专利名称：与爱滋病有关的糖蛋白上糖链中甘露九糖的合成的制作方法
技术领域：
本发明属于有生物活性的寡糖的制备领域，特别是涉及能用于防治爱滋病的寡糖药物的合成方法。
爱滋病毒糖蛋白gp120的糖链对爱滋病毒感染及产生抗病毒的抗体反应至关重要，因此这个糖链将来可能用于免疫治疗，或发展为疫苗。(见J.-E.S.Hansen J.Virol.1990，64，2833；J.Virol.1991，65，6461)这个糖链具有如下的结构 这个糖链由九个甘露糖分子与两个乙酰氨基葡萄糖分子组成(用A表示)，甘露九糖部分用B表示。研究表明这个寡糖链对爱滋病毒糖蛋白2的生物功能非常重要，去掉糖链的蛋白不再具有黏附和抗体的功能(见M.A.Recny，等J.Biol.Chem.1992，267，22428-22434；A.R.N.Arulanandam，等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993，90，11613-11620)制备这个甘露九糖(B)对研究整个糖链至关重要，且这个甘露九糖本身就可能具有重要的生物活性，过去曾有关于合成类似的甘露寡糖的报道(见P.Grice等Angew.Chem.Int.Ed.1996，35，197).但所用试剂复杂，步骤多。本专利将报道它的简明制备。其特点是用部分保护的糖为受体，通过高区选糖基化的方法来制备。
本发明的合成方法在于以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(10)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(13)，为起始物进行甘露九糖的简易合成。
以甘露糖苷1为糖基受体，以α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯2为糖基供体，一步法缩合成3，6位连接的甘露五糖3，脱掉乙叉基再乙酰化，选择性地脱掉1位乙酰基然后用三氯乙睛活化即得到五糖供体4。如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2由甘露糖原酸酯7缩合，得到α1→2连接的甘露双糖8，脱掉烯丙基后再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙酰基溴代甘露糖5制备，如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基 All＝烯丙基选择性脱掉8的乙酰基，得到双糖受体9，使9与单糖供体2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯10缩合得到三糖11，将11的烯丙基脱除，再用三氯乙睛活化1位，即得到三糖供体12，使12与4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷13缩合，选择性地得到3位连接的四糖14，将其2位乙酰化，再脱掉苄叉基，即得到4，6位为游离羟基的四糖受体16，如下反应式所示 五糖供体4与四糖受体16选择性地在16的6位缩合，得到保护的九糖17，乙酰化后再用碱脱掉乙酰基即得到九糖19，如下反应式所示
下面结合实施例对本发明进行详细的说明。
(1)保护的甘露核心五糖3的合成将1，2乙叉基甘露糖1(1.03克，5毫摩尔)，α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2(11.5克，10毫摩尔)溶于100毫升二氯甲烷中，冷却至-10℃，在搅拌下加入三甲基硅三氟甲磺酸酯100微升，然后使反应物自然升温到室温，五小时后加200微升三乙胺结束反应，减压下蒸掉溶剂，柱层析分离后得中间物3(16.5克，77％)。m.p141-144℃；[α]D-11.5°；1H NMRδ 7.98-7.25，5.67，5.64，5.53，5.26，5.20，5.12，5.08，5.05，2.01，2.00，1.50.(2)甘露五糖供体4的合成将保护的甘露核心五糖3(2186毫克，1毫摩尔)溶于10毫升90％的三氟乙酸中，在室温下搅拌，用TLC(乙酸乙酯/石油醚 1/1)监测反应，反应完成后减压下蒸掉溶剂，柱层析分离后得中间物，将此中间物溶于10毫升吡啶中，加入乙酸酐5毫升，五小时后反应完成，减压下蒸掉溶剂，两步反应后得到的全酰化的产品2201毫克，收率94％，将此产品(2244毫克，1毫摩尔)溶于二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，1毫摩尔)及DBU(14微升，0.1毫摩尔)。反应混合物搅拌2小时后完成，浓缩混合物，用柱层析法精制(2/1石油醚/乙酸乙酯)，得到结晶的五糖供体4(2150毫克，90％)M.p.135-137℃； (c＝1.3in CHCl3)；1H NMRδ＝(400 MHz，CDCl3，25℃，TMS)9.03，8.10-7.26，6.35，6.05，5.96，5.91，5.88，5.85，5.80，5.74，5.68-5.66，5.64，5.45，5.43，5.17，5.09，4.61-4.43，4.33，4.30，4.22-4.18，3.89-3.84，3.59-3.56，2.26，2.10，2.02，2.00；元素分析计算值(％)C124H108O42NCl3C 62.30，H 4.52；实测值C62.45，H 4.40.(3)3，4，6-三-O-苯甲酰基-β-D-甘露糖1，2-烯丙基原酸酯(7)将2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-甘露糖溴(8.22克，20毫摩尔)加入到烯丙醇(40毫升)中，在搅拌下加入2，4-二甲基吡啶(2.3毫升，20毫摩尔)，反应在室温下进行，用TLC检测(1∶1石油醚/乙酸乙酯)，反应完成后，减压下浓缩，残余物悬浮于无水甲醇中MeOH(20毫升)，加入甲醇钠的甲醇溶液(2摩尔，0.4毫升)，混合物搅拌过夜，反应完成，将反应液减压浓缩，残余物用柱层析分离，得到粉末状6(4.72克，90％)，将6溶于吡啶(30毫升)中，在搅拌下滴加苯甲酰氯(8.2毫升，70毫摩尔)，三小时后反应完成，用常规方法对反应液进行后处理，用柱层析(3/1石油醚/乙酸乙酯)精制，得到结晶的化合物7(10.33克，～100％).(4)2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖烯丙基苷(8)化合物7在高真空下干燥二小时，然后溶于二氯甲烷(80毫升)中，在-42℃氮气保护下滴加TMSOTf(100微升)，2小时后，TLC(3/1石油醚/乙酸乙酯)指示反应完成，用三乙胺中和，减压浓缩，柱层析精制得到固体的8(6.72克，66％).m.p 148-150℃；[α]D+3.0°(c 1.3，CHCl3)；1H NMRδ8.07-7.33，5.99，5.90-5.85，5.70，5.28-5.18，5.16，5.11，4.61-4.47，4.39-4.36，4.15-4.13，3.95-3.92，2.03.计算值C59H52O18C，67.56；H，4.96.实测值C，67.60；H，4.92.(5)2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(2)将化合物8(524毫克，0.5毫摩尔)加入到含乙酸钠(293毫克，3毫摩尔)的90％乙酸(10毫升)中，再加入PdCl2(89毫克，0.5毫摩尔)，混合物在室温下搅拌12小时，TLC(2/1石油醚/乙酸乙酯)指示反应完成，用二氯甲烷(30毫升)稀释，用水、饱和碳酸氢纳溶液洗涤，减压浓缩有机相，用柱层析精制，得到2-O-乙酰基-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖-(1→2)-3，4，6-三-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖(456毫克)，将其溶于二氯甲烷(20毫升)中，加入CCl3CN(0.1毫升，2毫摩尔)及DBU(14微升，0.18毫摩尔)，反应6小时后完成，减压下浓缩反应液，柱层析精制得到结晶的化合物2(473毫克，两步收率90％)，m.p 139-142℃；[α]D-1.5°(c 1.1，CHCl3)；1H NMRδ 8.64，8.02-7.26，6.59，6.09，5.95-5.87，5.70，5.20，4.68-4.48，2.03。计算值C58H48O18Cl3NC，60.31；H，4.16.实测值C，60.34；H，4.15.(6)双糖受体9的制备双糖8(1112毫克，1毫摩尔)加入到含2％乙酰氯的甲醇溶液(20毫升)中，5小时后反应完成，用碳酸氢纳中和，减压浓缩反应液，柱层析精制得到双糖受体9(930毫克，94％)。(7)三糖供体12的制备使双糖受体9(1毫摩尔)与单糖供体10(1毫摩尔)在真空下干燥2小时，然后溶于二氯甲烷(50毫升)中，在-20℃，搅拌下加入TMSOTf(15微升，0.08毫摩尔)，反应在搅拌下进行2小时，温度逐步升至室温，用三乙胺终止反应，浓缩反应物用柱层析法精制(1∶1.5石油醚-乙酸乙酯)得到结晶的三糖11(1268毫克，91％)；M.p.135-137℃； (c＝0.9 in CHCl3)；将11(1毫摩尔)溶于二氯甲烷(20毫升)中，加入PdCl2(20毫克)，室温下搅拌5小时，反应完成，将反应物浓缩，柱层析精制，得到的产物溶于30毫升二氯甲烷中，加入三氯乙睛3毫升，无水碳酸钾3克，室温下搅拌5小时，过滤，浓缩反应物，柱层析精制得到三糖供体12，1375毫克，收率72％，m.p.136-138℃； (c＝0.8 in CHCl3)；(9)四糖受体16的制备将三糖供体12(1677毫克，1毫摩尔)与单糖受体13(308毫克，1毫摩尔)在真空下干燥2小时，然后溶于二氯甲烷(50毫升)中，在-20℃搅拌下加入TMSOTf(15微升，0.08毫摩尔)，反应在2小时后结束，反应物温度逐步升至室温，用三乙胺中和反应，浓缩反应液，用柱层析精制，(1∶1.5石油醚-乙酸乙酯)得到结晶的14(1651毫克，90％)；m.p 131-133℃；[α]D-11.5°(c 1.1，CHCl3)；将14(1834毫克，1毫摩尔)溶于吡啶(30毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩尔)，在室温下搅拌过夜，用常规方法处理反应液，用柱层析精制(2∶1石油醚-乙酸乙酯)定量地得到15，m.p 138-140℃；[α]D-5.6°(c 1.1，CHCl3)；13C NMR δ 170.31，166.34，165，92，165.73，165.60，165.43，165.25，165.20，165.15，164.91，164.64，99.98，99.67，99.05，97.69，79.17，71.18，71.09，70.33，70.25，70.00，69.72，69.63，69.52，68.60，68.32，66.79，66.42，63.68，63.38，62.95，62.59.将15(1876毫克，1毫摩尔)溶于甲醇(50毫升)中，加入乙酰氯(0.05毫升，0.7毫摩尔)，混合物在室温下搅拌过夜，浓缩反应液，用柱层析精制得到固体的四糖受体16(1628毫克，91％)；[α]D-4.4°(c 1.2，CHCl3)；13CNMRδ 170.22，167.60，167.23，166.40，166.15，165.43，165.43，165.40，165.32，165.20，165.15，99 56，99.36，99.06，98.98，76.45，72.39，70.16，70.06，69.90，69.64，69.32，69.01，68.63，67.97，67.56，66.49，63.88，63.76，63.51，62.31，55.04。(10)九糖19的制备将五糖供体4(1193毫克，0.5毫摩尔)及四糖受体16(894毫克，0.5毫摩尔)在真空下干燥2小时，然后溶于二氯甲烷(30毫升)中，在-20℃下加入TMSOTf(7.5微升，0.08毫摩尔)，反应在搅拌下进行3小时，温度逐步升至室温，用三乙胺中和，浓缩反应物，将得到的浆状物用柱层析法精制(1∶1石油醚-乙酸乙酯)，得到九糖17(1606毫克，80％)； -18.0°(c＝0.9 in CHCl3)；质谱MALDI-TOF分析计算值C221H194O734015。15[M].实测值4015。39[M]；将17(1204毫克，0.3毫摩尔)溶于吡啶(20毫升)中，加入乙酸酐(1毫升，10毫摩尔)，在室温，搅拌下5小时，反应完成，用常规方法处理反应液，浓缩有机相，用柱层析法精制(1.5∶1石油醚-乙酸乙酯)，定量地得到固体的18 (c＝1.0 in CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝8.02-7.26，6.31，6.01，5.98-5.83，5.78-5.70，5.67-5 60，5.56，5.48，5.45-5.30，5.23，5.20，5.12，5.10，5.08，5.03，4.95，4.92，4.70-4.42，4.25，4.20，3.87-3.76，3.74，3.60-3.45，2.28，2.23，2.08，2.01，2.00，2.09，1.96；质谱MALDI-TOF计算值C223H196O744057.16[M].实测值4057。36[M]；将18(811毫克，0.2毫摩尔)溶于用氨饱和的甲醇(4毫升)中，室温下反应7天后，将反应物浓缩，用Sephadex LH-20(MeOH)精制后得到奖状的游离的九糖19(243毫克，80％)；13C NMR(400MHz，CDCl3，25℃，TMS)δ＝136.88，118.54，104.32，104.32，104.32，102.83，102.83，102.72，102.72，101.24，100.10，80.73，80.54；1H NMR(400MHz，D2O 25℃，TMS)δ＝5.90，5.30，5.27，5.24，5.18，5.05，4.72，4.68，4.60，4.05-3.53；质谱MALDI-TOF计算值C57H96O461516.52[M].实测值1539.27[M+Na]
权利要求
1.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(10)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(13)，为起始物的甘露九糖简易合成法。其特征在于以甘露糖苷1为糖基受体，以α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯2为糖基供体，一步法缩合成3，6位连接的甘露五糖3，脱掉乙叉基再乙酰化，选择性地脱掉1位乙酰基然后用三氯乙睛活化即得到五糖供体4。如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基
2.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(10)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(13)，为起始物的甘露九糖简易合成法。其特征在于α1→2连接的甘露双糖三氯乙酰亚胺酯的糖基供体2由甘露糖原酸酯7缩合，得到α1→2连接的甘露双糖8，脱掉烯丙基后再用三氯乙睛活化1位即得到2，而糖的原酸酯7由乙酰基溴代甘露糖5制备，如下反应式所示 Bz＝苯甲酰基，Ac＝乙酰基 All＝烯丙基
3.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(10)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(13)，为起始物的甘露九糖简易合成法。其特征在于选择性脱掉8的乙酰基，得到双糖受体9，使9与单糖供体2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯10缩合得到三糖11，将11的烯丙基脱除，再用三氯乙睛活化1位，即得到三糖供体12，使12与4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷13缩合，选择性地得到3位连接的四糖14，将其2位乙酰化，再脱掉苄叉基，即得到4，6位为游离羟基的四糖受体16，如下反应式所示
4.一种以1，2-乙叉基-β-D-甘露糖苷(1)，3，4，6-三-O-苯甲酰基-1，2-O-烯丙氧基乙叉基-β-D-甘露糖(7)，2，3，4，6-四-O-苯甲酰基-α-D-甘露糖三氯乙酰亚胺酯(10)，4，6-O-苄叉基-α-D-甘露糖烯丙基苷(13)，为起始物的甘露九糖简易合成法。其特征在于五糖供体4与四糖受体16选择性地在16的6位缩合，得到保护的九糖17，乙酰化后再用碱脱掉乙酰基即得到九糖19，如下反应式所示
全文摘要
本发明涉及生物体内起重要生物学作用的甘露九糖α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－{α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→3)－[－α－D－甘露糖－(1→2)－α－D－甘露糖－(1→6)]－α－D－甘露糖－(1→6)}－a－D－甘露糖的简便化学合成法。
文档编号C08B37/00GK1381504SQ0111076
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月20日 优先权日2001年4月20日
发明者孔繁祚, 朱玉亮 申请人:中国科学院生态环境研究中心