抗血小板膜糖蛋白vi单克隆抗体的制作方法

专利名称：抗血小板膜糖蛋白vi单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及血小板膜糖蛋白VI (以下简称为GPVI)的抗体和该抗体的识别区域。
背景技术：
血小板在血栓形成、机体防御方面担负着极为重要的作用，已经了解到其生理作用与各种病态相关。特别是血小板在形成止血血栓的功能中受人瞩目，例如，血管内皮细胞受损伤，则血管内皮下的主要基质蛋白-胶原蛋白暴露，血小板与其粘附。接着，来自胶原蛋白的信号激活血小板，最终经由血纤蛋白原使血小板聚集。根据情况，这可能成为血栓栓塞性疾病等病态的原因，因此人们将其作为治疗的目标。

以往，为了治疗或预防由于血小板聚集而导致的血栓形成，使用了阿司匹林、噻氯匹定、GPIIb/IIIa拮抗剂等抗血小板药，其有效性和出血等副作用方面有很多问题，人们希望出现不具有上述问题、具有充分的安全性、以及确实且适当作用的优异的抗血小板药。存在于血小板膜上的GPVI是血小板的胶原蛋白受体，已经得知其在胶原蛋白的刺激产生的血小板活化中担负中心性作用(参照高山博史，日本血栓止血学会志,2003年，第14卷，第2号，75-81页)。S卩，Sugiyama等人报道称自身免疫性血小板减少症患者的血小板中特异性缺失62kDa的膜蛋白，未见胶原蛋白导致的血小板聚集(参照TateoSugiyama等5人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页)，并且该患者的血小板中缺失的蛋白质是GPVI，由患者血清纯化的抗体的Fab片段抑制胶原蛋白引发的血小板聚集(参照Tateo Sugiyama等6人，Blood，美国，1987年，第69卷，第6号，1712-1720页；以及 Masaaki Moroi 等 4 人，Journal of Clinical Investigation,美国，1989 年，第84 卷，第 5 号，1440-1445 页)。目前，来自自身免疫疾病患者的抗人GPVI自身抗体有Sugiyama等人(参照TateoSugiyama 等 6 人，Blood,美国，1987 年，第 69 卷，第 6 号，1712-1720 页)或 Takahashi 等人(参照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美国，2001 年，第 67卷，第4号，262-267页)的报道。但是，在Sugiyama等人的报告中，由患者血浆纯化的抗人GPVI自身抗体具有引发血小板聚集的作用，因此无法直接应用于药物中。Takahashi等人的文献(参照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美国，2001 年，第67卷，第4号，262-267页)中记载存在推测为GPVI的约62kDa的蛋白的自身抗体；以及该抗体引发血小板聚集。为了将来自这些患者的抗GPVI抗体作为药物临床应用，必须以稳定的品质大量生产安全性高的抗体，但是工业化生产方法尚未确立。目前制备的抗GPVI抗体是抗小鼠GPVI单克隆大鼠抗体(参照欧洲专利申请公开公报第1228768号)、以及抗人GPVI单克隆小鼠抗体(参照国际专利申请公开公报第01/00810 号和国际专利申请公开公报第 02/080968 号；Thromb Haemost，2003Jun ；89(6)996-1003)。识别人GPVI的人单链抗体(scFv :单链Fv)是使用噬菌体展示法等制备的(参照国际专利申请公开公报第01/00810号、国际专利申请公开公报第02/080968号、以及PeterA Smethurst等16人，Blood,美国，2002年,第100卷,第11号,474a页)。这些单链抗体是通过肽接头将人抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结合，是具有来自人的可变区的抗体，但是与细胞所产生的通常的免疫球蛋白相比，通常与抗原的亲和性低，在生物体内的半衰期也短，另外,Smethurst等人的研究中，单链抗体内，关于抑制血小板聚集的克隆(10B12) JfGPVI上的表位进行分析，第59号的赖氨酸(Lys 59)显示具有相关的可能性(参照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美国，2001 年，第 67 卷，第 4 号，262-267 页;以及 Peter A Smethurst 等 16 人，Blood，美国，2002 年，第 100 卷，第11 号，474a 页)ο如上所述，目前报道的所有的抗人GPVI抗体都含有上述人自身抗体，具有在体外
(in vitro)以单独的抗体活化血小板的作用、和/或引发或促进血小板聚集的作用，因此，给予生物体时可能引起血小板减少。事实上，Nieswandt等人多次报道了在体内(in vivo)使血小板上的GPVI消失的单克隆抗体(JAQ1、JAQ2和JAQ3)，但是各种抗体在给予后都会引发血小板减少。近年来，有人报道了 GPVI的激动剂-胶原蛋白、convulxin和CRP、以及抑制GPVI与胶原蛋白的结合的抗体(9012. 2)可激活血小板，并与其相伴，通过经由金属蛋白酶的切断产生来自血小板的GPVI的释放(St印hens G等5人，Blood. 2005Jan I ；105(1) :186-91 ；Gardiner EE 等 5 人，Blood. 2004 ;104 :3611-3617 ;Bergmeier W 等 7 人，ThrombHaemost. 2004 ；91 :951-958)。并且还使用9012. 2抗体等推定了 GPVI上与胶原蛋白相互作用相关的氨基酸残基(Val34、Leu36) (Lecut C等8人，J Biol Chem. 2004 ；279 52293-52299.)。高山等人使用自身免疫疾病患者的淋巴细胞克隆抗人GPVI抗体，体外研究了其性质(国际专利申请公开公报第05/007800号)。但是，目前为止的任何报告中都未公开不激活血小板、和/或不引发生物体内血小板减少、并具有使血小板膜上的GPVI消失的作用的抗体。

发明内容
如上所述，在人们需求安全性高、有效性优异、且容易使用的药物作为抗血小板药的状况下，人们迫切希望能够有可给予生物体的抗GPVI抗体。本发明的目的在于提供与存在于血小板、例如哺乳类的血小板、具体来说人、猴、大鼠、小鼠血小板，特别是人血小板膜上的糖蛋白GPVI特异性结合的新型抗体，优选单克隆抗体。特别提供可以给予生物体、有效且在血小板减少等副作用方面没有问题的抗GPVI抗体。还提供与GPVI、特别是人GPVI特异性结合、并含有新型的CDR序列的抗体。还进一步提供产生这些抗体的细胞。本发明人等为解决上述课题，着眼于建立多种产生抗GPVI抗体的小鼠杂交瘤，对它们所产生的抗体的性状进行分析。基于该研究方向进行了深入的研究，结果成功地获得了产生抗体的杂交瘤，该抗体具有与GPVI结合的能力、具有使胶原蛋白导致的血小板聚集的性能降低的活性。又对各抗体的GPVI上的识别区域进行分析，获得了与GPVI的表位有关的有益的信息。还分离该单克隆进行进一步的研究，结果成功地获得了编码该抗体的基因，明确了该抗体的CDR氨基酸的序列为新的序列。又通过基因重组技术制备了重组抗体，完成了本发明。本说明书中，将杂交瘤(例如克隆F1232-18)所产生的抗体记为F1232-18抗体。本发明的第一方案是显示特定的功能或特性的、与GPVI例如哺乳类的GPVI、具体来说是人、猴、大鼠或小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合的抗体，优选单克隆抗体(以下分别记为抗人GPVI抗体和抗人GPVI单克隆抗体)或其活性片段或它们的衍生物。具体来说涉及以下(I)具有以下性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物a)与GPVI、特别是人血小板膜糖蛋白VI (GPVI)特异性结合，b)使血小板活化的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，以及c)通过与血小板接触,使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(2)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，特别是具有上述(I)的性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们不介导血小板GPVI的释放、特别是伴随血小板活化的经由金属蛋白酶的切断导致的血小板GPVI的释放，通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(3)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们介导血小板GPVI的内化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(4) (1)-(3)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们介导血小板GPVI的内化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(5) (1)-(4)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们通过在生物体内与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(6) (1)-(5)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，将它们给予生物体内，通过与血小板接触，使血小板应答胶原蛋白发生聚集的能力降低或缺失；(7) (1)-(6)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们对于出血时间的延长作用
M ；(8) (1)-(7)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI的解离常数为4X 1(Γ8Μ 以下。上述(1)-(8)的抗体优选为单独不会引发人血小板聚集的抗体。优选的例子有表6和表11所例举的克隆，优选识别GPVI的环9的抗体或将其与人IgG、更优选人IgG4重组的嵌合抗体或人源化抗体。本发明的抗体还是GPVI、特别是人GPVI与抗体的解离常数(Kd值)优选为10_8M以下，更优选4X10_9M以下的抗体。本发明的抗体或其活性片段或它们的衍生物只要具有与GPVI的结合能力即可，例如也包含嵌合抗体和人源化抗体、Fab (抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双链抗体(diabody)、纳米抗体(nanobody)和含有Q)R的肽等，以及标记抗体、缀合抗体(conjugatedantibody)和抗体融合蛋白等。本发明的第一方案的抗体等优选与GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合，使胶原蛋白引发的血小板聚集能力特异性降低，但对其它激动剂例如ADP或凝血酶引发的聚集能力没有影响。还优选单独不引发人血小板聚集。该抗体在与抑制胶原蛋白引发的人血小板聚集的浓度或用量同等、优选10倍、更优选100倍、进一步优选1000倍的情况下，单独不会显著引发人血小板聚集。这里，上述(1)-(8)的抗体只要具有上述特性即可，可以是抑制GPVI特别是人GPVI与胶原蛋白结合的抗体，优选是以10_8M以下、更优选10_9M以下、进一步优选KTkiM以下的解离常数(Kd值)抑制GPVI特别是人GPVI与胶原蛋白的结合的抗体。本发明的抗体未必限定于特定的克隆，具有与本发明的优选例子同样作用的抗体均包含在本发明的范围内。本发明的抗体的作用的有无可通过实施例所示的方法或公知的方法确认。本发明还包含与优选的抗体在GPVI上的识别区域、结合部位或表位相同或至少部分共通的抗体，例如与GPVI的结合中具有互相竞争关系的抗体均包含在本发明的范围内。与本发明的抗体在识别区域或结合部位上是否有共通性，这可以按照实施例所记载的方法或公知的方法确认。即，本发明可提供在本发明的特定抗体与GPVI结合中参与竞争的抗体。本发明的实施例的竞争试验的分类中，可将表I所例举的被分类为八种类型，优选类 型d、e或h，更优选类型d或e的抗体作为本发明的抗体。上述(1)-(8)的抗体的优选例子有识别GPVI、特别是识别人GPVI的环9的至少一部分的抗体。本发明的第二实施方案是由新的GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI上的识别区域、结合部位或表位所规定的抗GPVI抗体，优选单克隆抗体。具体来说有以下抗体(9)抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们特异性识别含有GPVI、特别是人GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域I的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的结构；(10) (9)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11的至少一部分为人GPVI的环2的E2UK22 和 P23，环 3 的 G33 及环 5 的 A57、K59 和 L62，或环 4 的 S43、S44、S45、R46 和 E48及环 5 的 A57、K59 和 L62，或者环 9 的 T116、R117、G119 和 Q122、或环 9 的 T116、R117、G119和Q122及环11的R139 ；(11) (9)或(10)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI特别是人GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域I的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9特异性结合；(12) (1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们识别含有GPVI特别是人GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或者结构域I的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的结构；(13) (1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们特异性识别含有人GPVI结构域I的环2的E21、K22和P23，环3的G33及环5的A57、K59和L62，或环4的S43、S44、S45、R46和E48及环5的A57、K59和L62，或者结构域2的环9的T116、R117、G119和Q122，或环9的Tl 16、Rl 17、Gl 19和Q122及环11的R139的氨基酸序列或GPVI上的结构；(14) (1)-(8)的抗体或其活性片段或它们的衍生物，它们与GPVI特别是人GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9、或环9和环11，优选结构域2的环9、或环9和环11、或结构域I的环2，更优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9特异性结合。这里，上述各环的至少一部分例如是在人GPVI中，与不同种GPVI例如猴、小鼠或大鼠GPVI对应的氨基酸残基不同的残基。GPVI、例如人GPVI的模型结构可通过实施例记载的方法推定，各环的结构位置如

图1、3和47所示。上述环内，结构域2的环9、环9和环11，以及结构域I的环2，优选结构域2的环9、或环9和环11，进一步优选结构域2的环9是很重要的本发明的抗体识别区域，优选采用识别它们的抗体。优选的例子有表6和11所例举的抗体或将它们与人IgG、更优选人IgG4重组所得的嵌合抗体或人源化抗体。本发明的第二方案的抗体是通过与本发明第八方案的肽和/或第九方案的多肽
的结合性来进行分类，或者确认结合区域。即，本发明提供一种抗GPVI抗体，该抗体与本发明第八方案的肽和/或第九方案的多肽内的特定部位的结合性不同，优选降低。具体来说，是与特定的GPVI突变体的结合性、和与人GPVI和/或其它GPVI突变体的结合性显著不同、优选降低的抗GPVI抗体。具体的确认方法、所使用的多肽等、适合的分类和适合的抗体的例子如实施例所示。对本发明的抗体的抗原结合价并没有特别限定，可以是如Fab或scFv等的I价抗体，但从生物体内特别是血液中的稳定性、与GPVI的结合性或作用的强度角度考虑，优选2价以上的多价抗体例如2价、3价、4价或10价的抗体，更优选2价抗体。因此，本发明的第二方案可提供识别GPVI上的特定区域、特别是环9的I价抗体和2价以上的多价抗体例如2价、3价、4价或10价抗体，优选2价抗体。这里，4价抗体的例子有IgA，10价抗体的例子有IgM，但并不限于此。另外，3价抗体生理上并不存在，但是利用具有固有的三聚体化特性的天然或合成肽、例如生腱蛋白(tenascin)分子的结构域(AA 110-139,Swissprot#P10039 (鸡)，或Swissprot#P24821 (人))，通过化学或基因工程学与I价抗体(scFv或Fab等)结合，可以制备3价抗体(参照日本特表2004-508828号公报)。本发明的第二方案的抗体优选显示第一方案的抗体的特定功能或特性。本发明的第三方案是含有新的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗GPVI抗体，优选与人IgG、特别是人IgG4重组的嵌合抗体，更优选CDR移植抗体，特别是人源化抗体。具体来说有以下抗体(15)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，至少抗体的H链或L链一方的3组⑶R、优选抗体H链和L链两者6组⑶R含有表8、9、12和13记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体的CDR的氨基酸序列作为分别对应的CDR的氨基酸序列；(16)抗GPVI抗体的重链或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VH⑶Rl、VHCDR2和VH CDR3中分别具有SEQ ID NO. 15、16和17的氨基酸序列；SEQ ID NO. 18、19和20的氨基酸序列；SEQ ID NO. 21、22 和 23 ;SEQ ID NO. 24、25 和 26，SEQ ID NO. 27、28 和 29，SEQ ID NO. 30、31 和 32，SEQ ID NO. 33、34 和 35，SEQ ID NO. 36、37 和 38，SEQ ID NO. 39、40 和 41，SEQ ID NO. 42,43 和 44，SEQ ID NO. 45,46 和 47，或 SEQ ID NO. 48,49 和 50 的氨基酸序列，或者表12记载的任意的克隆的VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3 ；(17)抗GPVI抗体的轻链或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VL⑶Rl、VLCDR2和VL CDR3中分别具有SEQ ID NO. 51、52和53的氨基酸序列；SEQ ID NO. 54、55和56的氨基酸序列；SEQ ID NO. 57、58 和 59，SEQ ID NO. 60、61 和 62，SEQ ID NO. 63、64 和 65，SEQ ID NO. 66,67 和 68，SEQ ID NO. 69,70 和 71，SEQ ID NO. 72,73 和 74，SEQ ID NO. 75、76 和 77，SEQ ID NO. 78,79 和 80，SEQ ID NO. 81,82 和 83，或 SEQ ID NO. 84,85 和 86 的氨基酸序列，或者表13记载的任意的克隆的VL⑶Rl、VL⑶R2和VL⑶R3 ；(18)抗GPVI抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，在VHCDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDRUVL CDR2 和 VL CDR3 中分别具有 SEQ ID NO. 15、16、17、51、52 和 53 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 18、19、20、54、55 和 56 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 21、22、23、57、58 和 59的氨基酸序列，SEQ ID NO. 24、25、26、60、61 和 62 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 27、28、29、63、64和65的氨基酸序列，SEQ ID NO. 30、31、32、66、67和68的氨基酸序列，SEQ ID NO. 33、34、35、69、70 和 71 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 36、37、38、72、73 和 74 的氨基酸序列，SEQ IDNO. 39、40、41、75、76 和 77 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 42、43、44、78、79 和 80 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 45、46、47、81、82 和 83 的氨基酸序列，或 SEQ ID NO. 48、49、50、84、85 和 86 的氨基酸序列，或者表12和表13记载的任意的克隆的VH CDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2 和 VL CDR3 ；

(19)嵌合抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链两者的可变区与含有表7或表14记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体所具有的可变区的氨基酸序列作为分别对应的可变区的氨基酸序列的抗人GPVI抗体、特别是人IgG、优选人IgG4重组。第三方案的抗体优选具有第一方案和/或第二方案的抗体等的特性和/或识别区域特异性。本发明的第四方案是多核苷酸或核酸，该多核苷酸或核酸含有编码第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的至少H链或L链一方的3组CDR、优选H链和L链的6组CDR、或可变区的碱基序列。具体来说有以下多核苷酸或核酸(20)多核苷酸,该多核苷酸含有编码第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的H链和/或L链的碱基序列；(21) (20)的多核苷酸，其中，该多核苷酸含有在表8和9或者表12和13记载的克隆、优选识别GPVI环9的抗体基因中，编码分别对应至少抗体的H链或L链一方的3组⑶R、优选抗体H链或L链两者6组⑶R的碱基序列；(22)多核苷酸，该多核苷酸含有在识别表7或表14记载的克隆GPVI环9的抗体的基因中，编码分别对应的至少抗体的H链或L链的可变区、优选抗体的H链和L链两者的可变区的喊基序列；(23)多核苷酸，该多核苷酸含有编码H链的可变区的SEQ ID NO. 280的碱基序列、和编码L链的可变区的SEQ ID NO. 284的碱基序列，或者含有编码H链的可变区的SEQ IDNO. 282的碱基序列、和编码L链的可变区的SEQ ID NO. 284的碱基序列。本发明还提供来自含有特定的小鼠种系抗体基因片段组合的抗体基因的抗人GPVI抗体基因或其重链或轻链可变区基因。即，(24)抗人GPVI抗体基因或其重链可变区基因，该基因来自抗体重链基因，该抗体重链基因含有表16记载的小鼠种系抗体基因片段VH、D1^P Jh的任意组合；(25)抗人GPVI抗体基因或其重链可变区基因，该基因含有上述重链可变区基因中编码CDR氨基酸序列的核苷酸序列；(26)抗人GPVI抗体基因或其轻链可变区基因，该基因来自抗体轻链基因，该抗体轻链基因含有表16记载的小鼠种系抗体基因片段\和I的任意组合；(27)抗人GPVI抗体基因或其轻链可变区基因，该基因含有上述轻链可变区基因中编码CDR氨基酸序列的核苷 酸序列；这里，优选表16记载的小鼠种系抗体基因片段内，各抗体克隆的第一行表示的得分高的片段的组合，例如克隆F1246-1 -1的重链基因中，优选Vh (3 3.9)、DH(DSP2. 7或DSP2. 5)和Jh(JH4)的组合。来自上述抗体基因的基因只要其编码的抗体显示同样的抗原特异性，包含该抗体基因本身或伴随有I个碱基以上的突变的基因，该突变可以是天然产生的以及人为导入的任意形式。同时，本发明还提供由抗人GPVI抗体基因或其重链或轻链可变区基因编码的抗体或其活性片段或它们的衍生物，其中，所述基因来自含有特定的小鼠种系抗体基因片段的组合的抗体基因。即，(28)抗人GPVI抗体或其重链可变区多肽，它们由上述(24)-(25)的抗体基因或其重链可变区基因编码；(29)抗人GPVI抗体或其轻链可变区多肽，它们由上述(26)-(27)的抗体基因或其轻链可变区基因编码。本发明进一步提供聚乙二醇(PEG)化的抗GPVI抗体，特别是抗人GPVI抗体，具体来说，提供上述本发明的抗体，优选识别GPVI环9的抗体或其活性片段或它们的衍生物。使PEG与抗体等结合的方法可按照公知的方法(例如参照Roberts M. J等人.Advanced Drugdelivery Reviews 54 (2002) 459-476)进行，具体如实施例 31 所述。本发明的第五方案是产生第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物的细胞，或者含有第四方案的多核苷酸的细胞。具体有以下细胞(30)产生上述(1)-(19)中任一项的抗体或其活性片段或它们的衍生物的细胞，特别是转化细胞或杂交瘤；(31)含有上述(20)-(23)中任一项的多核苷酸的细胞，特别是转化细胞或杂交瘤。本发明的第六方案是制备第一至第三方案的抗体的方法，其特征在于使用第四方案的多核苷酸或含有该多核苷酸的表达载体、或第五方案的细胞。具体来说如下(32)第一至第三方案的抗体的制备方法，该方法包括培养上述(30)或(31)的细胞的步骤；以及收集由该细胞产生的单克隆抗体的步骤；(33)第一至第三方案的抗体的制备方法，该方法包括使用上述(19)-(23)的多核苷酸、含有这些多核苷酸的表达载体、(30)或(31)的任意的细胞的步骤。本发明的第七方案涉及含有本发明第一至第三方案的抗体或其活性片段或它们的衍生物作为有效成分的药物组合物，因此，优选为预防和/或治疗血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的药物组合物。本发明的抗体几乎没有血小板活化作用、血小板聚集作用、血小板减少作用和出血时间延长作用等的副作用，对上述疾病等的预防和/或治疗有效。本发明的第八方案涉及构成GPVI上的特定结构、特别是环结构的肽，具体来说有(34)肽，该肽含有GPVI、特别是人GPVI结构域I的环2、环3和环5、或环4和环5，或者结构域2的环9，或环9和环11，特别是由上述的任意的氨基酸序列构成的肽。这里，该肽可以含有来自不同种GPVI的氨基酸序列或GPVI以外的多肽、例如Fe的氨基酸序列。本发明的第九方案是特定的GPVI突变体，例如在氨基酸置换体、种间的结构域置换体、或种间的部分序列置换体，例如环置换体等。优选为将构成图I和图3所示的GPVI的I或2个以上环结构的氨基酸用其它氨基酸或多种类(例如人、猴、小鼠和大鼠)所对应的环的氨基酸置换得到的突变体，具体例子如表4或实施例所述。具体有(35)含有SEQ ID NO. 137-151的氨基酸序列的多肽。本发明的第十方案是抗体或其活性片段或它们的衍生物的筛选方法，该方法包括以下步骤a)测定与血小板膜糖蛋白VI (GPVI)、特别是人GPVI的结合性的步骤，b)测定使血小板活化的作用和/或引发生物体内血小板减少的作用的步骤，以及c)测定通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步骤。本发明的第十一方案是抗体表位的推定方法或抗体识别区域的鉴定方法，该方法包括测定第八方案的肽或第九方案的多肽与抗体的反应性、例如结合性的步骤。本发明的第十二方案是GPVI特异性抗体的制备方法，其特征在于使用本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等，具体如下(36) GPVI特异性抗体、优选本发明的第一至第三方案的抗体的制备方法，其特征在于将本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等作为免疫用的给予抗原，或者作为体外免疫用抗原使用；(37)GPVI特异性抗体、优选本发明第一至第三方案的抗体的制备方法，其特征在于使用本发明第八方案的肽或第九方案的多肽等作为用于检测或鉴定抗体的抗原。即，将本发明的抗体可识别的GPVI、特别是人GPVI上的氨基酸序列、例如与环结构相对应的氨基酸序列在小鼠GPVI上重组的GPVI重组体本身作为免疫原和/或检测用抗原，可得到可识别相同识别领域的新型抗体。作为人治疗用抗体的更优选的制备方法，有人公开了使用人抗体基因转基因非人动物的方法(W02002/070648 (日本特表2005-504507)、W02002/043478 (日本特表2004-515230))。不同种的GPVI、例如在小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列得到的蛋白质免疫上述转基因动物例如免疫小鼠时，可有效地获得不与GPVI的小鼠氨基酸序列反应，而与插入的人氨基酸序列、优选通过表位进行反应的人抗体。因此，该方法得到的人抗体可用作具有本发明第一或第二方案抗体特征的人抗体，该方法特别有用。本发明的第十三方案是使用第一至第三方案的抗体，对试样中GPVI进行检测或定量的方法。该方法可以测定血小板上GPVI或体液、特别是血液中GPVI，可应用于疾病的诊断方法，优选伴随有血栓形成的疾病的诊断方法。该方法还可应用于与GPVI相关的治疗的监控，特别是以血小板上的GPVI为指标，对抗GPVI抗体的效果进行预测或判定，或者进行预后的判定等。附图简述图I是人可溶解型GPVI和小鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示GPVI的各结构域以及通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。图2表示GPVI缺失患者的抗体与小鼠抗人GPVI单克隆抗体的竞争试验的结果。YA-Abs-88和YA-Abs-03表示GPVI缺失患者的抗GPVI抗体。
图3是人可溶解型GPVI和大鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示各结构域和通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。图4表示研究小鼠杂交瘤抗体和嵌合抗体的反应性的结果。图5表示嵌合抗体和杂交瘤抗体抑制GPVI与胶原蛋白的结合。图6表示研究抗人GPVI抗体与GPVI突变体的结合特性的结果。图7表示研究CF1232-37-2与各种hGPVI小鼠环置换体的反应性的结果。图8表示人血小板和食蟹猴血小板活化作用。通过FACS测定人血小板⑷和食蟹猴血小板(B)的CD62P(P表示选择蛋白表达量)，以平均荧光强度(MFI)表示。图9表示引发人血小板聚集的作用。图10表示F1232-37-2对胶原蛋白引发的人血小板聚集的作用。图11表示F1232-37-2对ADP引发的人血小板聚集的作用。图12表示对食蟹猴静脉内给予小鼠抗人GPVI单克隆抗体F1232-37-2和F1199-6的试验结果。图13表示小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo (先体外后体内)试验(单次静脉内试验CF1232-37-2单次静脉内给予试验)的结果。图14表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴ex vivo试验(反复静脉内给予试验)的结果。将0.3mg/kg CF1232-37-2每隔I天给予食蟹猴，测定给予4次时胶原蛋白引发的血小板聚集能力(A)和血小板GPVI量(B)。图15表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗体的食蟹猴试验(皮下给予试验)的结果。在对食蟹猴皮下给予CF1232-37-2后，在不同时间采血，测定2yg/mL胶原蛋白引发的血小板聚集能力㈧和血小板GPVI量⑶。图16表示F1232-37_2Fab抑制胶原蛋白引发的血小板聚集的作用。图17表示F1232-37_2F(ab’ )2的食蟹猴ex vivo试验结果。图18表示CF1232-37-2双链稳定共表达质粒的构建。图19表示在COS细胞中表达的CF1232-37-2和在CHO细胞中表达的CF1232-37-2的抗原结合反应性。图20表示重链可变区的氨基酸序列及其人源化情况。图21表示轻链可变区的氨基酸序列及其人源化情况。图22表示人源化抗体与GPVI的结合特异性。图23表示给予了嵌合抗GPVI抗体的食蟹猴血小板的胶原蛋白引发的聚集能力试验的结果。图24表示食蟹猴出血时间试验的结果。A :表示静脉内给予依替巴肽5分钟后和给予抗GPVI抗体CF1232-37-2的48小时后血小板的胶原蛋白引发的聚集能力。B :表示将静脉内给予依替巴肽5分钟后和给予抗GPVI抗体CF1232-37-2的48小时后的出血时间与给予各组药物之前的值进行比较的结果。图25表示抗GPVI抗体导致的血小板GPVI抗原释放的确认试验结果。图26表示抗GPVI抗体的全抗体以及Fab抗体的PEG化的结果。各泳道表示如下1 F1232-37-2 全抗体；2 :F1232-37_2 的 PEG 化反应物；3 =PEG 化 F1232-37-2 纯化物；4 F1232-37-2Fab 抗体；5 :F1232-37_2Fab 的 PEG 化反应物；6 PEG 化 F1232_37_2Fab 纯化物。图27表示PEG化抗GPVI抗体的GPVI抗原结合活性试验的结果。图28表不大鼠GPVI基因的核昔酸序列以及由其编码的氣基酸序列。图29是表示由实 施例35得到的rGPVI-Fc融合蛋白的SDS-PAGE结果的图。泳道I表示分子量标记，泳道2表示rGPVI-hFc融合蛋白，泳道3表示rGPVI_mFc融合蛋白。图30表示研究与GPVI环置换体的结合能力的结果。图31表示研究抗大鼠GPVI抗体与大鼠血小板的结合能力的结果。图32表示研究给予了抗大鼠GPVI抗体的大鼠血小板聚集能力的结果。图33表示实施例40中的GPVI消失的结果。图34表示研究抗GPVI抗体对胶原蛋白致死模型的效果的结果。图35表示研究抗GPVI抗体对电刺激引发的动脉血栓模型的效果的结果。图36是表示CypHer5E标记cF1232-37_2/CH0的抗原结合评价的图。图37表示CypHer5E标记cF1232-37_2/CH0的体外内化的结果。图38表示CypHer5E标记F1239-6-1的抗原结合评价。图39表示CypHer5E标记F1239-6-1的体外内化的结果。图40表示CypHer5E标记F1239-6-1的体内内化的结果。图41表示CF1232-37-2S/C0S的血小板活化评价(CD62P)的结果。图42表示CF1232-37-2S/C0S对于胶原蛋白引发的血小板聚集的抑制作用。图43是表示CF1232-37-2S/C0S的食蟹猴ex vivo试验结果的图。表示通过胶原蛋白引发的血小板聚集能力的结果。图44是表示研究PEG化F1239_6_lFab的抗原结合活性的结果图。图45表示给予高剂量CF1232-37-2下食蟹猴的出血时间。图46表示实施例50中大鼠出血时间的测定结果。图47表示人可溶解型GPVI和食蟹猴可溶解型GPVI的氨基酸序列的比对。方框表示GPVI的各结构域以及通过建模预测的环区域的位置(L1-L14)。实施发明的最佳方式(构成)本发明的抗体是特异性识别存在于血小板例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠血小板，特别是人血小板上的膜糖蛋白GPVI的抗体。本发明的抗体所识别的GPVI不一定限于血小板上，例如也可以识别巨核细胞的GPVI。这里，本发明中作为对象的GPVI是哺乳类的GPVI，例如有人、猴、大鼠、小鼠GPVI，特别是人GPVI。以下进一步详细说明本发明。本说明书中，氨基酸序列以一个字母标记或以三个字母标记记载。本发明的抗体可以是多克隆抗体，优选为单克隆抗体。对该单克隆抗体的制备方法没有特别限定，例如可以是杂交瘤产生的单克隆抗体、插入了抗体基因的重组细胞所产生的单克隆抗体、或者通过EBV(埃巴病毒)转化的细胞所产生的单克隆抗体的任意抗体。还可以是含有至少一个本发明的单克隆抗体的抗体的混合物或多克隆抗体、或者多个本发明的单克隆抗体的混合物。本发明的抗体也包含双特异性抗体或多特异性抗体。本发明的抗体是与GPVI例如哺乳类的GPVI，具体来说人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特别是人GPVI特异性结合的抗体。本发明的抗体与GPVI、特别是人GPVI的结合可通过公知的方法测定，具体来说有实施例所例举的方法。本发明的抗体中，GPVI、特别是人GPVI与抗体的解离常数(Kb值)为4X10_8M，优选KT8M以下，更优选4X KT9M以下，进一步优选KT9M以下。对测定人GPVI与抗体的解离常数的方法没有特别限定，可按照常规方法进行。例如可使用固定在芯片上的GPVI-Fc，通过BIAC0RE3000等蛋白质相互作用分析装置测定。还可以使用血小板特别是人或猴血小板，通过公知的方法例如使用RI标记抗体的方法进行测定。具体来说如实施例5和52所示。本发明的第一方案的抗体通过与血小板接触、特别是在生物体内接触，具有使血小板膜上的GPVI至少部分消失的作用。该作用可在将本发明的抗体与血小板接触一定时间后分离血小板，通过测定其表面上的GPVI表达量来确认。GPVI表达量可通过使用FACS等的常规方法测定，具体方法如实施例所示。本发明的抗体例如以3mg/kg、优选lmg/kg、更优选O. 3mg/kg、进一步优选O. lmg/kg的给予量给予,与给予前的值或者对照组的值进行比较，具有使血小板上的GPVI消失20%以上、优选40%以上、更优选60%以上、进一步优选80%以上的作用。本发明的抗体具有GPVI消失作用，该作用并不介导血小板GPVI的释放、特别是伴随着血小板活化的经由金属蛋白酶切断而导致的血小板释放GPVI，或者，引发该释放作用弱、优选没有显著的引发作用、更优选实质上没有引发作用，是通过与血小板接触使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗体。这里，是否有释放可通过公知的方法(Stephens G等5人，Blood. 2005Jan I ；105(1) :186-91 ；Gardiner EE 等人·，Blood. 2004 ;104 :3611-3617 ;Bergmeier W 等人.，Thromb Haemost. 2004 ；91 :951-958.)检测，具体可米用实施例 30 所述的方法。本发明的抗体是介导血小板GPVI的内化，通过与血小板接触使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗体或其活性片段或它们的衍生物。这些抗体与引发伴随着血小板活化的经由金属蛋白酶切断而导致的血小板释放GPVI的抗体不同，如下所述，其本身活化血小板的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，优选几乎没有作用是有用的。上述抗体的优选例子是识别GPVI环9的抗体。根据本发明的抗体，血小板GPVI的内化可通过公知方法确认，优选使用如实施例所示的标记物例如荧光物、优选PH敏感性荧光物的方法，具体来说，用这些标记物直接或间接标记本发明的抗体，由此可以检测抗体所结合的GPVI是否被摄取到血小板内，或者可以测定其摄取量。优选的方法如实施例所示。本发明的抗体本身活化血小板的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱、优选几乎没有作用。血小板的活化可通过公知的方法测定，可以以血小板表面抗原、优选CD62P的表达量作为指标。例如有以下方法经过一定时间后，从给予了本发明抗体的生物体中分离血小板，按照常规方法测定其CD62P的表达量的方法；以及将本发明的抗体与从生物体中分离的血小板接触，经过一定时间后通过常规方法测定该CD62P的表达量的方法等。其具体方法如实施例所示。在以⑶62P的表达量为指标时，使血小板上的GPVI至少部分消失的给予量或浓度下，本发明的抗体导致的血小板活化的程度是对照血小板的5倍以下、优选2倍以下、更优选I. 5倍以下、进一步优选几乎相同程度。生物体内血小板是否有减少，这可以在将本发明的抗体给予生物体后的不同时间进行采血，按照常规方法测定血小板数，通过与给予前的值或对照个体血小板数进行比较来确认。具体方法如实施例所示。在使血小板上的GPVI至少部分消失的给予量或浓度下，以给予前的值或者对照组的值为100%，本发明的抗体导致的血小板数的变化为50%以上、优选70 %以上、更优选90 %以上，进一步优选大致相同程度。本发明的抗体具有使胶原蛋白导致的人血小板聚集能力降低的作用，即，通过给予生物体内并与血小板接触，使血小板应答胶原蛋白并聚集的能力降低或缺失。该作用可如下确认将本发明的抗体给予生物体内，与血小板接触，然后在不同的时间分离血小板，测定胶原蛋白引发的血小板聚集。这里，血小板聚集可通过公知的方法测定，例如用血小板聚集能力测定装置等，以光透射率为指标，通过计算聚集率来测定，通常以光透射率最大的点的聚集率(以下称为最大聚集率)表示。后述的实施例8等记载的方法中，本发明的抗体在3mg/kg、优选lmg/kg、更优选O. 3mg/kg、进一步优选O. lmg/kg的给予量下,与给予前的值或者对照组的值进行比较，具有降低20%、优选40%以上、更优选60%以上、进一步优选80%以上的使血小板的胶原蛋白聚集能力降低的作用。

本发明的抗体优选对于胶原蛋白以外的引发血小板聚集的物质、例如ADP或凝血酶导致的聚集几乎没有影响，在对胶原蛋白聚集能力有影响的给予量或浓度下，最大聚集率优选为对照的80%以上、更优选为对照的90%以上、进一步优选为对照的95%以上。测定抑制胶原蛋白以外的引发血小板聚集的物质导致的人血小板聚集的方法可按照常规方法进行。本发明的抗体是出血时间延长作用弱、优选没有显著延长作用、更优选实质没有延长作用的抗体。出血时间可通过公知的方法测定，具体可采用实施例28或50所述的方法。本发明的抗体即使给予治疗用量或更多的量、例如O. 3mg/kg、优选lmg/kg、更优选3mg/kg、进一步优选10mg/kg的给予量,也实质上不延长出血时间，具体来说，出血时间是给予前的值、正常值或对照组的5倍以下，优选3倍以下，进一步优选2倍以下，特别优选I. 5倍以下。上述优选例子可例举识别GPVI、特别是人GPVI环9的抗体。目前报道的抗人GPVI抗体、包括上述人自身抗体，体外以单独的抗体几乎都具有活化血小板的作用、和/或引发或促进血小板聚集的作用，因此给予生物体时可能引起血小板减少。有报道称=Fab片段等形态不引发血小板聚集，但是也不能完全否定生物体内由于一些原因导致Fab发生交联或聚集，显示出与IgG等同样的动态的可能性。因此，优选的抗GPVI抗体不是抗体的活性片段，而是在完全的抗体分子例如IgG的形态下也不显示上述作用，或者上述作用低。从生物体内的动态和稳定性来看，自然形态的抗体分子例如IgG等优异。通常，与Fab等片段相比，IgG在血液中半衰期长很多，在血栓形成、特别是伴随有心房纤颤的血栓形成等慢性疾病或需要长时间给予抗体的病态中，优选血液中半衰期长的分子形态、特别是 IgG0本发明的抗体还可以特异性抑制血小板上的GPVI与胶原蛋白的结合。例如，在后述实施例所记载的方法中，本发明的抗体是优选以100 μ g/mL以下、更优选10 μ g/mL以下、进一步优选I μ g/mL以下、特别优选O. I μ g/mL的浓度50%抑制GPVI与胶原蛋白结合的抗体。对测定胶原蛋白与GPVI结合的方法没有特别限定，可按照常规方法进行。本发明的第二方案是由新的GPVI上的识别区域、结合部位或表位所规定的抗GPVI抗体，优选单克隆抗体。本发明的抗体GPVI上的识别区域等通过公知的方法确认或推定。例如，应用本发明的第十一方案的方法，通过测定与第八方案的肽或第九方案的多肽的反应性来实施。具体方法如实施例所示。例如，在实施例7或实施例18所记载的方法中，可以以反应性或抑制率与对照(例如hGPVI-Fc)比较显著变化、例如为50%、优选30%、更优选10%以下的情况，或者IC50等值显著变化、例如为3倍、10倍、更优选30倍、进一步优选100倍的情况为基准进行确认或推定。确认了 GPVI上的识别区域、结合部位或表位的抗体可单独或者通过与其它抗体的组合，用于检测特定的GPVI分子种类，或者用于分析GPVI的结构与功能的关系。本发明的第三方案涉及含有新的CDR氨基酸序列或可变区氨基酸序列的抗人GPVI抗体。抗体的重链和轻链的N末端一侧存在可变区，分别称为重链可变区(VH)、轻链可
变区(VL)。可变区内存在互补性决定区域(CDR)，该部分负责抗原识别的特异性。可变区的CDR以外的部分具有保持CDR结构的作用，被称为构架区(FR)。在重链和轻链的C末端一侧存在恒定区，分别称为重链恒定区(CH)、轻链恒定区(CL)。重链可变区中存在第一互补性决定区域(⑶Rl)、第二互补性决定区域(⑶R2)和第三互补性决定区域(CDR3)三个互补性决定区域。重链可变区中的三个互补性决定区域总称为重链互补性决定区域。轻链可变区中同样存在第一互补性决定区域(CDRl)、第二互补性决定区域(CDR2)和第三互补性决定区域(CDR3)三个互补性决定区域。轻链可变区中的三个互补性决定区域总称为轻链互补性决定区域。对本发明抗体的⑶R序列并没有限定，VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3的氨基酸序列的优选组合，VL⑶Rl、VL⑶R2和VL⑶R3的氨基酸序列的优选组合，以及VH⑶Rl、VH⑶R2、VHCDR3、VL OTRUVL⑶R2和VL⑶R3的氨基酸序列的优选组合如表8和表9以及表12和表13所示。优选含有识别GPVI环9的抗体的CDR氨基酸序列中的任意一个以上、优选H链的三个、更优选全部氨基酸序列的抗体。对CDR以外的氨基酸序列没有特别限定，来自其它抗体、特别是其它种抗体的所谓的CDR移植抗体也包含在本发明的抗体中。其中，优选CDR以外的氨基酸序列是来自人的人源化抗体，根据需要，构架区(FR)可以伴随有I至数个氨基酸残基的附加、缺失、置换和/或插入。人源化抗体的制备方法可采用公知的方法，具体方法如实施例所示。本发明的抗体VH和VL的氨基酸序列并不受限定，优选的抗体是含有SEQ IDNO. 281的氨基酸序列作为VH或SEQ ID NO. 285的氨基酸序列作为VL的任意一个以上的抗体，或者是含有SEQ ID NO. 283的氨基酸序列作为VH或SEQ ID NO. 285的氨基酸序列作为VL的任意一个以上的抗体。本发明的抗体并不限定为特定的氨基酸序列，在对其活性和/或抗原性没有实质影响的范围内，在本发明的抗体氨基酸序列中，例如允许在可变区、特别是FR部分有I至数个氨基酸残基的附加、缺失、置换和/或插入。本发明的抗体优选抗体的恒定区含有来自人抗体、更优选人IgG、进一步优选人IgG4的氨基酸序列。本发明的抗体并不限于特定的分子种类。抗体、即免疫球蛋白的结构含有重链(H链)和轻链(L链)，根据重链的类型U、α、μ、δ、ε )分为五个同种型(IgG、IgA、IgM、IgD, IgE) o其中，IgG和IgA重链不同(例如人有Y I、Y 2、Y 3、Y 4、α I、α 2)，因此分为亚类(例如人有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2)。轻链被分为κ或λ的任意型。本发明的抗体的类型、亚型或同种型并不受限定，可以是被分类的即可。优选同种型为IgG的抗体，从没有补体结合性的角度考虑，进一步优选亚类为IgG4的抗体。本发明的抗体只要具有活性、例如与GPVI的结合能力即可，可以是抗体的片段、特别是活性片段或一部分。这里，抗体的活性片段是具有抗体的至少一种活性、特别是抗原结合活性的片段。例如有？813(抗原结合片段)、？313’、？(313’)2、单链抗体(SCFV)、二硫键稳定性抗体(dsFv)、双链抗体、SC (Fv)2 (例如参照 Orita T，Blood. 2005 ；105 =562-566)、纳米抗体(例如参照 Cortez-Retamozo V. , Cancer Research 64, 2853-2857, 2004)和含有CDR的肽等。抗体的衍生物是具有抗体的至少一种活性、特别是抗原结合活性的来自抗体的物质，有结合了其它物质的抗体或抗体的活性片段、用其它物质修饰的修饰抗体或其活性片段、或者向抗体的结构特别是氨基酸序列中导入突变的分子。本发明的抗体对其抗原结合价并没有特别限定，可以是Fab或scFv的一价抗体，从在生物体内、特别是血液中的稳定性、与GPVI的结合性或作用强度的角度考虑，优选二价以上的多价抗体，例如二价、三价、四价或十价抗体，更优选二价抗体。

本发明的第四方案提供编码本发明的第一至第三方案的抗体的多核苷酸或核酸。该多核苷酸只要是编码本发明抗体的氨基酸序列即可，没有限定，多核苷酸包含DNA和RNA。编码本发明抗体的⑶R序列的多核苷酸并不受特别限定，编码VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3氨基酸序列的碱基序列的优选组合、编码VL⑶R1、VL⑶Rl和VIXDR3氨基酸序列的碱基序列的适当组合、以及编码VH CDRl、VH CDR2和VH CDR3、VLCDRl、VL CDRl和VLCDR3氨基酸序列的碱基序列的优选组合如表8和表9以及表12和表13所示。对编码本发明抗体的VH和VL的氨基酸序列的多核苷酸并没有特别限定，优选含有编码 VH氨基酸序列的 SEQ ID NO. 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107 和 109 的碱基序列，或者编码 VL 氨基酸序列的 SEQ ID NO. 88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110的碱基序列的其中之一，更优选含有两者的碱基序列的多核苷酸，还优选编码VH氨基酸序列的序列号的碱基序列、或编码VL氨基酸序列的序列号的碱基序列的其中之一，更优选含有两者碱基序列的多核苷酸。编码本发明的抗体恒定区的多核苷酸优选含有来自人抗体、更优选人IgG、进一步优选人IgG4的碱基序列。通过将含有本发明抗体的核苷酸序列的载体或基因通过转移到细胞中，可以制备产生本发明的抗体的细胞。转移方法可按照公知方法进行，具体方法如实施例所示。本发明的第五方案提供产生本发明的抗体的细胞。上述细胞的例子有杂交瘤、转化体、或者导入了本发明的抗体基因的基因重组细胞等。产生抗体的杂交瘤具体可例举表6和11所示的克隆。本发明可以提供上述发明的细胞所产生的抗体。本发明的第八方案和第九方案可提供与GPVI相关的新型肽或多肽。这些肽等可通过公知的方法制备，具体方法如实施例所示。第八方案的肽或第九方案的多肽可作为制备抗GPVI抗体的免疫用的给予抗原、或者检测GPVI抗体的抗原使用。(制备方法)本发明的第六方案提供抗体的生产方法。对制备本发明的抗体的方法并没有特别限定，可按照以下的方法制备。即，以人GPVI或其片段或它们的衍生物、例如人GPVI-Fc作为抗原，给予动物例如小鼠，从其末梢血采集淋巴细胞，制备与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤。得到上述制备的杂交瘤所产生的抗体，选择与GPVI具有结合能力、具有第一至第三抗体特性的抗体，得到产生该抗体的细胞。通过培养该细胞可得到本发明的抗体。本发明的抗体可以制备成使用公知的方法(分别为Nature，312 :643，1984 ;Nature, 321 :522，1986，之后开发了很多方法)得到的重组人抗体的形式。首先，从产生本发明的抗体的细胞例如淋巴细胞、优选生产抗GPVI单克隆抗体的杂交瘤中获得编码VH或VL的核酸、例如cDNA，确定碱基序列和氨基酸序列。接着，将获得的编码VH和VL的cDNA分别插入到动物细胞用表达载体中，构建人抗体表达载体，导入动物细胞，使其表达，由此制备抗体。其中，所述动物细胞用表达载体含有由同一细胞或另外的人细胞制备的、编码人抗体CH和/或人抗体CL的基因。对导入到动物细胞中的基因的制备方法没有特别限定，可以从来自杂交瘤的基因组DNA或cDNA中获得，也可以通过PCR从杂交瘤的mRNA中获得，还可以通过化学合成获得。对插入了编码本发明抗体的VH或VL的核酸的载体并没有特别限定，优选使用蛋白质基因等的表达中常用的、特别适合抗体基因表达的载体或高表达用载体。优选的例子有含有EF启动子和/或CMV增强子的载体，例如有pEF-BOS或者在实施例中使用的载体。通常是分别制备插入了编码VH或VL的核酸的表达载体，对宿主细胞进行共转染，也可以插入到单一的表达载体中。对导入了表达载体的宿主细胞并没有特别限定，优选蛋白质基因等的表达中常用的、特别适合抗体基因表达的细胞。例如有细菌(大肠杆菌等)、放线菌、酵母、昆虫细胞(SF9等)、哺乳类细胞(COS-1、CH0、骨髓瘤细胞等)。为了工业化生产重组抗体，通常利用可使该抗体稳定高效率生产的重组动物细胞株，例如CHO细胞株。上述重组细胞株的制备、克隆、为了高表达而进行的基因扩增以及筛选可采用公知的方法(例如参照Omasa T. :J. Biosci. Bioeng.，94，600-605，2002等)。在建立稳定高产率动物细胞株的过程中使用了两种启动子，通过利用启动子活性不同的组合、例如活性高的和活性低的，优选通过利用活性相对弱的启动子作为选择标记的表达启动子，可以有效地(选择性地)取得表达性能高的克隆。优选的启动子的组合的例子和具体方法如实施例所示。重组人抗体的制备中使用的人抗体的恒定区例如可以使用C Y I或C Y 4作为人抗体重链恒定区，使用Ck等任意的人抗体的恒定区作为人抗体轻链恒定区。本发明的抗体内，含有人的氨基酸序列的抗体除了人体内天然存在的抗体之外，也包含含可变重链和可变轻链的组合文库，例如人抗体噬菌体文库和由产生人抗体的转基因动物得到的抗体等。人抗体噬菌体文库是将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中，使Fab、单链抗体等抗体活性片段在噬菌体表面表达的文库。通过对这些文库进行筛选，也可以获得本发明的抗体。这些方法以及其它方法是本领域技术人员所周知的(Huse 等人，Science 246 1275-1281 (1989) ；ffinter 和 Harris, immunol. Today 14 243-246(1993) ;Ward 等人，Nature 341 :544-546(1989) ;Harlow 和 Lane，同前，(1988)；Hilyard等，Protein Engineering A practical approach (IRL Pressl992) ；Borrabeck,Antibody Engineering,第 2 版(Oxford University Press 1995))。以与固定抗原的基质的结合活性为指标，可以由该文库回收表达具有所需抗原结合活性的抗体活性片段的噬菌体。进一步通过基因工程的方法，可将该抗体的活性片段变换成含有两条完全的H链或两条完全L链的人抗体分子。本发明除含有两条重链和两条轻链的抗体之外，也包含本发明的抗体的活性片段等。抗体活性片段例如有Fab(抗原结合片段)、Fab’、F(ab’)2，通过接头将抗体的活性片段结合的形式的有单链抗体(scFv)或二硫键稳定性抗体(dsFv)，含有抗体活性片段的肽例如有含有CDR的肽。它们可以通过用适当的蛋白分解酶对本发明的抗体进行处理的方法，或者基因重组技术等公知的方法制备。本发明的抗体为IgM时，本发明的Fab可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白分解酶-胃蛋白酶处理得到；抗体为IgG时，本发明的Fab可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白质分解酶-木瓜水解酶处理得到。或者，将编码该抗体的Fab的DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该载体导入原核生物或真核生物中使其表达，可以制备 Fab0
本发明的F(ab’)2可以将本发明的抗GPVI抗体用蛋白质分解酶-胃蛋白酶处理获得。或者将下述Fab’进行硫醚结合或二硫键结合来制备。本发明的Fab’可以通过将与GPVI特异性反应的F(ab’)2用还原剂二硫苏糖醇处
理获得。本发明的scFv中所含的VH和VL可以使用本发明的杂交瘤所产生的抗体或人抗体的任意一种。本发明的scFv可如下制备获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备scFv。dsFv是指将VH和VL中的各一个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基，将所得的多肽经由该半胱氨酸残基间的二硫键结合所得。置换为半胱氨酸残基的氨基酸残基可按照Reiter等人所示的方法[Protein Engineering, 7,697 (1994)],根据抗体的立体结构预测来选择。本发明的dsFv中所含的VH和VL可以使用来自本发明的第一或第二方案的任意抗体。本发明的dsFv可如下制备获取编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备dsFv。含有⑶R的肽是含有H链或L链⑶R的至少一个区域以上的构成。多个⑶R可以直接或者经由适当的肽接头结合。本发明的含有CDR的肽可如下制备获得编码本发明的抗GPVI抗体的VH和VL的cDNA，然后构建编码⑶R的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入原核生物或真核生物使其表达，从而可制备含有CDR的肽。含有CDR的肽可通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成方法制备。本发明的抗体或活性片段或它们的衍生物也包含例如杂交瘤所产生的抗体、用EBV转化的细胞所产生的抗体、由cDNA表达的重组抗体、或者使放射性同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与这些抗体的活性片段化学结合所得的抗体、或者基因工程学融合的抗体。例如结合了聚乙二醇等的抗体稳定性等方面应用价值高，是一个优选的例子。还可以通过化学方法[抗体工学入門(金光修著1994年(株)地人書館)]，使放射性元素同位素、蛋白质、肽或低分子化合物等与本发明的抗GPVI抗体或抗体的活性片段的H链或L链的N末端一侧或C末端一侧、抗体或抗体活性片段中适当的取代基或支链、以及抗体或抗体活性片段中的糖链结合来制备。杂交瘤是指淋巴细胞与来自人、小鼠、大鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合所得的、产生具有所需抗原特异性的单克隆抗体的细胞，可按照公知方法制备。制备单克隆抗体 时，优选考虑与细胞融合时使用的骨髓瘤细胞的配合性来选择。骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞。其中包含来自人的SK0-007、人小鼠杂合骨髓瘤SHM-D33、来自小鼠的P3、P3U1、SP2/0、NS-1，来自大鼠的YB2/0和Y3_Agl，2，3等骨髓瘤细胞。制备人抗体时，有以下方法利用体外免疫导致的淋巴细胞的活化来制备杂交瘤的方法；以及使用重组人抗体基因得到的动物、特别是转基因小鼠，例如KM小鼠制备杂交瘤的方法。(W02002/070648 (日本特表 2005-504507)、W02002/043478 (日本特表2004-515230))。向不同种GPVI例如小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列所得的蛋白质在免疫上述转基因动物、例如小鼠时，可以有效地获得不与GPVI的小鼠的氨基酸序列反应，而与插入的人氨基酸序列、优选表位反应的人抗体。因此，由该方法得到的人抗体作为具有本发明第一或第二方案抗体特征的人抗体，是有用的，该方法特别有效。对杂交瘤制备中使用的细胞没有特别限定，在制备人抗体时，优选在杂交瘤制备中使用的多种细胞中的至少一种是来自人的细胞。来自人的细胞可使用末梢血、淋巴结或脾脏等的人淋巴细胞，特别优选确认有自身抗体产生的人的淋巴细胞。淋巴细胞的活化可通过公知的方法进行。例如优选以下方法由人的末梢血或脾脏采集B细胞，通过体外免疫方法进行抗原刺激，制备与来自人B细胞的骨髓瘤细胞或来自小鼠的骨髓瘤细胞的杂交瘤的方法；用EBV转化，与小鼠骨髓瘤细胞融合的方法；用PWM等促细胞分裂原刺激，使B细胞多克隆激活并融合的方法(免疫试验操作法I · II、右田俊介等人编集、南江堂)等。对用于免疫动物的给予抗原、或者用于刺激细胞的抗原没有特别限定。抗原蛋白质的来源动物可以根据抗体的使用目的适当选择，可以是来自天然物的抗原、遗传工程制备的抗原、化学合成的抗原、与其它蛋白质或肽的融合蛋白等均可。例如可以使用血小板、血小板的膜、纯化GPVI、重组GPVI、GPVI-Fc，优选为GPVI-Fc。本发明第八方案的肽或第九方案的多肽适合作为制备抗GPVI抗体的免疫用的给予抗原使用。活化淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合可按照Milstein等的公知的方法(Methods inEnzymoI.，73卷3页)进行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作为融合剂的方法(单克隆抗体试验操作法入门、安东民卫 千叶丈著、讲谈社)或电融合法等。免疫细胞与骨髓瘤细胞的混合比只要是它们可以融合的比例即可，没有限定，优选相对于活化淋巴细胞，使用1/10量-等量的骨髓瘤细胞。使用PEG (平均分子量1，000-4, 000)进行细胞融合的方法中，PEG的浓度没有限定，优选以50%进行。可以添加二甲基亚砜(DMSO)等辅助剂作为融合效率促进齐U。融合时通过将加温至37°C的PEG溶液添加到混合的细胞中引发，反应1-5分钟后，添加培养基终止。由该融合形成的杂交瘤在含有次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和氨基蝶呤的培养基(HAT培养基)等选择培养基中培养I天-10天，分离未融合细胞。通过所产生的抗体进一步选择所得杂交瘤。选择的杂交瘤可通过公知的极限稀释法形成单一克隆，确立单一克隆性抗体产生杂交瘤。检测杂交瘤所产生的抗体的活性的方法可以使用公知的方法。这里，抗体的活性的检测分两阶段第一阶段是检测与GPVI抗原的结合能力，第二阶段是检测抑制GPVI与胶原蛋白结合的活性。第一阶段的活性的检测方法例如有=ELISA法、蛋白质印迹法、放射免疫测定法。第二阶段的活性的检测方法例如有=ELISA法(结合抑制型)、蛋白质相互作用分析法(BIAC0RE等)、抑制血小板聚集的测定法。第八方案的肽或第九方案的多肽可以作为检测抗GPVI抗体的抗原使用。具体方法如实施例所示。将建立的杂交瘤按照公知的方法培养，可以从其培养上清中获得单克隆抗体。抗体的纯化可以采用盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法或亲和柱层析法等公知的纯化方法进行。 抗体的浓度可以通过公知的蛋白质定量方法、例如通过测定280nm下的吸光度来测定。作为确认本发明的抗GPVI抗体的抗原结合性的方法、或者使用本发明的抗GPVI抗体检测生物试样中GPVI的方法，可以使用荧光抗体法、酶联免疫抗体法(ELISA)、放射线物质标记免疫抗体法(RIA)、免疫组织染色法、免疫细胞染色法等免疫组织化学染色法(ABC法、CSA法等)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、上述酶免疫测定法、夹心ELISA法[单克隆抗体试验手册、(講談社寸、工'y亍I 7 I、” ,1987年);生物化学实验讲座5免疫生化学研究法(東京化学同人、1986年)]等。(用途)本发明的抗体是与人GPVI特异性结合的抗体，本发明的抗体、抗体的活性片段、与化学物质结合得到的抗体的修饰物、或者含有它们的混合液的组合物等具有包括人的疾病的预防、诊断和治疗用途，以及检测受检试样、细胞和组织等中的人GPVI的用途等的各种用途。用涂药物本发明的抗体与人GPVI结合的特异性高，且单独使用时对人血小板活化和/或促进或引发血小板减少的作用低，因此对于人的疾病、例如血小板活化或聚集、或血管内皮障碍或者动脉硬化反应引起的疾病的预防和/或治疗有效，另外，也可用于血栓或栓塞引起的疾病、例如血栓形成和栓塞等的预防和/或治疗。这些疾病中，不仅包括动脉血栓形成，也包括静脉血栓形成，还包含心房纤颤弓I发的脑梗塞。本发明的抗体可以预防和/或治疗的人类疾病或病态具体有心肌梗塞，血栓溶解疗法时、实施经皮冠状窦内腔扩张术时、施行支撑架时、实施旁路手术时或者实施人工血管时或者这些手术之后的血管内皮肥厚、血管再狭窄、心绞痛或心肌梗塞、心房纤颤或心房扑动，以及上述原因的血栓形成、栓塞或脑梗塞、闭塞性血栓动脉炎、急性动脉闭塞症、闭塞性动脉硬化症或深部静脉血栓形成等，还有脑梗塞(粥样血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、心源性脑梗塞)、一过性脑缺血发作、株网膜下腔出血后的脑血管挛缩、肺血栓、肺栓塞、血管性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、播散性血管内凝血综合征、体外循环时防止血液凝固、全身性红斑狼疮、多发性动脉炎、抗磷脂抗体综合症、紫癜性肾炎、伴随糖尿病的内皮细胞损伤、糖尿病性肾炎、糖尿病性视网膜症、肾栓塞、伴随移植治疗的并发症(肝静脉闭塞症、移植物抗宿主病)等。对于之前所述的预防和/或治疗对象疾病，本发明的抗体可以单独给予，或者与其它药理活性成分联合使用。所述药理活性成分例如有公知的溶栓剂(例如组织纤溶酶原激活物(t-PA)及其衍生物(包括突变体或所谓的第二代)、尿激酶、链激酶)、或者公知的抗血小板药(例如阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、血栓烷拮抗剂、血栓烷合成抑制剂、GPIIb/IIIa拮抗剂)、公知的抗凝药(例如华法林、肝素、低分子肝素、戊多糖、凝血酶抑制齐U、FXa抑制剂、FVIIa抑制剂)等。这里所述的联合使用除了指给予同时含有本发明的抗体和该药理活性成分的合剂之外，也包含将本发明的抗体和该药理活性成分分别制成制齐U，在同一时期或者不同时间给予的情况，只要是在患者血液中同时存在即可，其给予形式不限。含有本发明的抗体以及制剂学上可接受的组合物作为有效成分的药物可使用通常使用的制剂用的载体或赋形剂、其它添加剂，制成例如片剂、注射剂、散剂、栓剂等，对人
或其它动物给予。应用于人时，其给予途径有口服给予、静脉内给予(单次给予、连续输液、间歇输液)、皮下给予、肌内给予、关节内给予、经皮给予、经鼻给予等，通常是口服给予或静脉内给予。本发明的抗体对人的临床给予量可以考虑适用患者的症状、体重、年龄或性别等，适当确定，通常成人每天静脉内给予I-IOOOOmg,优选IO-IOOOmg,可以将其分成一次或多次给予。给予量根据各种条件变动，因此也可能以比上述给予量少的量即足够。这里，本发明的抗体在识别GPVI方面是共通的，但本发明也包含具有不同机理的各种抗体。例如，直接抑制GPVI与胶原蛋白结合的、或者通过切断GPVI来抑制血小板活化和/或聚集的抗体有望获得比较即时性的效果，因此可能至少在疾病的急性期(例如心肌梗塞时或实施PTCA时或者实施之前或之后立即)有用。上述情况下，优选为了使本发明的抗体与血液中血小板表面的GPVI大部分结合而给予较大量的抗体，例如可以采取单次或分次静脉注射或静脉滴注的形式。另外，将GPVI摄入到内部的抗体可能无法获得即时效果，但是，考虑到人的血小板在血液中的寿命(9-10天左右)以及人抗体在血液中的半衰期(IgG时为数周)，则有望获得持续性的效果，因此，例如可在疾病的慢性期(例如心肌梗塞发病后或实施PTCA后数天-数月)有效。这种情况下，在部分优选完全抑制血液中血小板与胶原蛋白的反应性的程度下，以较长的间隔、例如一个周期为数天-数周，给予使血小板表面的GPVI消失所需量的抗体，例如可单次或分次静脉注射或静脉滴注。因此，优选的方案中，本发明的抗体可以同时具有这些效果。还可以实施将多种有望获得各效果的抗GPVI抗体组合的治疗。非口服给予的组合物包含通常溶解于可接受的载体、优选水性载体中的免疫球蛋白溶液或它们的混合液。可使用各种水性载体例如水、缓冲水、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、O. 4%生理盐水、O. 3%甘氨酸、人白蛋白溶液等。这些溶液是无菌的，通常不存在微粒物质。这些组合物可通过常用的熟知的灭菌方法灭菌。为了接近生理学条件，组合物中可以根据要求含有药学上可接受的辅助物质，例如PH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。这些制剂中的抗体浓度可在广范围内、即约低于O. 005 %重量(通常至少为约I %重量)-15或20%重量的大的量范围内变化，主要根据所选择的给予的特定方式，按照溶液容量、粘性等进行选择。用于制备非口服给予组合物的现实的方法是本技术领域的技术人员所公知或了解的，例如在 > 安 > 卜 > 文7 7 - 7 二-亍4力卟寸4工> 7 (第15版、7夕八7'
、y '> >夕''力二 ^卜 >>'>>八二7、1980)(该引例视为本说明书的一部分)有更为详细的记载。适合灌洗或其它途径的组合物可以根据所需的特定应用来选择。上述药学组合物可包含抗GPVI抗体和在该疾病中常用的其它治疗药。在任何情况下都可以采用单次给予和持续给予。预防性或治疗性的有效量可根据对象疾病、病态和患者的状态等适当确定。本发明的抗体可以为了储藏而冷冻或冷冻干燥，在使用之前在适当的载体中重新构成。该技术已知对于通常的免疫球蛋白是有效的，可以采用公知的冷冻干燥和重新构成技术。冷冻干燥和重新构成可能导致各种程度的抗体活性损失(例如常用的免疫球蛋白、
IgM抗体有产生比IgG抗体更大的活性损失的倾向)，以及在使用水平上，为了补充该损失必须进行调节，这是本领域技术人员应该认识到的。用涂GPVI检测使用本发明的抗体或抗体的活性片段检测受检试样中GPVI的方法可包括以下步骤使受检试样与本发明的抗体或抗体的活性片段接触的步骤；检测与本发明的抗体或抗体活性片段结合的受检试样中GPVI的步骤。可以进一步包括对受检试样中的GPVI进行定量的步骤。可通过检测受检试样中GPVI的方法进行疾病的诊断。特别是可用作人的疾病例如血栓性、栓塞性或动脉硬化性疾病的诊断。使用本发明的抗体检测受检试样中GPVI的方法有夹心ELISA系、抑制ELISA系、荧光抗体法、免疫组织化学染色法、放射性物质标记免疫抗体法、蛋白质印迹法、免疫沉淀法等，但并不限于此。作为对象的受检试样并不受限定，可以使用生物试样，有动物、特别是人的体液或组织、细胞和菌体以及它们的提取液、培养上清、涂抹标本和切片，优选血小板或血衆或者血清。通过测定血小板上的GPVI，可应用于与GPVI相关的治疗的监控，特别是以血小板上的GPVI消失为指标，对抗GPVI抗体的效果进行预测或判定，或者进行预后的判定等。
实施例通过以下实施例进一步详述本发明，但不应理解为本发明受这些实施例的限定。实施例IGPVI胞外区-Fe融合蛋白的制备A.人GPVI胞外区-小鼠Fe融合蛋白(hGPVI-mFc)的制备(l)hGPVI-mFc融合蛋白表汰质粒的构建以小鼠基因组DNA作为模板，扩增编码小鼠免疫球蛋白(mIgG2a)重链恒定区各结构域的基因区。即，用以下的引物对进行PCR反应，结果，用mIgG2a-a(SEQ ID NO. 152)和 mIgG2a-c(SEQ ID NO. 154)扩增了 CHl 结构域，用 mIgG2a_b(SEQ ID NO. 153)和mIgG2a-e (SEQ ID NO. 156)扩增了绞链部分、用 mlgG2a_d (SEQ ID NO. 155)和 mIgG2a_g(SEQID NO. 158)扩增了 CH2 结构域、用 mIgG2a-f (SEQ ID NO. 157)和mIgG2a_h (SEQ ID NO. 159)扩增了 CH3结构域。接着将上述四种扩增产物混合，使用引物mIgG2a-a和mIgG2a_h进行PCR反应，得到各结构域连接的扩增产物(编码重链恒定区(C Y 2a)的DNA片段)。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体上，然后用限制酶Bam HI和KpnI切取编码小鼠Fe区的DNA片段，制备片段A。另一方面，用限制酶Xba I和Bgl II由pCAGGS-GPVI-Fc质粒切取编码人GPVI胞外结构域的DNA片段，制备片段B。在用Xba I和Kpn I切断制备的表达载体pEF2cew的EF启动子下游，将这些片段连接成片段A+片段B，构建表达hGPVI-mFc (SEQ IDNO. 222)的质粒(pTK-2249)。(2) hGPVI-mFc融合蛋白的表汰和钝化C0S-1细胞在加入了 10%胎牛血清的DulbeccoMEM培养基中继代，将pTK-2249与转染试剂(FuGENE6，u力工夕人7 %吁人V 9 ^制备)以适当量混合，然后滴加到无血清的DulbeccoMEM培养基中，将其与培养液更换，进行转染。在5% C02存在下、在37°C下培养3天，然后将该培养上清用蛋白A柱(Pros印-A、MILLIP0RE)纯化，将所得作为制备抗人GPVI抗体用的抗原。B.人GPVI朐外区-人Fe融合蛋白(hGPVI-hFc)表汰质粒(dTK-2233)的构律和将具有编码人hGPVI-hFc的基因的质粒(pCAGGS-GPVI-Fc)用限制酶Xba I和Eco T22I切断，制备片段J，用限制酶Eco T22I和Bgl II切断，制备片段K，在表达质粒pEF2ceW的EF-I α启动子下游连接成片段J+K，构建hGPVI-mFc表达质粒(pTK_2233)。另夕卜，hGPVI-hFc的表达和纯化与hGPVI-mFc相同。C.小鼠GPVI朐外区-人Fe融合蛋白(hGPVI-hFc)表汰质粒(dTK-2440)的构律以小鼠基因组DNA为模板，用表述的引物对进行PCR反应。结果，用mGPVI_h(SEQID NO. 162)和 mGPVI-i (SEQ ID NO. 163)得到 PCR 扩增产物 hi，用 mGPVI-j (SEQ IDNO. 164)和 mGPVI-k(SEQ ID NO. 165)得到 PCR 扩增产物 jk，用 mGPVI-1 (SEQ ID NO. 166)和 mGPVI-m(SEQ ID NO. 167)得到 PCR 扩增产物 Im,用 mGPVI_n(SEQ ID NO. 168)和 mGPVI-o (SEQ ID NO. 169)得到 PCR 扩增产物 no,用 mGPVI-p (SEQ ID NO. 170)和mGPVI-c (SEQ ID NO. 160)得到PCR扩增产物pc。将这些扩增产物混合作为模板，再将引物 mGPVI-e(SEQ ID NO. 161)、mGPVI-q(SEQ ID NO. 171)、mGPVI-r(SEQ ID NO. 172),mGPVI-s (SEQ ID NO. 173)和mGPVI-c混合，进行PCR反应，得到各片段连接起来的扩增产物。将该扩增产物克隆到pT7-BlueT载体上，制备pTK-2437。在ρΤΚ_2437的含有小鼠GPVI胞外结构域的基因区5’ 一侧具有限制酶Nhe I的识别位点，3’ 一侧具有Bam HI的识别位点，用这些酶切断，制备DNA片段。然后将该片段插入到用限制酶Xda I和Bam HI切断制备的ρΤΚ-2233中，构建小鼠mGPVI-Fc表达质粒(pTK-2440)。P.食蟹猴GPVI胞外区-人Fe融合蛋白表达质粒的构建(I)食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fe融合蛋白表汰质粒的构建根据已知序列的人GPVI基因信息设计和制备适当的引物对，使用这些人GPVI引物，进行以食蟹猴基因组DNA为模板的PCR反应，确定食蟹猴GPVI基因序列的一部分。接着，以该序列为基础，重新设计和制备食蟹猴用的引物对，用各引物对、以食蟹猴的基因组 DNA 为模板再次进行 PCR 反应，用 macGPVI-a(SEQ ID NO. 174)和 macGPVI-b (SEQ IDNO. 175)得到扩增产物 ab，用 hGPVI-d (SEQ ID NO. 180)和 macGPVI-c (SEQ ID NO. 176)得到扩增产物 dc，用 macGPVI-d(SEQ ID NO. 177)和 hGPVI_h(SEQ ID NO. 182)得到扩增产物dh，用hGPVI-g(SEQ ID NO. 181)和macGPVI-g(SEQ ID NO. 178)得到扩增产物gg。另一方面，以 ρΤΚ-2233 为模板，通过使用 macGPVI-h(SEQ ID NO. 179)和 IgGl-i (SEQ ID NO. 183)的PCR反应，得到扩增产物hi。将以上五种扩增产物混合作为模板，通过macGPVI-a和IgGl-i再次进行PCR。该操作得到的扩增产物含有将食蟹猴GPVI的Dl和D2、人D3融合而成的嵌合GPVI基因，用限制酶Nhe I和Bam HI切断后，插入到用限制酶Xba I和Bam HI切断制备的ρΤΚ-2233中，构建食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fe融合蛋白(GPVI-FFH_hFc、SEQID NO. 223)表达质粒(pTK-2462)。实施例2抗人GPVI抗体的制备Α.兔多克隆抗体的制备为了制备抗人GPVI多克隆抗体，对兔进行免疫。即，将20 μ g实施例IA中制备的hGPVI-mFc在500 μ L生理盐水中稀释，与500 μ L弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，然后给予2. 1-2. 2kg的雌性新西兰白兔(北山f ”的背部皮下。2周后，再将20μ g hGPVI-mFc在500 μ L生理盐水中稀释，与500 μ L的弗氏不完全佐剂(DIFCO)等量混合，给予背部皮下。给予结束I周后，由耳静脉采血，按照规定方法分离抗血清，纯化抗体。即，向抗血清中添加硫酸铵，使最终饱和浓度为33%，在4°C下搅拌I小时，然后将析出的沉淀离心。接着将沉淀用Dulbecco磷酸缓冲液(以下记为D-PBS)溶解，用D-PBS透析过夜。过滤透析液，然后供给蛋白A柱(口七A、S V 7 )，用O. IM甘氨酸盐酸缓冲液(ρΗ3· O)洗脱结合的IgG组分，得到纯化抗体。所得洗脱组分用IM Tris盐酸缓冲液(ρΗ7. O)迅速中和，用D-PBS透析，然后由280nm的吸光度计算蛋白浓度(吸光系数0. 714mg/mL)。以下，将所得抗体记为抗GPVI多克隆抗体。B.抗人GPVI单克降抗体的制备将20 μ g GPVI-mFc与弗氏完全佐剂(DIFCO)等量混合，制成给予抗原。将给予抗原给予雌性ddY小鼠(8周龄、SLC) 2次，3天后由淋巴结分离淋巴细胞。将所得淋巴细胞与P3X63-Ag. 8. Ul (ATTC)混合，然后使用聚乙二醇(PEG1500、Sigma)，按照安东民卫、千叶丈/著“单克隆抗体试验操作入门”(讲坛社，83页)进行细胞融合。通过HAT培养基选择杂交瘤，I周后，用两种方法对产生目标抗体的杂交瘤进行筛选。即，使用了以与在板上固相化的hGPVI-hFc的结合活性作为指标的方法，以及以抑制胶原蛋白与GPVI结合活性为指标的方法。(I)以结合活性作为指标的杂交瘤的筛选用D-PBS将由实施例IB制备的hGPVI-hFc稀释为2 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到免疫板(MaXisorp、NUNC)中。在37°C下反应I小时，然后用离子交换水清洗5次。将含有2% StabilGuard(Surmodics)的 D-PBS (pH7. 4)以 100 μ L 添加到各孔中，进行封闭。接着，将培养上清添加到各孔中，在37°C下反应I小时，然后用含有O. 05%吐温-20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO、P260)用含有10%兔血清的D-PBS稀释为1000倍，向各孔中添加50 μ L。在37°C下反应I小时，然后同样清洗5次，向各孔中添加TMB溶液(BioFix)。在室温下反应10分钟，然后用O. 5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(I &十7\ > JX、大日本制药)测定450nm的吸光度。结果，选择与hGPVI-hFc反应的细胞，通过极限稀释法(安东民卫、千叶丈/著“单克隆抗体试验操作入门”(讲坛社，97页))进行克隆。8天后同样进行筛选，选择与hGPVI-hFc反应的抗体。(2)以抑制胶原蛋白-GPVI结合活性为指标的杂交瘤的筛选用D-PBS将胶原蛋白(Horn)稀释为10 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到免疫板(Maxisorp, NUNC)中。在4°C下反应过夜，然后用离子交换水清洗5次，用含有5% BSA的D-PBS封闭。接着添加25 μ L/孔培养上清，再以25 μ L/孔添加用D-PBS制备成2 μ g/mL的hGPVI-hFc，在37°C下反应I小时，然后用含有O. 05%吐温-20的生理盐水清洗3次。将过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(BioMeda)用含有10%山羊血清的D-PBS稀释成1000倍，向各孔中添加50 μ L。在37°C下反应I小时，然后同样清洗5次，将TMB溶液(BioFix)添加到各孔中。在室温下反应10分钟,然后用O. 5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(I ^
JX、大日本制药)测定450nm下的吸光度。选择相对于未添加抗体的孔的吸光度降低50%以上吸光度的孔作为产生抗GPVI抗体的杂交瘤。结果，通过多次的细胞融合(F编号表示I次)选择了具有抑制胶原蛋白与GPVI 的结合活性的杂交瘤。(3)杂交瘤所产生的抗体的制备产生抗GPVI抗体的杂交瘤用10% FCS/RPMI-1640培养基(Sigma)培养，然后更换为杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen)进行培养,使其产生抗体,使用蛋白A柱(Prosep-rA、^ 'J )，由培养上清中纯化抗体。即，将所得培养上清吸附于预先用D-PBS平衡的蛋白A柱(Pros印-A、Millipore)，将未吸附的蛋白质用D-PBS清洗，然后用25mM甘氨酸-盐酸缓冲液(PH3.0)洗脱吸附组分。然后用生理盐水进行透析，所得抗体的浓度是使用吸光系数(El% :1.4)，由28011111的吸光度进行计算。以下，将所得抗体记为抗GPVI单克隆抗体。实施例3抗GPVI单克降抗体的分组通过将实施例2所得的抗体按照与GPVI的结合特性、即结合区的不同进行分类，使用F1199、F1201、F1202、F1210和F1211各抗体进行竞争测定。首先，按照中根等人的方法(J. Histochem. Cytochem. ,22,1084,1974)制备各抗GPVI单克隆抗体的过氧化物酶标记抗体。接着使用这些过氧化物酶标记抗体进行与各纯化抗体的竞争测定，对抗体进行分类。即，用D-PBS将hGPVI-hFc稀释为2 μ g/mL，以50 μ L/孔添加到免疫板中。在37°C下反应I小时，然后用离子交换水清洗5次，向各孔中添加含有2% StabilGuard的D-PBS，进行封闭。接着，将25 μ L上述标记抗体和25 μ L各纯化抗体添加到孔中，在37°C下反应I小时，然后用含有O. 05%吐温-20的生理盐水清洗5次，用TMB溶液(BioFix)显色。在室温下反应10分钟，然后用O. 5M硫酸溶液中止反应，用板分光光度计(7 f 7々Y > JX、大日本制药)测定450nm的吸光度。以未添加纯化抗体时的吸光度为100 %，计算对各标记抗体的抑制活性，对各纯化抗体进行分类。结果，将与标记抗体(i)、(ii)、(V)、(viii)竞争的抗体分为a组。将与标记抗体(i)、(V)、(vii)竞争的抗体分为b组。将与标记抗体(i)、(ii)、(vii)、(viii)竞争的抗体分为c组。将与标记抗体(iii)、(iV)竞争的抗体分为d组,将与标记抗体(iii)、(iv)、(Vi)竞争的抗体分为e组。还将标记抗体(iii)、(vi)分为f组。未见有规则性的分为g组和h组。g组和h组互相不竞争，因此分为不同的组。因此，可以确认制备的抗GPVI单克隆抗体可以识别GPVI表面上的至少八种区域。实施例4供给候ex vivo试验的抗.体的分组在制备的抗人GPVI单克隆抗体中，按照实施例3的分组方法将与猴GPVI结合并可用于ex vivo试验的抗体进行分组。S卩，使用实施例3制备的各标记抗体,按照与实施例3同样的方法进行竞争测定,对各抗体进行分类。如表I所示，与实施例3同样可分为至少识别七种区域的抗体组。表I
权利要求
1.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与人GPVI结构域2的环9特异性结合。
2.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与SEQ ID NO. 147的氨基酸序列所示的人GPVI突变体的结合活性、和与SEQ ID NO. 135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的结合活性相比降低至50%以下，上述人GPVI突变体简称hGPVI-mL9-hFc,上述人 GPVI-hFc 简称 GPVI-HHH-hFc。
3.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段与人GPVI的结合受到SEQ ID NO. 135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的抑制，但未受到SEQ IDNO. 147的氨基酸序列所示的人GPVI突变体的抑制，上述人GPVI-hFc简称GPVI-HHH-hFc，上述人GPVI突变体简称hGPVI-mL9-hFc。
4.权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体为嵌合抗体。
5.权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体为人源化抗体。
6.权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的抗原结合价为I价。
7.细胞，该细胞产生权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段。
8.权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段，该抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段进行了聚乙二醇化，上述聚乙二醇简称PEG。
9.抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的制备方法，其特征在于使用权利要求7所述的细胞。
10.制备抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的方法，所述方法包括培养权利要求7所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段生产细胞的步骤，和收集由该细胞产生的单克隆抗体的步骤。
11.权利要求9或10所述的方法，其中权利要求7所述的抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段生产细胞为含有包含编码H链可变区域的SEQ ID NO :280的多核苷酸序列和编码L链可变区域的SEQ ID NO :284的多核苷酸序列的载体，或者包含编码H链可变区域的SEQ ID NO :282的多核苷酸序列和编码L链可变区域的SEQ ID NO :284的多核苷酸序列的载体的细胞。
12.药物组合物，该药物组合物含有权利要求I 3中任一项所述的抗人GPVI抗体或 其抗原结合性片段作为有效成分。
13.用于血栓或栓塞的权利要求12所述的药物组合物。
14.筛选与环9特异结合的、抗人GPVI抗体或其抗原结合性片段的方法，其包括以下步骤 a)测定与人血小板膜糖蛋白VI的结合性的步骤，上述糖蛋白VI简称GPVI， b)测定使血小板活化的作用或引发生物体内血小板减少的作用的步骤，以及 c)测定通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步骤。
全文摘要
本法明提供具有以下性质的抗体或其活性片段或它们的衍生物a)与人血小板膜糖蛋白VI(GPVI)特异性结合；b)使血小板活化的作用、和/或引发生物体内血小板减少的作用弱，以及c)通过与血小板接触，使血小板膜上的GPVI至少部分消失。
文档编号G01N33/577GK102875679SQ201210278310
公开日2013年1月16日 申请日期2006年4月28日 优先权日2005年4月28日
发明者高山博史, 白川嘉门, 古迫正司, 保坂义隆, 松末朋和, 内藤克纪, 堀田优米, 川原哲史, 本田元康 申请人:持田制药株式会社