专利名称：一种制备酵母β－葡聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备酵母β-葡聚糖的方法。
背景技术：
β-葡聚糖存在于许多细菌、真菌和高等植物中，它的一个主要来源是酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)。酵母β-葡聚糖是构成酵母细胞壁的主要成分，占细胞壁干重的30-60％。酵母β-葡聚糖属于结构多糖，位于细胞壁的最内层，和原生质体膜相连接，其主要生理功能是维持细胞壁的机械结构，保持细胞正常的生理形态。一般认为酵母β-葡聚糖由β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖组成，两者比例为85∶15。85％的碱不溶性葡聚糖是β-1，3键连接，同时在链间穿插3％β-1，6键，有着1500聚合度线性分子，分子量相当于240KDa。其余的15％是β-1，6键连接的，有着C-3，C-6位双取代形式，呈高度分支，聚合度为140，相当于22KDa的分子量。此外，根据从酵母细胞壁中提取葡聚糖的方法不同，又可分为碱溶、酸溶和酸碱不溶三类组成，其比例为10∶3∶17。
酵母β-葡聚糖具有显著的生理功效，人们研究发现酵母β-葡聚糖可以与特异的巨噬细胞受体结合以增强机体免疫活力，还可以通过激活巨噬细胞以起到抗肿瘤、抗菌和愈合伤口的功效。此外，酵母β-D-葡聚糖还具有良好的低胆固醇和血脂的功效。
酵母β-葡聚糖因其突出的功能活性而引起人们的关注，目前国外报道的酵母β-葡聚糖的提取方法主要是采用酸碱方法，其常规的工艺为新鲜的酵母3000rpm离心15min，去上清液。加1N NaOH溶液在100℃下，剧烈搅拌反应1h，冷却至室温，4000rpm离心15min，弃去暗红色上清液；不溶物用去离子水洗涤2遍后，加入0.75N NaOH溶液在100℃下，剧烈搅拌反应0.5h，离心洗涤，再加入0.5N磷酸溶液室温下搅拌处理3h，4000rpm离心，不溶物用去离子水洗涤至中性，然后用无水乙醇洗涤2遍，喷雾干燥得酵母β-葡聚糖。酵母β-葡聚糖制备过程中酸碱的应用具有明显的不足之处①酸碱用量大，工艺繁琐，劳动强度大；②在酸碱的极端提取介质中，会引起酵母β-葡聚糖的降解，使其提取率降低；③酵母β-葡聚糖在酸碱的极端介质中天然构象发生变化，使其生理活性显著降低；④酸、碱等物质的使用对环境造成了严重污染。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备酵母β-葡聚糖的方法。
本发明所提供的制备酵母β-葡聚糖的方法，包括以下步骤1)在酵母菌体悬浮液中，加入质壁分离剂，自溶酵母细胞；2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M，pH值为7.5的磷酸缓冲液中，于115-125℃，搅拌抽提，去除可溶酵母提取物，得到酵母细胞不溶物；3)将步骤2)得到的酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬，进行均质破壁处理，离心洗涤，得到酵母细胞壁；4)将步骤3)得到的酵母细胞壁在有机溶剂中加热回流1.5-2.5小时，得到脱脂的粗β-葡聚糖；5)将步骤4)得到的粗β-葡聚糖用蛋白酶酶解，除去蛋白后，得到酵母β-D-葡聚糖。
所述步骤1)中，所述质壁分离剂可为乙酸乙酯或NaCl；所述质壁分离剂优选为NaCl；所述NaCl加入菌体悬浮液中的终浓度为2-4％，优选为3％；所述百分比浓度为质量百分比浓度。
所述步骤1)中，所述酵母细胞自溶的温度为50-58℃，优选为55℃；自溶时间为12-48小时，优选为24小时。
所述步骤1)中，所述酵母菌体悬浮液中酵母的重量百分比浓度可为10-20％，优选为15％；所述酵母菌体悬浮液的pH值为4.0-6.0，优选为5.0。
所述步骤2)中，所述自溶后的酵母细胞在所述磷酸缓冲液中的重量百分比浓度可为8-14％，优选为10％。
所述步骤2)中，所述搅拌抽提的温度为121℃，所述搅拌抽提的时间为5-8小时，优选为6小时。
所述步骤3)中，所述均质破壁处理的压力可为50-80MPa，优选为70MPa；所述均质破壁处理的次数可为2-5次，优选为3次。
所述步骤4)中，所述有机溶剂为丙酮、正己烷或石油醚；优选为丙酮，所述酵母细胞壁在丙酮中回流的浓度可为100-300g/L，优选为250g/L。
所述步骤5)中，为避免酸碱等极端条件，所用蛋白酶为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶与所述粗β-葡聚糖作用的重量份数比为0.2％-0.7％；优选为0.5％；所述酶解的条件为50-58℃，pH为5.5-8.0；优选为55℃，pH为7.0。
本发明的方法，以酿酒酵母为原料，通过诱导自溶、高温抽提、均质破壁、回流脱脂和生物酶解等技术，制备酵母β-葡聚糖，相比传统酸碱分离方法，此方法不会造成β-葡聚糖的降解，保持了其天然构象，最终产品得率≥11％，纯度≥93％。本发明的方法制备的酵母β-葡聚糖可以广泛应用于食品、医药、日化和发酵等行业。
图1为制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤如下所述①酵母预处理将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后，重悬于去离子水中，配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，用直径为125μm的筛网过滤，以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质；然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍，至上清液清澈。
②诱导自溶将步骤①洗净的酵母用去离子水稀释成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液，用1mol/L NaOH溶液调节pH值为5.0，加入NaCl，使NaCl最终质量百分浓度为3％；然后，在55℃，120rpm搅拌下自溶24h。自溶完成后，将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温，离心，用去离子水洗涤得到自溶细胞，保存于4℃。
③高温抽提将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液重悬，配成质量百分含量为10％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，于121℃，100rpm下搅拌处理6h，离心得到沉淀，将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀，保存于4℃备用。
④均质破壁将上述酵母细胞不溶物沉淀，用蒸馏水配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，于均质压力70MPa条件下进行均质破壁处理3次。将破壁后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次，再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮，沉淀即为酵母细胞壁，保存于4℃备用。
⑤回流脱脂将步骤④得到的酵母细胞壁，按250(g/L)的比例与丙酮溶剂配成菌悬液，加热回流2h，离心收集沉淀，再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次，离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M，pH7.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15％的悬浮液，在pH7.0，55℃条件下，加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.5％中性蛋白酶(蛋白酶的名称Protamex，为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时，酶解结束后，用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白，沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8％的悬浮液，用喷雾干燥机(型号Buchi190，德国Buchi公司)，在进口温度180℃，出口温度85℃的条件下，进行喷雾干燥，得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状，共110g，最终产品得率为11％；按照下述方法测定各物质含量总氮的测定采用凯氏定氮法；可溶蛋白的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法；葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法，测定结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白的质量百分含量为2.99％，总糖质量百分含量为95.84％(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为93.12％)，脂肪质量百分含量为0.04％，灰分质量百分含量为3.87％。在80℃进行干燥恒重测定，结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为7％。
常温下，分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中，溶解性试验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水，溶于二甲基亚枫(DMSO)；分别在20、30、40、50以及60℃下，将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中，离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重，计算溶解度。实验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中，溶解度随温度的升高而略有上升，20℃下溶解度为14％(w/w)。
实施例2、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤如下所述
①酵母预处理将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后，重悬于去离子水中，配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，用直径为125μm的筛网过滤，以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质；然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍，至上清液清澈。
②诱导自溶将步骤①洗净的酵母(细胞干重为1000g)用去离子水稀释成质量百分含量为20％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液，用1mol/L NaOH溶液调节pH值为6.0，加入NaCl，使NaCl最终质量百分浓度为4％；然后，在58℃，120rpm搅拌下自溶48h。自溶完成后，将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温，离心，用去离子水洗涤得到自溶细胞，保存于4℃。
③高温抽提将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液重悬，配成质量百分含量为14％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，于125℃，100rpm下搅拌处理8h，离心得到沉淀，将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀，保存于4℃备用。
④均质破壁将上述酵母细胞不溶物沉淀，用蒸馏水配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，于均质压力80MPa条件下进行均质破壁处理5次。将破壁后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次，再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮，沉淀即为酵母细胞壁，保存于4℃备用。
⑤回流脱脂将步骤④得到的酵母细胞壁，按300g/L的比例与丙酮溶剂配成菌悬液，加热回流2.5h，离心收集沉淀，再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次，离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M，pH8.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15％的悬浮液，在pH7.0，58℃条件下，加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.7％的中性蛋白酶(该蛋白酶的名称Protamex，为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时，酶解结束后，用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白，沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8％的悬浮液，用喷雾干燥机(型号Buchi190，德国Buchi公司)，在进口温度180℃，出口温度85℃的条件下，进行喷雾干燥，得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状，共93g，即最终产品得率为93％；按照下述方法测定各物质含量总氮的测定采用凯氏定氮法；可溶蛋白的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法；葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法，结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白质量百分含量为4.01％，总糖质量百分含量为92.23％(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为90.44％)，脂肪质量百分含量为0.37％(w/w)，灰分质量百分含量为4.50％。在80℃进行干燥恒重测定，结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为7％。
常温下，分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中，溶解性试验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水，溶于二甲基亚枫(DMSO)；分别在20、30、40、50以及60℃下，将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中，离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重，计算溶解度。实验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中，溶解度随温度的升高而略有上升，20℃下溶解度为13％(w/w)。
实施例3、制备酵母β-葡聚糖及其效果验证本发明制备酵母β-葡聚糖的方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤如下所述①酵母预处理将啤酒发酵生产中的废弃物-新鲜酿酒酵母(由郑州奥克啤酒有限公司提供)1000g(细胞干重)离心收集后，重悬于去离子水中，配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，用直径为125μm的筛网过滤，以除去啤酒发酵后残余啤酒花等杂质；然后用蒸馏水离心洗涤3-4遍，至上清液清澈。
②诱导自溶将步骤①洗净的酵母(细胞干重为1000g)用去离子水稀释成质量百分含量为10％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬浮液，用1mol/L NaOH溶液调节pH值为4.0，加入NaCl，使NaCl最终浓度为2％；然后，在50℃，120rpm搅拌下自溶12h。自溶完成后，将自溶液加热到80℃保持15min后冷却至室温，离心，用去离子水洗涤得到自溶细胞，保存于4℃。
③高温抽提将步骤②自溶后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液重悬，配成质量百分含量为8％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，，于115℃，100rpm下搅拌处理5h，离心得到沉淀，将沉淀用去离子水洗涤得到酵母细胞不溶物沉淀，保存于4℃备用。
④均质破壁将上述酵母细胞不溶物沉淀用蒸馏水配成质量百分含量为15％(细胞干重/菌悬液质量)的菌悬液，于均质压力50MPa条件下进行均质破壁处理2次。将破壁后的酵母细胞用0.02M，pH7.5的磷酸缓冲液离心洗涤一次，再用蒸馏水离心洗涤三次至到上清液透亮，沉淀即为酵母细胞壁，保存于4℃备用。
⑤回流脱脂将步骤④得到的酵母细胞壁，按100g/L(w/w)的比例与丙酮溶剂配成菌悬液，加热回流1.5h，离心收集沉淀，再用丙酮按1∶1(g/L)的比例洗涤一次，离心得到脱脂的粗β-葡聚糖。
⑥生物酶解去除蛋白将步骤⑤得到的脱脂β-D-葡聚糖用0.02M，pH8.0的磷酸缓冲液配成质量百分含量为15％的悬浮液，在pH5.5，50℃条件下，加入是脱脂β-D-葡聚糖重量的0.2％的中性蛋白酶(蛋白酶的名称Protamex，为丹麦NOVO公司产品)酶解处理5小时，酶解结束后，用去离子水离心洗涤直到上清液不含可溶蛋白，沉淀即为得到湿酵母β-D-葡聚糖。
⑦喷雾干燥湿酵母β-D-葡聚糖用蒸馏水配成质量百分含量为8％的悬浮液，用喷雾干燥机(型号Buchi190，德国Buchi公司)，在进口温度180℃，出口温度85℃的条件下，进行喷雾干燥，得到白色粉末状β-葡聚糖。
结果表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖为白色粉末状，共132g，即最终产品得率为13.2％；按照下述方法测定各物质含量总氮的测定采用凯氏定氮法；可溶蛋白的测定采用Lowry法；脂肪和灰分的测定采用AOAC法；总糖的测定采用苯酚-硫酸法；葡聚糖和甘露聚糖测定采用Dallies方法，结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖中粗蛋白质量百分含量为7.74％，总糖质量百分含量为85.51％(其中酵母β-葡聚糖质量百分含量为78.32％)，脂肪质量百分含量为1.48％(w/w)，灰分质量百分含量为6.03％。在80℃进行干燥恒重测定，结果表明上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖的干燥失重为8％。
常温下，分别将1g的酵母β-葡聚糖搅拌溶于水(100mL)和二甲基亚枫(100mL)中，溶解性试验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖不溶于水，溶于二甲基亚枫(DMSO)；分别在20、30、40、50以及60℃下，将1g酵母β-葡聚糖搅拌溶于二甲基亚枫(50mL)中，离心得没有溶解的酵母β-葡聚糖干燥称重，计算溶解度。实验表明，上述方法提取得到的酵母β-葡聚糖在DMSO中，溶解度随温度的升高而略有上升，20℃下溶解度为16％(w/w)。
权利要求
1.一种制备酵母β-葡聚糖的方法，包括以下步骤1)在酵母菌体悬浮液中，加入质壁分离剂，自溶酵母细胞；2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M，pH值为7.5的磷酸缓冲液中，于115-125℃，搅拌抽提，去除可溶酵母提取物，得到酵母细胞不溶物；3)将步骤2)得到的酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬，进行均质破壁处理，离心洗涤，得到酵母细胞壁；4)将步骤3)得到的酵母细胞壁在有机溶剂中加热回流1.5-2.5小时，得到脱脂的粗β-葡聚糖；5)将步骤4)得到的粗β-葡聚糖用蛋白酶酶解，除去蛋白后，得到酵母β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述质壁分离剂为乙酸乙酯或NaCl。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述质壁分离剂为NaCl；所述NaCl加入菌体悬浮液中的终浓度为2-4％，优选为3％；所述百分比浓度为质量百分比浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述酵母细胞自溶的温度为50-58℃，优选为55℃；自溶时间为12-48小时，优选为24小时。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，所述酵母菌体悬浮液中酵母的重量百分比浓度为10-20％，优选为15％；所述酵母菌体悬浮液的pH值为4.0-6.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述自溶后的酵母细胞在所述磷酸缓冲液中的重量百分比浓度为8-14％，优选为10％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述搅拌抽提的温度为121℃；所述搅拌抽提的时间5-8小时，优选为6小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中，所述均质破壁处理的压力为50-80MPa，优选为70MPa；所述均质破壁处理的次数为2-5次，优选为3次。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)中，所述有机溶剂为丙酮、正己烷或石油醚，优选为丙酮；所述酵母细胞壁在丙酮中回流的浓度为100-300g/L，优选为250g/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤5)中，所述蛋白酶为中性蛋白酶，所述中性蛋白酶与所述粗β-葡聚糖作用的重量份数比为0.2％-0.7％；优选为0.5％；所述酶解的温度为50-58℃，pH值为5.5-8.0；所述酶解的温度优选为55℃，pH值优选为7.0。
全文摘要
本发明公开了一种制备酵母β－葡聚糖的方法。该方法，包括以下步骤1)在酵母菌体悬浮液中，加入质壁分离剂，自溶酵母细胞；2)将自溶后的酵母细胞重悬于0.02M，pH值为7.5的磷酸缓冲液中，于115－125℃，搅拌抽提5－8小时，去除可溶酵母提取物，得到酵母细胞不溶物；3)将酵母细胞不溶物用蒸馏水重悬，在50－80MPa下均质处理2－5次，以进行酵母细胞破壁处理，离心洗涤，得到酵母细胞壁；4)将酵母细胞壁在丙酮中加热回流，得到脱脂的粗β－葡聚糖；5)将粗β－葡聚糖用蛋白酶酶解，除去蛋白后，得到酵母β－D－葡聚糖。本发明的方法不会造成β－葡聚糖的降解，保持了β－D－葡聚糖天然构象，最终产品得率≥11％，纯度≥93％。
文档编号C12R1/865GK101020915SQ20071006424
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者王强, 刘晓永, 刘红芝 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所