专利名称：新的TGF-β家族的生长/分化因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的TGF-β家族的生长/分化因子及其DNA编码序列。
属于TGF-β家族的生长因子有BMP-、TGF-及激活素/抑制素-相关的蛋白(Roberts und Sporn，Handbook of Experimental Pharmacology 95，419-472，(1990))。此类生长因子广泛应用于临床治疗及相关应用。此类因子适于创伤治疗及组织再生。并且，TGF-β家族的更多因子可诱导组织如骨骼生长。
Wozney(Progress in Growth Factor Research 1(1989)，267-280)和Vale等人(Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990)，211-248)报道了各种不同的生长因子如与BMP-和激活素/抑制素组相近的因子。这种的成员之间具有明显的结构相似性。此类蛋白的前体由一个N端信号序列、前肽和一个含有110至140个氨基酸的C端序列构成。C端从前体分裂之后成为成熟蛋白。此类因子根据其氨基酸序列的同源性来划分。成熟蛋白含有高度保守的序列，尤其是此类因子具有该家族成员所共有的7个半胱氨酸残基。TGF-β类蛋白是多功能的具有激素活性的生长因子，并且也具有其他相关的生物活性如细胞的向化性、促进细胞的分化和组织诱导能力。EP 0 222 491 A1公开了抑制素α和β链的序列。
总之，TGF-β类蛋白在结构上的区别使其具有相当不同的生物学作用，并且此类蛋白存在于广泛不同的组织类型和发育时期。因而在执行具体功能方面有所不同，如要求的细胞生理环境、寿命、定位、对辅助因子的需求、抗降解能力。尽管已描述很多蛋白具有组织诱导的潜力，但是对其在机体内，尤其是在医学上的作用还需进行详细研究。很可能还有未知的TGF-β家族成员蛋白，它们对于不同组织的分化/诱导特别有意义。由于对其功能不够了解，而缺乏鉴别不同TGF-β蛋白的生物检测方法，因而这些新的TGF-β蛋白的分离具有很大难度。另一方面，与已知TGF-β蛋白的核酸序列同源性太小，传统的核酸杂交技术也不可能用于筛选未知的TGF-β蛋白。尽管如此，急需分离鉴定新的TGF-β蛋白以满足所有医疗上所需要的具有(组织)诱导/分化作用的蛋白。该类(蛋白)因子可用于治疗各种组织损伤和组织退化疾病。
PCT/EP93/00350专利申请提供了TGF-β蛋白MP121的一个核酸和蛋白序列，并标明了大部分与成熟肽相对应的序列。MP121前体肽的全序列还未公开发表。
本发明的根本任务是得到新的具有促细胞分裂和/或诱导分化潜力的TGF-β蛋白的DNA编码序列，尤其是TGF-蛋白MP121的DNA和氨基酸全长序列。
这一问题的解决在于得到一个编码TGF-β家族蛋白的DNA分子，它包含(a)编码成熟蛋白区段及任选地SEQ ID NO.1中标明的核甘酸序列的其它功能区段(b)由序列(a)根据遗传密码的简并而得到的核酸序列之一(c)一种对应于序列(a)和(b)之一的等位衍生物的核苷酸序列(d)基于其源自其它脊椎动物而与序列(a)不同的序列之一(e)与(a)、(b)、(c)、或(d)的序列之一杂交的核苷酸序列并且前提是根据(e)的DNA分子至少要含有TGF-β家族的成熟蛋白的编码区。
本发明的其它实施形式涉及权利要求2至10的主题，本发明的其它优点和特征由优选实施方案说明。序列及图谱现简述如下SEQ ID NO.1表示人的TGF-β蛋白MP121的编码DNA的完整核苷酸序列。起始密码ATG始于第128个核苷酸。完全成熟蛋白尤其优选始于第836个核苷酸。
SEQ ID NO.2是根据SEQ ID NO.1核酸序列推出的人TGF-β蛋白MP121的原前体蛋白的全长氨基酸序列。成熟蛋白起始点优选位于第217至240氨基酸之间的区域，尤其是第236或第237、而最优选第237氨基酸。
SEQ ID NO.3是小鼠的TGF-β蛋白MP121编码DNA的的完整核苷酸序列。编码区开始于第131个核苷酸处的ATG起始码并结束于在第1187个核苷酸处的终止码。优选成熟蛋白的起始码始于第839位核苷酸，在其基因组DNA的第446与447个位置之间有一长度为5.5kb的内含子。
SEQ ID NO.4是小鼠TGF-β蛋白MP121的原前体蛋白的完整氨基酸序列，该氨基酸序列是根据SEQ ID NO.3的核苷酸序列而得到的。该成熟蛋白起始点与SEQ ID NO.2的人MP121蛋白的起始点相当，即在第217至240氨基酸之间的区域。该成熟蛋白的最优选的起始点是第237个氨基酸，这样成熟蛋白部分正如人的MP121成熟蛋白一样由116个氨基酸组成。TGF-β家族的前体蛋白通常在RXXR位点之后切开从而分离成熟蛋白(见zkaynak et al.，J.Biol.Chem.267，25220-25227，(1992)及其所引的文献)。因此就小鼠的MP121而言，成熟蛋白的至少部分起始点也可能是第236个氨基酸。
SEQ ID NO.5显示人的MP121基因的外显子/内含子相接的核苷酸序列。两个外显子的核苷酸由大写字母表示，而内含子序列由小写字母表示。
图1是人MP121与一些TGF-β家族成员(抑制素α和β链)的氨基酸序列的比较，该图的比较是由7个保守的半胱氨酸残基的第一个开始。*表示该氨基酸在参加比较的所有蛋白中都是相同的；+表示在至少有一个参加比较的蛋白与人MP121都含有该氨基酸。
图2表示在此项发明中应用的寡核苷酸引物的核酸序列以及与已知的TGF-β家族成员的序列比较。M代表A或C，S代表C或G，R代表A或G，而K代表G或T。2a表示引物OD的序列，而2b表示引物OID的序列。
图3显示的是利用抗人MP121的鸡抗体进行的Western印迹的简图。
图4表示在小鼠不同组织中MP121与激活素βA和βB的表达相比较。
图5表示利用部分纯化的MP121对多巴胺神经元进行处理，对该神经元的生存力所产生的正面效果。
此外本发明中涉及的概念“成熟蛋白”也包括总蛋白的功能区域，它们具有几乎同样生物学活性并优选至少要含有TGF-β家族的7个保守半胱氨酸所在的区段的那些区域。特别是成熟蛋白的N端有可能被轻度修饰，因此其序列会与SEQ ID NO 2和4的序列有所不同。成熟蛋白中可能有附加的氨基酸存在，其存在不影响蛋白的功能、也可能存在氨基酸缺失，只要这些氨基酸的缺失也不限制蛋白的功能。但优选人及小鼠的蛋白具有SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4氨基酸序列中第237个氨基酸以后的所有氨基酸。已经发现，在TGF-β家族的其它成员中，位于成熟蛋白N端的附加氨基酸不影响蛋白的活性，如N端附加的6个组氨酸即属此种情况。
本发明包括上述所定义的成熟蛋白的编码区段，任选地也包括SEQID NO 1核苷酸序列的其它功能区段、及根据遗传密码的简并所产生的所有序列以及这些序列的衍生物。并且，本发明包括来自其他哺乳动物的由于来源不同而序列稍有不同的编码TGF-β家族蛋白的DNA序列，但这些DNA所编码的蛋白序列相近并具有大致相同的生物学作用。这些序列相互间具有很大的共同点，正如SEQ ID NO 1和NO 3比较所得出的相似性一样。
另外，本发明也包含与上述序列杂交的序列，前提是这些DNA序列至少含有完整的编码TGF-β家族成熟蛋白(根据上述定义)的区段并保留生物活性。
“功能区域”的概念从本发明的角度来讲，是指能够具备MP121蛋白天然区域的生物学作用之一的蛋白片段，如作为信号肽、前体肽或成熟蛋白部分。
优选的人MP121成熟蛋白部分的DNA编码区段优选从第836个核苷酸开始至终止码即SEQ ID NO 1所示序列的第1184个核苷酸。任选地该DNA分子还可能包括SEQ ID NO 1所示序列的其它功能区段，即编码信号肽或/和前体肽部分的核苷酸序列。特别优选该DNA分子包含用于信号-和前肽部分和成熟蛋白的部分的序列，即SEQ ID NO 1所示序列的第128至1184个核苷酸。如SEQ ID NO.3所示，优选的小鼠的MP121成熟蛋白的编码区始于第839个核苷酸直至第1187个核苷酸的终止码，某些情况下，该DNA分子也包括SEQ ID NO.3所示序列的其它功能区段，即信号肽或/和前体肽部分的编码序列。
另一方面，除成熟肽编码区之外，本发明的DNA分子也包括其它蛋白的功能信号肽和/或前体肽部分的编码区，这些蛋白如具有“半胱氨酸结”(Cystine Knot Motif)的蛋白(Cell，Vol.73(1993).S.421-424)，尤其是TGF-B-家族的其它蛋白如上面所提到的激活素/抑制素或BMP-蛋白，特别是MP52(见PCT/EP94/02630)。所涉及的核苷酸序列来源于上述所列的公开发表的文献。重要的是，这些序列仍然保持成熟蛋白的正确阅读框架。不过，由于在不同的寄主细胞中得到表达，因而不同的信号序列或/及前体肽可能对其表达具有正面影响。前体肽被其它蛋白的前体肽所替代已有诸如以下的报道(Mol.Endocrinol.5(1991)，149-155；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)，2905-2909).尽管该专利所覆盖的所有来自其它脊椎动物的简并序列及杂交序列，由于其核苷酸或/和氨基酸序列的细微变化而表现出结构上的区别，但是，这类序列所编码的蛋白仍具有大致相同的有用特性，使其仍然可能在医学上得到基本相同的应用。
根据本发明，“杂交”是常用杂交条件，优选利用6×SSC的盐浓度，杂交温度为62℃-66℃，之后的洗膜条件是使用0.6×SSC，0.1％SDS，于62℃-66℃洗涤1小时。
本发明的优选实施形式是如上所定义的源于脊椎动物尤其是哺乳动物如猪，鸡及啮齿动物如大鼠或小鼠，尤其是来源于灵长类如人的DNA序列及复制的相应序列。
SEQ ID NO.1及3所示的及称作人及鼠MP121的序列是本发明特别优选实施形式。MP121基因的转录在肝组织中进行，其编码蛋白与抑制素/激活素类的成熟蛋白的氨基酸序列具有很大同源性(见图1)。人的α-抑制素、抑制素βA(激活素βA)、及抑制素βB(激活素βB)的蛋白序列已由Mason等报道(Biochem.Biophys.Res.Comm.135，957-964(1986))。已知的抑制素序列所特有的典型的序列同源性也在MP121前体肽部分中出现，而MP121前体肽的其它部分与抑制素的前体肽有明显区别。
但就目前所知，MP121与激活素的表达模式有所不同。激活素主要在性腺中表达(激活素βA在卵巢，激活素βB在睾丸及卵巢)，而MP121主要在肝脏中表达。迄今所用的实验方法还不足以检测其微量表达。据文献报道，已证实激活素除了在不同小鼠组织的性腺表达之外也在成年动物(Meunier et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，247-251(1988))以及在胚胎发育过程中表达(Roberts et al.，Endocrinology 128，3122-3129(1991))。因此MP121也可能在其它组织中表达，这还有待于进一步的证实。
本发明的另一内容是至少含有本发明中的DNA分子的一个拷贝的载体。在此类载体中，优选该DNA分子与控制表达的序列相接。这类载体适用于在稳定或瞬时转化的细胞中生产TGF-β类蛋白。不同的动物、植物、真菌及细菌系统可用于转化以及后续的培养。优选本发明中的载体含有在寄主细胞中复制所必需的序列，并且可自主复制。此外优选利用含有可选择标记基因的载体使寄主细胞的转化能够得到鉴定。
本发明的另一内容是经本发明中的DNA或载体转化的寄主细胞，合适的寄主细胞实例包括各种真核及原核细胞，如大肠杆菌、昆虫细胞、植物细胞，哺乳细胞及真菌如酵母菌。
本发明的另一重要内容是权利要求1的DNA序列所编码的TGF-β家族的一个蛋白。优选该蛋白具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列或任选地其功能部分(如上定义)，并且表现出可能与医疗应用相关的生物特性如组织诱导活性。
由于该蛋白与具有“半胱氨酸结”的蛋白尤其是TGF-β蛋白形成同源双体或异源双体，因而该蛋白的上述特性会有所变化。这些双体结构同样可能在临床上得到应用，所以也是本专利申请的内容。优选异源双体包含由本发明中的蛋白单体及α-，βA-或βB-抑制素链的单体形成的异源双体。优选异源双体的性质可能更与激活素及抑制素的性质相近。例如若与抑制素α-蛋白或其他抑制素β-蛋白形成异源双体，那么MP121/抑制素(α-链)或MP121/激活素(βA-或βB-链)的异源双体就可能抑制或促进促滤泡激素(FSH)的合成。MP121/激活素异源双体也可能影响中胚层的发育。可以进一步预见，与TGF-β蛋白的BMP类的成员形成异源双体，会增强类BMP活性，诸如诱导或促进骨骼形成，软骨形成及结缔组织的形成的能力。
因此本发明的另一内容是如下所述的异源双体由权利要求1的DNA序列所编码的本发明的TGF-β家族蛋白，与具有“半胱氨酸结”的蛋白尤其是与其它TGF-β家族蛋白的单体所形成的异源双体。类似的异源双体蛋白在WO93/09229，EPO 626451A2及J.Biol.Chem.265(1990).13198-13205中已有描述。
本发明的另一内容是如下的嵌合蛋白即具有本发明的DNA序列编码蛋白如优选SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.4所示的蛋白的功能衍生物或区段，尤其是具有成熟蛋白的功能区段并此外含有其它蛋白的部分片段的嵌合蛋白。其它蛋白可以是优选属于TGF-β家族的含有“半胱氨酸结”的蛋白，如尤其MP52(PCT/EP94/02630).其它的完整蛋白的区域如蛋白的受体结合部位，会使原始的MP121蛋白的特异性发生变化本发明中的蛋白优选MP121的生物特性可根据以下文献中的活性分析方法进行确定Wrana等(Cell 71.1003-1014(1992))，Ling等(Proc.Natl.Acad.of Science.82.7217-7221(1985))，Takuwa等(Am.J.Physiol.257.E797-E803(1989))，Fann和Patterson(Proc.Natl.Acad.of Science.91.43-47(1994))，Broxmeyer等(Proc.Natl.Acad.of Science.85.9052-9056(1988))，Green等(Cell.71.731-739(1992))，Partridge等(Endocrinology.108.213-219(1981))或Krieglstein等(EMBO J.14.736-742(1995))。
已有报道，激活素A及TGF-β1，-2和-3在体外具有提高多巴胺神经元生存力的效果(Krieglstein等EMBO J.14，736-742(1995))；Krieglstein等Neurosciene 63.1189-1196(1994))。部分纯化的MP121对经8天培养的多巴胺神经元的存活力具有促进作用(与对照的上清液相比较)(图5)。
本发明的另一内容是生产TGF-β-家族蛋白的如下方法其特征在于，培养本发明的DNA或载体所转化的寄主细胞，从细胞中或/和培养液的上清液中提取TGF-β-蛋白。该方法包括在合适培养基中转化寄主细胞的培养及所产生的TGF-β-蛋白的提纯。通过该方法可生产足够量的目的蛋白，使其可能应用于医疗或需要生长因子的细胞培养技术。寄主细胞可以是细菌如芽孢杆菌类或大肠杆菌，真菌如酵母菌，植物细胞如烟草、马铃薯或拟南芥，或动物细胞尤其是脊椎动物细胞系如Mo-、Cos-或CHO-细胞系，或昆虫细胞系。利用杆状病毒系统，可实现在昆虫幼虫中的表达。利用细菌进行生产，则本发明蛋白可以包含体形式产生。对这些包含体可依照已知的方法进行复性，以得到具有活性的蛋白(见Jaenicke，R.和Rudolph，R.Protein Structure.ed.Creighton，T.E.，IRL Press.Chapter 9)。若生产与其它TGF-β家族成员蛋白所形成的异源双体，两种蛋白的单体可在同一细胞系中表达或分别表达，对形成的包含体同样的复性方法是合适的。适用于在同一细胞系中的共表达的方法主要有病毒系统如杆状病毒系统或痘菌病毒系统。异源双体蛋白质的生产原则上专业人员是已知的，如WO93/09229和EP 0626 451A2中所述。
生产含有其它蛋白部分的嵌合蛋白，需要在DNA水平上作相应的改变，这些通常是专业人员熟知的并由其操作(EMBO J.10(1991)，2105-2110；Cell 69(1992)，329-341；J.Neurosci.39(1994)，195-210)。
本发明的另一内容是含有药物有效量的TGF-β蛋白作为有效成分的药物组合物。这种组合物任选地含有制药上可接受的载体、辅助剂、稀释或填充剂。此药物组合物可单独用于创伤治疗及组织再生，也可与其它有效成分结合使用，如其它TGF-β蛋白或生长因子如EGF(表皮生长因子或PDGF(血小板生长因子)。并且，此种药物组合物也可用于预防疾病。
本发明中的内容还有含有本发明的异源双体蛋白或/和嵌合蛋白的药物组合物。
优选本发明的药物组合物用于治疗或预防骨/软骨/结缔组织/皮肤、黏膜、内皮组织、上皮组织、神经、大脑、肾或牙齿的损伤；及用于牙齿植入、创伤愈合及组织再生过程；作为促进细胞分裂素用于诱导肝组织生长，诱导骨髓细胞或前体细胞的增生；用于保持分化状态及治疗不育症及用于避孕。此外本发明的药物组合物还用于治疗物质交换方面的疾病如消化系统疾病或涉及血糖水平的疾病。
本发明中的TGF-β蛋白的另一可能的临床应用是作为免疫反应的抑制因子以避免器官移植后的排斥现象，或用于促进血管生成。并且，本发明中的蛋白还可用于促进受孕能力或避孕。本发明中的医药组合物还可用于防病或整容外科。该组合物的使用不局限于人类，也适用于动物、尤其是家养或经济动物。
另外，根据不同需要异源双体蛋白及嵌合蛋白的使用范围及特异性也可由于其它蛋白或蛋白单体的区段不同而有所改变。
总之，本发明中的蛋白可用于治疗与MP121的表达有关的疾病，一方面可通过提高MP121的量或已有的M121的活性，另一方面，则可通过抑制MP121的活性来实现。因此本发明的另一项内容是合成反义核酸及核酶，以用于抑制MP121的转译。抑制是由于信使RNA被反义核酸结合“隐蔽”或被核酶切割。
已有关于合成反义核酸的报道(Weintraub，H.M，Scientific American26240(1990))。反义核酸与相对应的信使RNA杂交而形成不能被转译的双链分子。反义核酸的利用例如见Marcus-Sekura，C.J的报道(Anal.Biochem.172(1988)，S.289-295)。
核酶是具有特异性切割类似于DNA限制性内切酶的其它单链RNA分子能力的RNA分子。核酶的合成见报道Cech，J.Amer.Med.Assn.260(1988)，S.3030.
根据本发明，具有本发明DNA序列的合适载体可用于在体外或体内转染病体细胞，或将该载体先用于体外细胞转染，再将这些转染细胞植入病人体内。同样，可将MP121反义多核苷酸转入不期望MP121表达的细胞。
对MP121活性的压制已可通过将与MP121相反不引起信号继续传导的分子结合于MP121受体上来进行。
由此可见，在本发明的范围内，细胞的MP121受体也很令人感兴趣。为发现MP121受体，首先通过交联实验，测定不同细胞系对放射性标记的MP121(125J-MP121)的结合能力。然后，对结合MP121的细胞，利用表达载体(InVitrogen提供)构建cDNA文库。利用对放射性标记的MP121的结合能力，筛选出被受体-cDNA转染的细胞。这是本专业人员已知的方法，如其用于分离激活素受体(Mathews，L.S.&Vale，W.W，Cell 65(1991)，973-982)和TGF-β TypeII受体(Lin，H.Y，等，Cell 68(1992)，775-785)。据推测MP121受体与已知的激活素受体类似，属于同一家族的受体复合体，因而也可利用已知的方法简并的寡核苷酸进行PCR，以发现异源复合体的部分片段。这一方法也用于激活素及TGF-β TYPE I受体(Tsuchida，等Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90(1993)，11242-11246；Attisano等，Cell，75(1993)，671-680；Franzen等，Cell 75(1993)，681-692).
本发明的最后一项内容是能够特异结合本发明蛋白的抗体或其一个抗体片段(如Fab或Fab’)。生产此种特异性抗体或抗体片段的方法属于一般专业常识。优选该抗体是一单克隆抗体。此抗体或抗体片段也适用于诊断方法。
此外，本发明将由以下实施例阐明。例1MP121的分离1.1总RNA是根据Chirgwin等的方法从(40岁)人的肝组织中提取的(Biochemistry，18，5294-5299(1979)).Poly(A+)-RNA则通过Oligo-(dT)层析从总RNA中分离出来(见产品提供者的方法Stratagene Poly(A)Quick-Column).1.2。反转录反应如下将1-2.5μg Poly(A)+-RNA 5分钟加热至65℃，快速转到冰上冷却。反应混合物包括27u RNA-Guard(Pharmacia)，2.5μg Oligo(dT)12-18(Pharmacia)，5×缓冲液(250mmol/l Tris/HClpH8.5，50mmol/l MgCl2，50mmol/l DTT，5mmol/l各dNTP，600mmol/LlKCl)，及每μg Poly(A+)-RNA所需的20U AMV反转录酶(BoehringerMannheim).反应混合物(25μl)在42℃温育2小时之后，将所得cDNA保存于-20℃。1.3图2所示的脱氧核苷酸引物OD及OID由全自动DNA合成仪(Biosearch)合成。先通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳、再利用等速电泳将凝胶上的主带分离，从而将引物纯化。通过比较已知TGF-β家族成员的核酸序列且选择较高的保守区，以设计寡核苷酸，该保守区的比较如图2所示。为了便于克隆，两个寡核苷酸都有EcoRI酶切位点，并且，引物OD在其5’端还有一个NcoI酶切位点。1.4.PCR反应的起始物是相当于20ng Poly(A+)RNA的cDNA(见1.2)。50μl的反应体积包括1×PCR缓冲液(16.6mmol/l(NH4)2SO4，67 mmol/l Tris/HCl pH 8.8，2mmol/l MgCl2，6.7μmol/l EDTA，10mmol/l β-巯基乙醇，170μg/ml牛血清蛋白(BSA)(Gibco)，200μmol/l各dNTP(Pharmacia)，30pmol各寡核苷酸(OD&OID)及1.5UTaq-聚合酶(Ampli Taq，Perkin Elmer Cetus)。于反应混合物之上加一层石蜡油，然后进行40个循环的PCR反应。PCR反应产物经过酚/氯仿抽提纯化后，用乙醇沉淀浓缩。1.5.PCR反应产物的一半用于SphI(Pharmacia)及AlwNI(Biolabs)酶切反应(根据公司提供的方法)。另一半则用于AvaI(BRL)、AlwNI(Biolabs)及TfiI(Biolabs)酶切反应。酶切反应体积为100μl(含8U酶)，于37℃温育2～12小时(TfiI除外，为65℃温育)进行。1.6.利用琼脂糖凝胶电泳将酶切产物分离。经溴乙锭染色后将未被酶切的扩增片段从凝胶上切出，并经酚抽提后分离出来。所得的DNA再经过两次酚/氯仿抽提后纯化。1.7.经乙醇沉淀后所得的DNA的1/4或1/5重新用以扩增，反应条件与第一次的扩增条件相同，不同的是循环次数降至13次，重新扩增产物经纯化后，用于与上述相同的酶切反应，然后从未被酶切的产物如对于扩增产物所述的一样琼脂糖凝胶上分离出来，再用于重复扩增。1.8将从凝胶上最后分离出的扩增产物用5U EcoRI(Pharmacia)酶切(反应条件根据酶提供者所述)。酶切混合物的1/4用于与EcoRI切割的pBluescript Sk+(Stratagene)载体连接。连接后各酶复合物的24个克隆作序列分析。AlwNI和SphI酶切片段只具有BMP6及抑制素βA序列、而不含任何新的序列。在AvaI、AlwNI及TfiI的酶切片段中，发现了19个相同的新序列并被命名为MP121。这些质粒被命名为pSK-MP121(OD/OID)。其中的一个序列与发现的主要序列在两个核苷酸上有所不同。连接反应及大肠杆菌的转化是根据Sambrook等的方法(MolecularCloningA Laboratory Manual(1989))。
根据Frohmann(见Perkin-ELmer Corp出版的Amplifications，5，11-15(1990))的方法，得到了cDNA克隆的3’端序列，从而具备了全长的cDNA克隆。用于分离第一MP121片段的肝mRNA如上所述在使用连接有衔接头引物的Oligo dT(16mer)(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC-T16)的情况下反转录。扩增反应所用的衔接头引物是(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)及根据MP121序列所合成的一内部引物(GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA)。扩增产物又重新用于扩增反应，所用引物为衔接头引物及另一根据MP121制备的内部引物(ACATAGCAGGC ATGCCTGGTATTG)。重新扩增产物经SphI酶切后，克隆在pT7/T3 U19载体(Pharmacia)的SphI位点并且测定其序列。利用与已知MP121序列的重合部分，对所得克隆进行鉴定。将一个被命名为P121Lt3’MP13的克隆用于分离一个NcoI/SphI片段(NcoI端经T4聚合酶处理为钝端)。该片段被克隆在上面提及的pSK-MP121(OD/OID)载体上，OD-引物序列与pSK的多克隆点的T7引物的方向相对应。所用的载体是经 SphI/SmaI酶切的。所构建的重组基因命名为pMP121DFus6。其含有SEQ ID NO.1所示的第922至1360个核苷酸的MP121序列部分。1.9 pMP121 DFus6中的DdeI片段，即SEQ ID NO.1中第931至1304个核苷酸部分，被用于筛选一个人肝脏的cDNA文库(Clontech，#HL3006b，Lot 36223)(方法见Ausubel等Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989)出版)。从8.1×105噬菌体中筛选出24个噬菌体区(Mischplaques)，并分别纯化得到了单噬菌体。从中选出经PCR反应检测为阳性的10个克隆，并纯化出单噬菌体。PCR所用引物为LO2(ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG)及来自DdeI片段的引物LOI1(CTGCAGCTGTGTTGGCCTTGAGA)。将噬菌体中的cDNA片段经EcoRI酶切分离出来，并克隆在用EcoRI裂解的pBluescript SK载体。
对所得质粒之一SK121L9.1的序列测定表明。起始密码始于SEQ IDNO.1中的第128位核苷酸，在该起始密码之前有三个处在同一阅读框架的终止码，分别在第62、77及92个核苷酸处。经过与其它TGF-β蛋白的序列同源性比较，MP121成熟蛋白始于SEQ ID NO.1中的第836个核苷酸，即SEQ NO.2中的第237个氨基酸，终止码始于SEQ ID NO.1的第1184个核苷酸。
质粒SK121L9.1(保藏号9177)在1994年4月26日保藏在DSM中。1.10.小鼠中MP121 cDNA及其基因组DNA的分离将人MP121序列信息用于分离小鼠的MP121序列，其中涉及的方法是专业人员所熟知的方法，见Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel et al；Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，Wiley&Sons，1987-1995)或Molecular Cloning(Sambrooket al，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989).
首先，从人MP121序列合成两个引物ACGAATTCCGACGAGGCATCGACTGC，及GCGTCGACTACCATGTCAGGTATGTC，在两个引物的5’端设计了一个酶切点(EcoRI及SalI)。两个引物用于小鼠基因组DNA的扩增后，将所得的0.35Kb长的片段再克隆在Bluescript(Stratagene)载体上，并用于制备放射性探针，利用该探针按照标准方法筛选小鼠基因组DNA的λ文库和cDNA文库。cDNA是由小鼠的肝脏分离出的RNA合成，加上EcoRI/NcoI连接物序列后克隆在λgt10上。
从基因库及cDNA库中都分离出了MP121克隆。将含有全长编码序列的cDNA亚克隆在Bluescript SK(Stratagene)的EcoRI位点，所得质粒命名为小鼠SKMP121并于1995年5月10日保藏在DSM资料库中(DSM9964)。序列分析所得全序列如SEQ ID NO.3所示。在SEQ ID NO.3序列中起始码始于第131个核苷酸而终止码始于第1187个核苷酸。根据该序列所推出的蛋白序列见SEQ ID NO.4。
来自基因组文库的含MP121克隆的亚克隆分析表明，MP121前体肽的编码区含有一个约5.5kb长的内含子。该内含子位于SEQ ID NO.3所示序列的第446与447个核苷酸之间。外显子/内含子的交接点如SEQ IDNO.5所示。例2MP121的表达在真核及原核系统中都有可能表达MP121。
只将MP121的成熟蛋白区段用于原核表达。在纯化之后在大肠杆菌中表达的MP121成熟单体，可折叠为双体。为简化MP121蛋白的纯化过程，在成熟蛋白的N-端可附加6个组氨酸残基，通过6个组氨酸残基与Ni螯合物Column层析柱的结合从而易于蛋白的纯化。
例如用原核载体pBP4表达人MP121成熟蛋白区段(SEQ ID No.2中的第237-352氨基酸)，其N-端共有包括6个组氨酸在内的13个附加氨基酸(MHHHHHHKLEFAM)。该载体是pBR322质粒的衍生物，并含有抗四环素基因和来自pBluescriptII SK质粒(Stratagene)的T7启动子。另外，该载体在其T7启动子之后还有一个核糖体结合部位和一个起始码，起始码之后则是6个组氨酸密码。终止子(T)位于多个用于插入内含子单酶切插入位点如Eco RI，Xho I，Sma I和Apa I及三种阅读框架的终止码之后。以质粒SK121L9.1(DSM保藏号9177)为模板，经PCR反应扩增出MP121成熟蛋白的cDNA，所用引物为GAATTCGCCATGGGCATCGACTGCCAAGGAGG和CCGCTCGAGAAGCTTCAACTGCA CCCACAGGC.两个寡核苷酸的末端都有附加的酶切位点(分别为Eco RI/Nco I，或xho I/Hin dIII)。将所得的377bp长的片段克隆于pBluescript II SK(Stratagene)的EcoRV位点。将其中一个克隆(MP1215’端指向T7启动子)经EcoRI酶切后所得的0.38kb的片段也克隆于pBP4载体的EcoRI位点。所得质粒pBP4MP121His中插入片段的正确走向经酶切分析及序列分析之后而得到确定。pBP4MP121His质粒于1995年1月30日保藏在DSM资料库中(保藏号为9704)。
MP121蛋白也可通过利用T7-RNA聚合酶而得到表达。可利用不同的表达T7-RNA聚合酶的方法，如利用另一个含有T7-RNA聚合酶基因的质粒、或编码T7-RNA聚合酶的噬菌体侵染，或通过一特殊的含有T7-RNA聚合酶整合基因的细菌菌株BL21(DE3)pLysS(Novagen，#69451-1)，在IPTG诱导表达T7-RNA聚合酶的情况下，可得到具有组氨酸标记(His-Tag)的MP121成熟蛋白(MP121 His)的包含体。在SDS聚丙稀酰胺(15％)凝胶电泳中，该蛋白的表观分子量近16KD(理论分子量14.2KD)，如图3的Western blot所示。用pBP4质粒转化的细菌作为对照，则没有发现特异的蛋白条带。由于该蛋白含有组氨酸标记(His-Tag)，所以，可利用Ni螯合剂-层析柱纯化蛋白的方法，如Hochuli等所述(BIO/Technology Vol.6，1321-1325(1988)).通过反相高压液相色谱法(HPLC)可对蛋白作进一步的纯化。利用一反相色谱柱(Nucleosil 300-7C4，Macherey-Nagel，Art715023)，所用色谱条件为流速2毫升/分钟，溶于0.1％TFA的乙腈，梯度为0～90％，时间100分钟。在此条件下，MP121His蛋白在乙腈浓度为40％时开始洗脱。
利用MP121特异性抗体，通过Western blot分析以证实上述蛋白为人的MP121蛋白。所用的MP121多克隆抗体来自鸡及兔。为得到用于免疫的抗原，将MP121成熟蛋白中的一个区段(SEQ ID NO.2中第260至352个氨基酸)与MS2一噬菌体聚合酶的前98个氨基酸片段的融合蛋白，在大肠杆菌中得到表达。将分离出的融合蛋白(MS2-MP121)包含体经聚丙烯酰胺电泳分离，根据铜染色法染色之后，从凝胶上冲洗出来并用于免疫(鸡或兔)(Tessmer，U.&Dernick，R.，IBL(1990)8-13)。从鸡或兔获得的抗体都能够检测出MP121的特异表达。图3所示的Western blot分析，所用的是来自鸡的MP121抗体。该抗体经过PEG沉淀(Thalley B.S及Carroll，S.B.BIO/Technology，Vol.8，934-938(1990))及膜结合抗原(融合蛋白(MS2-MP121))的处理而得到进一步纯化方法见Sambrook et al.，Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press1989.18.17页)。所用的二抗为与碱性磷酸酶(Sigma A9171)相偶连的抗鸡免疫球蛋白G(IgG)。利用Tropix Western-Light Protein Detection Kit(Serva#WL10RC)试剂盒，根据供货者所提供的方法进行进一步检测。
为得到具有生物活性的材料，可将在大肠杆菌中表达的MP121单体经纯化后折叠为双体。所用方法见Jaenicke，R.和Rudolph，R(ProteinStructure，ed，Creighton，T.E.IRL Press，Chapter9)。
在真核细胞中表达MP121，所用的是牛痘病毒表达系统。该表达系统在下述文献中有详细报道Cnrrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，Wiley&Sons，Chapter 16，Unit1 6.15～16.18)(以下将该文献简称CP)，本专业人员可效仿。该系统的主要依据是，使用特定载体外源DNA可通过同源重组而整合在牛痘病毒的基因组上。基于这一原理，所用的载体含有牛痘病毒基因组上的TK(胸苷激酶)基因。另外，载体也携带有大肠杆菌的花黄素—鸟嘌呤—磷酸核糖基转移酶基因(gpt)(Falkner，F.G.&Moss，B.，J.of Virol.62(1988)，1849-1854))，旨在筛选重组病毒在该载体中克隆了带有MP121的整个编码区的cDNA。
为缩短质粒SK121L9.1(DSM保藏号9177)中5’-端及3’-端的非翻译区，并在两端添加单酶切位点，需要进行一系列的PCR反应及亚克隆步骤。所有PCR反应都是以SK121 L9.1质粒(DSM保藏号9177)作为模板。为缩短5’-端的非翻译区所用的引物是CCCGGATCCGCTAGCACCATGACCTCCTCATTG CTTCTG(两端分别有BamHI和NheI酶切位点)，及一内部引物(CCCTGTTGTCCTCTAGAAGTG)。将所得的PCR片段克隆在Bluescript SK(Stratagene)上，通过序列分析并与SEQ ID NO.1所示序列的重合部分进行比较，以对所得序列进行确定。为缩短3’端的非翻译区所用的模板是质粒pBP4M121His中的SphI/EcoRI片段(0.22kb)。
人MP121的两端片段通过内部的酶切位点(XbaI与SphI)与质粒SK121L9.1(DSM保藏号9177)中的MP121中的缺少中间DNA序列相连接，标准方法见Sambrook等(Molecular Cloning，2nd editeon，ColdSpring Harbour Laboratory Press，1989)。已被缩短的cDNA仍具有完整的MP121阅读框架(SEQ ID NO.1中第128-1184个核苷酸)，并作为BamHI和EcoRI片段克隆在经BamHI和EcoRI酶切的pBP1载体上。由此所获得的质粒pBP1MP121于1995年1月12日保藏在DSM资料库中(保藏号9665)。
质粒pBP1MP121被用于构建重组的牛痘病毒。为此，将悬浮于1毫升PBS缓冲液的野生型牛痘病毒与80％合生的143B细胞(HuTK-，ATCC CRL 8303)在直径为35mm的培养皿中混合，室温下中度振荡30分钟以实现病毒对细胞的侵染(1病毒/10细胞)。将上清液移去并加入2毫升培养液(MEM，Gibco BRL#041-01095，含稀释到1/500浓度的青霉素和链霉素，Gibco BRL#043-05140)，于37C温育2小时。最后将培养液除去后，加入100ng pBP1MP121和2μg媒介DNA(超声波处理的小牛胸腺DNA，Boehringer Manheim#104175)及10μl Lipofektin(GibcoBRL#18292-011)，在1ml MEM中温育约15小时(37℃)，添加含有20％FCS(Sigma#F-7524)的1ml MEM之后于37℃继续温育24小时，最后将裂解细胞深冻保存。
基于花黄素—鸟嘌呤—磷酸核糖基转移酶的gpt筛选，及重组病毒的分离及扩增过程，大致如文献CP中Unit 16.17所述进行。只是所用的细胞为RK13(ATCC CCL37)。
利用斑点杂交法(见CP.Unit 16.18)以确定MP121 cDNA是否整合在病毒基因组上。经pBPMP121转染所获得的重组病毒与野生型病毒，都被用于分析MP121在细胞系143B(人HuTK-，ATCC CRL 8303)及NIH-3T3(DSM ACC59，瑞士小鼠胚胎)中的表达。根据细胞系提供者的说明进行细胞培养，用大约3倍于连生细胞数量的病毒进行细胞侵染(37℃，30分钟)，然后加入含有10％FCS及青霉素/链霉素(1500，GibcoBRL#043-05140)的培养液，并在37℃温育6小时。除去培养液后的细胞用例如HBSS(Gibco，BRL#14180-046)经两次洗涤后，再加入不含FCS的生产培养液(MEM用于HuTK-细胞系，DMEM+4.5g/l葡萄糖+NEAA(Gibco，BRL#11140-035)用于NIH-3T3细胞系；分别加入Aprotinin(Fluka#10820，50U/ml)和青霉素/链霉素)。经20至22小时培养之后收集培养细胞的上清液，利用Western blots分析表达水平(标准方法见CP，Unit 10.8)。在1～3毫升的细胞培养液的上清液中，加入等体积的丙酮并在冰上温育至少一小时之后蛋白质沉淀并进行离心。将所得沉淀悬浮于电泳上样液之中，并用于15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(上样液7M尿素，1％SDS，7mM NaH2PO4，0.01％溴酚蓝，及任选1％ β-巯基乙醇)。所用的标记蛋白为预染色的蛋白分子量标准物(Gibco BRL#6041-020)。蛋白转膜(PVDF膜Immobilon#IPVH 00010)及封膜过程与标准方法相同。
从(图3)Western blot筒图可以看出，经重组病毒侵染的细胞显示有特异性的MPl21条带。NIH-3T3细胞中表达的MP121为分泌蛋白，该蛋白在非还原条件下电泳后显示分子量约为18KD(预期的理论分子量为25KD)。该蛋白在还原性电泳中显示的分子量为15 KD(期望的理论分子量为12.5 KD)。该结果表明，MP121正如所期望的是作为成熟蛋白的双体得到表达。MP121蛋白双体比单体MP121移动相对稍慢一些，这很可能是由于球状结构的形成，在HTuK-细胞中，也发现前体蛋白被加工为成熟蛋白。经野生型病毒(不含外源DNA)侵染的细胞(HuTK-或NIH-3T3)在Western blot没有显示条带。
牛痘表达系统适用于利用重组牛痘病毒进行共转化，尤其是宜于不同TGF-β蛋白的异源双体蛋白的形成。利用含有一种TGF-β蛋白单体特异性抗体的亲合柱，有可能将异源双体与同源双体分开。其中抑制素的α-以及βA-βB链尤其令人感兴趣。例3小鼠不同组织中MP121表达的研究从6周龄小鼠的不同组织(脑、心脏、肾、肝、肺、脾、肌肉、卵巢、睾丸)及胚胎干细胞中依照标准方法提取总RNA。按产家说明用10μg总RNA进行核糖核酸酶保护实验(RPA)(Ambion RPAII Kit，#1410)。为获得激活素βA及βB的特异性探针，利用特异性引物，对与成熟蛋白相对应的小鼠(129SV)基因组DNA进行扩增。为使扩增片段易于克隆，引物的末端各引入了EcoRI及/或BamHI或HindIII酶切位点。扩增激活素βA的引物序列来自鼠的mRNA序列(GenBank Accession#M 37482)GGATCCGAATTCGGCTTGGAGTGTGATGGCAAGG和GGATCCGAATTCCTCTG GGACCTGGCAACTCTAG。
扩增激活素βB所用的简并引物则来自人的序列(Mason et al，Molecular Endocrinology 3，1352-1358(1989))GAGAATTCCA(GA)CA(GA)TT(TC)TT(CT)AT和GCAAGCTTT(GA)TA(TC)T C(GA)TC(GA)TC。获得的PCR片段亚克隆于载体pGEM-4(Promega)上并对其进行鉴定。RPA测验所保护的激活素特异性序列片段，激活素βA为369bp而激活素βB为254bp。MP121的保护片段为SEQ ID NO.3序列中的第887-1164个核苷酸。克隆于pGEM-4中的片段用于离体转录反应，以合成放射性标记的反义RNA探针。根据供货者(Promega，Riboprobe Gemini Systems)所提供反应条件，使用100μM CTP和α32P-CTP(800Ci/mmol，Amersham)。同样，用DdcI切开的线状质粒pTri-GAPDH(Ambion#7431)所合成的放射性标记RNA(CTP浓度为1mM)，用以作为对照。将4个反义RNA探针从聚丙烯酰胺凝胶上分离出来，并分别用于与小鼠相应组织的RNA(10μg总RNA/1×105cpm探针)混合，在42℃温育过夜。根据标准方法进行变性凝胶电泳及放射性自显影(4天)。例4MP121的部分纯化及部分纯化的MP121的活性研究在牛痘表达系统(见例2)所获得的MP121蛋白，可以通过两种层析柱而得到部分纯化。
MP121生产过程如下连生的NIH-3T3细胞(DSM ACC59，瑞士小鼠胚胎)与同样数量的重组病毒混合，于37℃温育30分钟以完成侵染过程，然后，添加含有10％FCS及青霉素/链霉素的培养液。
在37℃培养4小时之后，除去培养液将细胞洗涤两次，加入设有FCS的生产培养液(见例2)。继续培养20-22小时之后。收集上清液并进行离心(40000×g，30分钟，4℃)，然后对上清液再进行过滤以除去病毒(过滤网0.1μm孔径，MillexVV，Milliporc#SLVV25LS)。利用野生型牛痘病毒侵染所得的细胞，按以上方法获得对照上清液(Wt)。根据Western blot分析，MP121的表达量估计为50～100μg/l。
在1.1升含有MP121的细胞上清液中，分别加入蛋白酶抑制剂PMSF(1μm)，(NH4)2SO4(终浓度为1M)，Tris-pH8.0(终浓度为20mM)，将该样品加到经缓冲液A(1M(NH4)2SO4，20mM Tris-pH 8.0)平衡的苯基琼脂糖柱(体积为5毫升(FastFlow(high sub)Pharmacia#17-0973-05)，利用15倍于柱体积的缓冲液A及10倍于柱体积的缓冲液B(20mM Tris.DH8.0)冲洗并用线性梯度从100％缓冲液C(20mM Tris pH8.0，80％乙二醇)洗脱，流速为1毫升/分钟，洗脱50分钟(每个馏分5ml)。Western blot分析表明，MP121蛋白在乙二醇浓度为50～80％时被洗脱出来。将蛋白组分的一部分经聚丙烯酰胺凝胶(浓度15％)电泳，根据银染色法(SilverStain-II，Daiichi#SE140000)确定含有MP121的组分并将其集中起来。纯化对照上清液所得的相应组分，经银染色法分析之后，也被集中起来。
收集的MP121蛋白组分，通过反相高压液相色谱(HPLC)进一步纯化。先用缓冲液A(0.1％三氟乙酸的水溶液)平衡C8色谱柱(Aquapore RP300，Applied Biosystems，颗粒直径7μm，孔径300A°)。将上述收集的含MP121蛋白的组分加到色谱柱上之后，先用缓冲液A充分洗涤色谱柱。再用每分钟1.5％缓冲液B(90％乙腈，0.1％三氟乙酸)的线性梯度以0.2ml/分钟的流速将结合蛋白洗脱下来。将所收集的不同组分(体积600μl)用于Western blot及根据银染色法所进行的凝胶电泳分析。MP121蛋白在乙腈浓度为55％时开始洗脱。将含MP121蛋白的组分集中起来，并且上清液的纯化过程中的相应组分也被集中。经银染色的凝胶电泳分析表明，MP121蛋白组分中仍混有其它蛋白。为获得纯化的MP121，需要进一步的纯化步骤。
可用专业人员所熟悉的纯化方法作进一步纯化，如使用凝胶筛柱，离子交换柱，亲和柱或金属螯合柱。根据Western blot分析结果估计，从1升细胞培养的上清液中可分离出约8克部分纯化的MP121。部分纯化的蛋白经冷冻干燥后保存于-80℃。
为证实MP121对多巴胺神经元的影响，从14天龄的大鼠胚胎(E14)的中脑区分离神经元(方法见Shimoda等Brain Res.586，319-331(1992))。根据Krieglstein等(Neuroscience 63，1189-1196(1994))所述方法，进行神经单细胞的分离及培养。在涂有多鸟氨酸/昆布氨酸的载玻片上，设计细胞密度为 200000细胞/厘米2。经24小时培养之后，每隔三天将2/3的培养液(500μl)移去并添加同样量的新鲜培养液及所需的其它成分。将苯基琼脂糖柱及反相高压液相色谱(HPLC)纯化及冷冻干燥后部分纯化的MP121蛋白溶于50％乙腈中，加入细胞培养液。MP121在培养液中的终浓度为20ng/ml(乙腈的终浓度为0.3％)。将同样量的纯化的对照上清液(wt)样品溶于50％乙腈中并加入对照培养液中，其中乙腈的终浓度也为0.3％。经8天培养后，用4％多聚甲醛在室温下对所得培养物进行固定，经丙酮渗透处理后(10分钟，-20℃)再用PBS(磷酸缓冲的盐溶液)冲洗，经1％H2O2(溶于PBS)处理，并用马血清冲洗、封闭处理之后，进行免疫组织化学染色。酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺及其它儿茶酚胺生物合成过程中的特定酶，所以TH可作为上述神经元细胞培养的标记(含去甲肾上腺素的细胞不被分离)。用抗大鼠TH的小鼠单克隆抗体(稀释1∶200，BoehringerMannheim)，经37℃，1小时温育处理后，再用试剂盒(Vectastain ABC KitVecto Labs)进行进一步检测。从0.12cm2面积内统计TH-阳性细胞的数量。从图5可明显看出，MP121对多巴胺神经元的生长具有正面影响。
图5表示从大鼠胚胎(E14)中脑分离的神经元，经8天培养后TH免疫反应呈阳性的多巴胺神经元的存活数量。部分纯化的MP121(浓度20ng/ml)、等量的对照上清液产物(wt)的处理效果及未经处理的神经元(对照含有0.3％乙腈培养液)。所示值为三次重复取样的平均值±平均标准误差。图3-5的详细说明图3利用抗MP121的鸡抗体所进行的Western blot简图。1在还原条件下(1％β-巯基乙醇)经pBP4MP121His转化的大肠杆菌细胞。2在还原条件下(1％β-巯基乙醇)经重组病毒(含有插入的MP121 cDNA)侵染的NIH-3T3细胞的培养上清液。3在非还原条件下经重组病毒(含有插入的MP121 cDNA)侵染的NIH-3T3细胞的培养上清液。M预染的蛋白分子量标记(标明主要蛋白条带的表观分子量)(Gibco BRL#26041-020)。图4核糖核酸酶保护实验的凝胶分析的放射自显影图谱。所用的特异性探针为激活素βA(βA)-、激活素βB(βB)-、MP121-及作为对照的GAPDH-探针。所用的总RNA是来自不同的小鼠组织(1大脑，2心脏，3肾，4肝，5肺，6肌肉，9卵巢，10脾，11睾丸)，来自胚干细胞(12CJ7)和作为对照的酵母(泳道13)。样品14不含RNA以作为对照。8和15表示杂交中的未被保护的反义RNA样品右侧的括号内标明了期望的未被保护的片段长度；被保护的片段长度则在左侧标明。样品7是作为分子量标记的经MspI酶切及γ-32P-ATP(Amersham)末端标记的pBR322质粒。图5表示经8天培养后存活的具有TH-免疫反应的大鼠胚胎(E14)中脑的多巴胺神经元数目。所测效果来自以下不同处理部分纯化的MP121(浓度为20ng/ml)、等量的部分纯化的对照上清液(wt)及未经处理的神经元(对照含有0.3％乙腈的培养液)，所示值为三次重复取样的平均值±平均标准误差。
序列说明(1)一般信息(i)申请人(A)名称Biopharm Gesellschaft zur blotechnologlscnenEntwicklung von Pharmaka mhH(B)街号Czernyring 22(C)地点Heidelberg(E)国家Germany(F)邮编69115(ii)发明名称新的TGF一β家族的生长/分化因子(iii)序列数6(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPA)(v)申请信息申请号WO PCT/EP95/02552(2)SEQ ID NO1说明(i)序列特征(A)长度2272 BP(B)种类核苷酸(C)链状双链(D)拓扑线状(vi)原始来源(A)有机体Homo sapiens(xi)序列说明SEQ ID NO1CAAGGAGCCA TGCCAGCTGG ACACACACTT CTTCCAGGGC CTCTGGCAGC CAGGACAGAG 60TTGAGACCAC AGCTGTTGAG ACCCTGAGCC CTGAGTCTGT ATTGCTCAAG AAGGGCCTTC 120CCCAGCAATG ACCTCCTCAT TGCTTCTGGC CTTTCTCCTC CTGGCTCCAA CCACAGTGGC 180CACTCCCAGA GCTGGCGGTC AGTGTCCAGC ATGTGGGGGG CCCACCTTGG AACTGGAGAG 240CCAGCGGGAG CTGCTTCTTG ATCTGGCCAA GAGAAGCATC TTGGACAAGC TGCACCTCAC 300CCAGCGCCCA ACACTGAACC GCCCTGTGTC CAGAGCTGCT TTGAGGACTG CACTGCAGCA 360CCTCCACGGG GTCCCACAGG GGGCACTTCT AGAGGACAAC AGGGAACAGG AATGTGAAAT 420CATCAGCTTT GCTGAGACAG GCCTCTCCAC CATCAACCAG ACTCGTCTTG ATTTTCACTT 480CTCCTCTGAT AGAACTGCTG GTGACAGGGA GGTCCAGCAG GCCAGTCTCA TGTTCTTTGT 540CCAGCTCCCT TCCAATACCA CTTGGACCTT GAAAGTGAGA GTCCTTGTGC TGGGTCCACA 600TAATACCAAC CTCACCTTGG CTACTCAGTA CCTGCTGGAG GTGGATGCCA GTGGCTGGCA 660TCAACTCCCC CTAGGGCCTG AAGCTCAAGC TGCCTGCAGC CAGGGGCACC TGACCCTGGA 720GCTGGTACTT GAAGGCCAGG TAGCCCAGAG CTCAGTCATC CTGGGTGGAG CTGCCCATAG 780GCCTTTTGTG GCAGCCCGGG TGAGAGTTGG GGGCAAACAC CAGATTCACC GACGAGGCAT 840CGACTGCCAA GGAGGGTCCA GGATGTGCTG TCGACAAGAG TTTTTTGTGG ACTTCCGTGA 900GATTGGCTGG CACGACTGGA TCATCCAGCC TGAGGGCTAC GCCATGAACT TCTGCATAGG 960GCAGTGCCCA CTACACATAG CAGGCATGCC TGGTATTGCT GCCTCCTTTC ACACTGCAGT1020GCTCAATCTT CTCAAGGCCA ACACAGCTGC AGGCACCACT GGAGGGGGCT CATGCTGTGT1080ACCCACGGCC CGGCGCCCCC TGTCTCTGCT CTATTATGAC AGGGACAGCA ACATTGTCAA1140GACTGACATA CCTGACATGG TAGTAGAGGC CTGTGGGTGC AGTTAGTCTA TGTGTGGTAT1200GGGCAGCCCA AGGTTGCATG GGAAAACACG CCCCTACAGA AGTGCACTTC CTTGAGAGGA1260GGGAATGACC TCATTCTCTG TCCAGAATGT GGACTCCCTC TTCCTGAGCA TCTTATGGAA1320ATTACCCCAC CTTTGACTTG AAGAAACCTT CATCTAAAGC AAGTCACTGT GCCATCTTCC1380TGACCACTAC CCTCTTTCCT AGGGCATAGT CCATCCCGCT AGTCCATCCC GCTAGCCCCA1440CTCCAGGGAC TCAGACCCAT CTCCAACCAT GAGCAATGCC ATCTGGTTCC CAGGCAAAGA1500CACCCTTAGC TCACCTTTAA TAGACCCCAT AACCCACTAT GCCTTCCTGT CCTTTCTACT1560CAATGGTCCC CACTCCAAGA TGAGTTGACA CAACCCCTTC CCCCAATTTT TGTGGATCTC1620CAGAGAGGCC CTTCTTTGGA TTCACCAAAG TTTAGATCAC TGCTGCCCAA AATAGAGGCT1680TACCTACCCC CCTCTTTGTT GTGAGCCCCT GTCCTTCTTA GTTGTCCAGG TGAACTACTA1740AAGCTCTCTT TGCATACCTT CATCCATTTT TTGTCCTTCT CTGCCTTTCT CTATGCCCTT1800AAGGGGTGAA TTGCCTGAGC TCTATCACCT GAGCTCCCCT GCCCTCTGGC TTCGTGCTGA1870GGTCAGGGCA TTTCTTATCC CTGTTCCCTC TCTGTCTAGG TGTCATGGTT CTGTGTAACT1920GTGGCTATTC TGTGTCCCTA CACTACCTGG CTACCCCCTT CCATGGCCCC AGCTCTGCCT1980ACATTCTGAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TGAAAAGTTA AAAATTCCTT AATTTTTTAT2040TCCTGGTACC ACTACCACAA TTTACAGGGC AATATACCTG ATGTAATGAA AAGAAAAAGA2100AAAAGACAAA GCTACAACAG ATAAAAGACC TCAGGAATGT ACATCTAATT GACACTACAT2160TGCATTAATC AATAGCTGCA CTTTTTGCAA ACTGTGGCTA TGACAGTCCT GAACAAGAAG2220GGTTTCCTGT TTAAGCTGCA GTAACTTTTC TGACTATGGA TCATCGTTCC TT2272(2)对SEQ ID NO2的说明(i)序列特征(A)长度352氨基酸(B)种类氨基酸(C)链状(D)拓扑线状(ii)分子种类肽
(vi)原始来源(A)有机体Homo sapiens(xi)序列说明SEQ ID NO2Met Thr Ser Ser Leu Leu Leu Ala Phe Leu Leu Leu Ala Pro Thr Thr1 510 15Val Ala Thr Pro Arg Ala Gly Gly Gln Cys Pro Ala Cys Gly Gly Pro20 25 30Thr Leu Glu Leu Glu Ser Gln Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys35 40 45Arg Ser Ile Leu Asp Lys Leu His Leu Thr Gln Arg Pro Thr Leu Asn50 55 60Arg Pro Val Ser Arg Ala Ala Leu Arg Thr Ala Leu Gln His Leu His65 70 75 80Gly Val Pro Gln Gly Ala Leu Leu Glu Asp Asn Arg Glu Gln Glu Cys85 90 95Glu Ile Ile Ser Phe Ala Glu Thr Gly Leu Ser Thr Ile Asn Gln Thr100 105 110Arg Leu Asp Phe His Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ala Gly Asp Arg Glu115 120 125Val Gln Gln Ala Ser Leu Met Phe Phe Val Gln Leu Pro Ser Asn Thr130 135 140Thr Trp Thr Leu Lys Val Arg Val Leu Val Leu Gly Pro His Asn Thr145 150 155 160Ash Leu Thr Leu Alg Thr Gln Tyr Leu Leu Glu Val Asp Ala Ger Gly165 170 175Trp His Gln Leu Pro Leu Gly Pro Glu Ala Gln Ala Ala Cys Ser Gln180 185 190Gly His Leu Thr Leu Glu Leu Val Leu Glu Gly Gln Val Ala Gln Ser195 200 205Ser Val Ile Leu Gly Gly Ala Ala His Arg Pro Phe Val Ala Ala Arg210 215 220Val Arg Val Gly Gly Lys His Gln Ile His Arg Arg Gly Ile Asp Cys225 230 235 240Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe Phe Val Asp Phe245 250 255Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro Glu Gly Tyr Ala260 265 270Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile Ala Gly Met Pro275 280 285Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn Leu Leu Lys Ala
290 295 300Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr305 310 315 320Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn Ile325 330 335Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser340 345 350(2)对SEQ ID NO3的说明(i)序列特征(A)长度1558 BP(B)种类核苷酸(C)链状双链(D)拓扑线状(vi)原始来源(A)有机体小鼠(xi)序列说明SEQ ID NO3AAGGAGTCAT GCCAGTCGGA GGTCAGTCAC ATTCCTCCCA GGGTCCCTGG TGCCCAGGAC 60AGAGTTGAAG CACTCCCGTT GAGACCCTGA ATATAGGCTT TGGGTCCTTT AAGGAGGCTA 120TCCTCCAGCA ATGGCCTCCT CCTTGCTCCT GGCTCTTCTG TTCCTGACTC CAACCACAGT 180AGTGAACCCC AAAACTGAGG GTCCATGCCC AGCATGTTGG GGTGCCATCT TTGACCTGGA 240GAGCCAGCGG GAGCTGCTTC TCGATTTGGC CAAGAAAAGT ATCCTGGACA AGCTGCACCT 300CAGCCAGCGC CCCATACTCA GTCGGCCAGT GTCCAGAGGG GCTCTCAAGA CCGCGCTGCA 360GCGCCTCCGC GGGCCTCGAC GGGAAACCCT GTTGGAGCAT GACCAGAGAC AAGAAAGATA 420TGAGATCATC AGCTTTGCTG ACACAGACCT CTCCAGCATC AACCAGACCC GGCTCGAGTT 480CCACTTCTCT GGTAGAATGG CCAGTGGCAT GGAGGTCCGG CAGACCCGCT TCATGTTCTT 540CGTGCAGTTC CCCCACAATG CCACCCAGAC CATGAATATA AGAGTTCTTG TGCTAAGACC 600ATATGACACC AACCTCACCT TGACAAGTCA GTACGTGGTG CAGGTGAATG CCAGTGGCTG 660GTACCAGCTT CTCCTGGGAC CTGAAGCTCA AGCTGCTTGC AGCCAGGGAC ACCTTACTCT 720GGAGCTGGTA CCAGAAAGCC AGGTGGCCCA CAGTTCCTTG ATCCTGGGCT GGTTTTCCCA 780CAGGCCTTTT GTGGCAGCCC AGGTAAGGGT TGAGGGCAAG CATCGGGTTC GCCGGCGAGG 840TATCGATTGC CAGGGGGGGT CCAGGATGTG CTGTCGACAA GAGTTTTTTG TAGACTTCCG 900TGAGATTGGC TGGAATGACT GGATCATCCA GCCTGAAGGC TATGCCATGA ACTTCTGCAC 960TGGGCAGTGC CCACTACATG TGGCAGGCAT GCCTGGCATC TCTGCCTCCT TTCACACTGC1020AGTGCTGAAT CTGCTCAAAG CCAACGCAGC TGCTGGCACC ACTGGCAGGG GCTCGTGCTG1080CGTGCCTACA TCTCGGCGCC CTCTGTCTTT GCTCTACTAT GACAGGGACA GCAACATTGT1140CAAGACGGAT ATACCTGACA TGGTGGTCGA GGCCTGCGGG TGTAGTTAGC TTATGGGTGA 1200TACAGGCTGC CTGAGGTAGA ATGGCCTTCC TCAGGAAGGG AAACTCTGTT CCCACTTCTG 1260TCCAGAATGG AAACACCTTT CTAAGCATGC AGACATCCCT CTGTGGACTT CAGGGGATCC 1320ACCTCTAAAG AGAGTCACTA GTGACCAACA GCCTTTCTCT CTCCTGGGAC ATGGTTGACC 1380CAGTACACCC ATCCTCAGCC TTAAGTTAGA GGCTAATCGA CTCCTACATA TATATGTCAT 1440TTTGTCCTAG CAAACACCCC TTAGCTCCCC TTAGTCAACT ATGTAATCTA CTCTGCCTCC 1500CTGACCCTGC CACCGGAAGG TTCCTATTCC ACGATGATAT GCCTTAGTGT CTCCCCTT 1558(2)对SEQ ID NO4的说明(i)序列特征(A)长度352氨基酸(B)种类氨基酸(C)链状(D)拓扑线状(ii)分子种类肽(vi)原始来源(A)有机体小鼠(xi)序列说明SEQ ID NO4Met Ala Ser Ser Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Thr Pro Thr Thr1 510 15Val Val Asn Pro Lys Thr Glu Gly Pro Cys Pro Ala Cys Trp Gly Ala20 25 30Ile Phe Asp Leu Glu Ser Gln Arg Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Lys35 40 45Lys Ser Ile Leu Asp Lys Leu His Leu Ser Gln Arg Pro Ile Leu Ser50 55 60Arg Pro Val Ser Arg Gly Ala Leu Lys Thr Ala Leu Gln Arg Leu Arg65 70 75 80Gly Pro Arg Arg Glu Thr Leu Leu Glu His Asp Gln Arg Gln Glu Glu85 90 95TyrGlu Ile Ile Ser Phe Ala Asp Thr Asp Leu Ser Ser Ile Asn Gln100 105 110Thr Arg Leu Glu Phe His Phe Ser Gly Arg Met Ala Ser Gly Met Glu115 120 125Val Arg Gln Thr Arg Phe Met Phe Phe Val Gln Phe Pro His Asn Ala130 135 140Thr Gln Thr Met Asn Ile Arg Val Leu Val Leu Arg Pro Tyr Asp Thr145 150 155 160Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gln Tyr Val Val Gln Val Asn Ala Ser Gly165 170 175Trp Tyr Gln Leu Leu Leu Gly Pro Glu Ala Gln Ala Ala Cys Ser Gln180 185 190Gly His Leu Thr Leu Glu Leu Val Pro Glu Ser Gln Val Ala His Ser195 200 205Ser Leu Ile Leu Gly Trp Phe Ser His Arg Pro Phe ValAla Ala Gln210 215 220Val Arg Val Glu Gly Lys His Arg Val Arg Arg Arg Gly Ile Asp Cys225 230 235 240Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe Phe Val Asp Phe245 250 255Arg Glu Ile Gly Trp Ash Asp Trp Ile Ile Gln Pro Glu Gly Tyr Ala260 265 270Met Ash Phe Cys Thr Gly Gln Cys Pro Leu His Val Ala Gly Met Pro275 280 285Gly Ile Ser Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Ash Leu Leu Lys Ala290 295 300Asn Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Arg Gly Ser Cys Cys Val Pro Thr305 310 315 320Ser Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg Asp Ser Asn Ile325 330 335Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Ser340 345 350(2)对SEQ ID NO5的说明(i)序列特征(A)长度18bp(B)种类核苷酸(C)链状双链(D)拓扑线状(vi)原始来源(A)有机体Homo sapiens(ix)特征(A)名称/键外显子(B)位置1..3(ix)特征(A)名称/键内含子(B)位置4..18(xi)序列说明SEQ ID NO5CAGGTAGGTC CATGGTCG 18(2)对SEQ ID NO6的说明(i)序列特征(A)长度18bp(B)种类核苷酸(C)链状双链(D)拓扑线状
(vi)原始来源(A)有机体Homo sapiens(ix)特征(A)名称/键内含子(B)位置1.15(ix)特征(A)名称/键外显子(B)位置16..18(xi)序列说明SEQ ID NO6CTTGATTTTT AACAGACC 18
权利要求
1，编码一个TGF-β家族蛋白的DNA分子，它包含(a)编码成熟蛋白区段及任选地SEQ ID NO.1中标明的核苷酸序列的其它功能区段(b)由序列(a)根据遗传密码的简并而得到的核酸序列之一(c)一种对应于序列(a)和(b)之一的等位衍生物的核苷酸序列(d)基于其源自其它脊椎动物而与序列(a)不同的序列之一(e)与(a)、(b)、(c)、或(d)的序列之一杂交的核苷酸序列并且前提是根据(d)的DNA分子至少要含有完整的TGF-β家族的成熟蛋白的编码区。
2，根据权利要求1所述的DNA分子其特征为除含有权利要求1(a)至(e)的区段之一之外，还含有编码其它蛋白的至少一部分的核苷酸序列，并且其设计序列的表达可导致融合蛋白的形成。
3，载体其特征为它至少含有权利要求1或2的DNA分子的一个拷贝。
4，寄主细胞其特征为它是利用权利要求1或2中DNA或权利要求3中的载体所转化的。
5，权利要求4中的寄主细胞其特征为它是细菌、真菌、植物或动物细胞。
6，权利要求1或2中DNA序列所编码的TGF-β家族的蛋白。
7，权利要求6中的蛋白其特征为它具有SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4中显示的氨基酸序列或任选地其功能区段。
8，嵌合蛋白其特征为它含有权利要求6或7中的蛋白并且至少含有其它蛋白的部分区段。
9，异源双体蛋白其特征为它由权利要求6、7或8中的蛋白单体及其它具有“半胱氨酸结”的超家族蛋白单体构成。
10，权利要求6至8中任一项的蛋白的生产方法其特征为培养权利要求4或5中的寄主细胞及从细胞或/和培养的上清液中获得蛋白。
11，根据权利要求9的异源双体蛋白的生产方法其特征为进行两种单体在同一寄主细胞的共表达。
12，权利要求9的异源双体蛋白的生产方法其特征为使两种单体的包含体共同复性。
13，药物组合物其特征为它至少含有权利要求6至9中一项的一种蛋白作为有效成分、任选地含有制药常用载体、助剂、稀释剂或填充剂。
14，根据权利要求13的药物组合物用于治疗或预防骨\软骨\结缔组织\皮肤、黏膜、内皮组织、上皮组织、神经、大脑、肾或牙齿的损伤；及用于牙齿植入、创伤愈合及组织再生过程；作为促进细胞分裂素用于诱导肝组织生长、诱导骨髓细胞或前体细胞的增生；用于保持分化状态及治疗不育症及用于避孕，或用于治疗物质交换方面的疾病。
15，反义RNA其特征为其与权利要求1的DNA分子的一部分互补。
16，核酶其特征为它能够对权利要求1的DNA分子的转录得到的RNA分子进行特异切割
17，权利要求15中的反义RNA或权利要求16中的核酶用以阻断权利要求6和7中任一项的蛋白的表达的应用。
18，权利要求1或2中的DNA序列或权利要求3中的载体用以对病体细胞进行体外或体内转染的应用。
19，抗体或抗体片段其特征为其结合权利要求6至9中任一项的一种蛋白。
20，受体其特征为其上特异地结合权利要求6及7中任一项的一种蛋白。
全文摘要
本发明包括TGF-β家族的一种蛋白、其编码DNA及含有该蛋白的一种医药组合物。
文档编号A61P3/00GK1151758SQ95193816
公开日1997年6月11日 申请日期1995年6月30日 优先权日1994年7月1日
发明者G·霍藤, H·奈德哈特, R·贝克托尔德, J·波尔 申请人:药物生物技术发展公司