专利名称：一种非填充式核酸提取器件及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微流体芯片领域中的非填充式核酸提取器件及其制备方法与应用，特别是涉及一种以塑料为基材制作的非填充式核酸提取器件与其在提取核酸中的应用。
背景技术：
近年来，用于核酸分析的生物芯片技术发展迅速。目前，大多数已报道的核酸分析芯片都是用于对纯核酸样品进行分析，而这些纯核酸样品是用常规实验室技术提取和纯化获得的。因此，若想将实验室常规核酸提取步骤微型化，构建核酸提取芯片非常重要，这将有助于构建出真正意义上的集样品提取、生化反应和结果检测等步骤集于一体的微型全分析系统。
核酸提取是指从细胞、细菌的裂解液或其它含有核酸的样品中，提取出具有一定纯度的核酸过程。目前文献中已报道的核酸提取芯片大多是利用核酸固相萃取技术在高浓度离水剂盐(如盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠等)酸性溶液下，核酸的磷酸骨架通过离水剂盐阳离子桥特异性吸附到氧化硅表面(如微、纳米氧化硅颗粒、氧化硅膜(或氧化硅层)、玻璃珠、玻璃纤维、硅澡土等)，而蛋白、脂类等其它分子则不被吸附，从而实现核酸与蛋白等分子的分离。
根据芯片内氧化硅制作方法的不同，目前已报道的核酸提取芯片大致可分为以下两大类一类为填充式芯片，是用毛细管或在玻璃等基材上加工出管道，然后在管道中填充微米级的氧化硅颗粒。这类芯片由于需要填充氧化硅颗粒，但每次只能填充一个管道，因此，没法批量进行自动化加工。两片填充重复性不好，填充颗粒会造成核酸提取时流体阻力较大，使提取速度减慢，并且细胞裂解残骸还容易造成管道堵塞。另一类为非填充式芯片，是在硅基材上用深度离子刻蚀技术加工出微结构，然后用离子增强化学气相沉积(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition，PECVD)技术在微结构表面制作氧化硅层。这类芯片重复性好，性能稳定，缺点是加工费用昂贵。由于PECVD制作氧化硅层需要在高温下进行(一般大于350摄氏度)，因此，这种方法只能在硅等高熔点材料上制作，很难在塑料基材上制作。迄今为止，以塑料为基材非填充式核酸提取芯片还未见报道或应用。
与玻璃、硅等材料相比，塑料基材(如聚甲基丙烯酸甲酯(Poly(methylmethacrylate)，PMMA)、聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)等)具有不易碎、易于加工大比表面结构、其模具复制技术适于批量加工、成本低廉等优点，PCR芯片、杂交芯片、电泳芯片等越来越多的核酸分析芯片已选用PMMA等塑料材料作为基材。因此，如果能在塑料基底上制作非填充式核酸提取芯片，则会便于将核酸提取步骤和塑料基的其它核酸分析芯片整合到一起，以实现真正意义上的用于核酸分析的微型全分析系统。
溶胶-凝胶机理是由烷氧基硅烷(如正硅酸乙酯、正硅酸甲酯)或类似的有机金属烷氧化物在常温下经分解和缩聚而先成溶胶，然后老化成凝胶的一种方法(Hench LL，West J K.The sol-gel process[J].Chemical Review，1990，9033-72.)，最后经干燥可制备成玻璃或陶瓷。此外，氧化硅薄膜的制作方法也是建立在溶胶-凝胶机理基础之上的。提拉法(Dip-Coating)、旋涂法(Spin-Coating)是制备氧化硅膜常用的方法(Brinker C J.Hydrolysis and condensation of silicateseffectson structure[J].Journal of Non-Crystalline Solids，1988，10031-50.Klein LC.Sol-gel processing of silicates[J].Annual Review of MaterialScience，1985，15227-248.)。
Stber法是制备氧化硅颗粒最常用的方法。1968年，Stber等人发明了从10nm-2μm级氧化硅颗粒的制作方法，该法是以氨水为催化剂，利用了正硅酸乙酯(Tetraethoxysilane，TEOS)可在异丙醇中水解生成纳米氧化硅微核，然后团聚生成氧化硅颗粒的原理(Stber W，Fink A，Bohn E.Controlled growth of monodispersesilica spheres in the micron size range[J].Journal Colloid Interface Science，1968，2662-69.)。目前，制备微米级以下氧化硅颗粒及其衍生物的各种方法都是在Stber方法的基础上发展起来的。
发明内容
本发明的目的是提供一种以塑料为基材制作的非填充式核酸提取器件。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种非填充式核酸提取器件，它是由至少一个结构单元组成的，所述结构单元包括有均为塑料材质的一盖体和一样品吸附载体，所述样品吸附载体上设有管道、凹槽或腔体，所述盖体与样品吸附载体上具有管道、凹槽或腔体的一面紧密贴合，所述管道、凹槽或腔体内壁上设有氧化硅凝胶层，所述盖体或样品吸附载体上对应于所述管道、凹槽或腔体的位置设有至少一个进样孔和一个出样孔。
所述非填充式核酸提取器件可由两个、三个或三个以上罗列在一起的结构单元组成。
当所述样品吸附载体具有腔体结构时，样品吸附载体可由中间设有通孔的中间层和底板组成，底板紧密连接于中间层的下方，从而形成具有腔体结构的样品吸附载体。
为方便操作，可将进样孔和出样孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定。
可根据实际需要对进样孔和出样孔的孔径进行调整，如0.01-1000mm(优选为0.9mm)。
所述塑料基材的选择是多种多样的，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛等，优选为聚甲基丙烯酸甲酯。
所述塑料基材可以被加工成片状或管状等多种外部型状。
为获得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔体内还可以再设有柱形、棱锥、梳形或坝形等多种型状的突起，以增大内表面积。
本发明的第二个目的是提供一种上述非填充式核酸提取器件的制备方法。
本发明所提供的非填充式核酸提取器件的制备方法，可包括以下步骤1)在塑料基材上形成管道、凹槽或腔体结构，并在所述管道、凹槽或腔体的位置设置至少一个进样孔和一个出样孔；2)用溶胶-凝胶方法制备氧化硅凝胶；3)将氧化硅凝胶涂覆在所述管道、凹槽或腔体的内壁上，得到非填充式核酸提取器件。
在上述制备方法中，为方便操作，所述步骤1)中在进样孔和出样孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定；所述进样孔和出样孔的孔径可为0.01-1000mm(优选为0.9mm)；塑料基材的选择是多种多样的，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛等，优选为聚甲基丙烯酸甲酯。
步骤2)中用溶胶-凝胶方法制备氧化硅层的具体方法可为将烷氧基硅烷或有机金属烷氧化物，体积百分浓度0.01-100％乙醇，体积百分浓度0.01-100％异丙醇，水(优选为超纯水)和0.0001-12M(优选为0.12M)盐酸按体积比为0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100(优选的体积比为31∶23∶23∶19∶4)混合均匀，在0-120℃下(优选为70℃)水浴0-10000小时(优选为4.5小时)，得到氧化硅溶胶；所述烷氧基硅烷为正硅酸乙酯(TEOS)或正硅酸甲酯等；所述有机金属烷氧化物为异丙氧基钛或异丙氧基铝等。
步骤3)中将氧化硅凝胶涂覆于所述管道、凹槽或腔体内壁的线速度可为0.01-1000mm/s(优选为5mm/s)，涂覆后的氧化硅凝胶层可经氮气流干燥0.01-10000小时(优选为24小时)，氮气流速可为0.001-1000.0m/s(优选为0.5m/s)。
所述塑料基材可以被加工成片状或管状等多种外部型状。
为获得更好的提取效果，步骤1)中在所述管道、凹槽或腔体内还可以再设置有柱形、棱锥、梳形或坝形等多种型状的突起，以增大内表面积。
本发明的另一个目的是提供用上述非填充式核酸提取器件提取核酸的方法。
本发明所提供的提取核酸的方法，包括以下步骤1)将非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体依次用0-7M盐酸胍溶液、碘化钠溶液或异硫氰酸胍等吸附液(优选6M盐酸胍溶液)，体积百分浓度为50-100％的(优选为80％)的异丙醇水溶液、50-100％乙醇等清洗液，0-1000mM pH 6.0-14.0 Tris溶液(优选为5mM pH 8.5的Tris溶液)、pH 6.0-14.0的水等洗脱液，以及所述吸附溶液各浸泡15-60min；2)将待分离样品加入所述非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体中，静置或流动吸附，使样品中的核酸吸附于非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体内壁上的氧化硅层上；3)用所述清洗溶液对非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体进行清洗；4)用所述洗脱溶液进行洗脱，得到核酸样品。
在上述核酸提取方法中，步骤1)中的吸附液中可再包含有1-100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)和/或0.1-10mM乙二胺四己酸纳(EDTA)，清洗液的pH值为1.0-9.0。
步骤2)中若非填充式核酸提取器件为腔体式的，可选择静置吸附方式，吸附时间可为15-60min(优选为30min)，非填充式核酸提取器件为管道式的，可选择静置或流动吸附方式，静置吸附时间可为15-60min(优选为30min)，流动吸附时待分离样品液在管道中的流速为1-3mL/h(优选为2mL/h)。
本发明提供了一种非填充式核酸提取器件及其制备方法。该核酸提取器件是先在塑料基材上形成管道、凹槽或腔体结构，然后用溶胶-凝胶方法制备氧化硅凝胶，再将氧化硅凝胶涂覆在所述塑料基材上的管道、凹槽或腔体的内壁上得到的非填充式核酸提取器件。本发明通过溶胶-凝胶方法在塑料基材上管道、凹槽或腔体内壁上生成氧化硅层，主要由烷氧基硅烷(如正硅酸乙酯、正硅酸甲酯等)或类似的有机金属烷氧化物在常温下分解和缩聚先成溶胶，然后将溶胶溶液导入腔体中，老化即成凝胶。本发明的非填充式核酸提取器件避免了填充式核酸提取器件由于填充氧化硅颗粒带来的缺点，同时避免了以前报道的用PECVD方法制备非填充式芯片只能在硅等高熔点基材上制作氧化硅层的限制，实现了在塑料基底上制作用于提取核酸的非填充式核酸提取器件。用“溶胶-凝胶”方法在塑料管道(或腔体)内表面制作的氧化硅层可吸附核酸，从而可用于提取核酸，试验证明本发明的非填充式核酸提取器件具有较好的核酸提取效果，如所制备的管道式非填充式核酸提取器件，对于静置提取方式，DNA吸附率达到约为70％，洗脱率约为45-70％，芯片从DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率约为32-50％；对于流动提取方式，DNA吸附率约为50-70％，洗脱率约为37-52％，从DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率约为20-37％。本发明的非填充式核酸提取器件制备方法简单，成本低廉，将在核酸的提取及其分析研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为实施例1制备的夹心式非填充式核酸提取器件的示意2为夹心式非填充式核酸提取器件分解结构的立体3为封装好的夹心式非填充式核酸提取器件的立体4为夹心式非填充式核酸提取器件的腔体内表面SiO2层的表面形貌5为用本发明夹心式非填充式核酸提取器件提取的核酸样品的PCR检测结果图6为本发明管道式非填充式核酸提取器件的结构示意7为本发明管道式非填充式核酸提取器件的局部示意8为本发明管道式非填充式核酸提取器件的实物9为用本发明非填充式核酸提取器件及不同提取方式从DNA溶液中提取DNA时对DNA回收率的比较结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、夹心式非填充式核酸提取器件的制备及其核酸提取效果检测一、制备夹心式非填充式核酸提取器件本实施例以常用的塑料材料PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)为基材制备夹心式非填充式核酸提取器件，该夹心式非填充式核酸提取器件由两层塑料基片层(一层为盖体，一层为底板)及中间设有的中间层构成，其分解结构的立体图见图2，其制备方法包括以下步骤1)先将塑料基片层及中间层加工成如图2所示的形状及尺寸塑料基片层长75mm，宽25mm，厚1mm，其中一块作为盖体1，在进口和出口处用高速钻孔机各打一个直径1.2mm的孔(进样孔2和出样孔3)，将80μm厚，两侧带有保护膜的双面胶的中间区域用刀裁去后得到中间设有通孔的中间层4，通孔部分5形状如图1所示，所裁去部分的尺寸为中间部分最长为55mm，最短为35mm，宽13mm。然后揭掉中间层两面的保护膜，将两块塑料基片及中间层上、下对齐，将作为盖体的塑料基片与中间层的一面粘贴，将作为底板的塑料基片6与中间层的另外一面粘贴，然后将两根直径1mm的聚四氟乙烯管分别插入进样孔和出样孔中，用改性丙烯酸胶密封固定，从而得到中间具有腔体的夹心式芯片，如图3所示。
在实际操作中，也可用微机械加工的方法在一个作为样品吸附载体的塑料基片上直接雕刻出具有上述型状的通孔或其它型状的凹槽，然后再与另一片塑料基片(盖片)热键压合，在进口和出口处各打至少一个孔，得到具有腔体的非填充式核酸提取器件。为获得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔体内还可以再设有柱形、棱锥、梳形或坝形等多种型状的突起，以增大内表面积。
2)用溶胶-凝胶方法制备氧化硅凝胶将正硅酸乙酯(TEOS)3.1mL，无水乙醇和异丙醇各2.3mL，超纯水1.9mL和0.12M盐酸0.4mL混合均匀(终体积10mL)，在70℃下水浴4.5小时，自然冷却至室温，得到SiO2溶胶。
3)将氧化硅凝胶涂渍在所述塑料基材上腔体的内壁上形成SiO2层将2mL医用注射器连接一段10cm长的聚四氟乙烯管，吸取50μl SiO2溶胶，然后将注射器的聚四氟乙烯管用硅胶管连接至入口管，然后将管中的SiO2溶胶注入芯片以涂渍芯片的PMMA内表面，涂渍线速度约为5mm/s，多余的溶胶从出口管流出，最后将涂渍后的PMMA夹心式芯片连接氮气流干燥24小时，氮气的流速控制约为0.5m/s，残留在芯片内表面的SiO2溶胶液膜干燥后变成SiO2固体凝胶，干燥后将一块塑料基片拆开，用LEO 1530场发射扫描电镜观测芯片内表面涂渍的SiO2层表面形貌，观测之前，SiO2层表面经过喷碳以增加样品表面的导电性，观测结果如图4所示(SiO2表面经小刀敲碎破坏，左下部为暴露的PMMA基底)，由图4可以看出用上述溶胶-凝胶法在腔体的内表面成功制作了SiO2层，得到了本发明的非填充式核酸提取器件。
二、本发明夹心式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果检测以人血液裂解液为例检测用本发明夹心式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果。人血液裂解液的获得方法为在412.5μl吸附液中加入50μl新鲜的人血液，25μl Triton X-100，12.5μl蛋白酶K(20μg/μl)，混匀，得到血液裂解液(终体积500μl)。用步骤一制备的夹心式非填充式核酸提取器件从人血液裂解液中提取核酸，具体方法包括以下步骤1)预处理将非填充式核酸提取器件的腔体依次用含6M盐酸胍(GuHCl)，10mM三羟甲基氨基甲烷和1mM二胺四己酸纳的吸附液(pH 6.0)，80％的异丙醇水溶液，5mM pH 8.5的Tris溶液，以及所述吸附液各60μl分别浸泡30min；2)吸附用移液枪吸45μl血液裂解液注入所述夹心式非填充式核酸提取器件的腔体中(每个芯片实际最初的血液量为4.5μl)，静置吸附30min，使血液裂解液中的DNA充分吸附于非填充式核酸提取器件腔体内壁上的氧化硅层上，然后抽出多余液体；3)用25μl所述80％的异丙醇水溶液(清洗液)对非填充式核酸提取器件的腔体进行清洗，重复两次，以洗掉残留在芯片内表面的蛋白等分子；4)将45μl 5mM pH 8.5的Tris溶液(洗脱液)导入非填充式核酸提取器件的腔体进行洗脱，静置30分钟，以将吸附到氧化硅层上的DNA充分解吸附下来，然后抽出并收集腔内的洗脱液，得到核酸样品。
以未加入DNA模板和未经非填充式核酸提取器件提取的血液裂解液(用洗脱液稀释10倍)作为阴性对照，以用内腔未经SiO2溶胶涂渍的具有步骤一结构的芯片提取的血液裂解液DNA为对照，用PCR的方法检测本发明核酸提取器件的核酸提取效果，具体方法为PCR扩增的目的基因为编码人β珠蛋白的β-actin基因(250bp)，所用上游引物为5‘-CATGTACGTT-GCTATCCAGGC-3’，下游引物为5‘-CTCCTTAATGTCACGCA-CGAT-3’。PCR反应体系2.5μl10×PCR缓冲液，0.5μl10mM dNTPs，5μM上、下引物各1μl，1μl 10U/μl Taq聚合酶，5μl上述各组的DNA提取液，加水至终体积为25μl。PCR扩增条件为先96℃3分钟预变性；96℃25秒变性，60℃30秒退火，72℃30秒延伸，变性、退火、延伸共重复35个循环；最后72℃5分钟充分延伸，4℃保存。反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果(PCR产物上样量5μL)，结果如图5所示(泳道1为阴性对照；泳道2为将血液裂解液用未经SiO2溶胶涂渍的芯片提取的DNA的PCR检测结果；泳道3，4，5为三个经过SiO2溶胶涂渍的非填充式核酸提取器件从血液裂解液中提取DNA的检测结果；泳道6为以未经非填充式核酸提取器件提取的血液裂解液(用洗脱液稀释10倍)作为模板的PCR扩增产物；泳道M为2kb DNA Marker)，泳道1为阴性对照，没有加入DNA模板，所以没有250bp长度的DNA片段扩增出来；泳道2为血液裂解液用未经涂渍的核酸提取器件提取DNA的结果，由于芯片内表面没有经过SiO2溶胶涂渍，壁面没有SiO2层，因此无法提取DNA，故以此芯片的提取液作为模板，PCR未能扩增出相应的DNA片段；泳道6为用5μl洗脱液稀释的血液裂解液(用洗脱液代替吸附液，其配比与上述吸附液稀释的血液裂解液相同)没有经过DNA提取直接作为模板进行PCR扩增的结果，由于血液中有抑制PCR反应中的聚合酶的蛋白(如血红素)，导致PCR没有扩增出相应的目的DNA片断；而泳道3，4，5分别为本发明三个经过SiO2溶胶涂渍的非填充式核酸提取器件从血液裂解液中提取的DNA的PCR结果，经扩增获得了250bp大小的DNA条带，与预期结果相符，表明上述夹心式非填充式核酸提取器件具有较好的核酸提取效果。
实施例2、管道式非填充式核酸提取器件的制备及其核酸提取效果检测一、管道式非填充式核酸提取器件的制备1、管道的微机械加工与用高分子材料加工管道的其它方式(热压、浇注、注塑、LIGA等方式)相比，微机械加工方式是更为快速、廉价的用高分子材料进行微结构加工的方式。此外，由于不需要制作模具，制作出的图形不需受模具图形的限制，因此这种方法又具有灵活易用的优点，可以随时修改图纸制作不同的图形。用微机械加工的方法制备如图6所示的本发明管道式的非填充式核酸提取器件(又称管道式PMMA核酸提取芯片)，尺寸为104mm×70mm。其制作方法为采用5mm厚的PMMA片，用精雕机雕刻出沟1宽0.3mm、坝(两沟之间的间隔部分)2宽0.5mm、沟深0.3mm的管道(凹槽)，局部管道的示意图见图7，每片采用2×2的芯片阵列，即每片含四个芯片单元，管道有40根连通的单管组成，每单根管长2.5cm，即每块芯片上管道的总长度为2.5cm×40＝1m。每个小单元出口和入口之间的直线距离为42mm。芯片中每一小的单元的有效尺寸(不包括进样口和出样口处管道)为2.5cm×3.2cm，整块芯片的尺寸面积为10.4cm×7cm＝72.8cm2。
此外，还可用上述相同的方法在PMMA等塑料基片上形成圆形的管道、具有不同深度的半圆形管道或具有其它不同型状的凹槽。为获得更好的提取效果，所述管道、凹槽或腔体内还可以再设有柱形、棱锥、梳形或坝形等多种型状的突起，以增大内表面积。
2、管道式PMMA非填充式核酸提取器件的热压键合管道式PMMA非填充式核酸提取器件的热压键合过程包括以下步骤1)打孔在步骤1中经微机械加工后的PMMA基片上的每个管道上的出口和入口处各打一个直径1mm的进样口和一个直径1mm的出样口；2)清洗对一片步骤1)获得的设有管道并打孔的PMMA片(5mm厚，样品吸附载片)与另一片相同尺寸的PMMA片(1mm厚，盖片)进行清洗，步骤如下(1)蒸馏水冲洗三次；(2)白猫洗涤液洗涤一次；(3)蒸馏水冲洗三次；(4)95％乙醇超声清洗两次，每次10min；(5)超纯水超声清洗两次，每次10min；(6)氮气吹干。
3)管道式PMMA核酸提取器件的热压键合将上述两片清洗过的PMMA片贴合，置于热压机上进行键合，键合参数如下压强设为0.2MPa/mm2，温度100℃20min(从温度升至100度时计时)，结束后停止加温，自然冷却，松开台钳，取下芯片，实物图如图8所示。
4)接口封装将0.9mm直径的聚四氟乙烯管插入进样口和出样口处，用紫外胶密封。
3、用溶胶-凝胶方法制备氧化硅凝胶将正硅酸乙酯(TEOS)3.1mL，无水乙醇和异丙醇各2.3mL，超纯水1.9mL和0.12M盐酸0.4mL混合均匀(终体积10mL)，在70℃下水浴4.5小时，自然冷却至室温，得到SiO2溶胶。
4、SiO2层的形成将氧化硅凝胶涂渍在所述塑料基材上管道的内壁上形成SiO2层将2mL医用注射器连接一段10cm长的聚四氟乙烯管，吸取80μl SiO2溶胶，然后将注射器的聚四氟乙烯管用硅胶管连接至入口管，然后将管中的SiO2溶胶注入芯片以涂覆芯片的PMMA内表面，涂覆线速度约为0.5mL/h(约2mm/s)，多余的溶胶从出口管流出，最后将涂覆后的PMMA夹心式芯片连接氮气流干燥24小时，每个芯片单元氮气的流速控制约为0.5m/s，残留在芯片内表面的SiO2溶胶液膜干燥后变成SiO2固体凝胶，干燥后将一块塑料基片拆开，用LEO 1530场发射扫描电镜观测芯片内表面涂覆的SiO2层表面形貌，观测之前，SiO2层表面经过喷碳以增加样品表面的导电性，可以看出用上述溶胶-凝胶法在腔体的内表面成功制作了SiO2层，得到了本发明的管道式非填充式核酸提取器件。
二、管道式非填充式核酸提取器件的核酸提取效果检测以鲑鱼精DNA为例检测用本发明管道式非填充式核酸提取器件提取核酸的效果。将待提取的初始样品为鲑鱼精DNA溶于6M GuHCl TE溶液(pH 6.0)中，DNA的终浓度为5.03ng/μl。与夹心式非填充式核酸提取器件不同的是，管道式非填充式核酸提取器件的性能测定可以两种方式进行静置提取方式和流动提取方式。用静置方式提取时，DNA的吸附、洗脱均在静置状态下进行，而流动提取方式时，以上步骤均是使液体以一定速度流过管道时进行。用步骤一制备的管道式非填充式核酸提取器件提取核酸，具体方法包括以下步骤1)预处理将非填充式核酸提取器件的腔体依次用含6M盐酸胍，10mM三羟甲基氨基甲烷和1mM二胺四己酸纳的吸附液(pH 6.0)，80％的异丙醇水溶液，5mM pH8.5的Tris溶液，以及所述6M盐酸胍溶液各浸泡30min；2)吸附将DNA溶液注入所述管道式非填充式核酸提取器件的腔体中，上样初始液为60μl，静置吸附30min，使样品中的核酸吸附于非填充式核酸提取器件管道内壁上的氧化硅层上，然后抽出多余液体(对于流动提取方式，初始上样液在入口用针泵推入，流速为2mL/h，出样口处收集。收集的液体称为吸附余液。)；3)静置吸附和流动吸附使用相同的清洗方式用30μl 80％的异丙醇水溶液以5mL/h的速度通过管道，对非填充式核酸提取器件的管道进行清洗，清洗过程重复两次；4)用60μl 5mM pH 8.5的Tris溶液对所吸附的DNA进行洗脱对于静置提取方式，洗脱液注入后静置30分钟；对于流动洗脱方式，洗脱液以2mL/h速度推过管道，然后出样口收集，收集的液体称为洗脱余液，最终得到核酸样品。
经上述不同方式提取前、后进行DNA总量的测定初始样品、吸附余液和洗脱余液中的DNA含量的测定用PicoGreenR dsDNA定量试剂盒(Lot No.11496，MolecularProbes，Eugene，OR)，蛋白含量的测定用BCATM蛋白定量试剂盒(Lot No.23225，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)，DNA和蛋白含量的测定均在HTS 7000 Plus生物分析仪(PerkinElmer Inc.，Fremont，CA)上进行，测定方法按照试剂盒说明书进行。
管道式PMMA核酸提取芯片的提取DNA的实验结果如图8所示(A1-A4表示为静置提取方式，B1-B3为流动提取方式)，为了便于叙述，定义以下名词DNA吸附率＝(初始液中的DNA总量-吸附余液中DNA总量)/初始液中的DNA总量；DNA洗脱率＝回收液中的DNA总量/(初始液中的DNA总量-吸附余液中DNA总量)；DNA回收率＝回收液中的DNA总量/初始液中的DNA总量；蛋白回收率＝回收液中的蛋白总量/初始液中的蛋白总量。由图8可知，对于静置提取方式，DNA吸附率达到约为70％，洗脱率约为45-70％，芯片从DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率约为32-50％；对于流动提取方式，DNA吸附率约为50-70％，洗脱率约为37-52％，从DNA/蛋白混和液中提取DNA的回收率约为20-37％。上述实验结果表明，本发明管道式非填充式核酸提取器件具有较好的核酸提取效果。
权利要求
1.一种非填充式核酸提取器件，它是由至少一个结构单元组成的，所述结构单元包括有均为塑料材质的一盖体和一样品吸附载体，所述样品吸附载体上设有管道、凹槽或腔体，所述盖体与样品吸附载体上具有管道、凹槽或腔体的一面紧密贴合，所述管道、凹槽或腔体内壁上设有氧化硅凝胶层，所述盖体或样品吸附载体上对应于所述管道、凹槽或腔体的位置设有至少一个进样孔和一个出样孔。
2.根据权利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述器件由两个罗列在一起的结构单元组成。
3.根据权利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于当所述样品吸附载体具有腔体结构时，样品吸附载体由中间设有通孔的中间层和底板组成，底板紧密连接于中间层的下方，形成具有腔体结构的样品吸附载体。
4.根据权利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于将所述进样孔和出样孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定。
5.根据权利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述进样孔和出样孔的孔径为0.01-1000mm。
6.根据权利要求1所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述塑料基材为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛。
7.根据权利要求1-6任一项所述的非填充式核酸提取器件，其特征在于所述管道、凹槽或腔体内还设有柱形、棱锥、梳形或坝形的突起。
8.一种制备权利要求1所述的非填充式核酸提取器件的方法，包括以下步骤1)在塑料基材上形成管道、凹槽或腔体结构，并在所述塑料基材上管道、凹槽或腔体的位置设置至少一个进样孔和一个出样孔；2)用溶胶-凝胶方法制备氧化硅溶胶；3)将氧化硅溶胶涂覆在所述塑料基材上管道、凹槽或腔体的内壁上，得到非填充式核酸提取器件。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤1)中将所述进样孔和出样孔中各插入一根聚四氟乙烯管并固定，所述进样孔和出样孔的孔径为0.01-1000mm；塑料基材为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃、聚苯乙烯、ABS、聚乙烯、聚氯乙烯或聚甲醛；所述管道、凹槽或腔体内还设有柱形、棱锥、梳形或坝形的突起。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于步骤2)中用溶胶-凝胶方法制备氧化硅凝胶的方法为将烷氧基硅烷或有机金属烷氧化物，0.01-100％乙醇，0.01-100％异丙醇，水和0.0001-12M盐酸按体积比为0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100∶0.001-100混合均匀，在0-120℃下水浴0-10000小时，得到氧化硅溶胶；所述烷氧基硅烷为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯；所述有机金属烷氧化物为异丙氧基钛或异丙氧基铝。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述烷氧基硅烷或有机金属烷氧化物，0.01-100％乙醇，0.01-100％异丙醇，水和0.0001-12M盐酸的体积比为31∶23∶23∶19∶4。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述水为超纯水；盐酸的摩尔浓度为0.12M；水浴温度为70℃，水浴时间为4.5小时。
13.根据权利要求10或11或12所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中将氧化硅凝胶涂渍于所述管道或腔体内壁的线速度为0.01-1000mm/s，涂覆后的氧化硅凝胶层可经氮气流干燥0.01-10000小时，氮气流速可为0.001-1000.0m/s。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于所述将氧化硅凝胶涂渍于所述管道或腔体内壁的线速度为5mm/s，涂覆后的氧化硅凝胶层经氮气流干燥的时间为24小时，氮气流速为0.5m/s。
15.权利要求1-7任一项所述的非填充式核酸提取器件在提取核酸中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于所述提取核酸的方法包括以下步骤1)将非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体依次用吸附液，清洗液，洗脱液，以及所述吸附溶液各浸泡15-60min；所述吸附液为0-7M盐酸胍溶液、碘化钠溶液或异硫氰酸胍溶液；所述清洗液为体积百分浓度为50-100％的异丙醇水溶液或50-100％乙醇等；所述洗脱液为0-1000mM pH6.0-14.0的Tris溶液或pH6.0-14.0的水；2)将待分离样品加入所述非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体中，静置或流动吸附；3)用所述清洗溶液对非填充式核酸提取器件的管道、凹槽或腔体进行清洗；4)用所述洗脱溶液进行洗脱，得到核酸样品。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述步骤1)中的吸附液为6M盐酸胍溶液；所述清洗液为体积百分浓度为80％的异丙醇水溶液或80％乙醇；所述洗脱液为5mM pH8.5的Tris溶液。
18.根据权利要求16所述的应用，其特征在于所述步骤1)中的吸附溶液中还包含有1-100mM三羟甲基氨基甲烷和/或0.1-10mM乙二胺四己酸纳，溶液pH值为1.0-9.0。
19.根据权利要求16或17或18所述的应用，其特征在于所述步骤2)中若非填充式核酸提取器件为腔体式的，采用静置吸附方式，吸附时间为15-60min，若非填充式核酸提取器件为管道式的，采用静置或流动吸附方式，静置吸附时间为15-60min，流动吸附时待分离样品液在管道中的流速为1-3mL/h。
全文摘要
本发明公开了一种非填充式核酸提取器件及其制备方法与应用。其目的是提供一种以塑料为基材制作的非填充式核酸提取器件与其在提取核酸中的应用。该非填充式核酸提取器件是由至少一个结构单元组成的，所述结构单元包括有均为塑料材质的一盖体和一样品吸附载体，所述样品吸附载体上设有管道、凹槽或腔体，所述盖体与样品吸附载体上具有管道、凹槽或腔体的一面紧密贴合，所述管道、凹槽或腔体内壁上设有氧化硅凝胶层，所述盖体或样品吸附载体上对应于所述管道、凹槽或腔体的位置设有至少一个进样孔和一个出样孔。本发明的非填充式核酸提取器件制备方法简单，成本低廉，将在核酸的提取及其分析研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK101016510SQ20071006401
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月16日 优先权日2007年2月16日
发明者刘惯超, 邢婉丽, 程京 申请人:博奥生物有限公司, 清华大学