优化电穿孔的方法

专利名称：优化电穿孔的方法
优化电穿孔的方法本申请要求2008年7月18日提交的美国临时申请序列号61/081，924的优先权， 该份申请通过引用全文纳入本文。
背景技术：
I.发明领域本发明通常涉及将化学或生物试剂导入活细胞或细胞颗粒或脂囊泡的方法和设备。II.相关领域描述电穿孔过程-使用电场将胞外材料加载活细胞或细胞颗粒或脂囊泡-的效果在很 大程度上受两个主要参数的控制所应用电场(EF)脉冲的幅度和脉冲的持续时间。只要脉 冲幅度高于某个阈值水平，增加脉冲幅度或脉冲持续时间一般会导致胞外分子更多积聚在 细胞内。所应用电场的阈值与细胞大小成反比，对于有核细胞通常在l-3kV/cm范围内，对 于红细胞在2-4kV/cm范围内，对于血小板在5-7kV/cm范围内，对于细菌和酵母在7_10kV/ cm 范围内(Crawford 禾口 Chronos，1996)。应用于细胞悬液的每一电脉冲能被表征为一定量的能量，该能量等于电极上的电 压、通过缓冲液的电流和高压脉冲的持续时间的积。但是，所应用的电能仅小部分花费在改 变脂膜和将细胞外材料移入细胞的有用功上。该能量不能直接测量。其余电能以在细胞周 围介质产生热量的形式消散。微弱地加热细胞悬液的能量消散是应用电场的不可避免的结 果，即使产热本身不会导致细胞通透。缓冲液的导电性越强，浪费在热量产生上的能量越 多。所有生理介质都含有较大量的氯，钠和/或钾。这些离子的存在决定了介质的电导率， 该电导率通常在15-20mS/cm范围内。美国专利5，676，646公开了一种带有流动池的流式电穿孔设备，该流动池包含两 个被非导电隔板(spacer)分隔的电极，该隔板限定流动通路。该流动池以及其它现有技术 流动池的主要问题是电极的表面积不足在细胞被电穿孔时消散热量。因此，现有技术流动 池在细胞被电穿孔时积累非常高的热量。这种热量的积累能导致细胞和细胞组分的损伤并 降低电穿孔方法的效率。缓冲液的加热限制了细胞悬液成功电穿孔的能量用量，因为相应的温度升高不准 超过周围20-M度以上，否则细胞和/或生物材料可遭受永久损伤。在电穿孔(EP)样本中，温度的增加还有另一影响。这与样品电导率增加相关，在 简单的盐溶液中电导率的增加约为2%每摄氏度(°C)。所应用的电场导致电流穿过细胞 或颗粒悬液，这导致温度上升，而温度上升转化为电导率的增加和从电源流出更大的电流， 并如此继续下去。如果此正反馈过程不被打断(比如通过关闭脉冲)，电流持续以雪崩样 方式增加并导致电弧击穿(arcing)和样品损失。该影响主要在较高电场强度下(> 2kV/ cm)观察到。同行评议的文献中已经证明且记载了能用电穿孔将生物活性试剂插入血小板，然 后该试剂将在靶位点产生某种效应这一概念。在这些引用的研究中，用最大可容纳0. 5ml细胞悬液的静态系统处理血小板。美国专利7，186，559公开了可允许以快速(数分钟)通 量时间来处理数十或数百毫升含血小板的细胞悬液的方法和设备。血小板电穿孔需要更强的电场，因此必须限制缓冲液电导率及脉冲幅度。另一方 面，从文献(Authi 等，1989 ；Hughes 和 Crawford 1989 ；Crawford 和 Chronos 1996)中熟 知，血小板对其环境的生物化学变化极为敏感，在任何可能的时候都应该保持在生理条件 下。此外，对血小板悬液应用电场相关的环境中生理-化学变化可调节血小板的生理状态、 活化特性和生物学功能，从而影响传递临床效果的能力。为血小板操作和电穿孔开发的具 有较高电导率和很短电脉冲的缓冲液已使用(Pfliegler等，1994)。在某些情况下，诸如通过电穿孔将核酸加载原代或培养的细胞，需要使用长脉冲 (> 100 微妙(us)) (Wolf 等，1994 ；Rols 和 Teissie 1998)来转运大的 RNA 或 DNA 分子跨 过细胞膜。假定通过电穿孔将RNA加载入有核细胞这一观察结果可延续到血小板上，用RNA 和任何其他带大电荷的分子加载血小板就必需使用长电脉冲。为获得此过程的最佳结果， 使用者将必需在较长的时间间隔上将非常高的电压应用于高电导率介质。实际上，主要由 于电弧击穿的风险，这三个条件是相互排斥的，不易一次全部优化。因此，需要一种简单且 有效的方法以便电穿孔化学或生物试剂而不损伤细胞、脂质体或囊泡，从而超过它们产生 临床效果的能力。发明概述本发明涉及包封化学或生物学试剂的方法和设备。本发明特别适用于血液和其他 身体组织和液体中发现的细胞。本发明还包括非细胞衍生的脂囊泡、脂质体和其他基于脂 质的药物递送系统。本发明的实施方式包括电穿孔方法，该方法包括(a)决定电穿孔参数，从而在电 脉冲期间，代表该次脉冲期间电穿孔介质中电导率增加的第一时间常数U1)不小于代表电 容器放电的第二时间常数(t2)，其中脉冲持续时间既小于、也小于t2 ；和(b)在所述电穿 孔参数下对要电穿孔的样品应用一次或多次电脉冲。在某些方面，所述电穿孔参数包括缓 冲液电导率、电源电容、电穿孔室几何形状和电场强度。在其他方面，电穿孔参数可包括下 列一项或多项缓冲液电导率可在 0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5、1、1. 5 至 1、1. 5、2、2. 5、30hm/ m之间，包括其间所有的值和范围；电源电容可在1、10、20、30、40、50、100、200、500到200、 300、400、500、800、1000、5000、10，000,50, 000、IO4、105、IO6 μ F 之间，包括其间所有的值和 范围；电穿孔室可有如下尺寸其长度在0. 1、1、10、50到20、40、80、100cm之间，包括其间 所有数值和范围，其宽度在0. 1、0.5、1、5到l、5、10cm之间，包括其间所有的值和范围，并且 其间隙在0. 001、0. 01、0. 1、1、5到0. 1、1、5、IOcm之间，包括其间所有的值和范围；电场可 在0. 1、1、2. 5、5到2. 5、5、10kV/cm之间，包括其间所有的值和范围。在其他方面，电脉冲 至少为0. 5、1、5、10、15、20、25、50、100、200、500微秒(μ sec)或更长，包括其间所有的值 和范围。电脉冲的幅度可以是 0. 25,0. 5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 到 5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15kV/cm，包括其间所有的值和范围。在另一方面，电脉冲的幅度可以是0. 001,0. 01、 0. 1、1、10、100、1000至10、100、1000、10000伏之间，包括其间所有的值和范围。在一方面， 电脉冲幅度是5kV/cm。在某些方面，样品包括活细胞、细胞颗粒或脂囊泡。在其他方面，所述细胞是血细 胞或血小板，或其碎片或衍生物。所述活细胞、细胞颗粒或脂囊泡能加载有化学或生物学试剂。生物活性物质可以是核酸或小分子等。本发明的某些实施方式涉及电穿孔的细胞、细胞颗粒、脂囊泡或采用描述的任何 方法制备的其他产品。在某些方面，电穿孔的细胞、细胞颗粒、或脂囊泡是血小板。一群递 送囊泡包括但不限于电穿孔的细胞、细胞颗粒、或脂囊泡，其加载效率可以是至少，至多，或 大约50、60、70、80、90、95、99%，并包括其间所有的值和范围。其他实施方式涉及配置成可实施本文所述方法的电穿孔设备。进一步的实施方式涉及电穿孔方法，包括(a)决定电穿孔的参数，从而在电脉冲 衰减期间，电穿孔介质中电导率的增加速率低于电压衰减速率；和(b)在所述电穿孔参数 下对要电穿孔的样品应用一个或多个电脉冲。在某些方面，电压衰减速率是在1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10到4、5、6、7、8、9、10、11、12μ s、ns、ms、或秒(s)之间，包括其间所有的值和范 围。本发明的实施方式包括配置成可实施所述任意方法的电穿孔设备。本发明的进一步实施方式包括治疗患有或怀疑患有某种疾病或症状的患者的方 法，所述方法包括给予缓解所述疾病或症状用量的所述任意方法的产品。在某些方面，所述 疾病或症状与血小板功能或水平异常相关。在某些方面，所述方法的产品是药物递送载体， 并且很多种已知药物可通过所述方法制备的加载有药物的颗粒来递送。疾病或症状可包括 任何适合通过采用电穿孔方法制备(如加载)的脂质体颗粒、细胞颗粒或类似的递送载体 来递送药物或制剂的疾病或症状。此类疾病或症状的实施例包括但不限于血小板减少症、 高歇氏病、再生障碍性贫血、同种免疫失调、溶血性尿毒性综合征、伯-苏综合症，格兰兹曼 氏血小板机能不全、斯各特综合症(Scott' s syndrome)、冯·威利布兰德病、海_普二氏 综合症或血友病。本发明的进一步实施方式包括治疗患有或怀疑患有某种疾病或症状的对象的方 法，该方法给予包含在用所述方法制备的颗粒内的有效量药物、生物或其他生物活性分子。 在某些方面所述疾病是传染性疾病，包括但不限于细菌、真菌、寄生虫或病毒感染。在进一 步的方面，细菌感染是分支杆菌感染。在还要进一步的方面，病毒感染是逆转录病毒感染， 包括但不限于HIV感染。在其他方面，所述疾病是炎性疾病、癌症或血管闭合性疾病。在本申请通篇中，指代电穿孔靶标、或递送药物或治疗剂的载体的术语“细胞”或 “递送载体”包括生物学意义上的人或动物细胞。血小板可描述为“细胞衍生颗粒”。单词“一个”或“一种”与权利要求和/或说明书中的术语“包括”连用时，是指“一 个”，但还表示“一个或多个”，“至少一个”，以及“一或多于一个”。预计本文所讨论的所有实施方式可用本发明的任何方法和组合物实现，反之亦 然。另外，本方明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。在本申请通篇中，术语“大约”用以表示某数值包括用来确定该数值的装置或方法 的标准误差。在权利要求中所用的术语“或”表示“和/或”，除非明确地指出只表示二者选一， 或二者是相互排斥的，尽管说明书支持只是二者选一和“和/或”的定义。本说明书和权利要求中使用的词语“包含”(及任何形式的“包含”)，“有”(及任 何形式的“有”)，“包括”(及任何形式的“包括”)，或“含有”(及任何形式的“含有”)是包 含性或开放式的，并不排除额外的，未列举的元件或方法步骤。
本发明其他的目的、特征和优点通过以下详述可以清楚。但是应当理解的是，详述 和特定实施例在说明本发明的特定实施方式的同时，只是提供说明，因为本领域技术人员 从该详述可以清楚地理解本发明构思和范围内的各种改变和改进。


以下附图构成本说明书的一部分，用于进一步证明本发明的某些方面。通过参考 这些附图的一个或多个并结合本文所提供的特定实施方式的详述可以更好地理解本发明。图1.在同一个室，在不同场强及短(左列)与长(右列)时间量程下，模拟电流 增加的结果。图2.电容降低到100 μ F，可应用4kV/cm的长脉冲。图3.电容降到10 μ F，可应用8kV/cm的较短脉冲。图4.以Ims的持续时间和1秒间隔，将0. 5kV/cm的电场在2个连续脉冲中应用 于导电性介质。在各脉冲开始时电导率有温和的短期增加。图5. Ims的持续时间和1秒间隔，将lkV/cm的电场在4个连续脉冲中应用于导电 性介质。在各脉冲期间及各后续脉冲中，电导率都显著增加。图6. Ims的持续时间和1秒间隔，将1. 5kV/cm的电场在4个连续脉冲中应用于导 电性介质。在各脉冲期间及各后续脉冲中，电导率都显著增加。脉冲2-4开始时的电导率 数值大约和其之前脉冲结束时的电导率数值相同。这说明脉冲间的间隔期间缓冲液冷却速
率缓慢。图7. Ims的持续时间和1秒间隔，将2kV/cm的电场在4个连续脉冲中应用于导电 性介质。在该场强下，各脉冲期间的样品电导率迅速增加并超过了其起始值的200%。电弧 击穿出现在第3和第4个脉冲期间。图8.用Allstars阴性对照siRNA(恰根公司(Qiagen, Inc.))加载血小板。siRNA 储存液加入血小板悬液中至ι μ M终浓度，样品被分成“共温育”和“电穿孔”样品，后者通 过在MaxCyte系统上应用电脉冲进行处理。电源电容设置为20 μ F，场强为5kV/cm。图9.血小板按照图8所述制备，并通过电穿孔加载Alexa-488(英杰公司 (Invitrogen))。发明详述本发明的某些实施方式涉及电穿孔技术，该技术能在高电导率缓冲液中递送高幅 度的长电脉冲，并最大程度降低电弧或热激导致的损伤。I.电穿孔电穿孔过程通常包括穿过含细胞或囊泡的液体细胞悬液中应用电场脉冲而在细 胞膜或囊泡上形成孔洞。在穿孔过程中，细胞常悬浮在液体介质中，之后经历电场脉冲。所 述介质可以是电解质，非电解质，或电解质和非电解质的混合物。应用到悬液的电场强度以 及脉冲的长度(电场应用到细胞悬液上的时间)可根据细胞类型而有所变化。为了在细胞 外膜上形成孔洞，所应用电场的时间长度和电压必须在足够长的时间内产生跨细胞膜的固 定电势从而形成孔洞。应用超过某阈值水平的跨细胞质膜的电压可在细胞膜上形成孔洞。如果恰当选择 所应用电场的强度和/或暴露于该电场的时间，通过电脉冲形成的孔洞在短时间后重新密闭，在这期间细胞外的化合物就有机会进入细胞。然而，活细胞过分暴露于电场可导致凋亡 和/或坏死-即导致细胞死亡的过程。通常，电穿孔过程作为将某种物质导入细胞或囊泡的方法，例如用分子探针、可改 变细胞功能的药物或若干DNA片段，或各种形式的RNA，诸如mRNA、siRNA或微小RNA加载 细胞或囊泡，其经常用于转化细菌、酵母、植物原生质体、培养的细胞和其他细胞或囊泡。该 过程对于导入化学或生物学试剂也非常有效，所述化学或生物学试剂可特异性干扰组织培 养细胞或原代细胞，特别是哺乳动物细胞的分子通路。比如，电穿孔可用在生产敲除小鼠的 方法，以及肿瘤治疗、基因疗法和细胞的疗法中。在电穿孔过程中，电流流过导电性介质并导致其加热，随后使其电导率增加。不作 恰当控制，该电导率的增加会导致甚至更多来自电源的电流通过，并可能导致电弧击穿和 样品损失。这种影响通常在较高场强下(>2kV/cm)观测到。然而，例如电穿孔血小板需 要较强的电场，因而，要么可限制缓冲液的电导率，要么可限制脉冲幅度。多个电穿孔仪器 将预充电至所需电压的电容器的电压脉冲递送至样品。在脉冲期间，电容器上的电压降低， 该降低可视作样品电导率增加的补偿。多个电穿孔仪器将预充电至所需电压的电容器的电压脉冲递送至样品。电容器是 电力/电子设备，可在一对导体间(称作“板”)的电场中储存能量。在电容器中储存能量 的过程是熟知的“充电”，并涉及积累在各板上幅度相等，但极性相反的电荷。电容器由被电 介质分开的两个导电电极，或板组成。电容器作为能量储存设备用在电路和电子电路中。对于两板间显示的给定电势差或电压(V)，电容器的电容(C)是储存在各板上的 电荷量⑴)的量度c = Q/V。在SI单位中，当因在两板间施加1伏特的电势差而储存有 1库伦电荷时，电容器所带电容为1法拉。由于法拉是很大的单位，电容值通常以微法拉 (μ F)，纳法拉(nF)或皮法拉(pF)表示。相对于样品电导率增加，电容器电压降低的补偿情况分析如下通过缓冲液的电流表示为方程
权利要求
1.一种电穿孔方法，包括(a)决定电穿孔参数，从而在电脉冲期间，代表该次脉冲期间电穿孔介质的电导率增加 的第一时间常数U1)不小于代表电容器放电的第二时间常数(t2)，其中脉冲持续时间既小 Tt1也小于t2;并且(b)在所述电穿孔参数下对要电穿孔的样品应用一次或多次电脉冲。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电穿孔参数包括缓冲液电导率、电源 电容、电穿孔室几何形状和电场强度。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液电导率在0到30hm/m之间。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述电源电容在1到IOVF之间。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述电穿孔室尺寸为长度在0.1到IOOcm 之间，宽度在0. 1到IOcm之间，和在0. 001到IOcm之间的间隙。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述电场在0.01和lOkV/cm之间。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电脉冲至少是1微秒。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电脉冲的幅度在0.001到10，000伏特 之间。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包括活细胞、细胞颗粒或脂囊泡。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞为血细胞。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用化学或生物学试剂加载 细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述生物学活性物质是核酸或小分子。
13.采用权利要求1所述方法制备的电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂囊泡。
14.如权利要求13所述的电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂囊泡，其特征在于，所述细胞颗 粒为血小板。
15.一群电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂囊泡，所述细胞、细胞颗粒或脂囊泡具有至少为 50、60、70、80或90 %的加载效率。
16.一种电穿孔设备，所述设备配置成实施权利要求1所述的方法。
17.一种电穿孔方法，包括(a)决定电穿孔参数，从而在电脉冲衰减期间，电穿孔介质中电导率的增加速率低于电 压衰减速率；和(b)在所述电穿孔参数下对要电穿孔的样品应用一个或多个电脉冲。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述电穿孔参数包括缓冲液电导率，电 源电容量，电穿孔室几何形状和电场强度。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述电压衰减率是10μ s到10s。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述样品包括活细胞、细胞颗粒或脂囊泡。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞是血细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用化学或生物学试剂加 载细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述生物学活性物质是核酸或小分子。
24.采用权利要求17所述的方法制备的电穿孔的细胞。
25.一群电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂囊泡，所述细胞、细胞颗粒或脂囊泡具有至少为 50、60、70、80或90 %的加载效率。
26.一种电穿孔设备，所述设备配置成实施权利要求17所述的方法。
27.一种用有效量的药物、生物学或其他生物活性分子治疗患有或怀疑患有疾病或病 症的对象的方法，所述药物、生物学或其他生物活性分子包含在权利要求13、权利要求15、 权利要求M或权利要求25所述颗粒中。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述疾病是传染性疾病。
29.如权利要求观所述的方法，其特征在于，所述传染性疾病是细菌、真菌、寄生虫或 病毒感染。
30.如权利要求四所述的方法，其特征在于，所述细菌感染是分支杆菌感染。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述病毒感染是逆转录病毒感染。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述逆转录病毒感染是HIV感染。
33.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述疾病是炎性疾病。
34.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌症。
35.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述疾病是血管闭塞性疾病。
36.如权利要求27所述的方法，其特征在于，治疗功效因药物递送障碍而受限和/或治 疗毒性是剂量限制性的。
全文摘要
本发明的实施方式涉及一种电穿孔技术，其能在高导电性缓冲液中递送高幅度的长电脉冲，并最大程度降低经历电穿孔对细胞的损伤。
文档编号C12N13/00GK102124102SQ200980132804
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月15日 优先权日2008年7月18日
发明者S·泽库诺夫 申请人:麦克赛特股份有限公司