“夹心式”传感器(如酶联免疫吸附法)是检测蛋白质的一种有效方法。在这种检测体系中，目标蛋白质可以被电极表面的抗体(一抗)捕获，然后再通过酶标记的抗体(二抗)对被捕获的蛋白质进行识别和信号输出。然而，抗体和酶标记抗体往往价格较高、制备较困难，且容易变性。电化学传感器具有使用方便、测量精度高、维护简单和成本低等优点，在生物分析中具有广大的应用前景。因此，开发研制一种用于糖蛋白的高灵敏和选择性检测的电化学传感器是十分必要的。
【发明内容】
[0003]本发明为提供一种用于糖蛋白检测的电化学方法。
[0004]一种用于糖蛋白检测的电化学方法，包括以下步骤:
(A)制备苯硼酸-生物素-纳米金复合物，包括以下子步骤:
Al:纳米金粒子的合成，采用前驱体为HAuCl4,还原剂为柠檬酸钠，将HAuCl4溶液加热至沸腾，然后快速加入柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾10-50分钟，然后将溶液冷却到室温，即得到柠檬酸稳定的纳米金粒子溶液；
A2:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的合成:用移液枪取出上述纳米金粒子溶液，然后加入包含三(2-羧乙基)膦和多肽的PBS溶液，PBS溶液的pH为7-8，室温搅拌I小时以上得到生物素修饰的纳米金，再向反应溶液中加入4-巯基苯硼酸溶液，继续搅拌0.5小时以上得到苯硼酸-生物素-纳米金复合物；
A3:苯硼酸-生物素-纳米金复合物的纯化:将A2得到的反应产物离心分离，弃除上层未反应的多肽和三(2-羧乙基)膦，将所得沉淀物用pH =7-8的PBS溶液洗涤，将得到的纯化后的苯硼酸-生物素-纳米金复合物用PBS溶液分散，低温保存备用；
(B)工作电极的制备，包括以下子步骤:
B1:在金电极表面组装巯基化的核酸适配体；
B2:采用6-巯基己醇和牛血清蛋白封闭未反应的金电极表面；
B3:将含糖蛋白的待测物修饰到B2得到的电极表面；
B4:将步骤A制备得到的的苯硼酸-生物素-纳米金复合物修饰到B3得到的电极表面； B5:将链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物修饰到B4得到的电极表面；
B6:将B5得到的电极浸泡于p-APP溶液中，催化产生电活性物质对氨基酚；
(C)电化学测试:将步骤(B)制备得到的电极作为工作电极进行电性能测试。
[0005]进一步的，步骤A2和A3中所述的PBS溶液的pH值为7.4，进一步的，步骤BI中所述的核酸适配体为:5’ -SH- (CH2) 6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA,进一步的，步骤(C)中电化学测试采用三电极体系，制备的金电极作为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极，进一步的，步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用，所述的保存温度为0°C -8 °C，进一步的，步骤A3得到的苯硼酸-生物素-纳米金复合物低温保存备用，所述的保存温度为4 V。
[0006]本发明所提供的一种用于糖蛋白检测的电化学方法的有益技术效果为:糖蛋白富含糖基，而糖基可以和苯硼酸相互作用形成硼酸酯键，采用苯硼酸代替二抗来特异性地识别糖蛋白成本低、选择性高，且本发明对糖蛋白的识别准确性极高，本发明采用核酸适配体捕获糖蛋白，通过硼酸酯键作用，采用苯硼酸-生物素-纳米金复合物对糖蛋白进行衍生从而有利于通过生物素-亲和素之间的作用将多个链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物分子固定于电极表面，本发明的方法灵敏性高，检测限低，选择性好，本发明无需采用价格昂贵、易变性的抗体，成本较低，稳定性好。
【附图说明】
[0007]图1是本发明糖蛋白重组人红细胞生成素为例的测试原理图。
[0008]图2是柠檬酸稳定的纳米金和苯硼酸-生物素-纳米金复合物的紫外-可见吸收光谱图。
[0009]图3为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的透射电镜表征图。
[0010]图4是工作电极在经过和不经过rHuEPO修饰步骤的测试结果图。
[0011]图5是修饰不同浓度的rHuEPO时的测试结果图。
[0012]图6是峰电流与rHuEPO浓度的线性关系图。
[0013]图7是本发明的传感器的选择性测试图。
【具体实施方式】
[0014]为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。本发明中各种缩写所代表的物质分别为:TCEP:三(2-羧乙基)膦，CALNNGK(b1tin)G:多肽，PBS:磷酸盐缓冲液，MBA:4_巯基苯硼酸，rHuEPO:糖蛋白重组人红细胞生成素，BSA:牛血清蛋白，MCH:6_巯基己醇，p-APP:4-氨基苯磷酸盐，SA-ALP:链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物；mM、μΜ、ρΜ、为浓度单位，分别代表 lCT3mol/L、lCT6mol/L、lCT12mol/L, M-L:微升，Tris:英文名称:Tris (hydroxymethyl)aminomethane，中文别名:三(羟甲基)氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷。以下实施例以糖蛋白重组人红细胞生成素作为待测糖蛋白进行具体阐述。图2中曲线a为柠檬酸稳定的纳米金的紫外-可见吸收曲线，曲线b为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的紫外-可见吸收曲线。图3为苯硼酸-生物素-纳米金复合物的透射电镜表征图。图4中rHuEPO的浓度为10 pM，扫速为0.1 V/s，支持电解质为50 mM Na2SO4，箭头所示为扫描方向。图5中脉冲高度为50 mV，脉冲宽度为50 ms，图6中rHuEPO的浓度依次为0.02, 0.2，0.5，I和2 pM。图7中是电极对辣根过氧化氢酶(I)，前列腺特异抗原(2)，金属硫蛋白(3)，链霉亲和素(4)，凝血酶(5)，rHuEPO (6)及I?6混合物(7)的响应情况。rHuEPO的浓度为I ρΜ，Γ5的浓度均为10 pM，本发明中的核酸适配体5’ -SH-(CH2)6-GATTGAAAGGTCTGTTTTTGGGGTTGGTTTGGGTCAATA 为已知物，具体的可见参考文献 “Analyst，2010，135， 2924-2929”。
实施例1:
(A):苯硼酸-生物素-纳米金复合物的合成:
Al:采用体积比为1:3的HN03/HC1混合液将三颈烧瓶、球形冷凝管、量筒清洗干净，晾干。往三颈烧瓶中加入50 mL I mM的HAuCl4，加热至沸腾，然后快速加入5 mL 38.8 mM的柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾30分钟，然后将该红色溶液冷却到室温；
A2:用移液枪取出上述纳米金溶液5 mL，然后加入5 mL I mM的包含50 μΜ TCEP和2 μΜ CALNNGK (b1tin) G 的 PBS 溶液(pH 7.4)，室温搅拌 2 小时，再加入 0.1 mL 50 μΜ 的4-巯基苯硼酸溶液(MBA)，继续搅拌2小时；
A3:将反应物于13000 rpm/min的转速下离心，弃除上层未反应的CALNNGK (b1tin) G和MBA。将所得的苯硼酸-生物素-纳